CN103122374A

CN103122374A - 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒

Info

Publication number: CN103122374A
Application number: CN201210391127.1A
Authority: CN
Inventors: 黑濑熏; 小森真理子
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2013-05-29
Also published as: US20130084568A1; JP2013090622A; EP2578701A1; KR20130036146A

Abstract

本发明提供了多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。所述多态性检测用探针能够以高灵敏度、简便地检测出MDR1基因的外显子12中的C1236T突变型。解决手段是：用于检测MDR1基因的多态性的多态性检测用探针，其是选自由P1和P1’组成的组的一种荧光标记寡核苷酸。

Description

多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒

技术领域

本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。

背景技术

MDR1基因是编码P-糖蛋白的基因。P-糖蛋白在癌细胞、肝脏、小肠和脑血管内皮细胞等各种细胞中表达，与药剂的输送相关。

另外，已知，MDR1基因的外显子26的第3435位的C替换为T的突变型(C3435T突变型)、MDR1基因的外显子21的第2677位的G替换为A或T的突变型(G2677A/T突变型)以及MDR1基因的外显子12的第1236位的C替换为T的突变型(C1236T突变型)可用作为用于推测大肠癌的预后的因子(例如参见，Int.J.Colorectal.Dis.，2010年，第25卷，1167-1176页(非专利文献1))。

作为测定基因的多态性的方法，已知有下述的方法：使用被设计为扩增含有作为测定对象的碱基的部分的引物进行PCR，用可以根据该特定碱基中有无突变型来区分是否切断的限制性内切酶进行切断，之后通过电泳检测有没有被切断(PCR-RFLP法)。

另外，还已知有下述的其它方法：在用PCR法扩增含有突变型的区域之后，使经荧光染料标记的核酸探针与靶标核酸杂交，测定荧光染料发光的减少量，并基于熔解曲线分析的结果来解析碱基序列的突变型(例如，参见日本特许第3963422号公报(专利文献1))。

另外，报道称，通过使用特定的核酸探针，能够以高灵敏度、简便地检测MDR1基因的C3435T突变型的有无(例如参见日本特许第4454366号公报)。

发明内容

发明要解决的问题

非专利文献1中，使用了PCR-RFLP法作为检测MDR1基因的C3435T突变型的方法。在PCR-RFLP法中，需要在PCR反应之后提取扩增产物来进行限制性内切酶处理。因此，扩增产物有可能混入下一反应体系中，由此有时会获得假阳性、假阴性的结果。另外，由于在PCR结束之后用限制性内切酶进行处理，之后进行电泳，因此有时到检测为止所需的时间非常长。而且，由于操作复杂，因此难以自动化。

另外，非专利文献1中，使用测序解析法作为MDR1基因的G2677A/T突变型及C1236T突变型的检测方法。应用测序解析的检测方法中，进行PCR之后，必须要进行测序反应，通过测序仪进行电泳等，需要人力和成本。另外，因为必须要处理扩增产物，扩增产物有可能混入下一反应体系。

专利文献1中，通过应用核酸探针的方法来检测多态性。但是，专利文献1中，关于核酸探针的设计，仅教导了要将其设计为使得：末端被荧光染料标记的淬灭探针与靶标序列杂交的时候，在末端部分形成的核酸探针与靶标序列的杂交体的多个碱基对要形成至少一个G和C的配对。因此，在专利文献1记载的方法中，必须要使用具有特别适用于每种突变型的序列的核酸探针。

另外，根据本发明人的讨论发现，在核酸探针的序列中GC含量过高的话，淬灭探针不能完全发挥功能。

专利文献2中，记载了检测MDR1基因的外显子26中的C3435T突变型的方法，但利用专利文献2中记载的核酸探针无法检测MDR1基因的G2677A/T突变型、C12346T突变型。

鉴于这些现状，期待进一步开发用于检测MDR1基因中除C3435T突变型之外的其它碱基中的多态性的技术。

本发明要解决的问题在于提供一种能够以高灵敏度、简便地检测MDR1基因的外显子12中C1236T突变型的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法及药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。

用于解决问题的手段

本发明人发现，通过基于含有MDR1基因外显子12中C1236T突变的特定区域来设计淬灭探针，使用淬灭探针进行熔解曲线分析，能够检测C1236T突变。本发明基于所述发现而实现。

本发明如下所述。

<1>一种多态性检测用探针，其为从由下述P1和P1’组成的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测MDR1基因的多态性，

(P1)寡核苷酸，其与和含有序列编号1所示的序列中的第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补的序列有至少80％以上的同一性，与第395位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，并且该胞嘧啶被荧光染料标记，以及

(P1’)寡核苷酸，其与和含有序列编号1所示的序列中的第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补的序列的互补链在严格条件下杂交，与第395位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，并且该胞嘧啶被荧光染料标记。

<2>根据<1>所述的多态性检测用探针，其为从由下述P1-1和P1’-1组成的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸，

(P1-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号1所示的序列中的第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补的序列有至少80％以上的同一性，与第395位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶被荧光染料标记，并且该寡核苷酸识别序列编号1中第401位的多态性，以及

