CN102776277A - HGF基因的Poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途 - Google Patents

HGF基因的Poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供HGF基因的poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途。所述多态性检测用探针为用于检测HGF基因的多态性的探针，其由(P1-1)、(P1-2)、(P1’-1)、(P1’-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-1)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’-1)和(P3’-2)中的至少一种荧光标记寡核苷酸构成。例如(P1-1)为如下荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记。

Description

HGF基因的Poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途
技术领域
本发明涉及用于检测HGF(hepatocyte growth factor：肝细胞生长因子)基因的启动子区域中的poly A重复单元数目的突变的多态性的探针及其用途。 
背景技术
乳腺癌是发生于乳房组织的癌。是世界上常见的癌症，在西方国家中大约10％的女性一生中有罹患乳腺癌的机会。另外，大约20％的乳腺癌女性患者由于该疾病而死亡。因此，为了实现肿瘤的早期发现方法以及有效的治疗方法而耗费着巨大的劳动力。 
近年，已知乳腺癌的发病风险与HGF基因的启动子区域中的poly A重复单元数目的突变相关联。具体地，在HGF基因的启动子区域的polyA重复单元数目为正常型30时与poly A重复单元数目发生缩短突变(例如，变为25或25以下)时，乳腺癌的发病风险不同(Jihong Ma，et al.，2009，Somatic mutation and functional polymorphism of a novel regulatoryelement in the HGF gene promoter causes its aberrant expression in humanbreast cancer.、The Journal of Clinical Investigation Volume 119Number 3.，478-491)。 
作为HGF基因的poly A重复单元数目的突变检测方法的示例，有直接测序法(direct sequencing)以及用电泳检测的方法。但是，例如，在判别poly A重复单元数目为30和25以下时的A的重复数的差异时，直接测序法中测定相同碱基的连续序列时波形杂乱，难以确定正确的碱基序列。另外，即使使用电泳，也难以判别多个碱基(例如，30和25以下)的差别，难以正确判断是正常型还是突变型。 
另一方面，近年来的基因多态性的检测方法中，使用着利用了熔解曲线分析(Tm分析)的检测方法。该方法为如下方法：使用与含有检测目标基因多态性的检测靶标序列互补的探针，形成检测试样的靶标单链DNA与该探针的杂交体(双链DNA)，对该杂交体实施加热处理，通过吸光度或荧光强度等的信号测定来检测随着温度上升的杂交体解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值(℃)，从而判断目标多态性的有无。杂交体的同源性的越高则Tm值越高，同源性越低则Tm值越低。因此，对含有目标多态性的检测靶标序列和与其互补的探针的杂交体预先求得Tm值(℃)(评价标准值)，测定检测试样的靶标单链DNA和该探针的Tm值(℃)，若该测定值与评价标准值相同，则可以判断为完全匹配，即靶标DNA中存在目标多态性，若该测定值低于评价基准值，则可以判断为错配，即靶标DNA中不存在目标多态性。 
此外，日本专利文献特表2007-510154号公报中，记载了以下所示的E.coli 16S rRNA-特异性补充(補足)探针、以及E.coli 16S rRNA-特异性检测补充探针(序列编号1和序列编号2)。但是，这些探针只有最多14个A。另外，A重复的部分必须位于探针的序列的端部。因此，不仅不能检测poly A重复单元数目为15个以上的突变型的情况，也不能检测其他的碱基夹着的HGF基因的启动子区域的poly A重复单元的突变型的情况。 
序列编号1 
5’-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAA-3’ 
序列编号2 
5’-AAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’ 
发明内容
本发明的目的在于，提供能够正确地判别HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目突变的多态性检测用探针、使用该多态性检测用探针 的HGF基因的多态性检测方法、利用该多态性检测方法的药剂的评价方法、以及含有该多态性检测用探针的HGF基因的多态性检测用试剂盒。 
本发明人发现通过设计能够正确地判别HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目突变的多态性检测用探针，并使用该多态性检测用探针进行Tm分析，能够更准确地检测该poly A重复单元数目突变的多态性，从而完成了本发明。 
本发明如下所述。 
<1>.一种多态性检测用探针，其是用于检测HGF基因的多态性的探针，其特征在于，其由从下述(P1-1)、(P1-2)、(P1’-1)、(P1’-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-1)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’-1)和(P3’-2)中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸构成： 
(P1-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P1-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P1’-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对 应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P1’-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2’-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至 少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2’-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，与所述碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P3-1)荧光标记寡核苷酸，其为8～120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132～134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的4～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； 
(P3-2)荧光标记寡核苷酸，其为8～120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132～134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的4～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列其，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； 
(P3’-1)荧光标记寡核苷酸，其为8～56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132～134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的5～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； 
(P3’-2)荧光标记寡核苷酸，其为8～56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132～134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的5～31之间任意个数的连 续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记。 
<2>.根据<1>所述的多态性检测用探针，其特征在于， 
所述(P1-1)、所述(P1-2)、所述(P1’-1)和所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1～3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基； 
所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’-1)和所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1～3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基； 
所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’-1)和所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1～3位的位置具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。 
<3>.根据<1>所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)、所述(P1-2)、所述(P1’-1)和所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基； 
所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’-1)和所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基； 
