CN102766682B - 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够高灵敏度且简便地检测ABCC2基因的多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。用于检测ABCC2基因的多态性检测用探针是:(P1)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中第207位~第217位的碱基的碱基长11~60的序列,除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C之外相对于具有与序列编号1相同碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性,并且与序列编号1所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记;或者(P1’)荧光标记寡核苷酸,其与具有与序列编号1相同碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。
Description
技术领域
本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。
背景技术
ABCC2基因局部存在于肝细胞的胆管,对将谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、硫酸结合体从胆管输送到胆管的转运体进行编码,并与各种药剂的代谢有关。
另外,近年,在分析日本人的ABCC2基因的单核苷酸多态性(SNPs)之后,发现了各种各样的基因多态性。另外,已给出了通过对ABCC2基因的与5’末端相距24个碱基的胞嘧啶(C)突变成胸腺嘧啶(T)的C-24T进行测定有可能能够预测药物耐受性的启示(参见DrugMetabolism and Disposition,2002年,Vol.30,No.4,p.363-364)。因此,人们期待正确且短时间、低成本并且简便地测定ABCC2基因的多态性的方法。
另外,作为与药剂的敏感性相关的突变,例如,除了C-24T突变之外,还已知有MDR1基因的外显子26中的第3435位的胞嘧啶(C)突变成胸腺嘧啶(T)的C3435T突变等多种突变(参见日本专利特许第4454366号公报)。因此,不单单检测ABCC2基因的多态性,而是通过与C-24T突变一起检测其他的与药剂敏感性相关的突变体,有可能能够更高灵敏度地预测药剂耐受性。
目前,作为测定基因的多态性的方法,已知有下述的方法:使用被设计为扩增含有想要测定的碱基的部分的引物进行PCR,用可以该特定碱基中有无突变来区分是否切断的限制性内切酶进行切断,之后通过电泳检测有没有被切断(PCR-RFLP法)(参见Genet.Mol.Res.,2010年,第9卷,第1号,p.34-40)。
另外,还已知有下述的方法:在用PCR法扩增含有突变的区域之后,使用用荧光染料标记了的核酸探针进行熔解曲线分析,并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变(参见特开2002-119291号公报)。
发明内容
发明要解決的问题
但是,ABCC2基因的突变中如上述那样存在各种突变。因此,在PCR-RFLP法中,需要在PCR反应之后提取扩增产物来进行限制性内切酶处理。因此,扩增产物有可能混入下一反应体系中,由此有时会获得假阳性、假阴性的结果。另外,由于在PCR结束之后用限制性内切酶进行处理,之后进行电泳,因此有时到检测为止所需的时间非常长。而且,由于操作复杂,因此难以自动化。
根据这些现状,期待进一步开发用于检测ABCC2基因多态性的技术。
本发明要解决的问题在于提供一种能够高灵敏度、简便地检测ABCC2基因多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外,本发明要解决的问题在于提供使用了该多态性检测方法的药效判定方法。而且本发明要解决的问题在于提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。
用于解决课题的手段
本发明如下所述。
<1>一种多态性检测用探针,其为从包括下述P1和P1’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸,用于检测ABCC2基因的多态性,
(P1)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记;以及
(P1’)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号1相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。
<2>根据<1>所述的多态性检测用探针,其中,所述多态性检测用探针是下述P1或下述P1’的所述荧光标记核苷酸,
(P1-1)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记,并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号1的第207位的碱基的多态性;或者
(P1’-1)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号1相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记,并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号1的第207位的碱基的多态性。
<3>根据<1>或<2>所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第1位~第3位具有用荧光染料标记的第217位的碱基。
<4>根据<1>~<3>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的第217位的碱基。
<5>根据<1>~<4>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光,并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
<6>根据<1>~<5>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光,并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少。
<7>根据<1>~<6>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为12~55。
<8>根据<1>~<7>任意一项所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为15~45。
<9>根据<1>~<8>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸的碱基长为18~35。
<10>根据<1>~<9>中任一项所述的多态性检测用探针,其中所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。
<11>根据<1>~<10>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,所述多态性检测用探针具有序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7、序列编号8、序列编号9、序列编号10、序列编号11、序列编号12、序列编号13、序列编号14、序列编号15或序列编号16所示的碱基序列。
<12>一种多态性检测方法,其通过使用<1>~<11>中任一项所述的多态性检测用探针来检测ABCC2基因的多态性。
<13>根据<12>所述的多态性检测方法,包括:
