CN101421420B

CN101421420B - 突变的检测方法及用于该方法的试剂盒

Info

Publication number: CN101421420B
Application number: CN200780013688.5A
Authority: CN
Inventors: 平井光春; 间岛智史; 前川平; 木村晋也
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2006-08-08
Filing date: 2007-07-27
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2027-07-27
Also published as: WO2008018305A1; EP2031074A1; KR101171635B1; EP2031074A4; KR20110036646A; JP2012040029A; KR101110396B1; CN101421420A; JPWO2008018305A1; KR20080106292A; US20100216123A1

Abstract

本发明提供利用Tm分析的、检测灵敏度优异的突变检测方法。向含有检测位点已发生突变的检测对象DNA和上述检测位点未发生突变的非检测对象DNA的试样中，添加检测用探针以及抑制用多核苷酸，使上述检测用探针与上述DNA进行杂交，所述检测用探针包含与含有已发生突变的上述检测位点的检测对象序列互补的多核苷酸，所述抑制用多核苷酸与含有未发生突变的所述检测位点的非检测对象序列互补。然后，加热前述DNA和前述检测用探针的杂交形成体，测定伴随温度上升的信号改变，对所述信号改变进行分析以确定Tm值，从而确定突变的有无。

Description

突变的检测方法及用于该方法的试剂盒

技术领域

本发明涉及突变的检测方法及用于该方法的试剂盒。

背景技术

作为在基因水平分析所有疾病的病因、个体间的疾病易感性(易患病性)、个体间的药效差异等的方法，广泛进行点突变即所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。

点突变的一般检测方法例如可以举出：(1)对于试样的目标DNA，对相当于检测对象序列的区域进行扩增，对所得扩增产物的碱基序列进行分析的直接测序(direct sequencing)法；(2)焦磷酸测序法(Pyrosequencing)；(3)对相当于检测对象序列的区域进行扩增，对所得扩增产物在温度梯度柱中进行HPLC，根据洗脱时间检测有无突变的变性HPLC(DenaturingHPLC)法；(4)利用荧光探针结合于含有目标突变的区域时发出荧光的现象，通过检测上述荧光来检测突变的Invader法；(5)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR法等。

但是，上述(1)、(2)和(4)方法的灵敏度低，分别达到约20％、约5％、约5％左右，操作需要很多功夫和时间。上述(3)方法的灵敏度低，约10％，另外，仅能确认有无突变，无法分析在何位点产生了何种突变，具有缺乏特异性的问题。另外，上述(5)的方法虽然灵敏度高、但特异性低，具有易于产生假阳性的问题。予以说明，数值(％)越小则灵敏度为越高。

由该问题出发，近年作为点突变的检测方法进行利用Tm分析的检测。该方法例如可以如下进行。首先，使用与含有检测目标点突变的检测对象序列互补的探针，形成试样中的目标单链DNA和上述探针的杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交形成体实施加热处理，利用吸光度等信号测定来检测伴随温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交形成体的同源性越高时Tm值越高，在同源性越低时Tm值越低。因此，对于由含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交形成体，预先求出其Tm值(评价基准值)，测定目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)，则可以进行以下的判断。当上述测定值与上述评价基准值相同时，则可以判断为匹配、即目标DNA存在点突变。另一方面，上述测定值低于上述评价基准值时，则可以判定为错配、即目标DNA不存在点突变。

但是，使用这种Tm分析的检测方法具有灵敏度低的问题。举例来说，对于白血病患者的血细胞来源的DNA检测点突变时存在问题(专利文献1)。白血病是骨髓中的造血干细胞癌变所引起的疾病。其中，已知慢性粒细胞白血病(Chronic myeloidleukemia，CML)的发病原因在于由第9号染色体和第22号染色体易位所形成的bcr-abl融合基因，在其治疗中广泛使用作为ABL酶抑制剂的伊马替尼等。但是，存在如下的问题：该abl基因(包括上述融合基因中的abl基因)存在点突变时，对伊马替尼表现出耐受性。此时，治疗中有必要进行例如伊马替尼给药量的增加、换成其它治疗药、改为骨髓移植等。因此，在白血病、特别是CML的治疗中，检测abl基因上有无点突变非常重要。但是，即便是同一个CML患者的血液，在其血细胞中也包括abl基因中发生了点突变的序列(检测对象序列)和未发生点突变的序列(非检测对象序列)，两者的不同仅为点突变、即一个碱基的序列。这样，发生如下现象：用于检测点突变的探针与含有点突变的检测对象序列杂交(匹配)，进而还与不含点突变的非检测对象序列杂交(错配)。这种情况下，当通过Tm分析制作表示信号强度和温度间的关系的融解曲线时，匹配的检测对象序列相应的高温侧的峰因错配的非检测对象序列相应的低温侧的峰的存在而难以检测，进而发生检测灵敏度降低。

专利文献1：日本特表2004-537992号公报

发明内容

发明要解决的问题

因此，本发明的目的在于提供利用Tm分析的、检测灵敏度优异的突变检测方法及用于该方法的检测用探针试剂盒。

用于解决问题的方法

为了达成上述目的，本发明的突变检测方法的特征在于，所述试样为含有检测位点已发生突变的检测对象DNA和所述检测位点未发生突变的非检测对象DNA的试样，所述方法包括下述(A)～(E)工序。

(A)向含有上述DNA的试样中添加包含与检测对象序列互补的多核苷酸的检测用探针、和与非检测对象序列互补的多核苷酸(以下称作“抑制用多核苷酸”)的工序，所述工序中：

上述检测对象序列为上述检测对象DNA或其部分序列，其含有已发生突变的上述检测位点，

上述非检测对象序列为上述非检测对象DNA或其部分序列，其含有未发生突变的上述检测位点；

(B)使上述检测用探针与上述DNA杂交的工序；

(C)对上述DNA和上述检测用探针的杂交形成体，测定伴随温度变化的信号改变的工序；

(D)分析上述信号改变、确定Tm值的工序；

(E)由上述Tm值确定上述检测对象位点有无突变的工序。

本发明的检测用探针试剂盒，其特征在于，其为本发明的突变检测方法中所使用的检测用探针试剂盒，含有包含与检测对象序列互补的多核苷酸的检测用探针和与非检测对象序列互补的抑制用多核苷酸，

上述检测对象序列为检测位点已发生突变的检测对象DNA或其部分序列，其含有已发生突变的上述检测位点，

上述非检测对象序列为上述检测位点未发生突变的上述非检测对象DNA或其部分序列，其含有未发生突变的上述检测位点。

发明效果

本发明的突变检测方法为不仅向试样中添加针对检测位点已发生突变的上述检测对象序列的检测用探针，还添加针对检测位点未发生突变的上述非检测对象序列的抑制用多核苷酸。因此，可以抑制上述检测用探针与非检测对象序列杂交，结果可以以比以往优异的灵敏度(约3％)检测上述检测位点的突变。这样，能够抑制检测用探针与非检测对象序列杂交的原因在于，与上述检测用探针相比，上述抑制用多核苷酸与上述非检测对象序列的同源性高。因此，本发明的检测方法例如对于试样中含有检测对象DNA和非检测对象DNA两者的试样有用。特别是，对于白血病患者的试样有用，其中，对于慢性粒细胞白血病(CML)患者，在检测abl基因的突变(包括bcr-abl融合基因中的abl基因的突变)时有用。如上所述，由于能够以高灵敏度检测突变，因此能够在基因水平上分析每个患者的白血病治疗药的适合性，是医疗领域中极为有用的方法。另外，使用本发明的检测用探针试剂盒时，可以容易地进行本发明的突变的检测方法。