所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’-1)和所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。 
<4>.根据<1>～<3>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。 
<5>.根据<4>所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少。 
<6>.根据<1>～<5>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27～57； 
所述(P1’-1)或所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22～52； 
所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～62； 
所述(P2’-1)或所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22～52； 
所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为30～60； 
所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为19～49。 
<7>.根据<1>～<6>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于， 
所述(P1-1)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～52； 
所述(P1’-1)或所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27～47； 
所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37～57； 
所述(P2’-1)或所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27～47； 
所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为35～55； 
所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为24～44。 
<8>.根据<1>～<7>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37～47； 
所述(P1’-1)或所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～42； 
所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为42～52； 
所述(P2’-1)或所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～42； 
所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为40～50； 
所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为29～39。 
<9>.根据<1>～<8>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述多态性检测用探针为用于熔解曲线分析的探针。 
<10>.一种HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，使用<1>～<9>中任意一项所述的多态性检测用探针。 
<11>.根据<10>所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，包括： 
(I)使<1>至<9>中任意一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，获得所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸的杂交体的步骤； 
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度，使所述杂交体解离，测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动的步骤； 
(III)基于所述荧光信号的变动，评价所述杂交体的解离温度即Tm值的步骤；以及 
(IV)基于所述Tm值，检测HGF基因中的多态性的存在的步骤。 
<12>.根据<11>所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，还包括在所述(I)的获得杂交体之前或者与所述(I)的获得杂交体同时扩增核酸的步骤。 
<13>.一种药剂的评价方法，其特征在于，包括： 
(I)通过<10>至<12>中任意一项所述的HGF基因的多态性检测方法，来检测HGF基因的多态性的步骤； 
(II)基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效的步骤。 
<14>.HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，包括<1>～<9>中任意一项所述的多态性检测用探针。 
<15>.根据<14>所述的HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，还包括能够以含有与所述(P1-1)、所述(P1-2)、所述(P1’-1)、所述(P1’-2)、所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’-1)、所述(P2’-2)、所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。 
附图说明
图1为示出实施例1涉及的通过3T-HGF-WT-F1探针进行的Tm分析的结果的图。 
图2为示出实施例2涉及的通过3T-HGF-WT-F3探针进行的Tm分析的结果的图。 
图3为示出实施例3涉及的通过3T-HGF-WT-R1探针进行的Tm分析的结果的图。 
图4为示出比较例涉及的通过3T-HGF-WT-F2探针进行的Tm分析的结果的图。 
图5为示出实施例4涉及的通过3T-HGF-WT-R1探针进行的Tm分析的结果的图。 
具体实施方式
在本发明中，检测的目标的多态性基本上是指HGF基因中的启动子区域的poly A重复单元数目突变。在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))登录号NT_007933.15(Homo sapiens chromosome 7genomic contig，GRCh37.p2reference primary assembly)中作为部分序列登录了本发明中的HGF基因的细节。本发明中的“碱基编号”是指作为该部分序列的序列编号3所示的碱基序列的、从5’末端起向3’末端方向数的对应碱基的编号，即碱基编号1～碱基编号249。此外，该碱基编号1～碱基编号249的碱基序列对应于前述的登录号NT_007933.15中登录的77412220bp的全碱基序列的第1943861位的碱基～第19433101位的碱基的部分序列。 
人的HGF基因中的启动子区域的poly A重复单元数目若为正常型则是30(31)，若为突变型则是0(1)～29(30)。本发明中的“poly A重复单元数目突变”是指基因处于这样的突变型的情况。本发明的poly A重复单元数目中，例如在表示为30(31)的情况下，“30”’表示序列编号3的碱基序列所示的HGF基因中的启动子区域的poly A重复单元数目、 即碱基编号102～131的T(或与T互补的A)的数目，“(31)”是指序列编号3所示的碱基序列中，将前述启动子区域的poly A重复序列的5’末端侧上连接的T也包括在内的、碱基编号101～131的T(或与T互补的A)的数目。 
在本发明中，作为检测对象的试样中的单链核酸、多态性检测用探针或引物的每个的序列，基于这些序列的互补关系的事项，只要不特别指出，也适用于和该各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于与各序列互补的对应序列时，由该互补的序列识别的序列，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。该适用是在本领域技术人员的技术常识的范围内进行替换。 
在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。例如，当加热含有双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链DNA中的两条链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，全部双链DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。 
本说明书中“步骤”一词，不仅包含独立的步骤，而且例如在不能与其他的步骤明确区别的情况下，只要达到了本步骤预期的效果，则也包含在本术语之内。另外，在本发明中，使用“～”表示的数值范围表示分别包含“～”的前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。另外，在本发明中，组成物中的各成分的量，在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，是指组成物中存在的该多种物质的合计量。在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数第1～3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。 
本发明中的“靶标序列”是指为了检测多态性(poly A重复单元数目突变)而与对应探针杂交的核酸序列。下面说明本发明涉及的多态性检测用探针。此外，本发明中的“含有”和“具有”也包含“由……组成”以 及“由……构成”的意思。本发明中的“至少80％以上的同一性”是指，从检测灵敏度的观点来说，可以显示85％以上的同一性、90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或99％以上的同一性。 
杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如按照Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。 