(P1’-1)寡核苷酸，其与和含有序列编号1所示的序列中的第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补的序列的互补链在严格条件下杂交，与第395位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶被荧光染料标记，并且该寡核苷酸识别序列编号1中第401位的多态性。

<3>根据<1>或<2>所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中的任一位置具有经荧光染料标记的与第395位的碱基对应的碱基。

<4>根据<1>～<3>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的与第395位的碱基对应的碱基。

<5>根据<1>～<4>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与靶标序列杂交时的荧光强度比未杂交时的荧光强度减少或增加。

<6>根据<5>所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与靶标序列杂交时的荧光强度比未杂交时的荧光强度减少。

<7>根据<1>～<6>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸的碱基长为7～28。

<8>根据<1>～<7>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸的碱基长为7～18。

<9>根据<1>～<8>中任一项所述的多态性检测用探针，其中所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。

<10>一种多态性检测方法，其通过使用<1>～<9>中任一项所述的探针来检测MDR1基因的多态性。

<11>根据<10>所述的多态性检测方法，包括：

(I)使<1>～<9>中任一项所述的探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；

(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动；

(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值；以及

(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的MDR1基因的多态性的存在。

<12>根据<11>所述的多态性检测方法，还包括：在所述(I)的获得杂交体之前或者与所述(I)的获得杂交体同时扩增核酸。

<13>根据<10>～<12>中任一项所述的多态性检测方法，还包括：在同一个体系中对与序列编号15所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性和与序列编号16所示的碱基序列中的第300位的碱基对应的多态性中的至少一种多态性进行检测。

<14>根据<10>～<13>中任一项所述的多态性检测方法，包括：在同一个体系中，检测与序列编号1所示的碱基序列中的第401位的碱基对应的多态性、与序列编号15所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性、和与序列编号16所示的碱基序列中第300位的碱基对应的多态性。

<15>一种药剂的药效评价方法，包括：通过<10>～<14>中任一项所述的多态性检测方法来检测MDR1基因中的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。

<16>一种多态性检测用试剂盒，用于检测MDR1基因中的多态性，所述多态性检测用试剂盒包含<1>～<9>中任一项所述的探针。

<17>根据<16>所述的多态性检测用试剂盒，还包含：能够扩增含有与所述探针杂交的区域的碱基序列的引物。

<18>根据<16>或<17>所述的多态性检测用试剂盒，还包含：用于检测与序列编号1所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性的多态性检测用探针和用于检测与序列编号16所示的碱基序列中的第300位的碱基对应的多态性的多态性检测用探针。

发明效果

通过本发明，能够提供可以高灵敏度、简便地检测MDR1基因的外显子12中C1236T突变的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法和药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。

附图说明

图1的(A)是核酸混合物的熔解曲线的一个例子，(B)是微分熔解曲线的一个例子；

图2是本发明的实施例1涉及的试样的微分熔解曲线；

图3的(A)～(F)是本发明的实施例2涉及的试样的微分熔解曲线；

图4是本发明的比较例1涉及的试样的微分熔解曲线。

具体实施方式

本发明涉及的MDR1基因的多态性检测用探针(以下，有时仅称“多态性检测用探针”)为如下的多态性检测用探针，其为从由下述P1和P1’组成的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测MDR1基因的多态性：

本发明涉及的MDR1基因的多态性检测方法包括：使用至少一种用于检测所述MDR1基因的多态性的多态性检测用探针来检测MDR1基因的多态性。

本发明涉及的药剂的药效判定方法包括：通过所述MDR1基因多态性检测方法检测MDR1基因的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来判定针对药剂的耐受性或药剂的药效。

本发明涉及的多态性检测用试剂盒包含用于检测MDR1基因的多态性的多态性检测用探针。

本发明中的“MDR1基因”已经是公知的，其碱基序列相当于GeneID：5243、NCBI的登录号No.NG_011513的第4926位碱基～第214386 位碱基的序列。另外，本说明书中，没有特别说明的情况下，“MDR1基因”表示与序列编号1所示的MDR1基因的外显子12相当的碱基序列。

序列编号1的碱基序列是NCBI的dbSNP的登录号No.rs1128503的1～801的序列。

在本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或者引物的每个的序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时，由该互补的序列识别的序列，在本领域技术人员的技术常识的范围内，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。

在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。即，当加热含有双链核酸、例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，当全部双链DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。

在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数第1～3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。同样地，当称为“从5’末端起数第1～3位”时是以寡核苷酸链的5’末端为第1位起数的。

在本说明书中，“步骤”一词不仅包含独立的步骤，即使在不能与其他的步骤明确区别的情况下只要达到了本步骤预期的效果，则也包含在本术语之内。

另外，在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示将“～”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值包含的范围。

另外，在本发明中，组成物中的各成分的量在组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下只要不特别指出就是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量。