附图说明

图1为表示本发明实施例1的、添加了抑制用多核苷酸的Tm分析结果的图表。

图2为表示比较例1的、未添加抑制用多核苷酸时的Tm分析结果的图表。

图3为表示本发明上述实施例1的、改变检测用探针添加比例的Tm分析结果的图表。

图4为表示本发明上述实施例1的、改变抑制用多核苷酸添加比例的Tm分析结果的图表。

图5为表示本发明实施例2的、添加抑制用多核苷酸的Tm分析结果的图表。

图6为表示本发明实施例3的、添加抑制用多核苷酸的Tm分析结果的图表。

图7为表示本发明实施例4的、添加抑制用多核苷酸的Tm分析结果的图表。

具体实施方式

本发明的突变检测方法如上所述为检测试样中DNA的突变的方法，其特征在于，所述试样为含有检测位点已发生突变的检测对象DNA和上述检测位点未发生突变的非检测对象DNA的试样，所述方法包括下述(A)～(E)工序。

(A)向含有上述DNA的试样中，添加包含与检测对象序列互补的多核苷酸的检测用探针、和与非检测对象序列互补的抑制用多核苷酸的工序；

(B)使上述检测用探针与上述DNA杂交的工序；

(C)对于上述DNA和上述检测用探针的杂交形成体，测定伴随温度变化的信号改变的工序；

(D)分析上述信号改变、确定Tm值的工序；

(E)由上述Tm值确定上述检测对象位点有无突变的工序。

上述(A)工序中，上述检测对象序列是指上述检测对象DNA或其部分序列，为含有已发生突变的上述检测对象位点的序列。另外，上述非检测对象序列是指上述非检测对象DNA或其部分序列，为含有未发生突变的上述检测对象位点的序列。

本发明中，将检测位点存在突变的上述检测对象序列称作“突变序列”、将含有上述检测对象序列的检测对象DNA称作“突变DNA”、将检测位点不存在突变的上述非检测对象序列称作“正常序列”、将含有上述非检测对象序列的DNA称作“正常DNA”。另外，将检测位点的突变称作“检测目标的突变”。将成为检测有无突变的目标的试样中的DNA称作“目标DNA”。本发明中所检测的突变例如可以举出单核苷酸多态性(SNP)等。

本发明中，上述试样中的DNA可以为单链DNA还可以是双链DNA。上述DNA为双链DNA时，优选包括例如在上述(B)杂交工序之前，通过加热使上述试样中的双链DNA解离的工序。通过将双链DNA解离为单链DNA，在之后的(B)杂交工序中，可以高效地进行与检测用探针或抑制用多核苷酸的杂交。

本发明中，上述试样中的DNA例如可以为基因或者基因的部分序列。另外，上述试样中的DNA例如可以是生物试样等试样中原本含有的DNA，例如为了能够提高检测精度，优选为通过基因扩增法扩增出的扩增产物。具体地说，可以列举出：例如以上述试样原本含有的DNA为模板，通过基因扩增法扩增出的扩增产物、或者以cDNA为模板，利用基因扩增法扩增出的扩增产物，所述cDNA为由上述试样原本所含的RNA(总RNA、mRNA等)通过逆转录反应(例如RT-PCR(逆转录PCR))产生的。上述扩增产物的长度并无特别限定，例如为50～1000mer、优选为80～200mer。

应用本发明检测方法的试样并无特别限定。本发明例如如上所述，对于以含有具有目标突变的DNA(检测对象DNA)和不具有目标突变的DNA(非检测对象DNA)两者作为目标DNA的试样非常有用。上述DNA或RNA的来源并无特别限定，例如可以举出各种癌细胞等细胞、病毒、线粒体等。特别是，如上所述，对于白血病患者的生物试样(例如血液试样)进行突变的检测时，由于癌变的血细胞中含有具有已发生突变的DNA的细胞和具有未发生突变的DNA的细胞，因此易于发生如前所述的问题。因此，本发明的检测方法特别优选应用于具有已发生突变的DNA和未发生突变的DNA的试样，例如优选应用于白血病的生物试样，具体例子为血液试样、白细胞等。予以说明，本发明中，试样的采集方法、DNA的制备方法等并无限定，可以采用目前已知的方法。

本发明的检测目标的突变并无特别限定。如上所述，在检测与白血病有关的突变时，已知检测用探针与非检测对象序列杂交。因此，举例来说，在检测与白血病相关的基因的突变时，本发明的方法有用。作为上述与白血病相关的基因的突变例如可以举出abl基因的突变(包括bcr-abl融合基因中的abl基因的突变)。例如，可以举出在序列号1所示的abl基因的cDNA序列(mRNA序列)中，第756位碱基G、第758位碱基A、第763位碱基G的突变。这些碱基报道有例如向下述碱基的突变。予以说明，abl基因序列的NCBI登录号No.NM_005157。

突变G756C第756位碱基G突变为C

突变A758T 第758位碱基A突变为T

突变G763A 第763位碱基G突变为A

本发明中，上述检测用探针只要是与检测位点已发生突变的上述检测对象序列互补的序列即可，上述抑制用多核苷酸只要是与检测位点未发生突变的上述非检测对象序列互补的序列即可。上述探针和上述抑制用多核苷酸的长度并无特别限定，优选为相同的长度。上述检测用探针的序列与上述抑制用多核苷酸的序列例如除了在形成杂交体时与上述检测位点(发生目标突变的位点)成对的位点(碱基)之外，优选为90％～100％相同的序列，特别优选为100％相同。另外，上述检测用探针与上述抑制用多核苷酸例如只要为相同的链，则可以设计成与DNA正义链和反义链的任一个杂交。

以下，举出检测abl基因的上述3种突变(G756C、A758T、G763A)所使用的检测用探针和抑制用多核苷酸的组合。予以说明，各序列中，以大写表示的碱基分别对应于abl基因第756位、第758位、第763位碱基。本发明并非局限于这些。

突变G756C(正链的检测用)

检测用探针序列号2

5’-ccgtaGtggcccccgc-3’

抑制用多核苷酸序列号3

5’-ccgtaCtggcccccgc-3’

突变A758T(正链检测用)

检测用探针序列号4

5’-ccgAactggcccccgc-3’

抑制用多核苷酸序列号5

5’-cctccccgTactggcccccg-3’

抑制用多核苷酸序列号6

5’-ccgTactggcccccgc-3’

突变G763A(反链检测用)

检测用探针序列号7

5’-ccagtacgggAaggtgt-3’

抑制用多核苷酸序列号8

5’-ccagtacgggGaggtgt-3’

本发明中，上述抑制用多核苷酸的添加比例并无特别限定，例如可以根据上述检测用探针的长度、检测对象序列的GC含量等检测体系的条件适当决定。抑制用多核苷的相对于上述检测用探针的添加比例并无特别限定，以摩尔比计下限例如为0.1倍以上、优选为1倍以上、更优选为2倍以上。另外，以摩尔比计上限例如为100倍以下。上述抑制用多核苷酸的长度并无特别限定，例如为5～50mer、优选为10～30mer、优选设定为与上述检测用探针相同的长度。