本发明的“在严谨条件下”是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM～约50mM以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为详细的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl2中进行杂交的条件，但不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择上述条件。 
<多态性检测用探针> 
本发明的多态性检测用探针为用于检测HGF基因的多态性的探针，其特征在于，其由从下述(P1-1)、(P1-2)、(P1’-1)、(P1’-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-1)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’-1)和(P3’-2)的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸构成。 
(P1-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P1-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号 95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P1’-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与所述碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P1’-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、与序列编号3的 碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2’-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P2’-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，与所述碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； 
(P3-1)荧光标记寡核苷酸，其为8～120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132～134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的4～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； 
(P3-2)荧光标记寡核苷酸，其为8～120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132～134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的4～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； 
(P3’-1)荧光标记寡核苷酸，其为8～56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132～134以及由夹在碱基编号 100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的5～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； 
(P3’-2)荧光标记寡核苷酸，其为8～56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132～134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的5～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记。 
本发明的所述荧光标记寡核苷酸可以为与互补链杂交时的荧光强度比未与互补链杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以为与互补链杂交时的荧光强度比未与互补链杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。 
利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓的Q Probe(注册商标)。其中可以举出如下寡核苷酸，其被设计成3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并且被荧光染料标记以使该末端的C靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这样的探针，则可以根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。 
此外，除了使用Q Probe(注册商标)的检测方法之外，也可以应用其它公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。 
所述荧光染料无特别限制，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。这些荧光染料的市售产品例如可举出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。 
荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在检测波长445～480nm下检测，TAMRA能够在波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520～ 555nm下检测。如果使用具有这样的荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法，例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。此外，在与具有和荧光标记寡核苷酸互补的碱基序列的DNA杂交的情况下的Tm值、和具有仅有1个碱基为非互补的碱基序列的DNA杂交时的Tm值之差例如可举出2.0℃以上、3.0℃以上、5.0℃以上或7.0℃以上等。 
另外，本发明的多态性检测用探针例如可以在3’末端添加磷酸基。如后文所述，靶标序列可以通过PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链式反应)法等基因扩增法来制备。此时，可以将本发明的多态性检测用探针共存于基因扩增反应的反应液中。这种情况下，如果在多态性检测用探针的3’末端添加磷酸基，则能够充分防止探针该多态性检测用探针自身由于基因扩增反应而延长。另外，通过在3’末端添加前述那样的标记物质也能够获得同样的效果。以下，作为本发明的多态性检测用探针的代表，详细叙述(P1-1)、(P1’-1)、(P2-1)、(P2’-1)、(P3-1)和(P3’-1)荧光标记寡核苷酸。此外，由于(P1-2)为与(P1-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P1’-2)为与(P1’-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P2-2)为与(P2-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P2’-2)为与(P2’-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P3-2)为与(P3-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P3’-2)为与(P3’-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，因此特征相同，省略其详细说明。 
首先，所述(P1-1)和所述(P1’-1)荧光标记寡核苷酸的“与碱基编号95对应的碱基”是指与序列编号3所示的碱基序列中作为碱基编号95的碱基“G(鸟嘌呤)”对应的互补碱基“C(胞嘧啶)”。即，(P1-1)和(P1’-1)荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号3所示的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，但是该同一性的条件为与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶。在(P1-1)和(P1’-1)荧光标记寡核苷酸中，用荧光染料标记的C的位点不一定非要是3’末端，如下述的具体的变化实施方式所示，可以在从3’末端起数第1～3位的位置具有该C，通过该C存 在于3’末端，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。该(P1-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为27～57碱基长、32～52碱基长、或37～47碱基长。另外，该(P1’-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为22～52碱基长、27～47碱基长、或32～42碱基长。 
例如，作为具体的(P1-1)的变化实施方式，可以举出以下的荧光标记寡核苷酸。在(P1’-1)的情况下，与以下所示的(P1-1)不同，(P1’-1)成为仅在作为poly A重复序列的部分的序列的3’末端附属有含其他种类的碱基的碱基序列的状态。 
poly A重复单元数目30(31)、46mer、序列编号4 
5’-CAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(荧光标记)-3’ 
poly A重复单元数目30(31)、42mer、序列编号5 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(荧光标记)-3’ 
poly A重复单元数目0(1)、12mer、序列编号6 
5’-TTGTGAGCTGCC-(荧光标记)-3’ 
