CN102329857A - abl基因多态性的检测用探针和其用途 - Google Patents

abl基因多态性的检测用探针和其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医疗和诊断领域。具体而言，本发明涉及abl基因多态性的检测用探针和其用途。本发明公开了一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自P1～P9的至少1种荧光标记寡核苷酸构成。本发明还公开了利用本发明探针的检测方法和试剂盒。本发明的探针特异性高，具有优异的检测灵敏度。采用本发明探针的检测方法步骤简单，容易自动化。

Description

abl基因多态性的检测用探针和其用途
技术领域
本发明涉及用于检测与白血病相关的abl基因的多态性的探针和其用途。 
背景技术
白血病是由骨髓中的造血干细胞癌化而引起的疾病。已知其中慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia：CML)的发病原因在于9号染色体和22号染色体的易位而形成的bcr-abl融合基因，其治疗中广泛使用作为ABL激酶抑制剂的伊马替尼等。然而，该abl基因(包括前述融合基因中的abl基因)中存在点突变时，存在对伊马替尼表现出耐受性的问题，这种情况下，治疗中需要增加伊马替尼给药量、换成其它治疗药物、改为骨髓移植等等。因此，白血病特别是CML的治疗中，检测abl基因中有无点突变是非常重要的。 
作为abl基因中的点突变的检测方法，可以列举出：对abl基因变异，通过RT-PCR进行扩增、克隆后进行序列解析的方法(PNAS August 6，2002 vol.99 no.16 10700-10705)；用PCR-RFLP法对abl基因变异进行检测的方法(Leukemia(2002)16，2190-2196)；用DHPLC法对abl基因变异进行检测、序列解析的方法(Clin Cancer Res 2006；12(24)December 15，2006)等。然而，PNAS 2002中所述的方法在实验操作方面需要专业知识和技能，难以自动化。此外，实验操作方面也需要花费功夫，至获得结果为止需要数天。Leukemia 2002中所述的方法操作也繁杂，至获得结果为止需要1天左右。此外，有扩增产物污染其它反应之虞(发生污染)。且难以自动化。Clin Cancer Res 2006中所述的方法操作也繁杂，难以自动化。此外，DHPLC法难以区别突变型，需要通过测序法等另行对突变型进行检测。 
由这样的问题出发，近年正在进行利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测，来作为基因多态性的检测方法(日本特开2001-286300，日本特开2002-119291)。其为如下方法，即，使用与含有检测目的基因多态性的检测对象序列互补的探针，形成检测试样的目标单链DNA和前述探针的杂交体(双链DNA)，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的测定，来检测随温度上升的杂交体的解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值，从而判断有无目的多态性。在杂交产物的同源性越高时，Tm值越高，在同源性越低时，Tm值越低。因此，对含有目的多态性的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物预先求出Tm值(评价基准值)，测定检测试样的目标单链DNA和前述探针的Tm值(测定值)，若测定值与评价基准值相同则可以判断为匹配，即目标DNA中存在目的多态性，若测定值低于评价基准值则可以判断为错配，即目标DNA中不存在目的多态性。 
然而，使用这样的Tm分析的检测方法，存在灵敏度低这样的问题。在对白血病患者的血细胞来源DNA进行点突变检测时，这特别成问题(日本特表2004-537992)。即，即使是一个CML患者的血液，其血细胞中也包含abl基因发生点突变的基因(变异基因)和未发生突变的基因(正常基因)，两者的不同仅在于点突变即一个碱基的序列。这样，会发生如下现象：用于检测点突变的探针与含有点突变的变异序列(检测对象序列)杂交(匹配)，还与不含点突变的正常序列(非检测对象序列)进行杂交(错配)。这种情况下，利用Tm分析制作表示信号强度和温度的关系的熔解曲线时存在如下问题：匹配的变异序列所对应的高温侧的峰由于错配的正常序列所对应的低温侧的峰的存在而难以检测。即，就现有的探针而言，即使在含有变异的变异序列存在的情况下，也由于不含变异的正常序列的存在而变得难以检测，存在检测灵敏度降低的问题。 
WO2008/018305中记载了在利用Tm分析的检测方法中使用的、对 abl基因中的点突变即A758T(Y253F)、G756C(Q250E)、G763A(E255K)、和A758T(Y253F)进行检测的探针。此外，日本特开2008-199965中记载了对A730G(M244V)、G749A(G250E)、A943G(T315A)、C944T(T315I)、C951G(F317L)、T1052C(M351T)、A1064G(E355G)、T1075G(F359V)、和A1187G(H396R)进行检测的探针。然而，对T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)进行检测的探针在所有文献中均没有记载。 
发明内容
本发明的课题在于确立一种对于检测abl基因中的点突变T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)有效的检测用探针，提供对abl基因中的点突变T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)进行检测的方法、以及用于该检测的试剂盒。 
本发明人发现，通过基于abl基因中的含有点突变T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)的特定区域设计探针并进行使用该探针的Tm分析，能够检测该变异位点的多态性，从而完成了本发明。 
即，本发明包括以下发明。 
(1)一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自下述P1～P9的至少1种荧光标记寡核苷酸构成。 
(P1)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号1或2所示的碱基序列中的包含碱基号125～133的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶； 
(P2)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所 示的碱基序列中的包含碱基号135～146的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶； 
(P3)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶； 