本发明中，与上述检测对象序列互补的检测用探针的添加比例并无特别限定，例如为了能够充分地确保检测信号，优选相对于上述试样中的DNA以摩尔比计为1倍以下。在添加上述抑制用多核苷酸的基础上，还可以期待通过控制上述检测用探针的添加比例进一步提高检测灵敏度。另外，由于仅设定上述检测用探针的添加比例就足够，因此操作极为简单。上述检测用探针的添加比例更优选相对于上述DNA以摩尔比计为0.1倍以下。此时，试样中的DNA例如可以是检测对象DNA和非检测对象DNA的合计，还可以是含有检测对象序列的扩增产物和含有非检测对象序列的扩增产物的合计。予以说明，试样的DNA中的检测对象DNA的比例通常不清楚，但结果上优选上述检测用探针的添加比例例如相对于检测对象DNA(或者含有检测对象的扩增产物)以摩尔比计为10倍以下、更优选为5倍以下、进一步优选为3倍以下。另外，其下限也无特别限定，例如相对于上述检测对象DNA等，以摩尔比计优选为0.001倍以上、更优选为0.01倍以上、进一步优选为0.1倍以上。

予以说明，检测用探针相对于上述DNA的添加比例例如可以是相对于双链DNA的摩尔比，还可以是相对于单链DNA的摩尔比。另外，上述检测用探针的长度并无特别限定，例如为5～50mer、优选为10～30mer。

说明Tm值。持续加热含有双链DNA的溶液时，260nm的吸光度上升。这是由于双链DNA的双链间的氢键通过加热而解开、解离成单链DNA(DNA的融解)。而且，当所有双链DNA解离、成为单链DNA时，其吸光度显示为开始加热时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断融解完成。根据该现象，融解温度Tm一般定义为吸光度到达吸光度总上升量的50％时的温度。

本发明中，对用来确定Tm值的、随着温度上升的信号改变的测定，例如由上述原理出发，通过测定260nm的吸光度来进行。更优选使用用标记物标记的探针作为上述检测用探针，进行信号改变的测定。上述检测用探针的标记位点并无特别限定。另外，标记物也无特别限定，但通常可以结合于核苷酸的磷酸基上。

上述标记探针例如可以举出单独时显示信号且通过杂交不显示信号的标记探针，或者单独时不显示信号且通过杂交显示信号的标记探针。为前者的探针时，在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，通过加热而探针游离则显示信号。另外，为后者的探针时，通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)显示信号，通过加热而探针游离则信号减弱(消失)。因此，例如通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测该标记物所产生的信号，可以与上述260nm的吸光度测定同样地进行融解及Tm值的确定。

上述标记物并无限定，例如可以举出荧光染料(荧光团)。上述标记探针的具体例子优选例如经荧光染料标记、单独时显示荧光且通过杂交荧光减弱(例如淬灭)的探针。利用这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针被称作荧光淬灭探针。其中，检测用探针优选寡核苷酸的3’末端或5’末端用荧光染料标记，被标记的上述末端的碱基优选为C。此时，优选如下设计上述检测用探针的碱基序列：在检测用探针所杂交的检测对象DNA中，与上述检测用探针的末端碱基C成对的碱基或距离上述成对碱基1～3个碱基的碱基为G。这种探针一般称作鸟嘌呤淬灭探针，已知有所谓的QProbe(注册商标)。当这种鸟嘌呤淬灭探针与检测对象DNA杂交时，通过被荧光染料标记的末端的C接近上述检测对象DNA的G，显示上述荧光染料的发光变弱(荧光强度减弱)的现象。

上述荧光染料并无特别限定，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。市售的荧光染料例如可以举出BODIPY FL(商标名、Molecular Probes公司制)、FluorePrime(商品名、Amersham Pharmacia公司制)、Fluoredite(商品名、Millipore社制)、FAM(ABI社制)、Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia公司制)、TARMA(Molecular Probes公司制)等。检测条件并无特别限定，可以根据所用的荧光染料适当决定。举例来说，Pacific Blue例如可以在检测波长450～480nm下检测、TAMRA例如可以在检测波长585～700nm下检测、BODIPY FL例如可以在检测波长515～555nm下检测。使用这种探针时，可以通过信号改变容易地确认杂交和解离。另外，上述抑制用多核苷酸优选未被标记。

接着，以abl基因(序列号1)的第758位碱基A的点突变(A→T)为例，说明本发明的检测方法。予以说明，本发明的特征在于添加抑制用多核苷酸，对于其它工序和条件并无任何限定。另外，检测用探针所杂交的检测对象序列例如可以是序列号1的碱基序列中第758位碱基A突变成T的全长序列，但只要含有作为检测位点的第758位碱基(A→T)，则优选为部分序列。

首先，从全血中分离基因组DNA。从全血分离基因组DNA可以通过目前已知的方法进行，例如可以使用市售的基因组DNA分离试剂盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purificationkit；GE Healthcare BioScience公司制)等。

接着，向含有所分离的基因组DNA的试样中添加检测用探针和抑制用多核苷酸。添加上述检测用探针和抑制用多核苷酸时，如后所述并无任何限定，在本实施方式中，作为一例可以举出在添加检测用探针后添加抑制用多核苷酸的方法。

即，向含有所分离的基因组DNA的试样中首先添加检测用探针。上述检测用探针例如可以举出前面所述的探针，其中优选QProbe。该QProbe如上所述，通常末端碱基为胞嘧啶、用荧光染料标记上述末端的探针。而且，通过其与检测对象序列杂交，上述荧光染料和检测对象序列的鸟嘌呤相互作用，结果荧光减弱(或淬灭)。

上述检测用探针的序列如上所述，只要与含有点突变的检测对象序列互补即可，可以根据上述检测对象序列适当设计。当检测abl基因(序列号1)的第758位碱基A的点突变(A→T)时，例如可以举出包含上述序列号4的碱基序列的多核苷酸等。

突变A758T的检测用探针序列号4

5’-ccgaActggcccccgc-3’(GC含量81.3％)

以上述试样中的DNA或RNA为模板进行基因扩增法时，上述检测用探针的添加的时机并无特别限定。上述检测用探针例如可以在后述的基因扩增处理后，向所得扩增产物中添加，但优选在基因扩增处理之前添加。如此在基因扩增处理前添加上述检测用探针时，例如为了预防探针本身的延伸，可以在其3’末端进一步附加磷酸基，还可以用上述荧光染料标记3’末端。

上述检测用探针例如可以添加于含有所分离的基因组DNA的液体试样中，还可以在溶剂中与基因组DNA混合。上述溶剂并无特别限定，例如可以举出Tris-HCl等缓冲液，含有KCl、MgCl₂、MgSO₄、甘油等的溶剂，PCR反应液等目前已知的溶剂。

接着，以所分离的基因组DNA为模板，利用基因扩增法进行目标序列的扩增。具体地说，对含有产生检测目标的点突变的碱基位点的序列即检测对象序列、和非检测对象序列进行扩增。

基因扩增法并无限定，例如可以举出PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)、NASBA(依赖核酸序列的扩增，Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(转录介导的扩增，Transcription-mediated amplification)法、SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification)法等，优选PCR法。予以说明，下面以PCR法为例说明本发明，但本发明并非局限于此。PCR的条件并无特别限定，可以通过目前已知的方法进行。