接下来，所述(P2-1)和所述(P2’-1)荧光标记寡核苷酸的“与碱基编号92对应的碱基”是指与序列编号3所示的碱基序列中作为碱基编号92的碱基“G(鸟嘌呤)”对应的互补碱基“C(胞嘧啶)”。即，(P2-1)和(P2’-1)荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号3所示的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，但是该同一性的条件为与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶。如下述的具体的变化实施方式所示，该C不一定是3’末端，可以在从3’末端起数第1～3位的位置具有该C，通过该C存在于3’末端，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。该(P2-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为32～62碱基长、37～57碱基长、或42～52碱基长。另外，该(P2’-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为22～52碱基长、27～47碱基长、或32～42碱基长。 
例如，作为具体的(P2-1)的变化实施方式，可以举出如以下的荧光标记寡核苷酸。在(P2’-1)的情况下，与如以下所示的(P2-1)不同， (P2’-1)成为仅在作为poly A重复序列的部分的序列的3’末端附属有含其他种类的碱基的碱基序列的状态。 
poly A重复单元数目30(31)、46mer、序列编号7 
5’-TTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(荧光标记)-3’ 
poly A重复单元数目30(31)、42mer、序列编号8 
5’-TGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(荧光标记)-3’ 
poly A重复单元数目0(1)、11mer、序列编号9 
5’-GAGCTGCCTGC-(荧光标记)-3’ 
最后，所述(P3-1)和所述(P3’-1)荧光标记寡核苷酸的“碱基编号134的碱基”是指序列编号3所示的碱基序列中作为碱基编号134的碱基“C(胞嘧啶)”。即，(P3-1)和(P3’-1)荧光标记寡核苷酸相对于序列编号3所示的碱基序列具有至少80％以上的同一性，但是该同一性的条件为碱基编号134的碱基为胞嘧啶。如下述的具体的变化实施方式所示，该C并不一定要是3’末端，而是可以在从3’末端起数第1～3位的位置具有该C，通过该C存在于3’末端，例如有检测灵敏度变高等的倾向。该(P3-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为30～60碱基长、35～55碱基长、或40～50碱基长。另外，该(P3’-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为19～49碱基长、24～44碱基长、或29～39碱基长。 
例如，作为具体的(P3-1)的变化实施方式，可以举出以下所示的荧光标记寡核苷酸。在(P3’-1)的情况下，与以下所示的(P3-1)不同，(P3’-1)成为仅在作为poly A重复序列的部分的序列的3’末端附属有含其他种类的碱基的碱基序列的状态。 
poly A重复单元数目30(31)、46mer、序列编号10 
5’-AGAGCAGGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-(荧光标记)-3’ 
poly A重复单元数目30(31)、36mer、序列编号11 
5’-GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-(荧光标记)-3’ 
poly A重复单元数目2(3)、8mer、序列编号12 
5’-GCTTTCAC-(荧光标记)-3’ 
如上述(P1-1)、(P1’-1)、(P2-1)、(P2’-1)、(P3-1)或(P3’-1)(也包括特征类似的(P1-2)、(P1’-2)、(P2-2)、(P2’-2)、(P3-2)或(P3’-2))荧光标记寡核苷酸所示的本发明涉及的多态性检测用探针能够用于HGF基因的poly A重复单元数目突变的检测。检测方法无任何限制，只要是利用靶标序列和这些多态性检测用探针的杂交的方法即可。例如，可以仅使用(P1-1)、(P1’-1)、(P2-1)、(P2’-1)、(P3-1)或(P3’-1)的poly A重复单元数目30(31)的多态性检测用探针(正常型探针)，来检测HGF基因的poly A重复序列突变。另外，也可以使用(P1-1)、(P1’-1)、(P2-1)、(P2’-1)、(P3-1)或(P3’-1)的poly A重复单元数目30(31)之外的各种poly A重复单元数目重复数的多态性检测用探针(突变型探针)，来检测HGF基因的polyA重复单元数目突变。另外，本发明的多态性检测用探针的特征在于其为用于熔解曲线分析的探针。以下叙述HGF基因的多态性检测方法的详细(也包括利用这样的熔解曲线分析的方法)。 
<HGF基因的多态性检测方法> 
本发明的HGF基因的多态性检测方法(HGF基因的poly A重复单元数目突变的检测方法)特征在于使用前述的多态性检测用探针。即，本发明的多态性检测方法的特征在于使用前述的本发明的多态性检测用探针，其他的构成或条件等不限于以下的记载。 
本发明的多态性检测方法例如包括下述步骤(I)、步骤(II)、步骤(III)和步骤(IV)。 
(I)使所述多态性检测探针和试样中的单链核酸接触，来获得荧光标记寡核苷酸和单链核酸的杂交体的步骤。 
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动的步骤。 
(III)基于所述荧光信号的变动来评价所述杂交体的解离温度、即Tm值的步骤。 
(IV)基于所述Tm值来检测HGF基因中的多态性的存在的步骤。 
此外，上述步骤(III)中，“评价Tm值”可以是仅仅包括评价(确定)Tm值下的温度，也可以包含评价(确定)Tm分析中的峰的高度，即评价(确定)每单位时间的荧光强度的变化量的峰。通过评价该峰的高度，能够确认具有poly A重复单元数目突变的碱基序列的丰度比。 
更具体地说，例如，在仅使用正常型探针来实行这样的多态性检测方法的情况下，预先测定使用正常型单链核酸的情况下的Tm值。正常型单链核酸例如从全血等中使用市售的基因组DNA分离盒来分离基因组DNA并使用。之后，通过比较该正常型的Tm值和试样的Tm值，能够评价试样HGF基因是否具有poly A重复单元数目突变。即，当Tm值为与正常型时完全相同的值时，判断为试样poly A重复序列与正常型探针完全匹配。但是，Tm值小于正常型时，表示试样单链核酸和正常型探针的解离温度低，因此这种情况下，可知试样单链核酸的poly A重复单元数目少于正常型的30(31)。 
另外，即使不是正常型探针，而是0(1)～29(30)的任意poly A重复单元数目的突变型探针，也能够使用这样的方法来评价是完全匹配还是错配，并正确地检测试样的poly A重复单元数目突变。另外，至少使用一种这样的各种多态性检测用探针即可，也可以一起使用两种以上。通过一起使用两种以上的多态性检测用探针，并评价每单位时间的荧光强度的变化量(荧光信号)的峰，能够一次性地评价与各个多态性检测用探针完全匹配的poly A重复单元数目的靶标序列的丰度比。反应体系中本发明的多态性检测用探针的添加浓度无特别限制，对于每一种多态性检测用探针例如可以举出10～1000nmol/L或20～500nmol/L。 
本发明涉及的HGF基因的多态性检测方法，也可以含有在前述(I)的获得杂交体之前，或者与获得杂交体的同时扩增核酸的步骤。作为核酸的扩增法无特别限制，例如可以举出PCR法、NASBA(Nucleic AcidSequence Based Amplification：基于核酸序列的扩增)法、TMA (Transcription-Mediated Amplification：转录介导扩增)法、或SDA(Strand Displacement Amplification：链置换扩增)法等。其中可以为PCR法。 
核酸的扩增法的条件无特别限制，可以通过以往公知的方法来进行。基于作为模板的核酸来生成扩增产物中，例如可以举出使用用于扩增含有该检测目标的poly A重复单元数目突变的序列的引物。该引物的扩增区域无特别限制，可以根据检测目标的poly A重复单元数目突变来适当设定。例如，可以举出含有与前述的(P1-1)、(P1’-1)、(P2-1)、(P2’-1)、(P3-1)或(P3’-1)荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域。另外，该引物的序列无特别限制，例如，只要能够扩增检测目标的poly A重复单元数目突变的序列即可，可以根据该检测序列和其周边序列等来通过现有公知的方法而适当设定。另外，该引物的长度无特别限制，可以设定为一般的长度，例如可以举出10～50碱基长。 
作为这样的引物，例如可以使用扩增正义链的正向引物(F引物)和扩增反义链的反义引物(R引物)中的任何一者，例如可以举出使用将两者作为一对的引物对。在使用该引物的反应体系中，引物的添加浓度无特别限制，例如对于一种引物可以举出0.1～4μmol/L、0.25～1.5μmol/L或0.5～1μmol/L。另外，在使用F引物和R引物的情况下，F引物和R引物的添加比例无特别限制，例如，按照以摩尔比的F引物：R引物，可以举出1∶0.1～1∶10或1∶0.5～1∶5。 
适用本发明的HGF基因的多态性检测方法的试样无特别限制，例如可以举出生物试样。作为该生物试样的具体示例，例如可以举出全血、白血球细胞等血细胞、骨髓、口腔粘膜等口腔内细胞、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、洗胃液等。在本发明中，该试样的采集方法以及由该试样制备被检核酸的方法等无特别限制，可采用现有的公知方法。在该生物试样为全血时，本发明的反应体系中该全血的浓度例如可以举出0.01～2体积％、0.05～1.5体积％或0.1～1体积％。另外，在该生物试样为血清时，本发明的反应体系中该血清的浓度例如可以举出0.1～20体积％、0.25～15体积％或0.5～10体积％。 
<药剂的评价方法> 
本发明的药剂的评价方法以通过利用前述的HGF基因的多态性检测方法、来评价能够用于与HGF基因相关的疾病的药剂的耐受性或药效为特征。即，本发明的药剂的评价方法的特征在于使用前述HGF基因的多态性检测方法进行评价，其他的构成或条件等不限于以下的记载。 
本发明的药剂的评价方法例如包括下述步骤(I)和步骤(II)。 
(I)通过前述的HGF基因的多态性检测方法，来检测HGF基因的多态性的步骤。 
(II)基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效的步骤。 
具体的详情与前述HGF基因的多态性检测方法相同。(II)中的“基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效”例如是指，基于突变型和正常型的丰度比或有无等来对针对乳腺癌等药剂的耐受性或药剂的药效进行评价。如此的药剂的评价方法在确定由于该poly A重复单元数目突变导致的疾病的治疗方针(如增减药剂的施与量、或改变为其他的治疗药等)中有用。 