(I)使<1>~<11>中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触,从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体;
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离,并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动;
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值;以及
(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的ABCC2基因的多态性的存在。
<14>根据<13>所述的多态性检测方法,还包括:在所述(I)之前或者与(I)同时扩增核酸。
<15>根据<12>~<14>中任一项所述的多态性检测方法,还包括:通过使用从包括MDR1基因的多态性检测用探针和CYP3A5基因的多态性检测用探针的组中选择的至少一种探针,来检测从包括MDR1基因和CYP3A5基因的组中选择的至少一种基因的多态性。
<16>一种药剂的药效评价方法,包括:
通过<12>~<15>中任一项所述的多态性检测方法来检测ABCC2基因的多态性;以及
基于检测到的多态性的有无来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。
<17>一种多态性检测用试剂盒,用于检测ABCC2基因的多态性,所述多态性检测用试剂盒包含<1>~<11>中任一项所述的多态性检测用探针。
<18>根据<17>所述的多态性检测用试剂盒,还包含:能够扩增含有与所述P1荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。
<19>根据<17>或<18>所述的多态性检测用试剂盒,还包含:从包括用于检测MDR1基因的多态性的探针以及用于检测CYP3A5基因的多态性的探针的组中选择的至少一种以上的多态性检测用探针。
发明效果
通过本发明,能够提供可以高灵敏度、简便地检测ABCC2基因多态性的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法。另外,本发明能够提供使用了该多态性检测方法的药效判定方法。而且,本发明能够提供使用了该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。
附图说明
图1的(A)是核酸混合物的熔解曲线的示例,图1的(B)是微分熔解曲线的示例。
图2的(A)~(F)是本发明的实施例1涉及的试样的微分熔解曲线。
图3的(A)~(C)是本发明的实施例2涉及的试样的微分熔解曲线。
图4的(A)~(C)是本发明的比较例1涉及的试样的微分熔解曲线。
具体实施方式
本发明涉及的ABCC2基因的多态性检测用探针(以下,有时仅称“多态性检测用探针”)为如下的多态性检测用探针,其为从包括下述P1和P1’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸,用于检测ABCC2基因的多态性:
(P1)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性,并且与序列编号1所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记;以及
(P1’)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有和序列编号1相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。
本发明涉及的ABCC2基因多态性检测方法包括:使用至少一种用于检测所述ABCC2基因的多态性的多态性检测用探针来检测ABCC2基因的多态性。
本发明涉及的药剂的药效判定方法包括:通过所述ABCC2基因多态性检测方法检测ABCC2基因的多态性;以及基于检测到的多态性的有无来判定针对药剂的耐受性或药剂的药效。
本发明涉及的多态性检测用试剂盒包含用于检测ABCC2基因的多态性的多态性检测用探针。
本发明中的“ABCC2基因”已经是公知的,其碱基序列表示NCBI的登录号No.NC_000010.10的101542463~101611662的序列。序列编号1的碱基序列为NCBI的dbSNP的登录号No.rs717620的1~611的序列,相应于ABCC2基因的启动子区域中的核酸的碱基序列的一部分。
在本发明中,关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或者引物的每个的序列,基于它们的相互互补的关系所记述的事项,只要不特别指出,也适用于各个序列和相对于各序列互补的序列。在将本发明的事项适用于相对于各序列互补的该序列时,由该互补的序列识别的序列,在本领域技术人员的技术常识的范围内,视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。
在本发明中,“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度:Tm),一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。即,当加热含有双链核酸、例如双链核酸DNA的溶液时,260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂,解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且,当双链核酸DNA解离成单链DNA时,其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链核酸DNA的吸光度)的约1.5倍左右,由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出,均是指吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。
在本发明中,关于寡核苷酸的序列,当称为“从3’末端起数的第1~3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第1位起数的。
在本说明书中,“步骤”一词不仅包含独立的步骤,即使在不能与其他的步骤明确区别的情况下只要达到了本步骤预期的效果,则也包含在本术语之内。
另外,在本说明书中,使用“~”表示的数值范围为将“~”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值包含的范围。
另外,在本发明中,组成物中的各成分的量在组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下只要不特别指出就是指所述组成物中存在的该多种物质的合计量。
下面说明本发明。
<ABCC2基因多态性检测用探针>
本发明涉及的ABCC2基因的多态性检测用探针(以下,有时仅称为“多态性检测用探针”)为如下的多态性检测用探针,其为从包括下述P1和P1’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸,用于检测ABCC2基因的多态性:
(P1)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性,并且与序列编号1所示的序列的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记;以及
(P1’)荧光标记寡核苷酸,其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外与具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记。
本发明的从包括所述P1和所述P1’的组中选择的一种荧光标记寡核苷酸(以下也称为“所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸”。)是能够检测序列编号1所示的碱基序列的第207位的碱基的多态性的探针。