本说明书中，突变表示由于野生型的碱基序列的一部分碱基被替换、缺失、重复或插入而产生的新的碱基序列。另外，多态性表示通过突变产生的碱基序列的多态性。

下面说明本发明。

<MDR1基因多态性检测用探针>

本发明的MDR1基因的多态性检测用探针(以下，有时仅称为“多态性检测用探针”)为如下的多态性检测用探针，其为从由下述P1和P1’组成的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测MDR1基因的多态性：

本发明的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸是能够检测序列编号1所示的碱基序列的第401位的碱基中的多态性的探针。

在MDR1基因的野生型中，与序列编号1所示的序列中的第401位对应的碱基为C(胞嘧啶)，但在突变型中突变成T(胸腺嘧啶)(以下，也称为“C1236T突变”)，该碱基相当于MDR1基因的第87133179位～第87342639位的碱基中的第87296217位的碱基。

本发明的所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸是与含有序列编号1中第395位～第401位的碱基的碱基序列互补的碱基序列。

具体地，本发明中确认了同源性的荧光标记寡核苷酸相对于与含有序列编号1所示的碱基序列中第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补的序列具有至少80％以上的同一性。并且，与第395位的碱基对应的碱基需要是胞嘧啶。

另外，从检测灵敏度的观点来说，相对于与含有序列编号1所示的碱基序列中第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补的序列，也可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。

在对本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸和除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列编号1同一的碱基的碱基序列进行比较时的同一性低于80％的情况下，针对含有突变型的MDR1基因的试样核酸的检测灵敏度变低。

本发明中的所述P1’荧光标记寡核苷酸在严格条件下与下述序列的互补链杂交，所述序列与含有序列编号1所示的碱基序列中的第395位～第401位的碱基的碱基长为7～38的碱基序列互补。并且，与第395位的碱基对应的碱基需要是胞嘧啶。

杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如MolecularCloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。

严格条件是指形成特异性的杂交体但不形成非特异性的杂交体的条件。典型的严格条件例如可以举出在钾浓度约25mM～约50mM以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl2下进行杂交的条件，但是不限于此。此外，严格条件被记载在MolecularCloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择这样的条件。

另外，作为本发明的所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸，在所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸也包括在本发明中荧光标记寡核苷酸内。

该插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述P1 和P1’的荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可，在插入、缺失或取代了碱基的情况下，其插入、缺失或取代的位置无特别限定。作为插入、缺失或取代的碱基的数量，可以举出1个碱基或2个碱基以上，该数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以举出1个碱基～10个碱基，优选地1个碱基～5个碱基。

所述荧光标记寡核苷酸中，除了寡核苷酸之外还可含有经修饰的寡核苷酸作为寡核苷酸。

作为所述寡核苷酸的构成单位，可以举出核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、人工核酸等。作为所述人工核酸，可以举出DNA、RNA、作为RNA类似物的LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)、作为肽核酸的PNA(Peptide Nucleid Acid)；作为桥联核酸的BNA(Bridged Nucleic Acid)等。

所述寡核苷酸可以是由所述构成单位中的一种构成的，也可以是其中的多种构成的。

本发明的所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸的长度需要是7mer～38mer。在所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸的长度为不到7mer或者超过38mer的情况下，MDR1基因多态性的检测灵敏度降低，不优选。

另外，本发明的所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸的长度可以为7mer～28mer，也可以是7mer～18mer。通过设成7mer～28mer的范围，例如具有检测灵敏度进一步变高等的倾向。

通过改变所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸的碱基长，例如能够将荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调整至期望的值。

以下将本发明的所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸中的碱基序列的示例示于表1，但是本发明不限于此。

此外，在表1中，将与序列编号1的第401位的碱基对应的碱基用大写字母表示。并且一并示出了与序列编号1的第401位对应的碱基为T或C时的试样核酸与各个P1荧光标记寡核苷酸的杂交体的Tm值。这里Tm值是使用Meltcalc 99 free(http://www.meltcalc.com/)在设定条件： Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件下计算的。

表1

在本发明中，和与序列编号1的第401位对应的碱基是T的所述试样核酸杂交的情况下的Tm值、和与序列编号1的第401位对应的碱基是C的所述试样核酸杂交的情况下的Tm值之差，例如可以是1.5℃以上、2.0℃以上、5℃以上、9℃以上。通过所述Tm值之差为1.5℃以上，例如能够更高灵敏度地检测序列编号1中的第401位的碱基的突变型。

作为增大所述Tm值之差的方法，例如可举出下述方法：使探针在与该探针杂交的区域对应的碱基序列含有错配的碱基。具体而言，可举出Nature Biotech(1997)vol 15p.331-335等所述的方法。

另外，本发明的所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸的第395位的碱基(胞嘧啶)需要用荧光染料标记。

在所述P1和P1’的荧光标记寡核苷酸中，该荧光标记了的第395位的碱基能够存在于从3’末端起数第1位～第3位的任何位置。另外，能够存在于3’末端。由此，例如多态性检测灵敏度进一步提高。另外，能够生产性良好地获得P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸。

本发明的所述荧光标记寡核苷酸可以是其与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以是与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。