<HGF基因的多态性检测用试剂盒> 
本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒以含有前述的多态性检测用探针为特征。即，本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒的特征在于含有前述的多态性检测用探针，其他的构成或条件等不限于以下的记载。此外，还可以含有：能够以含有与前述的多态性检测用探针即(P1-1)、(P1’-1)、(P2-1)、(P2’-1)、(P3-1)或(P3’-1)(也包括特征类似的(P1-2)、(P1’-2)、(P2-2)、(P2’-2)、(P3-2)或(P3’-2))荧光标记寡核苷酸杂交的碱基序列的区域为模板进行扩增的引物。 
下面叙述本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒的示例。例如，本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒为在HGF基因的poly A重复单元数目突变的检测中使用的试剂盒。试剂盒中也可以含有一种或两种以上的前述的多态性检测用探针。在后者的情况下，两种以上的多态性检测用探针可以以混合状态被包含，也可以作为单独的试剂被包含。另外，在两 种以上的本发明的多态性检测用探针以混合的状态包含在本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒中的情况下，或者虽然作为单独的试剂被包含，但是例如使用时在相同的反应体系中进行各多态性检测用探针和各靶标序列的Tm解离分析的情况下，各多态性检测用探针可以用不同的荧光染料进行标记。通过如此改变荧光染料的种类，使得即使相同的反应体系中，也能够进行针对各个多态性检测用探针的检测。作为所述荧光染料，例如，可以举出检测波长不同的物质。 
如前所述，近年，据称HGF基因的poly A重复单元数目突变与乳腺癌的发病风险有关。因此，通过本发明的多态性检测用探针、HGF基因的多态性检测方法以及HGF基因的多态性检测用试剂盒等，能够正确地检测poly A重复单元数目的多个碱基单位的突变，因此使得能够预先检查乳腺癌的发病风险，很有可能能够与乳腺癌的早期发现等相关联。 
接下来说明本发明的实施例。但是，本发明不限于下述实施例。 
下面叙述如下实施例，所述实施例中使用本发明的多态性检测用探针评价了作为HGF基因的启动子区域的部分序列的、从第19432961位的碱基到第19432991位的碱基的poly A重复单元数目突变。 
(实施例1) 
实施例1中，利用本发明的多态性检测用探针，对HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目突变，使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(IS-5310)、爱科来公司制)进行了Tm分析。添加到i-densy(IS-5310)中的探针等溶液、试剂的处方如下表所示。 
表1 
  (反应液量：50μl)  
  1×P C R缓冲液  
  dNTP   0.2mM
  MgCl2   1.5mM
  Taq聚合酶   1.88U
  探针   0.2μM
  互补链   0.2μM
上述表1中的探针为3T-HGF-WT-F1探针(正常型检测用探针)，序列如下所示。 
3T-HGF-WT-F1探针、序列编号5、30(31) 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(TAMRA)-3’ 
3T-HGF-WT-F1探针的上述序列的3’末端的C使用了TAMRA作为用于Tm分析的荧光染料。 
在本实施例1中使用了两种与上述序列的3T-HGF-WT-F1探针形成杂交体的互补链。另外，也对这两种互补链分别使用了0.1μM的样品进行了实验。各个序列如下所示。 
HGF-R-A30-60、序列编号13、30(31) 
5’-ctcagagcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaa-3’ 
HGF-R-A25-60、序列编号14、25(26) 
5’-gggctcagagcaggcagcttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaact-3’ 
将这样的反应液分别添加到i-densy(IS-5310)中，于95度(℃)处理1秒钟、接着40度下处理60秒钟、再以3秒钟1度的温度上升速度从40度加热到75度，测定对应于该探针的荧光染料的检测波长(585～700nm)下的荧光强度随时间的变化，进行了Tm分析。 
图1是示出实施例1涉及的通过3T-HGF-WT-F1探针进行的Tm分析的结果的图。横轴为温度(℃)，纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量。在图1中，30A为使用了0.2μM的互补链HGF-R-A30-60的结果，25A为使用了0.2μM的互补链HGF-R-A25-60的结果，30A/25A为同时使用了0.1μM的每一种互补链的Tm分析的结果。如30A所示，在poly A重复单元数目为30(31)时(为正常型时)，峰为65℃，熔解温度Tm值较高。另外，25A中，虽然poly A重复序列比正常型仅少了几个碱基左右，但是峰为61℃，熔解温度Tm值降到与30A相比即能相互区别的程度。另外，同时使用了0.1μM的每一种链的30A/25A中，在两者的熔解温度Tm值处都有峰。 
(实施例2) 
在实施例2中，使用与前述实施例1中使用的本发明的多态性检测用探针不同的本发明的多态性检测用探针，进行了Tm分析。实验方案和试剂等的调配与前述的实施例1相同。 
在本实施例2中，替代实施例1的3T-HGF-WT-F1探针，使用了3T-HGF-WT-F3探针。3T-HGF-WT-F3探针的序列如下所示。 
3T-HGF-WT-F3探针、序列编号15、30(31) 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(TAMRA)-3’ 
如此，与实施例1类似，3T-HGF-WT-F3探针序列的3’末端的C上使用了TAMRA作为用于Tm分析的荧光染料。 
本实施例2中也使用了两种与上述序列的3T-HGF-WT-F3探针形成杂交体的互补链、以及同时使用了0.1μM的与上述序列的3T-HGF-WT-F3探针形成杂交体的每一种互补链，这一点如下述的序列所示，与实施例1类似。 
HGF-R-A30-60、序列编号13、30(31) 
5’-ctcagagcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaa-3’ 
HGF-R-A25-60、序列编号14、25(26) 
5’-gggctcagagcaggcagcttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaact-3’ 
对于这样的反应液，也用与实施例1同样的方法进行了Tm分析。 
图2是示出实施例2涉及的通过3T-HGF-WT-F3探针进行的Tm分析的结果的图。横轴为温度(℃)，纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量。在图2中，30A为使用了0.2μM的互补链HGF-F-A30-60的结果，25A为使用了0.2μM的互补链HGF-F-A25-60的结果，30A/25A为分别使用了0.1μM的互补链的Tm分析的结果。如30A所示，在poly A重复单元数目为30(31)时(为正常型时)，峰为71℃。在25A中，没有出现比实施例1的结果更大的差，峰为68℃，减少了。但是，对于同时使用了0.1μM的每一种链的30A/25A，或许是由于每个温度的峰没有足够大的差，因而不能检测到明确的两个峰。 
(实施例3) 
在实施例3中，使用与前述实施例1和实施例2中使用的探针不同的本发明的多态性检测用探针，进行了Tm分析。实验方案和试剂等的调配与前述实施例1相同。 
在本实施例3中，替代实施例1的3T-HGF-WT-F1探针，使用了3T-HGF-WT-R1探针。3T-HGF-WT-R1探针的序列如下所示。 
3T-HGF-WT-R1探针、序列编号16、30(31) 
5’-gctttttttttttttttttttttttttttttttcac-(TAMRA)-3’ 
如此，与实施例1类似，3T-HGF-WT-R1探针序列的3’末端的c上使用了TAMRA作为用于Tm分析的荧光染料。 
在本实施例3中也使用了两种与上述序列的3T-HGF-WT-R1探针形成杂交体的互补链。另外，对于同时使用了0.1μM的这两种互补链的样品也进行了实验。各个序列如下所示。 
HGF-F-A30-60、序列编号17、30(31) 
5’-TTTGGCAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAG-3’ 
HGF-F-A25-60、序列编号18、25(26) 
5’-AGTTTGGCAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCC-3’ 
用与实施例1同样的方法对这样的反应液进行了Tm分析。 
图3为示出实施例3涉及的通过3T-HGF-WT-R1探针进行的Tm分析的结果的图。横轴为温度(℃)，纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量。在图3中，30A为使用了0.2μM的互补链HGF-F-A30-60的结果，25A为使用了0.2μM的互补链HGF-F-A25-60的结果，30A/25A为同时使用了0.1μM的每种互补链的Tm分析的结果。首先，如30A所示，在polyA重复单元数目为30(31)时(为正常型时)，当使用3T-HGF-WT-R1时，峰为62℃。另外，在25A中，与实施例1的结果同样地，poly A重复单元数目比正常型减少了几个碱基，因此峰变为56℃，与30A的Tm值相比，产生了较大的差。同时使用了0.1μM的每一种链的30A/25A也同样地能够判别各个的温度的峰。 
(比较例) 
在比较例中，使用与本发明的多态性检测用探针不同的探针，进行了Tm分析。实验协议和试剂等的调配与前述的实施例1同样。 
在本比较例中，替代实施例1中的本发明涉及的多态性检测用探针，使用了3T-HGF-WT-F2探针。3T-HGF-WT-F2探针的序列如下所示。 
3T-HGF-WT-F2探针、序列编号19、30(31) 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTC-(TAMRA)-3’ 
如此，与实施例1类似，3T-HGF-WT-F2探针中，上述序列的3’末端的C上也使用了TAMRA作为用于Tm分析的荧光染料。 