PCR的引物序列例如只要是能够扩增目标检测对象序列即可，可以根据目标序列、利用目前已知的方法适当设计。所扩增的区域例如可以仅为目标检测序列，还可以是含有上述检测对象序列的区域。引物的长度并无特别限定，可以设定为一般的长度，例如10～30mer。如上所述，当检测abl基因(序列号1)的第758位碱基A的点突变(A→T)时，举例来说，可以使用包含下述多核苷酸的引物。这些引物的组合并无特别限定。予以说明，当将包含序列号9的碱基序列的多核苷酸(正向引物)和包含序列号10的碱基序列的多核苷酸(反向引物)组合时，所得扩增产物的长度为103mer左右。

(引物对1)

正向引物序列号9

5’-ggagatggaacgcacggac-3’(GC含量63.2％)

反向引物序列号10

5’-ggccaccgtcaggctg-3’(GC含量75％)

(引物对2)

正向引物序列号11

5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’

反向引物序列号12

5’-cacggccaccgtcagg-3’

接着，在后述的杂交工序之前，向含有上述扩增产物的试样中添加上述抑制用多核苷酸。上述抑制用多核苷酸的添加比例如上所述。如上所述，添加的时机并非局限于此，例如可以在上述检测用探针添加之前、之后或与添加上述检测探针同时进行。另外，上述抑制用多核苷酸的添加例如可以是上述基因扩增处理之前、之后的任一种，例如为了处理简单，优选在基因扩增处理之前预先添加。这样在基因扩增处理前添加上述抑制用多核苷酸时，例如为了防止抑制用多核苷酸本身延伸，可以在其3’末端进一步附加磷酸基。

如上所述，检测abl基因(序列号1)的第758位碱基A的点突变(A→T)时，作为抑制用多核苷酸例如可以举出不含点突变的、包含序列号5的碱基序列的多核苷酸等。该抑制用多核苷酸优选与包含上述序列号4的碱基序列的检测用探针组合使用。

突变A758T的抑制用多核苷酸序列号5

5’-cctccccgTactggcccccg-3’(GC含量80％)

接着，进行所得扩增产物的解离以及使通过解离获得的单链DNA与上述检测用探针及抑制用多核苷酸杂交。

上述解离工序的加热温度只要是上述扩增产物能够解离的温度则无特别限定，例如为85℃以上、优选为85℃～95℃。加热时间也无特别限定，例如为1秒～10分钟、优选为1秒～5分钟。

另外，解离的单链DNA和上述检测用探针的杂交以及上述单链DNA和上述抑制用多核苷酸的杂交例如可以在上述解离工序后，通过降低上述解离工序的加热温度而进行。温度条件例如为40℃以下。

杂交工序的反应液中各组分的体积、浓度并无特别限定，举例来说，在上述反应液中，DNA浓度例如为0.01～1μM、优选为0.1～0.5μM，上述检测用探针的浓度优选为例如满足上述检测用探针对DNA的添加比例的范围，例如为0.001～10μM、优选为0.001～1μM，上述抑制用多核苷酸的浓度例如为0.1nM～1mM、优选为0.1nM～100μM。

本发明中，如上所述，抑制用多核苷酸的添加很重要，例如检测对象DNA、检测用探针、抑制用多核苷酸在反应液中的浓度等并无特别限定。举例来说，在后述的信号检测中，例如所用装置的检测灵敏度相对越高则越可以降低反应液中检测对象DNA的浓度，所用装置的检测灵敏度相对越低则越应增加反应液中的检测对象DNA的浓度。举例来说，在后述的信号检测中，使用市售装置(商品名Smart Cycler；Cepheid公司制)时，例如优选反应液中检测对象DNA浓度为5～1000nM、上述检测用探针浓度为50～1000nM、上述抑制用多核苷酸浓度为5nM～100μM，更优选检测对象DNA浓度为10～500nM、上述检测用探针浓度为100～500nM、上述抑制用多核苷酸浓度为10nM～50μM。

而且，对所形成的、上述单链DNA与上述标记探针或抑制用多核苷酸的杂交形成体进行加热，测定伴随温度上升的信号改变。例如，使用Q-Probe时，在与单链DNA杂交的状态下荧光减弱(或淬灭)，在解离的状态下发出荧光。因此，例如可以慢慢加热荧光减弱(或淬灭)了的杂交形成体，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。

测定信号改变时的温度范围并无特别限定。开始温度例如为室温(例如10℃)～85℃、优选为25～70℃，终止温度例如为40～105℃。另外，温度的上升速率并无特别限定，例如为0.1～20℃/秒、优选为0.3～5℃/秒。

接着，分析上述信号改变，确定Tm值。具体地说，可以由所得荧光强度计算各温度下的值(-d荧光强度增加量/dt)，将显示最低值的温度作为Tm值。另外，还可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点作为Tm值。予以说明，不使用淬灭探针、而是使用单独时不显示信号且通过杂交显示信号的探针作为检测用探针时，相反地测定荧光强度的减弱量即可。

上述Tm值例如可以用目前已知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等计算，或者还可以用邻接法(Nearest Neighbor Method)确定。

另外，本发明中，例如还可以测定杂交时的信号改变来代替如上所述的加热杂交形成体并测定伴随温度上升的信号改变的方法。即，还可以在降低添加有上述探针的试样温度以形成杂交形成体时，测定伴随上述温度降低的信号改变。

以下示出具体例子。使用单独时显示信号且通过杂交不显示信号的标记探针(例如Q-Probe)作为检测用探针时，在将上述检测用探针添加于试样中时，上述探针为解离状态，因此发出荧光，但通过降低温度而形成杂交体时，上述荧光减弱(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低上述试样的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的减弱。另外，使用单独时不显示信号且通过杂交显示信号的标记探针作为检测用探针时，在将上述探针添加于试样中时，由于上述探针为解离状态，因此不会发出荧光，但通过降低温度而形成杂交体时，则发出荧光。因此，例如可以慢慢降低上述试样的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的增加。

接着，本发明的检测用探针试剂盒，如上所述，其特征在于，其为用于本发明的突变检测方法的试剂盒，含有包含与检测对象序列互补的多核苷酸的检测用探针和、与非检测对象序列互补的抑制用多核苷酸。本发明中，上述检测对象序列如上所述为检测位点已发生突变的检测对象DNA或其部分序列，为含有已发生突变的上述检测位点的序列。另外，上述非检测对象序列如上所述为上述检测位点未发生突变的上述非检测对象DNA或其部分序列，为含有未发生突变的上述检测位点的序列。本发明的检测用探针试剂盒只要含有上述探针和上述抑制用多核苷酸即可，其它成分并无限定。

上述探针和上述抑制用多核苷酸并无限定，可以使用与上述同样的物质，优选组合也如上所述。

本发明的检测用探针试剂盒中，上述探针和上述抑制用多核苷酸可以混合成一个试剂，也可以独立作为个别试剂。为前者时，优选上述探针和上述抑制用多核苷酸以上述那样的比例混合。为后者时，例如可以按照反应液中的比例为上述那样的范围而使用。另外，本发明的检测用探针试剂盒还可以具有用于将包含与上述探针互补的序列的区域扩增的引物。