利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓Q Probe(注册商标)。其中可以举出如下的寡核苷酸：寡核苷酸被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并用荧光染料标记该末端的C使其靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。

若使用这样的探针，则能够根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。

此外，除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。

作为所述荧光染料无特别限制，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。作为这些荧光染料的市售产品例如有PacificBlue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。

所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在检测波长445～480nm下检测，TAMRA能够在检测波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在检测波长520～555nm下检测。

如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。

另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使其共存于扩增反应的反应液中。

另外，通过在3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光染料)，也能够得到同样的效果。

所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸能够用作检测MDR1基因的多态性、尤其检测MDR1基因的C1236T突变型的MDR1基因多态性检测用探针。

另外，MDR1基因多态性检测用探针能够用作熔解曲线分析用的探针。

此外，本发明涉及的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸除了在序列编号1所示的碱基序列中与第395位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，并且与第395位的碱基对应的碱基使用通过荧光染料标记了的碱基之外，能够按照被已知为寡核苷酸的合成方法的公知方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等记载的方法来制备。

作为所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸的更优选的形式，可举出下述P1-1和P1’-1荧光标记寡核苷酸。

另外，“识别序列编号1中第401位的多态性”和“与表示序列编号1中第401位的多态性的碱基结合”是同义的。

<引物>

在后述的MDR1基因多态性检测方法中，当通过PCR法扩增含有作为检测对象的MDR1基因多态性的序列时，使用引物。

可以在本发明中使用的引物只要能够扩增含有与作为目标的检测对象的MDR1基因的多态性的位点、即序列编号1所示的序列中的第401位的碱基对应的碱基的核酸，则无特别限制。

应用于PCR法中的引物只要能够扩增含有与本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列则无特别限制，本领域技术人员能够基于序列编号1～序列编号6所示的碱基序列来适当设计。引物的长度和Tm值例如可以设为12～40mer和40℃～70℃，或者16～30mer和55℃～60℃。

另外，引物对的各引物的长度例如也可以不相同，但可以举出两个引物的Tm值能够设定为大致相同(或者两个引物的Tm值之差为5℃以内)。

下面示出能够在本发明的多态性检测方法中用来扩增含有与本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物的示例。此外，这些仅是例示而已，并不限制本发明。

表2

引物	序列(5′→3′)	长度(mer)	序列编号
				MDR1(1236)F	ccttgaagtttttttctcactcgtcctg	28	7
MDR1(1236)R	gtctgcccactctgcaccttc	21	8

扩增包含本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的时候，从灵敏度和效率的观点出发，可以将表2所示的各寡核苷酸作为一对引物组使用。

多态性的检测方法只要是将所述荧光标记核苷酸用作探针的方法则无特别限制。作为将所述荧光标记核苷酸用作探针的多态性检测方法的示例，下面对利用了Tm分析的多态性检测方法进行说明。

<多态性检测方法>

本发明涉及的MDR1基因多态性检测方法是包括使用至少一种所述MDR1基因多态性检测用探针来检测MDR1基因的多态性的MDR1基因多态性检测方法。

通过本发明涉及的多态性检测方法，能够通过包括至少一种所述多态性检测用探针来简便且灵敏度良好地检测MDR1基因的多态性。

另外，本发明的多态性检测方法是一种MDR1基因的多态性的检测方法，能够包括下述步骤(I)～(IV)，也可以包括下述工程(V)。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针，其他的构成和条件不限于下面的记载。

(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体。

(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动。

(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值。

(IV)基于所述Tm值来检测MDR1基因中的多态性的存在。

(V)基于所述多态性的存在，检测所述试样中的单链核酸中具有多态性的单链核酸的丰度比。

另外，在本发明中，除了所述步骤(I)～(IV)或所述步骤(I)～(V)之外，还可以包括：在步骤(I)的获得杂交体之前或者与步骤(I)的获得杂交体的同时扩增核酸。

此外，在所述(III)中测定Tm值时，也可以包括：不仅测定杂交体的解离温度，还测定在杂交体熔解时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。

在本发明中，所述试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。在所述核酸为双链核酸的情况下，例如可举出包括在与所述荧光标记寡核苷酸杂交之前，通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核酸。通过将双链核酸解离成单链核酸，可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂交。

在本发明中，作为检测对象的试样中包含的核酸，例如可以是生物试样中本来含有的核酸，但是从能够提高检测精度的角度，可以举出以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过PCR等扩增法扩增含有MDR1基因的突变了的位点的区域而得到的扩增产物。所述扩增产物的长度无特别限制，例如可以设为50～1000mer或者80～200mer。另外，试样中的核酸例如可以是从源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(逆转录PCR，Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。

在本发明中，本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA，例如可以为1倍以下。另外，从充分确保检测信号的观点来说，可以将本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以下。

这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样中的核酸中的所述检测对象核酸的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)可以设为10倍以下。另外，相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)可以设为5倍以下或3倍以下。另外，其下限无特别限制，例如可以设为0.001倍以上，0.01倍以上或0.1倍以上。