在本比较例中也使用了两种与上述序列的3T-HGF-WT-F2探针形成杂交体的互补链、以及同时使用了0.1μM的与上述序列的3T-HGF-WT-F2探针形成杂交体的每一种互补链，这一点如下述的序列所示，与实施例1和实施例2同样。 
HGF-R-A30-60、序列编号13、30(31) 
5’-ctcagagcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaa-3’ 
HGF-R-A25-60、序列编号14、25(26) 
5’-gggctcagagcaggcagcttttttttttttttttttttttttttcacaaactgccaaact-3’ 
用于实施例1同样的方法对于这样的反应液进行了Tm分析。 
图4为示出比较例涉及的通过3T-HGF-WT-F2探针进行的Tm分析的结果的图。横轴为温度(℃)，纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量。在图4中，30A为使用了0.2μM的互补链HGF-F-A30-60的结果，25A为使用了0.2μM的互补链HGF-F-A25-60的结果，30A/25A为同时使用了0.1μM的每一种互补链的Tm分析的结果。如图4所示，在本比较例中，30A、25A和30A/25A的任何情况下，都不能检测到峰、即Tm值。 
由实施例1至实施例3的结果可知，为了正确地判别HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目的突变，以该poly A重复序列的序列的周边的“C”的位置为基准，使用荧光标记进行了Tm分析，通过评价荧光标记的信号的峰值的温度，可以判别突变。但是，由比较例的结果也确认了，作为荧光标记的基准的poly A重复序列的序列的周边的“C”的位置受到限制。即通过将实施例1中序列编号3的碱基编号95的G的互补碱基的“C”、实施例2中序列编号3的碱基编号92的G的互补碱基的“C”、实施例3中序列编号3的碱基编号134的“C”分别用荧光标记，使得能够分析HGF基因启动子区域的poly A重复单元数目突变。 
(实施例4) 
在实施例4中，插入PCR的步骤，对HGF基因的poly A重复序列突变进行了Tm分析。用于进行PCR和Tm分析的装置使用了与前述的实施例1、实施例2和实施例3同样的i-densy(IS-5310)。添加的探针等溶液/试剂的组成如下表所示。 
表2 
  (反应液量：50μl)  
  1×PCR缓冲液  
  dNTP   0.2mM
  MgCl2   1.5mM
  Taq聚合酶   1.88U
  探针   0.2mM
  HGF-KKD-F   1μM
  HGF-KKD-R   0.5μM
上述表2中的HGF-KKD-F和HGF-KKD-R为引物，序列如下所示。 
HGF-KKD-F、序列编号20、32mer、Tm＝63.6℃ 
5’-GGGACAGGCTATGGACAATGACTGTTTCTTGG-3’ 
HGF-KKD-R、序列编号21、28mer、Tm＝61.4℃ 
5’-gggtgtggtattgtggggccaaaataag-3’ 
另外，上述表2中的探针是与前述实施例3同样的3T-HGF-WT-R1探针，序列如下所示。 
3T-HGF-WT-R1探针、序列编号16、30(31) 
5’-gctttttttttttttttttttttttttttttttcac-(TAMRA)-3’ 
3T-HGF-WT-R1探针的上述序列的3’末端的c上与前述同样地使用了TAMRA作为用于Tm分析的荧光染料。 
模板中使用三种质粒(全部为GeneScript公司制)进行了比较。序列编号22所示的质粒(29A)、序列编号23所示的质粒(25A)、序列编号24所示的质粒(20A)均使用了2500copy/μl。将这样的反应液分别添加到i-densy(IS-5310)中，为了首先进行PCR，因此在95度加热60秒钟之后，在进行了50个从95度下1秒钟到60度下15秒钟的循环。之后，与前述的实施例1、实施例2和实施例3同样，于95度下处理1秒钟、接着40度下处理60秒钟、然后以3秒钟1度的温度上升速度从40度加热到75 度，测定与该探针的荧光染料对应的检测波长(585～700nm)下的、荧光强度随时间的变化，进行了Tm分析。 
图5为示出实施例4涉及的通过3T-HGF-WT-R1探针进行的Tm分析的结果的图。横轴为温度(℃)，纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量。在图5中，29A为示出使用序列编号22所示的质粒进行PCR、Tm分析的结果，25A为示出使用序列编号23所示的质粒进行PCR、Tm分析的结果，20A为示出使用序列编号24所示的质粒进行PCR、Tm分析的结果。当poly A重复单元数目为29(30)个碱基A时，如图5的29A所示，进行PCR时峰为55℃。另外，在poly A重复单元数目为25(26)个碱基A的情况下，如图5的25A所示，进行PCR时峰为51℃。在poly A重复单元数目为20(21)个碱基A的情况下，如图5的20A所示，进行PCR时峰为48℃，可知即使步骤中包括PCR，也可以判别每个峰。 
另外，使用Tm值计算软件MeltCalc，计算了在以如下Tm值的变化为指标的情况下是否能够判别正确的A碱基的缺失个数，其中，所述Tm值的变化是比上述实施例1至实施例3以更少的单位缺失靶标序列中的poly A重复序列的A碱基而引起的。 
首先，计算中使用的正常型序列和突变型序列、即A碱基缺失序列如下所示。 
正常型、序列编号5、30(31) 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
poly A重复序列1个碱基缺失、序列编号25、29(30) 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
poly A重复序列3个碱基缺失、序列编号26、27(28) 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
poly A重复序列5个碱基缺失、序列编号27、25(26) 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
正常型、序列编号15、30(31) 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-3’ 
poly A重复序列1个碱基缺失、序列编号28、29(30) 
5’-gcaggcagctttttttttttttttttttttttttttttt-3’ 
poly A重复序列3个碱基缺失、序列编号29、27(28) 
5’-gcaggcagctttttttttttttttttttttttttttt-3’ 
poly A重复序列5个碱基缺失、序列编号30、25(26) 
5’-gcaggcagctttttttttttttttttttttttttt-3’ 
正常型、序列编号16、30(31) 
5’-gctttttttttttttttttttttttttttttttcac-3’ 
poly A重复序列1个碱基缺失、序列编号31、29(30) 
5’-ttttttttttttttttttttttttttttttcac-3’ 
poly A重复序列3个碱基缺失、序列编号32、27(28) 
5’-ttttttttttttttttttttttttttttcac-3’ 
poly A重复序列5个碱基缺失、序列编号33、25(26) 
5’-ttttttttttttttttttttttttttcac-3’ 
以下在表中示出上述正常型序列和缺失序列中的碱基数(mer)、A(t)数、和计算出的Tm值(℃)。 
表3 
  序列   mer   A的数目   Tm(℃)
  正常型30A   42   31   58.3
  1个碱基缺失29A   36   30   55.2
  3个碱基缺失27A   34   28   54.6
  5个碱基缺失25A   32   26   53.9
  正常型30A   45   31   60.6
  1个碱基缺失29A   39   30   58.1
  3个碱基缺失27A   36   28   57.7
  5个碱基缺失25A   34   26   57
  正常型30A   36   31   53.3
  1个碱基缺失29A   33   30   50.3
  3个碱基缺失27A   31   28   49.3
  5个碱基缺失25A   29   26   48.2
另外，为了更详细地对产生同样的效果的对应荧光标记探针的碱基长和碱基序列进行调查，使用与实施例1至实施例3同样的方法，对Tm值(℃)及其变化与碱基序列的关联进行了调查。 
首先，对与序列编号3的碱基编号95对应的碱基进行荧光标记并进行了调查的探针的碱基序列如下所示。 
序列编号34 
5’-AGCTGCC-3’ 
序列编号35 
5’-GAGCTGCC-3’ 
序列编号36 
5’-TTGTGAGCTGCC-3’ 
序列编号37 
5’-AAAGCTGCC-3’ 
序列编号38 
5’-AAAAAAGCTGCC-3’ 
序列编号39 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
序列编号40 
5’-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
序列编号41 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTG-3’ 
序列编号42 
5’-CAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
序列编号43 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCA-3’ 
序列编号44 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATG-3’ 
序列编号45 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGG-3’ 
序列编号46 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGC-3’ 
序列编号47 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCA-3’ 
序列编号48 
5’-GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTT-3’ 
序列编号49 
5’-GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTTGTTTT-3’ 