另外,本发明的所述P1和P1’荧光标记寡核苷酸具体为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的序列。
在ABCC2基因的野生型中,与序列编号1所示的序列的第207位对应的碱基为C(胞嘧啶),但在突变型中突变成T(胸腺嘧啶)(以下,称为“C-24T突变”),该碱基相当于ABCC2基因的第-428位~第183位的碱基中的第207位的碱基。
本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸需要除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列具有同源性。
具体地,本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列显示80%以上的同一性。
另外,从检测灵敏度的观点来说,可以显示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一性。
在对本发明的所述P1荧光标记寡核苷酸和除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列进行比较时的同一性低于80%的情况下,针对含有突变型的ABCC2基因的试样核酸的检测灵敏度变低。
另外,作为本发明涉及的所述P1荧光标记寡核苷酸,也可以是荧光标记寡核苷酸(P1-1),其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外相对于具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列具有至少80%以上的同一性,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记,并且该荧光标记寡核苷酸识别序列编号1的第207位的碱基的多态性。
该荧光标记寡核苷酸具有对含有突变型的ABCC2基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。
本发明中的所述P1’荧光标记寡核苷酸需要除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为C(胞嘧啶)之外具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交。
杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法,例如MolecularCloning 3rd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。
严谨条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM~约50mM以及镁浓度约1.0mM~约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例,可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl2下进行杂交的条件,但是不限于此。此外,严谨条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择这样的条件。
另外,作为本发明涉及的所述P1’荧光标记寡核苷酸,也可以是荧光标记寡核苷酸(P1’-1),其为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为11~60的序列,该序列除了与序列编号1中的第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶之外和具有与序列编号1相同的碱基的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交,并且与序列编号1所示的序列中的第217位的碱基对应的碱基用荧光染料标记,并且该荧光标记寡核苷酸(P1’-1)识别序列编号1的第207位的碱基的多态性。
该荧光标记寡核苷酸除了具有特定的碱基序列之外,还具有识别序列编号1的第207位的碱基的多态性的功能,因此具有对含有突变型的ABCC2基因的试样核酸的检测灵敏度变高的倾向。
另外,本发明的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸还包括在所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸中插入、缺失或者取代了碱基的荧光标记寡核苷酸。
该插入、缺失或取代了碱基的荧光标记寡核苷酸只要显示与所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸同等程度的作用即可,在插入、缺失或取代了碱基的情况下,其插入、缺失或取代的位置无特别限定。插入、缺失或取代的碱基的数量可以举出1个碱基或2个碱基以上,该数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同,例如可以举出1个碱基~10个碱基或1个碱基~5个碱基。
在插入、缺失或取代中,作为本发明的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸,也可以举出取代了所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的碱基的荧光标记寡核苷酸。
取代的位置无特别限定。例如,从检测灵敏度的观点来说,可以举出位于序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基之外的碱基被取代。作为被取代的碱基的数量,可以举出1个碱基或2个碱基以上。被取代的碱基的数量根据荧光标记寡核苷酸全体的长度而不同,例如可以举出1个碱基~5个碱基、或1个碱基~3个碱基。
本发明的所述P1或所述P1’的荧光标记寡核苷酸的长度需要是11mer~60mer。在所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的长度为10mer以下或者61mer以上的情况下,ABCC2基因多态性的检测灵敏度变低。
另外,本发明的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的长度可以为12mer~55mer、15mer~45mer或18mer~35mer。通过设成12mer~55mer的范围,例如具有检测灵敏度变高等的倾向。
另外,通过改变所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的碱基长,例如能够将由P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸与其互补链(靶标序列)形成的杂交体的解离温度、即Tm值调整至期望的值。
以下将本发明的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸中的碱基序列的示例示于表1,但是本发明不限于此。
此外,在表1中,将与序列编号1的第207位的碱基对应的碱基用小写字母表示,并且一并示出了与该序列编号1的第207位对应的碱基为A、G、T和C时的寡核苷酸与各个荧光标记寡核苷酸的杂交体的Tm值。另外,相对于序列编号1所示的序列增加了突变的碱基带有下划线。
这里Tm值是使用Meltcalc 99free(http://www.meltcalc.com/)在设定条件:Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件下计算的。
表1
※△为mt(突变型)和WT(野生型)的Tm值之差
在本发明中,所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸与具有互补的碱基序列的DNA杂交时的Tm值(表1中的Tm(mt))、和与仅序列编号1的第207位的碱基对应的碱基为非互补的寡核苷酸杂交时的Tm值(表1中的Tm(WT))之差,例如可以举出2.0℃以上、3.0℃以上、5.0℃以上、或7.0℃以上等。通过所述Tm值之差为2.0℃以上,例如能够更高灵敏度地检测序列编号1中的第207位的碱基的突变。