本发明的多态性检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。

在本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定可以基于前述那样的原理，通过260nm的吸光度测定来进行，可以测定如下信号：所述信号是基于所述多态性检测用探针上添加的标记的信号的信号，并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体形成的状态而变动。因此，能够使用荧光标记寡核苷酸来作为所述多态性检测用探针。作为所述荧光标记寡核苷酸，例如可以举出与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸，或者与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。

如果是前者那样的探针，则在该探针和检测对象序列形成了杂交体(双链DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热而探针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。

另外，如果是后者的探针，则通过与检测对象序列形成杂交体(双链 DNA)而显示荧光信号，通过加热而探针解离时荧光信号减少(消失)。因此，通过在所述荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地进行熔解的发生以及Tm值的确定。

接着，关于本发明的多态性检测方法，举出检测基于荧光染料的信号的变化的方法的具体例来进行说明。此外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针本身，其他的步骤和条件没有任何限制。

作为含有进行核酸扩增时的模板核酸的试样，只要是含有核酸尤其是MDR1基因即可，无特别限制。例如大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。

例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。

接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针。

所述多态性检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特别限制，例如可以是Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl₂、MgSO₄、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。

所述多态性检测用探针的添加时机无特别限制，例如在进行后述的PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物中，也可以在扩增处理前添加。

如此，在利用PCR等进行扩增处理前添加所述检测用探针的情况下，例如，如前所述，可以在所述检测用探针的3’末端添加荧光染料，或者添加磷酸基。

作为核酸扩增的方法，例如可以举出利用聚合酶的方法等。作为其示例，可以举出PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过利用聚合酶的方法进行扩增的情况下，能够在本发明探针存在的情况下进行扩增。根据使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等对本领域技术人员来说是容易的。由此，在核酸扩增后仅通过分析探针的Tm值就能够评价多态性的有无，因此在反应结束之后不需要处理扩增产物。由此，不用担心所述扩增产物带来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器，容易自动化。

另外，作为用于PCR法的DNA聚合酶，可以使用通常所用的DNA聚合酶，无特别限制。例如可以为GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。

作为聚合酶的使用量，只要是采用通常使用的浓度即可，无特别限制。例如在使用Taq聚合酶的情况下，例如相对于反应溶液量50μl，可以为0.01U～100U的浓度。由此，具有MDR1基因多态性的检测灵敏度变高等的倾向。

另外，PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。

此外，在扩增时，例如也可以通过实时PCR来监视扩增，调查试样中包含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即，随着DNA(检测对象序列)通过PCR而扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光强度发生变动。通过对此进行监视，能够检测试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变型DNA)的拷贝数和丰度比。

在本发明的多态性检测方法中，使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触，由此使两者杂交。试样中的单链核酸例如能够通过将前述那样得到的PCR扩增产物解离而制备。

所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度只要是所述扩增产物能够解离的温度则无特别限制。例如为85～95℃。加热时间也无特别限制。加热时间例如可以为1秒～10分钟，或1秒～5分钟。

另外，解离的单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件例如为40～50℃。

杂交步骤的反应液中的各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体例，所述反应液中的DNA的浓度例如可以为0.01μM～1μM，或0.1μM～0.5μM。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于所述DNA的添加比例的范围，例如可以为0.001μM～10μM，或0.001μM～1μM。

然后，将所得的所述单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交体慢慢加热，测定随温度上升的荧光信号的变动。例如当使用了Q Probe时，在其与单链DNA杂交的状态下，与解离状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如将荧光减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热并测定随温度上升的荧光强度的增加即可。

对荧光强度的变动进行测定时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室温～85℃，或25～70℃。结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/秒。

接着，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧光强度来计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。此外，在标记探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。

另外，在本发明中，如前所述，对杂交体进行加热，并测定伴随温度上升的荧光信号变动(优选荧光强度的增加)，但替代该方法，例如也可以测定杂交体形成时的信号变动。即，也可以对降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体时随所述温度下降的荧光信号变动进行测定。

作为具体例，在使用与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针(例如Q Probe) 的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加热的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。

另一方面，在使用由于杂交体形成而信号增加的标记探针的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭)，但是在由于温度下降而形成杂交体时，荧光强度增加。因此，例如可以慢慢降低所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的增加。

此外，在本发明的多态性检测方法中，除MDR1基因的外显子12的第1236位的碱基(序列编号1所示碱基序列中的第401位的碱基)的突变型之外，还包括检测MDR1基因的外显子26的第3435位的碱基(序列编号15所示碱基序列中的第256位的碱基)的突变型和MDR1基因的外显子21的第2677位的碱基(序列编号16所示碱基序列中的第300位的碱基)的突变型中的至少一种的突变型。

通过这样，除序列编号1所示的碱基序列的第401位的碱基的突变型之外，还能检测序列编号15所示的碱基序列中第256位的碱基和序列编号16所示的碱基序列中第300位的碱基的突变型中的至少一种的突变型。