另外，本发明的数据分析方法，其特征在于，其为用于确定DNA有无突变的数据分析方法，具有下述(a)～(b)工序。

(a)对本发明的突变检测方法的(C)工序所获得的信号改变进行分析，演算Tm值的工序

(b)由上述演算工序演算出的上述Tm值确定DNA有无突变的工序

本发明的系统，其特征在于，其为用于检测试样中DNA有无突变的系统，具有以下单元：输入本发明的突变检测方法的(C)工序中获得的信号改变的输入单元、由上述输入单元输入的上述信号改变演算Tm值的演算单元、以及根据上述演算单元演算出的Tm值确定DNA有无突变的确定单元。本发明的系统例如可以举出通过计算机系统构建的检测装置。上述系统的硬件结构并无限定，例如在作为控制部的CPU上连接存储装置、键盘或鼠标等输入装置，进而，还可以连接结果的输出装置、显示输入数据或结果的显示装置(显示器)等。另外，各单元例如可以为通过计算机的CPU执行规定程序而实现的功能模块。因此，各构成单元例如可以不安装成硬盘形式，还可以是网络系统。

另外，本发明的系统例如可以具有用于执行本发明的突变检测方法的(B)工序、(C)工序的单元。用于执行上述工序的单元例如可以举出温度控制单元、信号的检测单元。通过上述温度控制单元的执行，例如可以进行：通过杂交形成双链DNA(杂交形成体)、杂交形成体的解离。另外，通过上述信号检测单元的执行，例如可以检测随着温度变化形成杂交形成体所产生的信号改变量、杂交形成体解离所产生的信号改变量。此时，例如除了上述输入单元，还可以具有记录单元，其记录通过上述信号检测单元检测的信号改变。而且，本发明的系统还可以具有输出单元，其输出由上述确定单元所确定的DNA有无突变。

本发明的程序为可以在计算机上执行本发明的数据分析方法的计算机程序。

另外，本发明的电子介质为保存有本发明的计算机程序的计算机可读取的电子介质(也成为“记录介质”)。

接着，一并说明本发明的实施例和比较例。但本发明并非局限于下述实施例和比较例。

[实施例1]

abl基因第758位碱基的点突变(A→T)

(1)添加抑制用多核苷酸，对abl基因第758位碱基的点突变(A→T)进行Tm分析。

制备abl基因第758位碱基没有突变的白细胞细胞株的基因组DNA(序列号1)和abl基因第758位碱基具有突变的白细胞细胞株的基因组DNA(序列号1中第758位碱基为T：abl酪氨酸激酶A758T(＝Y253F))。以下，将没有突变的前者称作“wtDNA”、具有突变的后者称作“mtDNA”。然后，将两者制备成规定比例(mtDNA:wtDNA＝100:0、50:50、10:90、5:95、3:97、0:100)，将10⁴copy/test(1μL)添加于下述PCR反应液50μL中，进行PCR反应。上述PCR反应液中，抑制用多核苷酸的终浓度为200nM、检测用探针的终浓度为50nM。上述PCR反应利用热循环仪在95℃下处理60秒钟后、以95℃下10秒钟和60℃下30秒钟为一个循环反复进行50个循环，进而在95℃下处理1秒钟、40℃下处理60秒钟。然后使温度的上升速率为1℃/3秒，将上述PCR反应液从40℃加热至95℃，测定实时的荧光强度的变化。测定波长为585～700nm。予以说明，检测用探针的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.1倍，抑制用多核苷酸的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.4倍和相对于上述探针以摩尔比计为4倍。予以说明，检测用探针相对于检测对象DNA(检测对象序列的扩增产物)的添加比例如下所述。将这些结果作为实施例1-1。另外，比较例1-1除了将蒸馏水2μL代替抑制用多核苷酸2μL添加于下述PCR反应液之外，同样进行荧光强度的测定。

表1

表2

^*商品名Gene Taq FP：NIPPON GENE CO.，LTD.制(以下同样)

正向引物序列号9

5’-ggagatggaacgcacggac-3’

反向引物序列号10

5’-ggccaccgtcaggctg-3’

检测用探针序列号4

5’-(TARMA)-ccgAactggcccccgc-P-3’

抑制用多核苷酸序列号5

5’-cctccccgTactggcccccg-3’

将它们的结果示于图1和图2中。两图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表，纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”(以下相同)。图1为实施例1-1的结果、图2为比较例1-1的结果。图1中，(A)为全基因组100％具有点突变的试样的结果、(B)为全基因组中5％具有点突变的试样的结果、(C)为全基因组中3％具有点突变的试样的结果、(D)为全基因组没有点突变的试样的结果。图2中，(A)为全基因组100％具有点突变的试样的结果、(B)为全基因组中50％具有点突变的试样的结果、(C)为全基因组中5％具有点突变的试样的结果、(D)为全基因组中3％具有点突变的试样的结果、(E)为全基因组没有点突变的试样的结果。

如图1的(A)和图2的(A)所示，mtDNA在69.5℃检测出信号峰，如图1的(D)和图2的(E)所示，wtDNA在61.5℃检测出信号峰。以其为标准评价各试样。结果，在未添加抑制用多核苷酸的比较例1-1中，当mtDNA为50％时，如图2的(B)所示，可检测到mtDNA的信号；但当mtDNA为少量(5％、3％)时，如图2的(C)和(D)所示，完全检测不到mtDNA的信号。与此相反，在添加抑制用多核苷酸的实施例1-1中，即便mtDNA为少量(5％、3％)，如图1的(B)和(C)所示，可检测到mtDNA的信号。即，可以说通过添加抑制用多核苷酸，由于抑制了检测用探针与没有点突变的wtDNA杂交，结果，与mtDNA结合的检测用探针的量增加，由此检测灵敏度提高。

(2)进而，改变检测用探针的添加比例，对abl基因第758位碱基的点突变(A→T)进行Tm分析。

使上述实施例1中PCR反应液的检测用探针添加量由0.5μL变成0.1μL、使蒸馏水添加量由34.375μL变成34.775μL、将上述检测用探针的终浓度设定为原来的1/5即10nM，除此之外，与上述实施例1同样进行Tm分析。将其结果作为实施例1-2，示于图3。该图中，(A)为全基因组100％具有点突变的试样的结果、(B)为全基因组中10％具有点突变的试样的结果、(C)为全基因组中5％具有点突变的试样的结果、(D)为全基因组中3％具有点突变的试样的结果。

该结果如该图所示，可以显著地检测到mtDNA的峰。例如与除了探针添加量之外在相同条件下进行分析的实施例1-1的结果相比，如图3的(C)和上述图1的(B)、图3的(D)和图1的(C)所示，通过比实施例1-1减少探针的添加量(相对于PCR扩增产物以摩尔比计为0.02倍)，wtDNA的峰进一步变小、mtDNA的峰相对增大。由此可知，通过调节探针添加量，检测灵敏度进一步提高。

(3)增加抑制用多核苷酸的添加量，对abl基因第758位碱基的点突变(A→T)进行Tm分析。

使上述实施例1中PCR反应液的抑制用多核苷酸添加量由2μL变成3μL、使蒸馏水添加量由34.375μL变成33.775μL，除此之外，与上述(2)的实施例1-2同样地进行Tm分析。上述PCR反应液的抑制用多核苷酸的终浓度为300nM、检测用探针的终浓度为10nM。将它们的结果作为实施例1-3，示于图4。该图中，(A)为全基因组100％具有点突变的试样的结果、(B)为全基因组中10％具有点突变的试样的结果、(C)为全基因组中5％具有点突变的试样的结果、(D)为全基因组中3％具有点突变的试样的结果。