(P3’)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶； 
(P4)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号134～135的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶； 
(P5)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号138～142的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶； 
(P6)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～153的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶； 
(P7)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～150的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶； 
(P8)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6～8所示的碱基序列中的包含碱基号126～135的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶； 
(P9)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6～8所示的碱基序列中的包含碱基号126～129的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号129对应的碱基为胞嘧啶。 
(2)根据(1)所述的探针， 
P1的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号125对应的碱基， 
P2的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号146对应的碱基， 
P3和P3’的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基， 
P4的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号134对应的碱基， 
P5的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号138对应的碱基， 
P6的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号153对应的碱基， 
P7的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号150对应的碱基， 
P8的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号135对应的碱基， 
P9的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号129对应的碱基。 
(3)根据(1)所述的探针， 
P1的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号125对应的碱基， 
P2的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号146对应的碱基， 
P3和P3’的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基， 
P4的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号134对应的碱基， 
P5的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号138对应的碱基， 
P6的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号153对应的碱基， 
P7的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号150对应的碱基， 
P8的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号135对应的碱基， 
P9的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号129对应的碱基。 
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少或增加。 
(5)根据(4)所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光，杂交到目标序列时荧光强度减少。 
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的探针，P1、P3、P3’、P4、P5、P7、P8和P9的寡核苷酸的碱基长为10～30，P2和P6的寡核苷酸的碱基长为12～30。 
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的探针，前述探针为熔解曲线分析用探针。 
(8)一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，使用(1)～(7)中任一项所述的探针。 
(9)一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，包括下述工序(I)～(IV)： 
(I)在含有DNA的试样中添加(1)～(7)中任一项所述的探针使前述探针杂交到前述DNA的工序； 
(II)改变温度而使前述DNA和前述探针的杂交产物解离并测定基于杂交产物的解离的信号变动的工序； 
(III)解析前述信号变动而确定Tm值的工序；和 
(IV)由前述Tm值确定有无目的多态性或具有多态性的碱基序列的存在比的工序。 
(10)根据(9)中所述的方法，还包括在(I)工序之前或与(I)工序同时地扩增DNA的步骤。 
(11)对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的判断方法，其包括：根据(8)～(10)中任一项所述的方法检测abl基因中的多态性的工序、和基于有无多态性而判断对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的工序。 
(12)一种用于检测abl基因中的多态性的试剂盒，其含有(1)～(7)中任一项所述的探针。 
(13)根据(12)中所述的试剂盒，其还含有用于扩增abl基因的下述区域的引物，所述区域为：序列号1所示的碱基序列中的、包含P1的寡核苷酸所杂交的序列的区域，序列号3所示的碱基序列中的、包含P2、P3、P3’、P4、P5、P6或P7的寡核苷酸所杂交的序列的区域，或序列号6所示的碱基序列中的、包含P8或P9的寡核苷酸所杂交的序列的区域。 