另外,本发明的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸的第217位的碱基需要用荧光染料标记。
在所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸中,该荧光标记了的第217位的碱基能够存在于从3’末端起数第1位~第3位的任何位置。另外,能够存在于3’末端。由此,多态性检测灵敏度进一步提高。另外,能够生产性良好地获得P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸。
本发明的所述荧光标记寡核苷酸可以是其与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中,可以是与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。
利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针,已知为所谓Q Probe(注册商标)。其中可以举出如下的寡核苷酸:其被设计为3’末端或5’末端为胞嘧啶(C),并用荧光染料标记该末端的C使其靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这样的探针,则能够根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。
此外,除了使用Q Probe的检测方法之外,也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式,可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。
作为所述荧光染料无特别限制,例如可以为荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。所述荧光染料的市售产品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。
所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制,可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在波长445~480nm下检测,TAMRA能够在波长585~700nm下检测,BODIPY FL能够在波长520~555nm下检测。
如果使用具有这种荧光染料的探针,则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法,来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。
另外,所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3’末端添加有磷酸基。因为通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基,能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述,检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时,通过使用在3’末端添加有磷酸基的荧光标记寡核苷酸,能够使其共存于扩增反应的反应液中。
另外,通过在3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光染料),也能够得到同样的效果。
下面示出具有上述碱基序列并且3’末端的C用荧光染料被标记的寡核苷酸的具体例(大写字母的碱基表示突变点,(TAMRA)相当于所述荧光染料)。但是,本发明中的荧光标记寡核苷酸不限于以下的寡核苷酸。
表2
探针 | 序列(5′→3′) | (mer) | 序列编号 |
3T-ABCC2-C-24T-mt-F2 | tctggaacAaagactcttc-(TAMRA) | 19 | 12 |
3T-ABCC2-C-24T-WT-Fa | tctagaacGaagactcttc-(TAMRA) | 19 | 13 |
3T-ABCC2-C-24T-mt-Fb | ggactgcgtctggaacAaagactcttc-(TAMRA) | 27 | 14 |
3T-ABCC2-C-24T-mt-Fc | ttcctgaaccgcgtctggaacAaagactcttc-(TAMRA)-t | 32 | 15 |
3T-ABCC2-C-24T-mt-Fd | ttcctgaaccAcgtctggaacGaagactcttc-(TAMRA) | 32 | 16 |
所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸能够用作检测ABCC2基因的多态性、尤其检测C-24T突变的ABCC2基因多态性检测用探针。
另外,ABCC2基因多态性检测用探针能够用作熔解曲线分析用的探针。
此外,本发明涉及的所述P1或所述P1’荧光标记寡核苷酸除了在序列编号1所示的碱基序列中与第217位的碱基对应的碱基为胞嘧啶,并且与第217位的碱基对应的碱基使用通过荧光染料标记了的碱基之外,能够按照被已知为寡核苷酸的合成方法的公知方法、例如特开2002-119291号公报等记载的方法来制备。
<引物>
在后述的ABCC2基因多态性检测方法中,当通过PCR法扩增含有作为检测对象的ABCC2基因多态性的序列时,使用引物。
可以在本发明中使用的引物只要能够扩增含有与作为目标的检测对象的ABCC2基因的多态性的位点、即序列编号1所示的序列中的第207位的碱基对应的碱基的核酸,则无特别限制。
应用于PCR法中的引物只要能够扩增本发明的多态性检测用探针能够杂交的区域则无特别限制,本领域技术人员能够基于序列号1所示的碱基序列来适当设计。引物的长度和Tm值例如可以设为12~40mer和40℃~70℃,或者16~30mer和55℃~60℃。
另外,引物对的各引物的长度例如也可以不相同,但两个引物的Tm值能够设定为大致相同(或者两个引物的Tm值之差为5℃以内)。
下面示出能够在本发明的多态性检测方法中用来扩增含有与本发明的多态性检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物的示例。此外,这些仅是例示而已,并不限制本发明。
作为用于检测所述序列编号1所示的序列中第207位的碱基的多态性的引物,可以是从包括下述P2、P2’、P3和P3’的组中选择的至少一种寡核苷酸。
(P2)寡核苷酸,其相对于含有序列编号1所示的碱基序列中的第172位~第194位的碱基的碱基长为23~60的碱基序列具有至少80%以上的同一性;(P2’)寡核苷酸,其与含有序列编号1所示的碱基序列中的第172位~第194位的碱基的碱基长为23~60的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交;(P3)寡核苷酸,其相对于含有序列编号1所示的碱基序列中的第265位~第294位的碱基的碱基长为30~60的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一性;以及(P3’)寡核苷酸,其与含有序列编号1所示的碱基序列中的第265位~第294位的碱基的碱基长为30~60的碱基序列在严谨条件下杂交。
作为所述P2寡核苷酸,也可以是相对于含有序列编号1所示的碱基序列中的第172位~第194位的碱基的碱基长为23~60的碱基序列具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列编号1中的第207位的碱基的区域的寡核苷酸。另外,作为所述P2’寡核苷酸,也可以是与含有序列编号1所示的碱基序列中的第172位~第194位的碱基的碱基长为23~60的碱基序列的互补链在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列编号1的第207位的碱基的区域的寡核苷酸。另外,作为所述P2或P2’寡核苷酸,也可以是所述P2或P2’寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