用于检测的具体手段没有特别限制，例如，除用于检测本发明的序列编号1所示的碱基序列中第401位碱基的多态性的探针之外，可一并使用用于检测与序列编号15所示的碱基序列中的第256位碱基对应的多态性的探针和用于检测与序列编号16所示的碱基序列中的第300位碱基对应的多态性的探针等。

所述用于检测与序列编号15所示的碱基序列中的第256位碱基对应的多态性的探针没有特别限制，例如，可以举出日本专利文献特开2005-287335号公报中记载的探针、由序列编号9所示的碱基序列构成的探针等。

所述用于检测与序列编号16所示的碱基序列中的第300位碱基对应的多态性的探针没有特别限制，例如可以举出包括序列编号10所示的碱基序列的探针。

另外，本发明的检测方法中，包括：除序列编号1所示的碱基序列的第401位的碱基的多态性之外，还在同一体系中检测序列编号15所示的碱基序列中第256位碱基的多态性和序列编号16所示的碱基序列中的第300位碱基的多态性中的至少一种的多态性。

通过这样，可在同一体系中，除检测序列编号1所示的碱基序列的第401位的碱基的多态性之外，还检测序列编号15所示的碱基序列中的第256位碱基的多态性和序列编号16所示的碱基序列中的第300位碱基的多态性中的至少一种的多态性，从便利性的观点来看是优选的。

作为在同一体系中检测存在于不同外显子中的多种多态性的方法，无特别限制。例如，可以预先将能够检测各个多态性的各个探针混合并添加到试样中，也可以将能够检测各个多态性的各个探针连续添加到含有单链核酸的试样中。

这里，“体系”是指用含有由荧光标记寡核苷酸和单链核酸杂交的而得的杂交体的试样形成的一个独立的反应体系。

本发明的多态性检测方法中，可包括在同一体系中检测与序列编号1所示的碱基序列的第401位的碱基对应的多态性、与序列编号15所示的碱基序列中的第256位碱基对应的多态性和与序列编号16所示的碱基序列中的第300位碱基对应的多态性。

由此，不仅能在一个体系中简便地检测三种基因多态性，还能更正确地预测与这三种多态性相关联的后文所述的对药剂的耐受性和有效性。

用于检测的具体手段没有特别限定，例如，除用于检测本发明的序列编号1所示的碱基序列中的第401位碱基的多态性的探针之外，一并使用用于检测与序列编号15所示的碱基序列中的第256位碱基对应的多态性的探针和用于检测与序列编号16所示的碱基序列中的第300位碱基对应的多态性的探针这三种探针等。

另外，关于各探针的优选的形式、序列，可适用与上述各探针相关的说明。

<药效判定方法>

本发明的药效判定方法包括：通过上述的多态性检测方法来检测MDR1基因的多态性；以及基于所述检测结果来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。

在上述的多态性检测方法中，使用本发明的多态性检测用探针来灵敏度良好且简便地检测MDR1基因的多态性，因此能够基于MDR1基因中的所述多态性来灵敏度良好且简便地进行药剂的判定。

另外，能够基于多态性的有无来判定对药剂的耐受性或药剂的药效。并且，本发明的药效判定方法在基于有无突变型来确定疾病的治疗方针中有用，例如增加药剂施与量、改为其他治疗药等治疗方针的更改。

另外，作为所述判定对象的药剂，具体地，可以举出抗癌剂、高血压治疗药、免疫抑制剂、中枢作用药等，特别可举出抗癌剂。

<多态性检测用试剂盒>

本发明的多态性检测用试剂盒包含上述的多态性检测用探针。

该多态性检测用试剂盒通过包含至少一种上述的多态性检测用探针，例如具有能够更简便地进行MDR1基因的多态性的检测的倾向。

多态性检测用试剂盒还可以包含用于扩增含有上述探针杂交的区域的碱基序列的引物。

由此，本发明的多态性检测用试剂盒能够以良好精度进行MDR1基因的多态性的检测。

此外，关于多态性检测用试剂盒中可包含的探针以及引物，能够直接适用前述的部分。

另外，本发明的多态性检测用试剂盒优选地除了含有MDR1基因的多态性检测用探针之外，还可含有选自由上述的用于检测与序列编号15所示的碱基序列中第256位的碱基对应的多态性的探针和用于检测与序列编号16所示的碱基序列中的第300位的碱基对应的多态性的探针组成的组的至少一种探针。

本发明的多态性检测用试剂盒通过除MDR1基因的多态性检测用探针之外还含有上述其他的探针，而能简便地检测多个外显子中存在的多种多态性。

在含有两种以上的荧光标记寡核苷酸作为多态性检测用探针的情况下，各个荧光标记寡核苷酸既可以以混合的状态被包含，也可以单独被包含。

两种以上的所述多态性检测用探针可以通过发光波长互不相同的荧光染料被标记。

如此通过改变荧光物质的种类，即使在相同的反应体系中也能够同时进行各个荧光标记寡核苷酸相关的检测。

另外，本发明中的检测用试剂盒除了所述探针和所述引物之外，也可以还含有进行本发明检测方法中的核酸扩增所需要的试剂类。另外，所述探针、所述引物和其他试剂类可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成为混合物。