予以说明，在上述中，abl基因的多态性还包括该基因的附近区域的多态性。 
根据本发明的探针，即使是具有检测目的变异的abl基因(包括bcr-abl融合基因中的abl基因。以下同样。)(变异基因)和未发生变异的abl基因(正常基因)共存的情况下，也能够检测发生了前述目的变异的检测对象序列。Tm分析中，探针与仅一个碱基不同的变异基因和正常基因这两者杂交时，熔解曲线中两者的信号重叠，检测变异基 因的存在是非常困难的。与此相对，本发明的探针虽与变异基因和正常基因这两者杂交，但熔解曲线中两者的信号能够充分分离。因此，根据本发明能够以比以前更优异的灵敏度对变异基因进行检测。 
若预先将本发明的探针添加到PCR等基因扩增体系中，则基因扩增反应结束后仅进行Tm分析即能够以高灵敏度进行多个基因变异型的分型。进而，由于能够直接检查全血、口腔粘膜悬浮液等，因此能够减少功夫和成本。 
本发明的探针特异性高，检测灵敏度高。 
通过使用本发明的方法，即使是进行PCR的情况下，也不必取出扩增产物，因此几乎不存在污染的危险性。此外，本发明的方法步骤简单，因此容易自动化。 
附图说明
图1中，(A)是表示核酸混合物的熔解曲线的一个例子的图，(B)是表示微分熔解曲线的一个例子的图。 
图2是表示标准曲线的一个例子的图。 
图3A表示的是实施例1的对含有T1076G(F359C)的质粒(变异含有率2.5％)使用序列号9(3’末端标记)的探针的Tm分析中的每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(℃)。 
图3B表示的是比较例1的对含有T1076G(F359C)的质粒(变异含有率2.5％)使用序列号9(5’末端标记)的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(℃)。 
图4A表示的是实施例2-1的对含有T757C(Y253H)的质粒(变异 含有率0％(I)、10％(II)、20％(III))使用序列号10的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图4B表示的是实施例2-2的对含有T757C(Y253H)的质粒(变异含有率10％)使用序列号11的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图4C表示的是实施例2-3的对含有T757C(Y253H)的质粒(变异含有率10％)使用序列号12的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图5A表示的是实施例3-1的对含有A764T(E255V)的探针的互补链(变异含有率10％)使用序列号13的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图5B表示的是实施例3-2的对含有A764T(E255V)的探针的互补链(变异含有率10％)使用序列号14的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图5C表示的是实施例3-3的对含有A764T(E255V)的探针的互补链(变异含有率10％)使用序列号15的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图5D表示的是实施例3-4的对含有A764T(E255V)的探针的互补链(变异含有率10％)使用序列号16的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图6A表示的是实施例4-1的对含有G895C(V299L)的质粒(变异含有率5％)使用序列号17的探针的Tm分析中每单位时间的BODIPY FL的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图6B表示的是实施例4-2的对含有G895C(V299L)的质粒(变异含有率5％)使用序列号18的探针的Tm分析中每单位时间的BODIPY FL的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图6C表示的是实施例4-3的对含有G895T(V299L)的质粒(变异含有率5％)使用序列号19的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
图6D表示的是实施例4-4的对含有G895T(V299L)的质粒(变异含有率5％)使用序列号20的探针的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量/t，横轴为温度(℃)。 
具体实施方式
本发明中，以下也将具有检测目的变异的abl基因称为“变异基因”，将具有检测目的变异的序列称为“变异序列”，将未发生检测目的变异的abl基因称为“正常基因”，将未发生检测目的变异的序列称为“正常序列”，将检测有无变异的试样中的DNA称为“目标DNA”。 
本发明中，作为所检测的多态性，可以列举出例如单核苷酸多态性(SNP)等。 
此外，本说明书中，T1076G(F359C)是指abl基因的1076位的碱基由T(野生型)变为G(变异型)的变异，括号内是指随着碱基的变异，359位的氨基酸由F变成C。其它变异的记载也同样。 
予以说明，abl基因的碱基序列已经登录为美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)登录号No.NG_012034。下述所示的序列号1、3、6的序列均包含于该序列中。 
以下对本发明的探针进行说明。 
<探针> 
如前所述，本发明的探针特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自前述P1～P9组成的组中的至少一个寡核苷酸构成。 
(P1)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号1或2所示的碱基序列中的包含碱基号125～133的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号125对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号1和2的碱基号125的g(鸟嘌呤)对应的互补碱基c(胞嘧啶)。P1探针中，优选该c存在于从3’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于3’末端。 
由P1的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号1的碱基序列中的133位碱基的多态性的探针。该碱基相当于T1076G变异的碱基，若为野生型则为T，若为变异型则为G。将包含T1076的区域的序列示于序列号1(野生型：133位为T)和2(变异型：133位为G)。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P1的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号1所示的碱基序列中的包含碱基号125～133的10～50碱基长的碱基序 列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号2所示的碱基序列中的包含碱基号125～133的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号9的碱基序列的探针。 