作为所述P3寡核苷酸,也可以是相对于含有序列编号1所示的碱基序列中的第265位~第294位的碱基的碱基长为30~60的碱基序列的互补链具有至少80%以上的同一性、并且扩增含有序列编号1中的第207位的碱基的区域的寡核苷酸。另外,作为所述P3’寡核苷酸,也可以是与含有序列编号1所示的碱基序列中的第265位~第294位的碱基的碱基长为30~60的碱基序列在严谨条件下杂交、并且扩增含有序列编号1中的第207位的碱基的区域的寡核苷酸。另外,作为所述P3或P3’寡核苷酸,也可以是所述P3或P3’寡核苷酸的碱基被插入、缺失或取代了的寡核苷酸。
此外,关于进行杂交的方法可以按照描述探针的部分中记载的方法,关于严谨条件,能够适用与描述探针的部分中记载的条件相同的条件。另外,关于同一性、插入、缺失或取代的范围,也能够适用与描述探针的部分中记载的范围相同的范围。
下面示出在本发明的多态性检测方法中的含有所述序列编号1的第207位的碱基的区域的扩增中能够使用的引物的示例。
表3
引物 | 序列(5′→3′) | (mer) | 序列编号 |
ABCC2-C-24T-F1 | cttctccagcatgattcctggac | 23 | 17 |
ABCC2-C-24T-R1 | atcagaatggtagataattcctgttccact | 30 | 18 |
另外,为了检测所述序列编号1中的第207位的碱基的多态性,可以将所述P2和P3、或者P2’和P3’所示的各寡核苷酸用作一对引物对。
多态性的检测方法只要是将所述荧光标记核苷酸用作探针的方法则无特别限制。作为将所述荧光标记核苷酸用作探针的多态性检测方法的示例,下面对利用了Tm分析的多态性检测方法进行说明。
<多态性检测方法>
本发明涉及的ABCC2基因多态性检测方法包括:使用至少一种所述ABCC2基因多态性检测用探针来检测ABCC2基因的多态性。
通过本发明涉及的多态性检测方法,能够通过包括至少一种所述多态性检测用探针来简便且灵敏度良好地检测ABCC2基因的多态性。
另外,本发明的多态性检测方法是一种ABCC2基因的多态性的检测方法,能够包括下述步骤(I)~(IV),也可以包括下述工程(V)。此外,本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针,其他的构成和条件不限于下面的记载。
(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触,从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交来获得杂交体。
(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离,并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动。
(III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度、即Tm值。
(IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的、ABCC2基因中的多态性的存在。
(V)基于所述多态性的存在,检测所述试样中的单链核酸中具有多态性的单链核酸的丰度比。
另外,在本发明中,除了所述步骤(I)~(IV)或所述步骤(I)~(V)之外,还可以包括:在步骤(I)杂交之前或者与步骤(I)杂交的同时扩增核酸。
此外,在所述(III)中测定Tm值时,也可以包括:不仅测定杂交体的解离温度,还测定在杂交体熔解时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。
在本发明中,所述试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。在所述核酸为双链核酸的情况下,例如能够在与所述荧光标记寡核苷酸杂交之前,通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核酸。通过将双链核酸解离成单链核酸,可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂交。
在本发明中,作为检测对象的试样中包含的核酸,例如可以是生物试样中本来含有的核酸,但是从能够提高检测精度的角度,可以举出以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过PCR等扩增法扩增含有ABCC2基因的突变了的位点的区域而得到的扩增产物。所述扩增产物的长度无特别限制,例如可以设为50~1000mer或者80~200mer。另外,试样中的核酸例如可以是从源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。
在本发明中,本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA,例如可以为1倍以下。另外,从充分确保检测信号的观点来说,可以将本发明的多态性检测用探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以下。
这里,试样中的核酸例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象核酸和未发生所述多态性的非检测对象核酸的合计,也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外,试样中的核酸中的所述检测对象核酸的比例通常是不清楚的,但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物),所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)可以设为10倍以下。另外,相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物),所述多态性检测用探针的添加比例(摩尔比)可以设为5倍以下或3倍以下。另外,其下限无特别限制,例如可以设为0.001倍以上,0.01倍以上或0.1倍以上。
本发明的多态性检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比,也可以是相对于单链核酸的摩尔比。
在本发明中,用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定可以基于前述那样的原理,通过260nm的吸光度测定来进行,可以测定如下信号:所述信号是基于所述多态性检测用探针上添加的标记的信号的信号,并且该信号根据单链DNA和所述多态性检测用探针的杂交体形成的状态而变动。因此,能够使用前述的荧光标记寡核苷酸来作为所述多态性检测用探针。作为所述荧光标记寡核苷酸,例如可以举出与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度比未与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸,或者与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度比未与靶标序列(互补序列)杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。
如果是前者那样的探针,则在该探针和检测对象序列形成了杂交体(双链核酸DNA)时,不显示荧光信号或荧光信号弱,但通过加热而探针解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。