该结果如该图所示，可以显著地检测到mtDNA的峰。特别是，与除了抑制用多核苷酸的添加量之外在相同条件下进行分析的实施例1-2的结果相比，如图4的(B)和上述图3的(B)、图4的(C)和图3的(C)、图4的(D)和图3的(D)所示，通过比实施例1-2增加抑制用多核苷酸的添加量(相对于上述探针以摩尔比计为30倍)，wtDNA的峰进一步变小、mtDNA的峰相对增大。由此可知，通过调节抑制用多核苷酸添加量，检测灵敏度进一步提高。

[实施例2]

abl基因第756位碱基的点突变(G→C)

添加抑制用多核苷酸，对abl基因第756位碱基的点突变(G→C)进行Tm分析。

制备插入有序列号1所示的第756位碱基G没有突变的正常abl基因序列的质粒和插入有上述第756位碱基G突变为C的突变abl基因(abl酪氨酸激酶G756C(＝Q250E))的质粒。以下，将没有突变的前者称作“wtDNA”、具有突变的后者称作“mtDNA”。然后，与上述实施例1的表1同样，将两者制备成规定比例(mtDNA:wtDNA＝0:100、3:97、100:0)，将10⁴copy/test(1μL)添加于下述PCR反应液49μL中，进行PCR反应。上述PCR反应液中的抑制用多核苷酸的终浓度为300nM、检测用探针的终浓度为50nM。上述PCR反应如下进行：利用热循环仪在95℃下处理60秒钟后、以95℃下1秒钟和58℃下30秒钟为1个循环反复进行50个循环，进而在95℃下处理1秒钟、40℃下处理60秒钟。然后使温度的上升速率为1℃/3秒，将上述PCR反应液从40℃加热至95℃，测定实时的荧光强度的变化。测定波长为585～700nm。检测用探针的添加比例相对于PCR扩增产物以摩尔比计为0.05倍，抑制用多核苷酸的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.3倍和相对于上述探针以摩尔比计为6倍。另外，比较例2除了将蒸馏水3μL代替3μL抑制用多核苷酸添加于下述PCR反应液中之外，同样进行荧光强度的测定。

表3

正向引物序列号13

5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’

反向引物序列号14

5’-cacggccaccgtcagg-3’

检测用探针序列号2

5’-(BODIPY FL)-ccgtaGtggcccccgc-P-3’

抑制用多核苷酸序列号3

5’-ccgtaCtggcccccgc-P-3’

将它们的结果示于图5中。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图5中，(A)为全部质粒均没有点突变的试样的结果、(B)为全部质粒100％具有点突变的试样的结果、(C)和(D)为全部质粒中3％具有点突变的试样的结果。上述(C)为比较例2的结果，上述(D)为实施例2的结果。

如该图的(A)所示，wtDNA在61.0℃检测出信号峰，如该图的(B)所示，mtDNA在67.0℃检测出信号峰。以其为标准，评价全部质粒中3％具有点突变的试样。结果，如该图的(C)所示，在未添加抑制用多核苷酸的比较例2中，完全检测不到mtDNA的信号。与此相反，在添加抑制用多核苷酸的实施例2中，如该图的(D)所示，即便mtDNA为少量，也可检测wtDNA和mtDNA两者的信号。

[实施例3]

abl基因第763位碱基的点突变(G→A)

添加抑制用多核苷酸，对abl基因第763位碱基的点突变(G→A)进行Tm分析。

制备插入有序列号1所示的第763位碱基G没有突变的正常abl基因序列的质粒和插入有上述第763位碱基G突变为A的突变abl基因(abl酪氨酸激酶G763A(＝E255K))的质粒。以下，将没有突变的前者称作“wtDNA”、具有突变的后者称作“mtDNA”。然后，与上述实施例1的表1同样，将两者制备成规定比例(mtDNA:wtDNA＝0:100、3:97、100:0)，将10⁴copy/test(1μL)添加于下述PCR反应液49μL中，进行PCR反应。上述PCR反应液的抑制用多核苷酸的终浓度为500nM、检测用探针的终浓度为50nM。上述PCR反应与上述实施例2同样地进行，测定实时的荧光强度的变化。测定波长为585～700nm。检测用探针的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.05倍，抑制用多核苷酸的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.5倍和相对于上述探针以摩尔比计为10倍。另外，比较例3除了将蒸馏水5μL代替5μL抑制用多核苷酸添加于下述PCR反应液中之外，同样进行荧光强度的测定。

表4

正向引物序列号15

5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’

反向引物序列号16

5’-cacggccaccgtcagg-3’

检测用探针序列号7

5’-(BODIPY FL)-ccagtacgggAaggtgt-P-3’

抑制用多核苷酸序列号8

5’-ccagtacgggGaggtgt-P-3’

将它们的结果示于图6中。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图6中，(A)为全部质粒均没有点突变的试样的结果、(B)为全部质粒100％具有点突变的试样的结果、(C)和(D)为全部质粒中3％具有点突变的试样的结果。上述(C)为比较例3的结果，上述(D)为实施例3的结果。

如该图的(A)所示，wtDNA在50.0℃检测出信号峰，如该图的(B)所示mtDNA在59.0℃检测出信号峰。以其为标准，评价全部质粒中3％具有点突变的试样。结果，如该图的(C)所示，在未添加抑制用多核苷酸的比较例3中，完全检测不到mtDNA的信号。与此相反，在添加抑制用多核苷酸的实施例3中，如该图的(D)所示，即便mtDNA为少量，也可检测wtDNA和mtDNA两者的信号。

[实施例4]

abl基因第758位碱基的点突变(A→T)

添加抑制用多核苷酸，对abl基因第758位碱基的点突变(A→T)进行Tm分析。

制备插入有序列号1所示的第758位碱基A没有突变的正常abl基因序列的质粒和插入有上述第758位碱基A突变为T的突变abl基因(abl酪氨酸激酶A758T(＝Y253F))的质粒。以下，将没有突变的前者称作“wtDNA”、具有突变的后者称作“mtDNA”。然后，与上述实施例1的表1同样，将两者制备成规定比例(mtDNA:wtDNA＝0:100、3:97、100:0)，将10⁴copy/test(1μL)添加于下述PCR反应液49μL中，进行PCR反应。上述PCR反应液中的抑制用多核苷酸的终浓度为500nM、检测用探针的终浓度为50nM。上述PCR反应与上述实施例2同样地进行，测定实时的荧光强度的变化。测定波长为585～700nm。检测用探针的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.05倍，抑制用多核苷酸的添加比例相对于上述PCR扩增产物以摩尔比计为0.5倍和相对于上述探针以摩尔比计为10倍。另外，比较例4除了将蒸馏水5μL代替5μL抑制用多核苷酸添加于下述P CR反应液之外，同样进行荧光强度的测定。

表5

正向引物序列号11

5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’

反向引物序列号12

5’-cacggccaccgtcagg-3’

检测用探针序列号4

5’-(TARMA)-ccgAactggcccccgc-P-3’

抑制用多核苷酸序列号6

5’-ccgTactggcccccgc-P-3’

将它们的结果示于图7中。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析的图表。图7中，(A)为全部质粒没有点突变的试样的结果、(B)为全部质粒100％具有点突变的试样的结果、(C)和(D)为全部质粒中3％具有点突变的试样的结果。上述(C)为比较例4的结果，上述(D)为实施例4的结果。

如该图的(A)所示，wtDNA在60.0℃检测出信号峰，该图的(B)所示，mtDNA在67.0℃检测出信号峰。以其为标准，评价全部质粒中3％具有点突变的试样，结果，如该图的(C)所示，在未添加抑制用多核苷酸的比较例4中，完全检测不到mtDNA的信号。与此相反，在添加抑制用多核苷酸的实施例4中，如该图的(D)所示，即便mtDNA为少量，也可检测wtDNA和mtDNA两者的信号。

产业实用性

如上所述，根据本发明的突变检测方法，通过添加上述这样的抑制用多核苷酸，例如即使是白血病患者的白细胞试样这样的混合存在有具有点突变的检测对象DNA和没有上述点突变的非检测对象DNA的试样，也能够以优异的灵敏度检测上述点突变。另外，由于突变的种类可以特定，因此是特异性也优异的检测方法。因而，该方法对于白血病患者的点突变检测非常有用，例如还能够在基因水平上分析白血病治疗药在不同个体间是否合适，可以说是医疗领域中极为有用的方法。

序列表

<110>爱科来株式会社(ARKRAY，Inc.)