5’-cctgtggatgCagtttttc*-3’(序列号9) 
这里，c*表示在3’侧进行了荧光标记的c(以下同样)。 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的C为A。 
(P2)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135～146的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号146对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和4的碱基号146的g对应的互补碱基c。P2探针中，优选该c存在于从5’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于5’末端。 
由P2的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的135位的碱基的多态性的探针。该碱基相当于T757C变异的碱基，若为野生型则为T，若为变异型则为C。将包含T757C的区域的序列示于序列号3(野生型：135位为T)和4(变异型：135位为C)。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为12～30碱基长，更优选为15～30碱基长，进一步优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P2的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者 或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号135～146的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号4所示的碱基序列中的包含碱基号135～146的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号10的碱基序列的探针(大写字母表示变异碱基，以下相同)。 
5’-*cacctccccgtGctg-3’(序列号10) 
这里，*c表示在5’侧进行荧光标记的c(以下同样)。 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的G为A。 
(P3)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号144对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和4的碱基号144的g对应的互补碱基c。P3探针中，优选该c存在于从5’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于5’末端。 
由P3的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的135位的碱基的多态性的探针。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P3的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号135～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号4所示的碱基序列中的包含碱基号135～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号11的碱基序列的探针。 
5’-cctccccgtGctggc-3’(序列号11) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的G为A。 
(P3’)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号144对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和5的碱基号144的g对应的互补碱基c。P3’探针中，优选该c存在于从5’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于5’末端。 
由P3’的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。该碱基相当于A764T变异的碱基，若为野生型则为A，若为变异型则为T。将包括A764T的区域的序列示于序列号3(野生型：142位为A)和5(变异型：142位为T)。 
用于检测该多态性的探针优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长，可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号 142～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号142～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号16的碱基序列的探针。 
5’-*ccAccccgtactggcc-3’(序列号16) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。 
(P4)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号134～135的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号134对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和4的碱基号134的g对应的互补碱基c。P4探针中，优选该c存在于从3’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于3’末端。 
由P4的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的135位的碱基的多态性的探针。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P4的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号134～135的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶；被荧光 染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号4所示的碱基序列中的包含碱基号134～135的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号12的碱基序列的探针。 