另外,如果是后者的探针,则通过与检测对象序列形成杂交体(双链核酸DNA)而显示荧光信号,通过加热而探针解离时荧光信号减少(消失)。因此,通过在所述荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的变化,能够与所述260nm的吸光度测定同样地进行熔解的发生以及Tm值的确定。
接着,关于本发明的多态性检测方法,举出检测基于荧光染料的信号的变化的方法的具体例来进行说明。此外,本发明的多态性检测方法的特征在于使用所述多态性检测用探针,其他的步骤和条件没有任何限制。
作为含有进行核酸扩增时的模板的试样,只要是含有核酸尤其是ABCC2基因即可,无特别限制。例如大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外,试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制,均可采用现有的公知方法。另外,作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用,或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。
例如,在将全血作为试样的情况下,可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如,可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit;GE Healthcare Bioscience公司制造)等。
接着,向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针。
所述多态性检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液体试样中,也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特别限制,例如可以是Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。
所述多态性检测用探针的添加时机无特别限制,例如在进行后述的PCR等扩增处理的情况下,可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物中,也可以在扩增处理前添加。
如此,在利用PCR等进行扩增处理前添加所述检测用探针的情况下,例如,如前所述,可以在所述检测用探针的3’末端添加荧光染料,或者添加磷酸基。
作为核酸扩增的方法,例如可以为利用聚合酶的方法等。作为其示例,可以举出PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。在通过利用聚合酶的方法进行扩增的情况下,能够在本发明探针存在的情况下进行扩增。根据使用的探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等对本领域技术人员来说是容易的。由此,在核酸扩增后仅通过分析探针的Tm值就能够评价多态性,因此在反应结束之后不需要处理扩增产物。由此,不用担心所述扩增产物带来的污染。另外,由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测,因此不需要移动容器,容易自动化。
另外,作为使用PCR法的DNA聚合酶,可以使用通常所用的DNA聚合酶,无特别限制。例如可以为GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。
作为聚合酶的使用量,只要是采用通常使用的浓度即可,无特别限制。例如在使用Taq聚合酶的情况下,例如相对于反应溶液量50μl,可以为0.01U~100U的浓度。由此,具有ABCC2基因多态性的检测灵敏度变高等的倾向。
另外,PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。
此外,在扩增时,例如也可以通过实时PCR来监视扩增,调查试样中包含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即,随着DNA(检测对象序列)通过PCR而扩增,形成杂交体的探针的比例增加,因此荧光强度发生变动。通过对此进行监视,能够检测试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变DNA)的拷贝数和丰度比。
在本发明的多态性检测方法中,使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触,由此使两者杂交。试样中的单链核酸例如能够通过将前述那样得到的PCR扩增产物解离而制备。
所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度只要是所述扩增产物能够解离的温度则无特别限制。例如为85~95℃。加热时间也无特别限制。加热时间例如可以为1秒~10分钟,或1秒~5分钟。
另外,解离的单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件例如为40~50℃。
杂交步骤的反应液中的各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体例,所述反应液中的DNA的浓度例如可以为0.01μM~1μM,或0.1μM~0.5μM。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于所述DNA的添加比例的范围,例如可以为0.001μM~10μM,或0.001μM~1μM。
然后,将所得的所述单链DNA和所述荧光标记寡核苷酸的杂交体慢慢加热,测定随温度上升的荧光信号的变动。例如当使用了Q Probe时,在其与单链DNA杂交的状态下,与解离状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此,例如将荧光减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热并测定随温度上升的荧光强度的增加即可。
对荧光强度的变动进行测定时的温度范围无特别限制,例如起始温度可以为室温~85℃,或25~70℃。结束温度例如可以为40~105℃。另外,温度的上升速度无特别限制,例如可以为0.1℃/秒~20℃/秒,或0.3℃/秒~5℃/秒。
接着,分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言,基于所得的荧光强度来计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt),将显示最低值的温度确定为Tm值。另外,可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。此外,在标记探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下,相反地测定荧光强度的减少量即可。
另外,在本发明中,如前所述,对杂交体进行加热,并测定伴随温度上升的荧光信号变动(优选荧光强度的增加),但替代该方法,例如也可以测定杂交体形成时的信号变动。即,也可以对降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体时随所述温度下降的荧光信号变动进行测定。
作为具体例,在使用Q Probe的情况下,当在试样中添加了所述探针时,所述探针处于解离状态因此荧光强度大,当由于温度下降而形成杂交体时,所述荧光减少(或淬灭)。因此,例如可以慢慢降低所述加热的试样的温度,并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。
另一方面,在使用由于杂交体形成而信号增加的标记探针的情况下,当在试样中添加了所述探针时,所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭),但是在由于温度下降而形成杂交体时,荧光强度增加。因此,例如可以慢慢降低所述试样的温度,并测定随温度下降的荧光强度的增加。