此外，“单独收容”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。

通过包含能够扩增含有多态性位点的序列(与探针杂交的区域)的引物对，例如能够更高灵敏度地检测多态性。

另外，本发明的多态性检测用试剂盒可以含有记载了使用所述多态性检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测MDR1基因中的多态性的使用说明书，或者是记载了检测用试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书。

实施例

下面详细说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。

[实施例1]

使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表3记载的处方的检查用试剂，进行了Tm分析，确认了荧光标记寡核苷酸(序列编号2)的MDR1(1236)探针的性能。另外，使用序列编号18和序列编号19的人工寡聚序列作为模板。

表3

上述表3中使用的探针和模板的详细示于下文。此外，探针中的3’末端的括号内示出荧光染料的种类。表4所示的碱基序列中大写字母表示多态性的位置。下文中相同。

表4

MDR1(1236)探针

ttcaggttcagAcccttc-(TAMRA)

序列编号2

表5

序列(5′→3′)	长度(mer)	序列编号
			gatcttgaagggTctgaacctgaag	25	18
gatcttgaagggCctgaacctgaag	25	19

在Tm分析中，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高至75℃，并测定了其间荧光强度随时间的变化。另外，将激发波长设为520nm～555nm、将检测波长设为585nm～700nm，分别测定来自荧光标记探针的荧光强度变化。

通过Tm分析，得到了图2，其显示探针的荧光值的变化量。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。图中，以菱形表示的图案示出了使用序列编号19所示的人工寡聚序列(其中，序列编号1所示的碱基序列中第401位的碱基(Y)是C)作为模板时结果。图中，四角形表示的图案示出了使用序列编号18所示的人工寡聚序列(其中，序列编号1所示的碱基序列中第401位的碱基(Y)是T)作为模板时结果。图中，三角形表示的图案示出了使用序列编号18所示的人工寡聚序列和序列编号20所示的人工寡聚序列以1∶1混合用作为模板时的结果。

根据图2的结果，明确了：即便序列编号1所示的碱基序列中第401 位的碱基(Y)是C的情况和是T的情况混合存在，通过将本发明所涉及的荧光标记寡核苷酸用作为探针，也可检测序列编号1所示的碱基序列中第401位的碱基的多态性。另外，序列编号19所示的人工寡聚序列被用作为模板的情况下，Tm值是63℃，在序列编号18所示的人工寡聚序列用作为模板的情况下，Tm值是56℃。

[实施例2]

使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表6和表7记载的处方的反应液，进行了PCR和Tm分析。

表6

使用精制人基因细为模板的情况

使用从全血精制的人基因组

表7

使用精制人基因组为模板的情况

PCR为在95℃下处理60秒后，以95℃下处理1秒和57℃下处理30秒作为一个循环，反复进行50个循环。

在Tm分析中，PCR后，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高至75℃，并测定了其间荧光强度随时间的变化。

多态性检测用探针中，使用了序列编号2所示的序列中3’末端被荧光染料(TAMRA)标记的荧光标记寡核苷酸(MDR1(1236)探针)、序列编号9所示的序列的5’末端被荧光染料(Pacific Blue)标记的荧光标记寡核苷酸(MDR1外显子26探针)和序列编号10所示的序列的5’末端被荧光染料(BoDIPY FL)标记的荧光标记寡核苷酸(MDR1外显子21探针)。

下文详细显示了MDR1外显子26探针和MDR1外显子21探针。

表8

探针	序列(5′→3′)	序列编号
			MDR1外显子26探针	(Pacific Blue)-ctgccctcacAatctcttc-P	9
MDR1外显子21探针2	(BODIPY FL)-cccagAaccttctagttc-P	10

[0224] 另外，荧光染料Pacific Blue的激发波长为365nm～415nm，检测波长为445nm～480nm。荧光染料BODIPY FL的激发波长为420nm～485nm，检测波长为520nm～555nm。荧光染料TAMRA的激发波长为520nm～555nm，检测波长为585nm～700nm(下文中相同)。根据各自的波长，分别测定来自荧光标记探针的荧光强度变化。

使用的引物中，下文详细显示了除序列编号7所示的MDR1(1236)F和序列编号8所示的MDR1(1236)R以外的引物。

表9

引物	序列(5′→3′)	序列编号
			MDR1外显子21-F	aaatgttgtctggacaagcactg	11
MDR1外显子21-R	aattaatcaatcatatttagtttgactcac	12
			MDR1外显子26-F	actgcagcattgctgagaac	13
MDR1外显子26-R	cagagaggctgccacatgctc	14

分别使用全血和来自全血的以常用方法精制的精制人基因组作为模板。

全血是按照下文所述来制备的。

将全血10μl加入至70μl稀释液1中，良好混合后，将10μl该混合液加入至70μl稀释液2中。将17μl该混合物在95℃加热10分钟，得到4μl经预处理的全血。这被用作为针对1份测试的模板。