5’-gtacacctccccgtGc*-3’(序列号12) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的G为A。 
(P5)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号138～142的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号138对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和5的碱基号138的g对应的互补碱基c。P5探针中，优选该c存在于从3’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于3’末端。 
由P5的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P5的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号138～142的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号138～142的10～50碱基长的碱基序列互补或同源 的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号13的碱基序列的探针。 
5’-cctcgtacaccAcccc*-3’(序列号13) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。 
(P6)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～153的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号153对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和5的碱基号153的g对应的互补碱基c。P6探针中，优选该c存在于从5’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于5’末端。 
由P6的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为12～30碱基长，更优选为15～30碱基长，进一步优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P6的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号142～153的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号142～153的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号14的碱基序列的探针。 
5’-*cctcgtacaccAcccc-3’(序列号14) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。 
(P7)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～150的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶 
这里，“与碱基号150对应的碱基”是指前述互补序列或同源序列中，与序列号3和5的碱基号150的g对应的互补碱基c。P7探针中，优选该c存在于从5’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于5’末端。 
由P7的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号3的碱基序列中的142位的碱基的多态性的探针。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P7的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有与序列号3所示的碱基序列中的包含碱基号142～150的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有与序列号5所示的碱基序列中的包含碱基号142～150的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号15的碱基序列的探针。 
5’-*cgtacaccAccccgta-3’(序列号15) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的A为T。 
(P8)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6～8所示的碱基序列中的包含碱基号126～135的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号135对应的碱基”是指前述序列中，序列号6～8的碱基号135的c。P8探针中，优选该c存在于从3’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于3’末端。 
由P8的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号6的碱基序列中的126位的碱基的多态性的探针。该碱基相当于G895C/T变异的碱基，若为野生型则为G，若为变异型则为C或T。将包含G895C的区域的序列示于序列号6(野生型：126位为G)、序列号7(变异型：126位为C)和8(变异型：126位为T)。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P8的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者或三者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有序列号6所示的碱基序列中的包含碱基号126～135的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号7所示的碱基序列中的包含碱基号126～135的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号8所示的碱基序列中的包含碱基号126～135的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号17或19的碱基序列的探针。 
5’-cctgCtgcagctcc-3’(序列号17) 
5’-aacctgTtgcagctcc*-3’(序列号19) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的C或T为G。 