此外,在本发明的多态性检测方法中,通过使用从包括MDR1基因的多态性检测用探针和CYP3A5基因的多态性检测用探针的组中选择的至少一种探针,除了ABCC基因的多态性之外,还能够检测从包括MDR1基因和CYP3A5基因的组中选择的至少一种基因的多态性。
而且,通过并用ABCC2基因的多态性检测用探针、MDR1基因的多态性检测用探针和CYP3A5基因的多态性检测用探针,不仅能够在一个体系中简便地检测这三种基因的多态性,而且能够更加正确地预测对药剂的耐受性和有效性。
作为在同一体系中检测多个基因多态性的方法,无特别限制。例如,可以预先将能够检测各个多态性的各个探针混合后添加到试样中,也可以将能够检测各个多态性的各个探针连续添加到含有单链核酸的试样中。
这里,“体系”是指用含有由荧光标记寡核苷酸和单链核酸杂交的杂交体的试样形成的一个独立的反应体系。
本发明中的“MDR1基因”是已公知的,其碱基序列的一部分相应于NCBI的dbSNP登录号No.rs1045642的1~511的序列。
另外,本发明中的“CYP3A5基因”是已公知的,其碱基序列的一部分是指NCBI的dbSNP登录号No.rs776746的1~801的序列。
作为所述MDR1基因的多态性检测用探针,只要是能够检测MDR1基因的多态性的探针即可,无特别限制,可以设为能够检测MDR1基因的外显子26的多态性的探针,也可以设为能够检测MDR1基因的第3435位的碱基的多态性的探针。
作为这些用于检测MDR1基因的多态性的探针,例如可以举出日本专利文献特开2005-287335号公报中记载的探针等。另外,例如也可以举出由序列编号19所示的碱基序列构成的探针等。
作为所述CYP3A5基因的多态性检测用探针,只要能够检测CYP3A5基因的多态性的探针即可,无特别限制,可以设为能够检测CYP3A5基因的内含子3的多态性的探针,也可以设为能够检测CYP3A5基因的第6986位的碱基的多态性的探针。例如可以举出包括序列编号20所示的碱基序列的探针等。
<药效判定方法>
本发明的药效判定方法包括:通过上述的多态性检测方法来检测ABCC2基因的多态性;以及基于所述检测结果来判定对药剂的耐受性或者药剂的药效。
在上述的多态性检测方法中,使用本发明的多态性检测用探针来灵敏度良好且简便地检测ABCC2基因的多态性,因此能够基于ABCC2基因中的所述多态性来灵敏度良好且简便地进行药剂的判定。
另外,能够基于多态性的有无或者突变序列和正常序列的丰度比来判定对药剂的耐受性或药剂的药效。并且,本发明的药效判定方法在基于有无突变、突变序列的丰度比来确定疾病的治疗方针中有用,例如增加药剂施与量、改为其他治疗药等治疗方针的更改。
作为所述判定对象的药剂,具体地,可以举出免疫抑制剂、分子靶向治疗药、抗抑郁药等,尤其可以举出免疫抑制剂和分子靶向治疗药。
<多态性检测用试剂盒>
本发明的用于检测ABCC2基因的多态性的ABCC2基因多态性检测用试剂盒包含上述的多态性检测用探针。
该多态性检测用试剂盒通过包含至少一种能够简便并且灵敏度良好地检测ABCC2基因中序列编号1所示的序列中的第207位的碱基的多态性的上述的多态性检测用探针,例如具有能够更简便地进行ABCC2基因的多态性的检测的倾向。
另外,本发明的多态性检测用试剂盒也可以还包含能够扩增含有作为上述检测对象的ABCC2基因多态性的序列的引物。由此,本发明的多态性检测用试剂盒能够高精度地进行ABCC2基因的多态性的检测。
另外,本发明的多态性检测用试剂盒除了ABCC2基因的多态性检测用探针之外,也可以还包含从包括上述的MDR1基因的多态性检测用探针以及CYP3A5基因的多态性检测用探针的组中选择的至少一种探针。
此外,关于多态性检测用试剂盒中可包含的探针以及引物,能够直接适用前述的部分。
在含有两种以上的荧光标记寡核苷酸作为多态性检测用探针的情况下,各个荧光标记寡核苷酸既可以以混合的状态被包含,也可以单独被包含。
两种以上的所述多态性检测用探针可以通过发光波长互不相同的荧光染料被标记。
如此通过改变荧光物质的种类,即使在相同的反应体系中也能够同时进行针对各个探针的检测。
另外,本发明中的检测用试剂盒除了所述探针和所述引物之外,也可以还含有进行本发明检测方法中的核酸扩增所需要的试剂类。另外,所述探针、所述引物和其他试剂类可以被单独容纳,它们的一部分也可以形成为混合物。
此外,“单独收容”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可,不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。
通过包含能够扩增含有多态性位点的序列(与探针杂交的区域)的引物对,例如能够更高灵敏度地检测多态性。
另外,本发明的多态性检测用试剂盒可以含有记载了使用所述多态性检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测ABCC2基因中的多态性的使用说明书,或者是记载了检测用试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书。
实施例
下面说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。
[实施例1]
使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标),爱科来公司制)和下述表4记载的处方的检查用试剂,进行了PCR和Tm分析。此外,使用的聚合酶为Taq聚合酶。
表4
检查用试剂
反应液处方(最终浓度)反应液量50μl | |
缓冲液1×PCR buffer | |
dNTP | 0.2mM |
MgCl2 | 1.5mM |
Taq聚合酶 | 1.88U |
100μM MDR1 F112-131 | 1μM |
100μM MDR1 R3 | 0.5μM |
100μM CYP3A5*3F4 | 0.25μM |
100μM CYP3A5*3R4 | 0.5μM |
100μM ABCC2-C-24T-F1 | 0.5μM |
100μM ABCC2-C-24T-R1 | 1μM |
100μM 3PB-MDR1-T-R1-19 | 0.4μM |
100μM 3FL-CYP3A5*3-mt-F21 | 0.2μM |
100μM 3T-ABCC2-C-24T-mt-F2 | 0.2μM |
此外,上述表4中使用的探针和引物的详细分别示于以下的表5和表6。此外,探针中的3’末端的括弧内表示荧光染料的种类。
表5
探针的种类 | 名称 | 序列(5’→3’) | (mer) | 序列编号 |
用于MDR1基因多态性 | 3PB-MDR1-T-R1-19 | ctgccctcacAatctcttc-(Pacific Blue) | 19 | 19 |
用于CYP3A5基因多态性 | 3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21 | ttgtctttcaGtatctcttcc-(BODIPY FL) | 21 | 20 |
用于ABCC2基因多态性 | 3T-ABCC2-C-24T-mt-F2 | tctggaacAaagactcttc-(TAMRA) | 19 | 12 |
表6
引物的种类 | 名称 | 序列(5’→3’) | (mer) | 序列编号 |
用于MDR1基因多态性 | MDR1 F112-131 | actgcagcattgctgagaac | 20 | 21 |
用于MDR1基因多态性 | MDR1 R3 | cagagaggctgccacatgctc | 21 | 22 |
用于CYP3A5基因多态性 | CYP3A5*3F4 | cgtatgtaccacccagcttaacg | 23 | 23 |
用于CYP3A5基因多态性 | CYP3A5*3R4 | cacaggagccacccaagg | 18 | 24 |
用于ABCC2基因多态性 | ABCC2-C-24T-F1 | cttctccagcatgattcctggac | 23 | 17 |
用于ABCC2基因多态性 | ABCC2-C-24T-R1 | atcagaatggtagataattcctgttccact | 30 | 18 |
在PCR中,在95℃下处理60秒之后,以95℃下1秒以及61℃下30秒为一个循环,反复进行50个循环的处理。