表10

通过Tm分析，得到图3，其显示了探针的荧光值的变化量。

图3的(A)～(C)显示了使用精制人基因组作为试样时的结果。

图3的(D)～(F)显示了使用全血作为试样时的结果。

另外，图3的(A)和(D)显示了与序列编号1所示的碱基序列中的第401位的碱基对应的多态性的有无，图3的(B)和(E)显示了与序列编号15所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性的有无，以及图3的(C)和(F)显示了与序列编号16所示的碱基序列中的第300位的碱基对应的多态性的有无。

图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。

结果明确了：通过使用本发明涉及的荧光标记寡核苷酸作为探针，在能检测序列编号1所示的碱基序列中第401位的碱基的多态性的同时，可在同一体系中简便地检测与序列编号15所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性的有无和与序列编号16所示的碱基序列中第300位的碱基对应的多态性的有无。

[比较例1]

使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表11记载的处方的检查用试剂，进行了Tm分析。使用序列编号17所示的荧光标记寡核苷酸作为探针，使用序列编号20和序列编号21的人工寡聚序列作为模板。

表11

另外，上述表11中使用的探针和模板的详细示于下文。探针中的3’末端的括号内表示荧光染料的种类。

表12

表13

序列(5′→3′)	长度(mer)	序列编号
			cttcaggttcagAcccttcaagatc	25	20
cttcaggttcagGcccttcaagatc	25	21

Tm分析为，在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高至75℃，并测定了其间荧光强度随时间的变化。使用TAMRA作为荧光染料。

通过Tm分析，得到了图4，其显示探针的荧光值的变化量。图中，分别地，纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。图中，以菱形表示的图案示出了使用序列编号21所示的人工寡聚序列(其中，序列编号1所示的碱基序列中的第401位的碱基(Y)是C)作为模板时的结果。图中，四角形表示的图案示出了使用序列编号20所示的人工寡聚序列(其中，序列编号1所示的碱基序列中第401位的碱基(Y)是T)作为模板时的结果。图中，三角形表示的图案示出了使用序列编号20所示的人工寡聚序列和序列编号22所示的人工寡聚序列以1∶1混合用作为模板时的结果。

根据图2的结果，在序列编号1所示的碱基序列中第401位的碱基(Y)是C的情况和是T的情况混合存在的情况下，仅能得到一个检测峰，无法检测多态性。

另外，比较例1中使用的序列编号17所示的荧光标记寡核苷酸只不过是显示了大量存在的不可能用于检测的探针的代表例子。

如上文所述，明确了：通过本发明，能够高灵敏度且简便地检测MDR1基因的多态性。

Claims

1.一种多态性检测用探针，其为从由下述P1和P1’组成的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸，用于检测MDR1基因的多态性，

2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其为从由下述P1-1和P1’-1组成的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸，

3.根据权利要求1或2所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置中的任一位置具有经荧光染料标记的与第395位的碱基对应的碱基。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的与第395位的碱基对应的碱基。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与靶标序列杂交时的荧光强度比未杂交时的荧光强度减少或增加。

6.根据权利要求5所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与靶标序列杂交时的荧光强度比未杂交时的荧光强度减少。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸的碱基长为7～28。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的多态性检测用探针，其中，所述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸的碱基长为7～18。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的多态性检测用探针，其中所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。

10.一种多态性检测方法，其通过使用权利要求1～9中任一项所述的探针来检测MDR1基因的多态性。

11.根据权利要求10所述的多态性检测方法，包括：

(I)使权利要求1～9中任一项所述的探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体；

12.根据权利要求11所述的多态性检测方法，还包括：在所述(I)的获得杂交体之前或者与所述(I)的获得杂交体同时扩增核酸。

13.根据权利要求10～12中任一项所述的多态性检测方法，还包括：在同一个体系中对与序列编号15所示的碱基序列中第256位的碱基对应的多态性和与序列编号16所示的碱基序列中第300位的碱基对应的多态性中的至少一种多态性进行检测。

14.根据权利要求10～13中任一项所述的多态性检测方法，包括：在同一个体系中，检测与序列编号1所示的碱基序列中的第401位的碱基对应的多态性、与序列编号15所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性、和与序列编号16所示的碱基序列中的第300位的碱基对应的多态性。

15.一种药剂的药效评价方法，包括：通过权利要求10～14中任一项所述的多态性检测方法来检测MDR1基因中的多态性；以及基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。

16.一种多态性检测用试剂盒，用于检测MDR1基因中的多态性，所述多态性检测用试剂盒包含权利要求1～9中任一项所述的探针。

17.根据权利要求16所述的多态性检测用试剂盒，还包含：能够扩增含有与所述探针杂交的区域的碱基序列的引物。

18.根据权利要求16或17所述的多态性检测用试剂盒，还包含：用于检测与序列编号1所示的碱基序列中的第256位的碱基对应的多态性的多态性检测用探针和用于检测与序列编号16所示的碱基序列中的第300位的碱基对应的多态性的多态性检测用探针。