(P9)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6～8所示的碱基序列中的包含碱基号126～129的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号129对应的碱基为胞嘧啶。 
这里，“与碱基号129对应的碱基”是指前述序列中，序列号6～8的碱基号129的c。P9探针中，优选该c存在于从3’末端数第1～3位的位置，更优选该c存在于3’末端。 
由P9的寡核苷酸构成的探针为用于检测序列号6的碱基序列中的126位的碱基的多态性的探针。 
用于检测该多态性的探针的长度优选为10～30碱基长，更优选为15～25碱基长。 
予以说明，由P9的寡核苷酸构成的探针可以是下述中的任意一者或两者或三者：被荧光染料标记的野生型检测用寡核苷酸，其具有序列号6所示的碱基序列中的包含碱基号126～129的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号129对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号7所示的碱基序列中的包含碱基号126～129的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号129对应的碱基为胞嘧啶；被荧光染料标记的变异型检测用寡核苷酸，其具有序列号8所示的碱基序列中的包含碱基号126～129的10～50碱基长的碱基序列或与该 碱基序列同源的序列，且与碱基号129对应的碱基为胞嘧啶。 
优选列举变异型检测用的具有下述序列号18或20的碱基序列的探针。 
5’-accctaacctgCtgc*-3’(序列号18) 
5’-tcaaacaccctaacctgTtgc*-3’(序列号20) 
予以说明，其所对应的野生型检测用探针中，大写的C或T为G。 
本申请中的“同源”是指相对于特定的碱基序列，具有与碱基序列的互补链或该碱基序列具有80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的同源性的序列的碱基序列。 
本发明的探针优选为未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸探针。其中，更优选未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸探针。这类利用了荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针通常被称为鸟嘌呤淬灭探针，已知有所谓的QProbe(注册商标)。其中，优选以将寡核苷酸设计为3’末端或5’末端为C而使得该末端的C接近G时发光变弱的方式用荧光染料进行标记的探针。 
予以说明，本说明书中，“从5’末端数第1～3位”的情况下，将5’末端数作第1位，“从3’末端数第1～3位”的情况下，将3’末端数作第1位。 
前述荧光染料没有限制，可以列举出例如荧光黄、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，市售的荧光染料可以列举出例如BODIPY FL(商标名，Molecular Probe公司制)、FluorePrime(商品名，FluAmersham Pharmacia公司制)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制)、FAM(ABI 公司制)、Cy3和Cy5(FluAmersham Pharmacia公司制)、TARMA(Molecular Probe公司制)等。探针的检测条件没有特别限制，可根据所使用的荧光染料适当决定，例如就Pacific Blue而言，可以在检测波长445～480nm下检测，就TAMRA而言，可以在检测波长585～700nm下检测，就BODIPY FL而言，可以在检测波长520～555nm下检测。使用这样的探针可以根据信号的变动而容易地确认杂交和解离。 
此外，本发明的探针例如可以在3’末端添加磷酸基。如后所述，用于检测有无变异的DNA(目标DNA)可以通过PCR等基因扩增法而制备，此时可以使本发明的探针共存于基因扩增反应的反应液中。这种情况下，若预先在探针的3’末端添加磷酸基则能够充分防止探针自身因基因扩增反应而伸长。此外，也可以通过在3’末端添加前述那样的标记物而获得同样的效果。 
具有上述碱基序列且5’末端或3’末端的C被荧光染料标记的探针的具体例子如下述表1所示(大写的碱基表示变异点，P表示磷酸基)。但本发明的探针并不限于以下探针。 
【表1】 
本发明的探针可以用于abl基因的多态性的检测。检测方法没有任何限定，只要是利用检测对象序列和探针的杂交的方法即可。作为应用本发明的探针的方法的一个例子，以下对利用Tm分析的多态性检测方法进行说明。 
<多态性检测方法> 
如前所述，本发明的多态性检测方法，其特征在于，其为abl基因中的多态性的检测方法，包含下述工序(I)～(IV)。予以说明，本发明的多态性检测方法特征在于使用本发明的探针，其它构成、条件等不受以下记载的限制。 
(I)在含有DNA的试样中添加本发明的探针使前述探针杂交到前述DNA的工序 
(II)对前述DNA和前述探针的杂交产物测定伴随温度变化的信号变动的工序 
(III)解析前述信号变动而确定Tm值的工序 
(IV)由前述Tm值确定有无目的多态性或具有多态性的碱基序列的存在比的工序 
予以说明，就(III)中确定Tm值而言，不仅包括确定Tm的温度，还包括确定Tm的峰高。通过峰高可以确定具有多态性的碱基序列的存在比。予以说明，为了进一步定量确定具有多态性的碱基序列的存在比，优选制作如下述所示的标准曲线并基于其确定存在比。 
下面以确定野生型和特定的变异型的存在比为例，示意出定量确定具有多态性的碱基序列的存在比的方法。但该方法仅仅是一个例子，确定具有多态性的碱基序列的存在比的方法不限定于此。 
首先制备野生型的核酸Wt和变异型的核酸Mt这两种核酸的存在比各自不同的多个核酸混合物，对多个核酸混合物分别使用熔解曲线 解析装置等获得熔解曲线。 
在图1的(A)中示出表示某一核酸混合物的温度和荧光强度的关系的熔解曲线，在图1的(B)中示出表示温度和荧光强度的微分值的关系的熔解曲线(也称为微分熔解曲线)。通过由该微分熔解曲线检测峰，从而分别检测核酸Wt的熔解温度TmW和核酸Mt的熔解温度TmM，并分别设定包含Tmw和TmM的温度范围。作为包含Tmw的温度范围ΔTw，例如能够设定如下温度范围：以在Tmw和TmM之间荧光强度的微分值最小的温度为下限，以与荧光强度的峰的峰脚下平原部对应的温度为上限。另外，作为包含TmM的温度范围ΔTM，例如能够设定如下温度范围：以在Tmw和TmM之间荧光强度的微分值最小的温度为上限，以与荧光强度的峰的峰脚下平原部对应的温度为下限。另外，温度范围ΔTw和温度范围ΔTM可以设定成同一宽度(例如10℃)，或设定成不同宽度(例如，温度范围ΔTw为10℃，温度范围ΔTM为7℃)。另外，温度范围ΔTw和温度范围ΔTM可以分别设定成各自的融解温度Tm+X℃的宽度、各自的融解温度Tm-X℃的宽度(X℃例如是15℃以内，优选为10℃以内)。 