另外,在Tm分析中,在PCR之后,在95℃下处理1秒、在40℃下处理60秒,接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高至75℃,并测定了其间荧光强度随时间的变化。
此外,荧光染料Pacific Blue的激发波长为365nm~415nm,检测波长为445nm~480nm。荧光染料BODIPY FL的激发波长为420nm~485nm,检测波长为520~555nm。荧光染料TAMRA的激发波长为520nm~555nm,检测波长为585nm~700nm。通过各个波长分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
模板使用了全血和精制基因组(Roche公司制)。
全血如下制备。
将全血10μl加入至80μl的稀释液1中混合均匀之后,将该混合液10μl加入至80μl的稀释液2中。将该混合液17μl在95℃下加热10分后得到4μl的经前处理的全血。将其用作每个测试(test)的模板。
表7
稀释液1 | |
Tris-HCL(pH8.0) | 10mM |
EDTA(pH8.0) | 0.1mM |
SDS | 0.30% |
表8
稀释液2 | |
Tris-HCL(pH8.0) | 10mM |
EDTA(pH8.0) | 0.1mM |
每个测试使用了4μl的30拷贝/μl的精制基因组(Roche公司制)。
通过Tm分析获得了示出探针的荧光值的变化量的图2的(A)~(F)。在图中,纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t),横轴表示温度(℃)。
图2的(A)示出了在将全血用作模板时的MDR1基因中,关于野生型的峰和C3435T突变型的峰两者都能够获得清楚的峰。
图2的(D)示出了在将人类基因组用作模板时的MDR1基因中,关于野生型的峰和C3435T突变型峰两者都能够获得清楚的峰。
图2的(B)示出在将全血用作模板时的CYP3A5基因中,关于野生型(*1)的峰和突变型(*3)的峰两者能够获得清楚的峰。
图2的(E)示出了在将人类基因组用作模板时的CYP3A5基因中,关于突变型(*3)的峰能够获得清楚的峰。
图2的(C)示出了在将全血用作模板时的ABCC2基因中,关于野生型的峰能够获得清楚的峰。
图2的(F)示出了在将人类基因组用作模板时的ABCC2基因中,关于野生型的峰和C-24T突变型的峰两者能够获得清楚的峰。
[实施例2]
使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)和下述表9记载的处方的反应液进行了Tm分析。
表9
处方
反应液处方(最终浓度)反应液量50μl | |
1×PCR缓冲液 | |
dNTP | 0.2mM |
MgCl2 | 1.5mM |
5μM探针 | 0.4μM |
5μM互补链 | 0.4μM |
在Tm分析中,在PCR之后,在95℃下处理1秒,在40℃下处理60秒,接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃升高至75℃,并测定其间荧光强度随时间的变化。由于使用TAMRA作为荧光染料,因此激发波长为520nm~555nm,检测波长为585nm~700nm。通过各个波长,分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。
多态性检测用探针使用了作为含有序列编号1所示的序列中的第207位~第217位的碱基的碱基长为19的序列的、并且第217位的碱基用荧光染料(TAMRA)被标记的荧光标记寡核苷酸(tctggaacAaagactcttc序列编号12)。
使用单链核酸ABCC2-C--24T-WT(atattaatagaagagtcttTgttccagacgcagtccagga序列编号25)作为野生型的模板,使用单链核酸ABCC2-C--24T-mt(atattaatagaagagtcttCgttccagacgcagtccagga序列编号26)作为突变型的模板,使用以1:1的比例混合了单链核酸ABCC2-C--24T-WT和单链核酸ABCC2-C--24T-mt的混合物作为混合型的模板。
通过Tm分析获得了示出探针的荧光值的变化量的图3的(A)~。(C)。图3的(A)示出了野生型的结果,图3的(B)示出了突变型的结果,图3的(C)示出了混合型的结果。图中,纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t),横轴表示温度(℃)。
从该结果可知,在图3的(A)~(C)的任何一者的情况下,都能够获得能够识别野生型和突变型的峰。
[比较例1]
除了将多态性检测用探针从序列编号12记载的碱基序列所示的3T-ABCC2-C--24T-mt-F2(tctggaacAaagactcttc-(TAMRA))变更为序列编号27记载的碱基序列所示的3T-ABCC2-C--24T-mt-F1((TAMRA)-ctggaacAaagactcttctatt-(磷酸化))之外,与实施例2同样地进行了Tm分析。
其结果,获得了示出探针的荧光值的变化量的图4的(A)~。(C)。图4的(A)示出了野生型的结果,图4的(B)示出了突变型的结果,图4的(C)示出了混合型的结果。图中,纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t),横轴表示温度(℃)。
在Tm分析中,由于随着温度上升,探针解离、荧光值上升,因此峰变为凸型才能进行正常的判定。但是,如图4的(A)~(C)所示,明确了在使用3T-ABCC2-C--24T-mt-F1作为多态性检测用探针的情况下,由于峰的形状为凹型,因此不能正常的判定。
如上文所述,通过本发明,能够高灵敏度且简便地检测ABCC2基因的多态性。
日本申请特愿2011-102986(申请日2011年5月2日)公开的全部内容通过参考被并入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请以及技术规格,与每个文献、专利申请以及技术规格通过参考被并入的具体并且分别记载的情况同等程度地通过参考被并入本说明书中。
Claims (8)
1.一种多态性检测用探针,其为由序列编号12所示的碱基序列所构成的荧光标记寡核苷酸,用于检测ABCC2基因的多态性,其中,所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的碱基。
2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光,并且在与该靶标序列杂交时荧光强度减少。
3.根据权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针。
4.根据权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述多态性检测用探针为用于分析熔解曲线的探针,所述荧光标记寡核苷酸在3’末端具有荧光标记的碱基,并且在未与靶标序列杂交时发出荧光,在与该靶标序列杂交时荧光强度减少。
5.一种多态性检测用试剂盒,用于检测ABCC2基因的多态性,所述多态性检测用试剂盒包含权利要求1至4中任一项所述的多态性检测用探针。
6.根据权利要求5所述的多态性检测用试剂盒,还包含:能够扩增含有与权利要求1所述的荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。
7.根据权利要求5所述的多态性检测用试剂盒,还包含:从包括用于检测MDR1基因的多态性的探针以及用于检测CYP3A5基因的多态性的探针的组中选择的至少一种以上的多态性检测用探针。
8.根据权利要求5所述的多态性检测用试剂盒,还包含:能够扩增含有与权利要求1所述的荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域的引物;以及
从包括用于检测MDR1基因的多态性的探针以及用于检测CYP3A5基因的多态性的探针的组中选择的至少一种以上的多态性检测用探针。
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