<120>突变的检测方法及用于该方法的试剂盒

<130>TF07027-01

<150>JP2006/216194

<151>2006-08-08

<150>JP2007/040078

<151>2007-02-20

<160>16

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5381

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgttggaga tctgcctgaa gctggtgggc tgcaaatcca agaaggggct gtcctcgtcc 60

tccagctgtt atctggaaga agcccttcag cggccagtag catctgactt tgagcctcag 120

ggtctgagtg aagccgctcg ttggaactcc aaggaaaacc ttctcgctgg acccagtgaa 180

aatgacccca accttttcgt tgcactgtat gattttgtgg ccagtggaga taacactcta 240

agcataacta aaggtgaaaa gctccgggtc ttaggctata atcacaatgg ggaatggtgt 300

gaagcccaaa ccaaaaatgg ccaaggctgg gtcccaagca actacatcac gccagtcaac 360

agtctggaga aacactcctg gtaccatggg cctgtgtccc gcaatgccgc tgagtatctg 420

ctgagcagcg ggatcaatgg cagcttcttg gtgcgtgaga gtgagagcag tcctggccag 480

aggtccatct cgctgagata cgaagggagg gtgtaccatt acaggatcaa cactgcttct 540

gatggcaagc tctacgtctc ctccgagagc cgcttcaaca ccctggccga gttggttcat 600

catcattcaa cggtggccga cgggctcatc accacgctcc attatccagc cccaaagcgc 660

aacaagccca ctgtctatgg tgtgtccccc aactacgaca agtgggagat ggaacgcacg 720

gacatcacca tgaagcacaa gctgggcggg ggccagtacg gggaggtgta cgagggcgtg 780

tggaagaaat acagcctgac ggtggccgtg aagaccttga aggaggacac catggaggtg 840

gaagagttct tgaaagaagc tgcagtcatg aaagagatca aacaccctaa cctggtgcag 900

ctccttgggg tctgcacccg ggagcccccg ttctatatca tcactgagtt catgacctac 960

gggaacctcc tggactacct gagggagtgc aaccggcagg aggtgaacgc cgtggtgctg 1020

ctgtacatgg ccactcagat ctcgtcagcc atggagtacc tggagaagaa aaacttcatc 1080

cacagagatc ttgctgcccg aaactgcctg gtaggggaga accacttggt gaaggtagct 1140

gattttggcc tgagcaggtt gatgacaggg gacacctaca cagcccatgc tggagccaag 1200

ttccccatca aatggactgc acccgagagc ctggcctaca acaagttctc catcaagtcc 1260

gacgtctggg catttggagt attgctttgg gaaattgcta cctatggcat gtccccttac 1320

ccgggaattg acctgtccca ggtgtatgag ctgctagaga aggactaccg catggagcgc 1380

ccagaaggct gcccagagaa ggtctatgaa ctcatgcgag catgttggca gtggaatccc 1440

tctgaccggc cctcctttgc tgaaatccac caagcctttg aaacaatgtt ccaggaatcc 1500

agtatctcag acgaagtgga aaaggagctg gggaaacaag gcgtccgtgg ggctgtgagt 1560

accttgctgc aggccccaga gctgcccacc aagacgagga cctccaggag agctgcagag 1620

cacagagaca ccactgacgt gcctgagatg cctcactcca agggccaggg agagagcgat 1680

cctctggacc atgagcctgc cgtgtctcca ttgctccctc gaaaagagcg aggtcccccg 1740

gagggcggcc tgaatgaaga tgagcgcctt ctccccaaag acaaaaagac caacttgttc 1800

agcgccttga tcaagaagaa gaagaagaca gccccaaccc ctcccaaacg cagcagctcc 1860

ttccgggaga tggacggcca gccggagcgc agaggggccg gcgaggaaga gggccgagac 1920

atcagcaacg gggcactggc tttcaccccc ttggacacag ctgacccagc caagtcccca 1980

aagcccagca atggggctgg ggtccccaat ggagccctcc gggagtccgg gggctcaggc 2040

ttccggtctc cccacctgtg gaagaagtcc agcacgctga ccagcagccg cctagccacc 2100

ggcgaggagg agggcggtgg cagctccagc aagcgcttcc tgcgctcttg ctccgcctcc 2160

tgcgttcccc atggggccaa ggacacggag tggaggtcag tcacgctgcc tcgggacttg 2220

cagtccacgg gaagacagtt tgactcgtcc acatttggag ggcacaaaag tgagaagccg 2280

gctctgcctc ggaagagggc aggggagaac aggtctgacc aggtgacccg aggcacagta 2340

acgcctcccc ccaggctggt gaaaaagaat gaggaagctg ctgatgaggt cttcaaagac 2400

atcatggagt ccagcccggg ctccagcccg cccaacctga ctccaaaacc cctccggcgg 2460

caggtcaccg tggcccctgc ctcgggcctc ccccacaagg aagaagctgg aaagggcagt 2520

gccttaggga cccctgctgc agctgagcca gtgaccccca ccagcaaagc aggctcaggt 2580

gcaccagggg gcaccagcaa gggccccgcc gaggagtcca gagtgaggag gcacaagcac 2640

tcctctgagt cgccagggag ggacaagggg aaattgtcca ggctcaaacc tgccccgccg 2700

cccccaccag cagcctctgc agggaaggct ggaggaaagc cctcgcagag cccgagccag 2760

gaggcggccg gggaggcagt cctgggcgca aagacaaaag ccacgagtct ggttgatgct 2820

gtgaacagtg acgctgccaa gcccagccag ccgggagagg gcctcaaaaa gcccgtgctc 2880

ccggccactc caaagccaca gtccgccaag ccgtcgggga cccccatcag cccagccccc 2940

gttccctcca cgttgccatc agcatcctcg gccctggcag gggaccagcc gtcttccacc 3000

gccttcatcc ctctcatatc aacccgagtg tctcttcgga aaacccgcca gcctccagag 3060

cggatcgcca gcggcgccat caccaagggc gtggtcctgg acagcaccga ggcgctgtgc 3120

ctcgccatct ctaggaactc cgagcagatg gccagccaca gcgcagtgct ggaggccggc 3180

aaaaacctct acacgttctg cgtgagctat gtggattcca tccagcaaat gaggaacaag 3240

tttgccttcc gagaggccat caacaaactg gagaataatc tccgggagct tcagatctgc 3300

ccggcgacag caggcagtgg tccagcggcc actcaggact tcagcaagct cctcagttcg 3360

gtgaaggaaa tcagtgacat agtgcagagg tagcagcagt caggggtcag gtgtcaggcc 3420

cgtcggagct gcctgcagca catgcgggct cgcccatacc cgtgacagtg gctgacaagg 3480

gactagtgag tcagcacctt ggcccaggag ctctgcgcca ggcagagctg agggccctgt 3540