接着，对于温度范围ΔTw和温度范围ΔTM，各自求出由通过微分融解曲线的温度范围的下限对应的点和上限对应的点所做的直线与微分融解曲线包围的面积(图1之(B)的斜线部分)。作为求算面积的方法之一例，具体来说可以如下求算。设温度T下的荧光强度的微分值为f(T)，温度T下的基线值为B(T)，通过下述式(1)来求得。 
面积S＝{f(Ts+1)-B(Ts+1)}+{f(Ts+2)-B(Ts+2)} 
+…+{f(Te-1)-B(Te-1)} …(1) 
其中，Ts是各温度范围的下限值，Te是上限值。另外，各温度T时的基线值B(T)是通过下述式(2)求得的值，其表示荧光强度的检测信号中所包含的背景水平。通过从荧光强度的微分值减去该基线值，能够去除荧光强度的检测信号中所包含的背景的影响。 
B(T)＝a×(T-Ts)+f(Ts)      …(2) 
其中，a＝{f(Te)-f(Ts)}/(Te-Ts)。 
按照上述式(1)和式(2)，对各核酸混合物求得温度范围ΔTw下的面积Sw和温度范围ΔTM下的面积SM，并制作表示面积比与各核酸混合物的存在比之间的关系的标准曲线。图2中示出了横轴采用存在比(核酸Mt相对于核酸混合物总量的比例)、纵轴采用面积比(SM/Sw)的标准曲线的一个例子。予以说明，面积比也可以规定为SW/SM。 
根据使用实际试样获得的融解曲线和微分融解曲线来算出面积比，并基于如上所述预先制作的标准曲线，能够确定实际试样中所含的具有多态性的碱基序列的存在比。 
在本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。在所述DNA为双链DNA的情况下，例如在进行前述杂交工序之间，优选包含通过加热而将所述试样中的双链DNA解离的工序。通过将双链DNA解离成单链DNA，在接下来的杂交工序中能够与检测用探针杂交。 
本发明中，试样所含的DNA例如可以是生物体试样原本含有的DNA，但为了提高检测精度，优选以生物体试样原本含有的DNA为模板通过PCR等扩增包含abl基因的变异位置的区域而获得的扩增产物。扩增产物的长度没有特别限制，例如为50～1000mer，优选为80～200mer。此外，试样中的DNA例如也可以是由生物体试样来源的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。 
应用本发明的多态性检测方法的试样可以列举出存在abl基因的试样。具体例子可以列举出白细胞等血细胞试样、全血试样等。予以说明，本发明中，试样的采集方法、DNA的制备方法等没有限制，可以 采用现有公知的方法。 
本发明中，本发明的探针相对于前述试样中的DNA的添加比例(摩尔比)没有限制，但为了充分确保检测信号，相对于试样中的DNA优选为1倍以下，更优选为0.1倍以下。此时，试样中的DNA既可以是指例如发生了检测目的多态性的检测对象DNA和未发生前述多态性的非检测对象DNA的合计，也可以是含有发生了检测目的多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生前述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。予以说明，试样中的DNA中的前述检测对象DNA的比例通常是未知的，但从结果来看，优选前述探针的添加比例(摩尔比)相对于检测对象DNA(包含检测对象序列的扩增产物)为10倍以下，更优选为5倍以下，进一步优选为3倍以下。此外，其下限没有特别限制，例如为0.001倍以上，优选为0.01倍以上，更优选为0.1倍以上。 
本发明的探针相对于前述DNA的添加比例既可以是例如相对于双链DNA的摩尔比，也可以是相对于单链DNA的摩尔比。 
下面对Tm值进行说明。持续加热含双链DNA的溶液的话，260nm处的吸光度会上升。这是由于双链DNA中双链间的氢键由于加热而解开，解离成单链DNA(DNA熔解)。并且所有的双链DNA解离成单链DNA后，其吸光度显示为开始加热时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍，可以由此判断已完成熔解。根据这种现象，熔解温度Tm通常指吸光度达到吸光度所有上升部分的50％时的温度。 
本发明中，用于确定Tm值的伴随温度变化的信号变动的测定虽然也可以基于前述原理通过测定260nm的吸光度而进行，但优选测定基于添加到本发明的探针的标记信号的、根据DNA和探针的杂交体形成状态而变动的信号。因此，优选使用前述标记化探针作为本发明的探针。前述标记化探针可以列举出例如未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针、或未 杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸探针。若为前者那样的探针，则与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号或者信号弱，但通过加热而探针游离时显示信号或者信号增加。此外，若为后者的探针，则通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示信号，通过加热而探针游离时信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测基于该标记的信号变化，从而能够与前述260nm的吸光度测定同样地进行熔解的进行以及Tm值的确定。标记化探针中的标记物如前所述，但优选为荧光染料标记化探针。 
接着列举以使用被荧光染料标记的标记化探针作为本发明的探针的例子对本发明的多态性检测方法进行说明。予以说明，本发明的多态性检测方法特征在于使用本发明的探针这点，其它工序、条件没有任何限制。 
首先，由全血分离基因组DNA。自全血中分离基因组DNA可以按照现有公知的方法进行，例如使用市售的基因组DNA分离试剂盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Biosciences K.K.制)等。 
接着，在含有分离的基因组DNA的试样中添加标记化探针。前述标记化探针例如为QProbe。该Qprobe通常是指探针末端的胞嘧啶碱基被荧光染料标记的探针，其通过与检测对象序列形成杂交体，前述荧光染料和检测对象序列的鸟嘌呤碱基相互作用，结果荧光减少(或淬灭)。标记化探针的序列如前所述，可以根据检测目的多态性而适当选择。 
前述检测用探针既可以添加到含有分离的基因组DNA的液体试样中，也可以在溶剂中与基因组DNA混合。前述溶剂没有特别限制，可以列举出例如Tris-H Cl等缓冲液，含有KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等 的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。 
前述检测用探针的添加时机没有特别限制，例如在后述进行PCR等扩增处理的情况下，既可以在扩增处理后对PCR扩增产物进行添加，也可以在扩增处理前添加。这样在利用PCR等的扩增处理前添加前述检测用探针的情况下，例如如前所述，优选在其3’末端添加荧光染料或磷酸基。 