接下来，在表中示出这些探针的碱基序列中的mer、A的数目、Tm值(℃)(完全匹配)、1个碱基缺失的Tm值(℃)以及Tm值(℃)(完全匹配)-1碱基缺失的Tm值(℃)的值(Δ)。 
表4 
Figure BSA00000717417400331
若按照如下条件：即以仅缺失1mer时即产生Δ1℃以上(也包括不能检测)的差的情况视为本发明的多态性检测用探针能够检测、以及该探针本身的Tm值(℃)为0℃以上，则上述表4表明，序列编号46、序列编号47和序列编号49的荧光标记探针不能进行检测。 
另外，对与序列编号3的碱基编号92对应的碱基进行荧光标记并进行了调查的探针的碱基序列如下所示。 
序列编号50 
5’-AGCTGCCTGC-3’ 
序列编号51 
5’-GAGCTGCCTGC-3’ 
序列编号52 
5’-AAAGCTGCCTGC-3’ 
序列编号53 
5’-AAAAAAGCTGCCTGC-3’ 
序列编号54 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-3’ 
序列编号55 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-3’ 
序列编号56 
5’-TGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-3’ 
序列编号57 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTC-3’ 
序列编号58 
5’-TTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCT 
GCCTGC-3’ 
序列编号59 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGG-3’ 
序列编号60 
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCA-3’ 
序列编号61 
5’-GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTT-3’ 
序列编号62 
5’-GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGCTCTGAGCCCATGGGGCAGGGGCAATTTTTTCATCTGACAATCTGCGTGCTTTTGTTTT-3’ 
接下来，表中记载了这些探针的碱基序列中的mer、A的数目、Tm值(℃)(完全匹配)、缺失1个碱基的Tm值(℃)、以及Tm值(℃)(完全匹配)-1个碱基缺失的Tm值(℃)的值(Δ)。 
表5 
Figure BSA00000717417400361
若按照与前述同样的条件视为本发明的多态性检测用探针能够检测，则上述表5表明序列编号60和序列编号62的荧光标记探针不能检测。 
另外，对序列编号3的碱基编号134的碱基进行荧光标记并对进行了调查的探针的碱基序列如下所示。 
序列编号63 
5’-CTCAC-3’ 
序列编号64 
5’-CTTCAC-3’ 
序列编号65 
5’-TTTCAC-3’ 
序列编号66 
5’-CTTTCAC-3’ 
序列编号67 
5’-TTTTCAC-3’ 
序列编号68 
5’-CTTTTCAC-3’ 
序列编号69 
5’-TTTTTCAC-3’ 
序列编号70 
5’-TTTTTTTCAC-3’ 
序列编号71 
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3’ 
序列编号72 
5’-CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3’ 
序列编号73 
5’-GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3’ 
序列编号74 
5’-AGAGCAGGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-3’ 
序列编号75 
5’-CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCACACATTTACCCAAAGTATACAAAATAAACTTGTCTGATCTGACTTTTTAAGAGAAAGTCC-3’ 
序列编号76 
5’-CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCACACATTTACCCAAAGTATACAAAATAAACTTGTCTGATCTGACTTTTTAAGAGAAAGTCCAAGAAACAGTCATTGTCCATAGCCT-3’ 
序列编号77 
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATA-3’ 
序列编号78 
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCAC-3’ 
序列编号79 
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACAAACTGCCAAACTCACGAAATACCACACATTTACCCAAAGTATACA-3’ 
接下来，表中记录了这些探针的碱基序列中的mer、A的数目、Tm值(℃)(完全匹配)、1个碱基缺失的Tm值(℃)、以及Tm值(℃)(完全匹配)-1个碱基缺失的Tm值(℃)的值(Δ)。 
表6 
Figure BSA00000717417400381
若按照与前述同样的条件视为本发明的多态性检测用探针能够检测，则上述表6表明序列编号63至序列编号69、序列编号76、序列编号78以及序列编号79的荧光标记探针不能检测。 
如此，从实施例1、实施例2和实施例3的结果、以及Tm值计算软件MeltCalc计算的Tm值推测结果，可知以荧光标记探针的poly A重复序列的序列(或互补的T)的周边的“C”的位置为基准使用荧光标记，来进行Tm分析并评价荧光标记的信号的峰值的温度，即使只相差几个碱基单位的情况下也能够正确地判别靶标序列的poly A重复单元数目突变。 
更详细地说，如表4至表6所示，根据使用荧光染料进行标记的位置、T(或互补碱基A)的连续个数和碱基长，该多态性能够检测的情况和不能够检测的情况是有条件的。例如，提示了在对与序列编号3的碱基编号95对应的碱基进行荧光标记的情况下，对于相对于与碱基编号95～100和碱基编号132之间夹着T的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性的序列而言，原来的碱基序列的T的连续个数为1～31、碱基长为8～94(P1-1)；对于相对于与由碱基编号95～100的碱基序列和T的连续序列构成的碱基序列(未夹着T的连续序列的状态)互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性的序列而言，则原来的碱基序列的T的连续个数为1～31、碱基长为7～55(P1’-1)。 
提示了在对与序列编号3的碱基编号92对应的碱基进行荧光标记的情况下，对于相对于与碱基编号92～100和碱基编号132之间夹着T的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性的序列而言，原来的碱基序列的T的连续个数为1～31个、碱基长为11～94(P2-1)；对于相对于与由碱基编号92～100的碱基序列和T的连续序列构成的碱基序列(未夹着T的连续序列的状态)互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性的序列而言，原来的碱基序列的T的连续个数为1～31个、碱基长为10～55(P2’-1)。提示了在将序列编号3的碱基编号134的碱基荧光标记的情况下，对于相对于碱基编号100和碱基编号132～134之间夹着T的碱基序列具有至少80％以上的同一性的序列而言，原来的碱基序列的T的连续个数为4～31个、碱基长为8～120(P3-1)；对于相对于由碱基编号132～ 134的碱基序列和T的连续序列构成的碱基序列(未夹着T的连续序列的状态)具有至少80％以上的同一性的序列而言，原来的碱基序列的T的连续个数为5～31个、碱基长为8～56(P3’-1)。 
本发明不限于上述发明的实施方式和对实施例的说明。在不脱离权利要求书的记载、本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变形方式都包含在本发明内。 
本说明书中写明的论文和公开专利公报等内容，视为通过援用其全部内容而引用。 
如此，通过利用本发明，可以在只相差几个碱基单位的情况下也能够正确地判别HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目突变，另外，即使在正常型和突变型共存的情况下，也能够判别poly A重复单元数目。尤其是在同时利用Tm分析的情况下，通过评价熔解曲线，不论一种还是两种以上都能够容易地判别poly A重复单元数目突变。另外，如在实施例和比较例中所述，通过Tm分析的熔解曲线能够评价poly A重复单元数目突变的荧光染料的标记部位受到限制，因此利用该标记部位的本发明涉及的多态性检测用探针和HGF基因的多态性检测方法可以说是大有用处的发明。 
本申请基于2011年5月9日申请的日本专利申请2011-104503号、以及2012年4月10日申请的日本专利申请2012-89507号。本说明书中，将日本专利申请2011-104503号和日本专利申请2012-89507号的说明书、权利要求书、附图、序列表全体作为参考并入本文。 
Figure ISA00000717417600011
Figure ISA00000717417600041
Figure ISA00000717417600051
Figure ISA00000717417600081
Figure ISA00000717417600101
Figure ISA00000717417600111
Figure ISA00000717417600121
Figure ISA00000717417600131

Claims (15)

1.一种多态性检测用探针，其是用于检测HGF基因的多态性的探针，其特征在于，其由从下述(P1-1)、(P1-2)、(P1’-1)、(P1’-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-1)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3，-1)和(P3’-2)的组中选择的至少一种荧光标记寡核苷酸构成：
(P1-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；
(P1-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；