ggagtccagc tctactacct acgtttgcac cgcctgccct cccgcacctt cctcctcccc 3600

gctccgtctc tgtcctcgaa ttttatctgt ggagttcctg ctccgtggac tgcagtcggc 3660

atgccaggac ccgccagccc cgctcccacc tagtgcccca gactgagctc tccaggccag 3720

gtgggaacgg ctgatgtgga ctgtcttttt catttttttc tctctggagc ccctcctccc 3780

ccggctgggc ctccttcttc cacttctcca agaatggaag cctgaactga ggccttgtgt 3840

gtcaggccct ctgcctgcac tccctggcct tgcccgtcgt gtgctgaaga catgtttcaa 3900

gaaccgcatt tcgggaaggg catgcacggg catgcacacg gctggtcact ctgccctctg 3960

ctgctgcccg gggtggggtg cactcgccat ttcctcacgt gcaggacagc tcttgatttg 4020

ggtggaaaac agggtgctaa agccaaccag cctttgggtc ctgggcaggt gggagctgaa 4080

aaggatcgag gcatggggca tgtcctttcc atctgtccac atccccagag cccagctctt 4140

gctctcttgt gacgtgcact gtgaatcctg gcaagaaagc ttgagtctca agggtggcag 4200

gtcactgtca ctgccgacat ccctccccca gcagaatgga ggcaggggac aagggaggca 4260

gtggctagtg gggtgaacag ctggtgccaa atagccccag actgggccca ggcaggtctg 4320

caagggccca gagtgaaccg tcctttcaca catctgggtg ccctgaaagg gcccttcccc 4380

tcccccactc ctctaagaca aagtagattc ttacaaggcc ctttcctttg gaacaagaca 4440

gccttcactt ttctgagttc ttgaagcatt tcaaagccct gcctctgtgt agccgccctg 4500

agagagaata gagctgccac tgggcacctg cgcacaggtg ggaggaaagg gcctggccag 4560

tcctggtcct ggctgcactc ttgaactggg cgaatgtctt atttaattac cgtgagtgac 4620

atagcctcat gttctgtggg ggtcatcagg gagggttagg aaaaccacaa acggagcccc 4680

tgaaagcctc acgtatttca cagagcacgc ctgccatctt ctccccgagg ctgccccagg 4740

ccggagccca gatacggggg ctgtgactct gggcagggac ccggggtctc ctggaccttg 4800

acagagcagc taactccgag agcagtgggc aggtggccgc ccctgaggct tcacgccggg 4860

agaagccacc ttcccacccc ttcataccgc ctcgtgccag cagcctcgca caggccctag 4920

ctttacgctc atcacctaaa cttgtacttt atttttctga tagaaatggt ttcctctgga 4980

tcgttttatg cggttcttac agcacatcac ctctttgccc ccgacggctg tgacgcagcc 5040

ggagggaggc actagtcacc gacagcggcc ttgaagacag agcaaagcgc ccacccaggt 5100

cccccgactg cctgtctcca tgaggtactg gtcccttcct tttgttaacg tgatgtgcca 5160

ctatatttta cacgtatctc ttggtatgca tcttttatag acgctctttt ctaagtggcg 5220

tgtgcatagc gtcctgccct gccccctcgg gggcctgtgg tggctccccc tctgcttctc 5280

ggggtccagt gcattttgtt tctgtatatg attctctgtg gttttttttg aatccaaatc 5340

tgtcctctgt agtatttttt aaataaatca gtgtttacat t 5381

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>2

ccgtagtggc ccccgc 16

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多核苷酸

<400>3

ccgtactggc ccccgc 16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>4

ccgaactggc ccccgc 16

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多核苷酸

<400>5

cctccccgta ctggcccccg 20

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多核苷酸

<400>6

ccgtac tggc ccccgc 16

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>7

ccagtacggg aaggtgt 17

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多核苷酸

<400>8

ccagtacggg gaggtgt 17

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>9

ggagatggaa cgcacggac 19

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>10

ggccaccgtc aggctg 16

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>11

gacaagtggg agatggaacg c 21

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>12

cacggccacc gtcagg 16

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>13

gacaagtggg agatggaacg c 21

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>14

cacggccacc gtcagg 16

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向引物

<400>15

gacaagtggg agatggaacg c 21

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向引物

<400>16

cacggccacc gtcagg 16

Claims

1.一种检测用探针试剂盒，其特征在于，其为在同一反应体系中同时使用的试剂盒，所述检测用探针试剂盒含有包含与检测对象序列互补的多核苷酸的检测用探针、和与非检测对象序列互补且抑制所述探针与非检测对象序列杂交的多核苷酸，

所述检测对象序列为检测位点已发生突变的检测对象DNA或其部分序列，其含有已发生突变的所述检测位点，

所述非检测对象序列为所述检测位点未发生突变的所述非检测对象DNA或其部分序列，其含有未发生突变的所述检测位点，并且

所述检测用探针试剂盒在检测试样中的DNA的突变的方法中使用，所述试样为含有检测位点已发生突变的检测对象DNA和所述检测位点未发生突变的非检测对象DNA的试样，

所述方法包括下述(A)～(E)工序，

(A)向含有所述DNA的试样中，添加包含与检测对象序列互补的多核苷酸的检测用探针、和与非检测对象序列互补的多核苷酸的工序；

(B)使所述检测用探针与所述DNA杂交的工序；

(C)对于所述DNA和所述检测用探针的杂交形成体，测定伴随温度变化的信号改变的工序；

(D)分析所述信号改变、确定Tm值的工序；

(E)由所述Tm值确定所述检测对象位点有无突变的工序。

2.根据权利要求1所述的检测用探针试剂盒，其中，所述检测用探针为用标记物标记的探针。

3.根据权利要求1所述的检测用探针试剂盒，其中，与所述检测对象序列互补的检测用探针和与所述非检测对象序列互补的多核苷酸除了与所述检测位点成对的位点之外序列相同。

4.根据权利要求1所述的检测用探针试剂盒，其中，所述突变为ab1基因的突变。

5.根据权利要求1所述的检测用探针试剂盒，其中，所述突变为序列号1的碱基序列中第756位碱基G突变为C，所述检测用探针为包含序列号2的碱基序列的探针，所述与非检测对象序列互补的多核苷酸为包含序列号3的碱基序列的多核苷酸。

6.根据权利要求1所述的检测用探针试剂盒，其中，所述突变为序列号1的碱基序列中第758位碱基A突变为T，所述检测用探针为包含序列号4的碱基序列的探针，所述与非检测对象序列互补的多核苷酸为包含序列号5和序列号6中的至少一者的碱基序列的多核苷酸。

7.根据权利要求1所述的检测用探针试剂盒，其中，所述突变为序列号1的碱基序列中第763位碱基G突变为A，所述检测用探针为包含序列号7的碱基序列的探针，所述与非检测对象序列互补的多核苷酸为包含序列号8的碱基序列的多核苷酸。