(P1’-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与所述碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；
(P1’-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；
(P2-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；
(P2-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；
(P2’-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；
(P2’-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92～100以及由夹在所述碱基编号92～100的3’末端和碱基编号132之间的1～31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10～55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，与所述碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；
(P3-1)荧光标记寡核苷酸，其为8～120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132～134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的4～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；
(P3-2)荧光标记寡核苷酸，其为8～120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132～134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的4～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；
(P3’-1)荧光标记寡核苷酸，其为8～56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132～134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的5～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；
(P3’-2)荧光标记寡核苷酸，其为8～56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132～134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132～134的5’末端之间的5～31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，
所述(P1-1)、所述(P1-2)、所述(P1’-1)和所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1～3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基；
所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’-1)和所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1～3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基；
所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’-1)和所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1～3位的位置具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。
3.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)、所述(P1-2)、所述(P1’-1)和所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基；
所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’-1)和所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基；
所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’-1)和所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。
4.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
5.根据权利要求4所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少。
6.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27～57；
所述(P1’-1)或所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22～52；
所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～62；
所述(P2’-1)或所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22～52；
所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为30～60；
所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为19～49。
7.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～52；
所述(P1’-1)或所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27～47；
所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37～57；
所述(P2’-1)或所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27～47；
所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为35～55；
所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为24～44。
8.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(P1-1)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37～47；
所述(P1’-1)或所述(P1’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～42；
所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为42～52；
所述(P2’-1)或所述(P2’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32～42；
所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为40～50；
所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为29～39。
9.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述多态性检测用探针为用于熔解曲线分析的探针。
10.一种HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的多态性检测用探针。
11.根据权利要求10所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，包括：
(I)使权利要求1所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，获得所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸的杂交体的步骤；
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度，使所述杂交体解离，测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动的步骤；
(III)基于所述荧光信号的变动，评价所述杂交体的解离温度即Tm值的步骤；以及
(IV)基于所述Tm值，检测HGF基因中的多态性的存在的步骤。
12.根据权利要求11所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，还包括在所述(I)的获得杂交体之前或者与所述(I)的获得杂交体同时扩增核酸的步骤。
13.一种药剂的评价方法，其特征在于，包括：
(I)通过权利要求10所述的HGF基因的多态性检测方法，来检测HGF基因的多态性的步骤；
(II)基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效的步骤。
14.HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多态性检测用探针。
15.根据权利要求14所述的HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，还包括能够以含有与所述(P1-1)、所述(P1-2)、所述(P1’-1)、所述(P1’-2)、所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’-1)、所述(P2’-2)、所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’-1)或所述(P3’-2)荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。
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