优选以分离的基因组DNA为模板通过PCR等基因扩增法扩增包含发生了检测目的多态性的位点的序列(检测对象序列和/或非检测对象序列)。前述基因扩增法没有限制，可以列举出例如PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription-mediated amplification)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法等，优选PCR法。予以说明，以下以PCR法为例对本发明进行说明，但并非限定于此。予以说明，PCR的条件没有特别限制，可以按照现有公知的方法进行。 
PCR的引物的序列只要能够扩增目的检测对象序列和/或非检测对象序列(探针所杂交的区域)即可，没有特别限制、可根据目的序列通过现有公知的方法适当设计。引物的长度没有特别限制，可以设定为通常的长度(例如10～50mer)。下面示出使用前述P1～P9的探针时的、能够用于扩增检测对象序列的引物对的一个例子。予以说明，这些仅仅是例示，对本发明没有限定作用。 
P1探针用的引物对
正义引物 序列号21 
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’ 
反义引物 序列号22 
5’-tccatggcgcaggctgcctg-3’ 
P2～P4探针用的引物对
正义引物 序列号23 
5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’ 
反义引物 序列号24 
5’-cacggccaccgtcagg-3’ 
P8～P9探针用的引物对
正义引物 序列号25 
5’-gaaagaagctgcagtcatgaaagagat-3’ 
反义引物 序列号26 
5’-cgcgagaccctctcttcagagc-3’ 
P5～P7探针用的引物对也可以基于序列号3容易地设计。 
予以说明，扩增时可以通过实时PCR监测扩增并调查试样中所含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即，随着用PCR进行DNA(检测对象序列)扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光强度发生改变。通过对其进行监测，可以调查试样中所含的检测对象序列(正常DNA或变异DNA)的拷贝数、存在比。 
接着进行获得的PCR扩增产物的解离、和通过解离而获得的单链DNA和前述标记化探针的杂交。 
前述解离工序中的加热温度只要是前述扩增产物能够解离的温度即可，没有特别限制，为例如85～95℃。加热时间也没有特别限制，通常为1秒～10分钟，优选为1秒～5分钟。 
此外，解离的单链DNA和前述标记化探针的杂交可以通过例如在前述解离工序后降低前述解离工序中的加热温度而进行。温度条件为例如40～50℃。 
杂交工序的反应液中的各组分的体积、浓度没有特别限制。具体例子为前述反应液中的DNA的浓度为例如0.01～1μM，优选为0.1～ 0.5μM，前述标记化探针的浓度例如优选满足相对于前述DNA的添加比例的范围，例如为0.001～10μM，优选为0.001～1μM。 
然后缓慢加热所获得的前述单链DNA和前述标记化探针的杂交产物，测定伴随温度上升的信号的变动。例如使用Qprobe的情况下，在与单链DNA杂交的状态下，荧光减少(或淬灭)，在解离的状态下发出荧光。因此，缓慢加热例如荧光减少(或淬灭)状态的杂交产物并测定伴随温度上升的荧光强度的增加即可。 
测定荧光强度变动时的温度范围没有特别限制，例如起始温度为室温～85℃，优选为25～70℃，结束温度为例如40～105℃。此外，温度的上升速度没有特别限制，例如为0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。 
接着解析前述信号的变动，确定Tm值。具体而言，可以由获得的荧光强度算出各温度下的值(-d荧光强度增加量/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。此外，也可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。予以说明，在标记化探针并非使用淬灭探针而是使用单独时比形成杂交体时信号强度增加的探针的情况下，可以相反地测定荧光强度的减少量。 
前述Tm值可以通过例如现有公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等算出，此外也可以通过最近邻法(Nearest Neighbor Method)确定。 
此外，如前所述，本发明中也可以测定例如杂交体形成时的信号变动，来代替加热杂交产物并测定伴随温度上升的信号变动的方法。即，也可以在降低添加了前述探针的试样的温度而形成杂交产物时测定伴随前述温度下降的信号变动。 
作为具体例子，在使用未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目 标序列时荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针(例如QProbe)的情况下，将前述探针添加到试样中时，前述探针由于解离而发出荧光，但通过降低温度而形成杂交体时，前述荧光减少(或淬灭)。因此，例如缓慢降低前述已加热的试样的温度并测定伴随温度降低的荧光强度的减少即可。 
另一方面，使用通过形成杂交体信号增加的标记化探针的情况下，在将前述探针添加到试样中时，前述探针由于解离而不发出荧光，通过降低温度而形成杂交体时，则发出荧光。因此，例如缓慢降低前述试样的温度并测定伴随温度下降的荧光强度的增加即可。 
根据本发明的abl基因多态性检测方法，可以调查abl基因中是否存在与对抗白血病药剂(例如伊马替尼)的耐受性有关的变异。可以基于多态性的有无、变异序列和正常序列的存在比判断对抗白血病药的耐受性、抗白血病药的药效。并且本发明的方法在基于变异的有无、变异序列的存在比确定增加药剂的投与量、换成其它治疗药、改为骨髓移植等等白血病的治疗方针是有用的。 
<abl基因多态性检测用试剂盒> 
本发明的abl基因多态性检测用试剂盒特征在于，其为用于abl基因的多态性检测的试剂盒，含有本发明的探针。本发明的试剂盒中，本发明的探针可以是一种也可以是两种以上。为后者的情况下，两种以上的探针既可以是以混合状态被包含，也可以作为分开的试剂被包含。此外，两种以上的本发明探针以混合的状态被包含于本发明的探针试剂盒的情况下、以及作为分开的试剂被包含但在例如使用时在同一反应体系中进行各探针和各检测对象序列的Tm分析的情况下，各探针优选用不同的荧光物质进行标记。通过如此改变荧光物质的种类，即使是同一反应体系也能对各个探针进行检测。前述荧光物质例如优选为检测波长不同的物质。 
此外，abl基因多态性检测用试剂盒也可以含有用于扩增含有上述多态性位点的序列(探针所杂交的区域)的引物对。 
如前所述，abl基因中与白血病相关的多个变异是已知的，根据本发明的探针能够检测前述各种变异。与白血病相关的abl基因中，有时仅能检测到任意一个位置的变异，但有时能检测到多个位置的变异，因此通过检测多个变异并对这些结果进行综合判断，能够进行更好的诊断、治疗。因此，本发明的试剂盒中通过含有两种以上本发明的探针，能够更简便地进行用于诊断、治疗等的变异的检测。 
下面对本发明的实施例进行说明。但本发明不受下述实施例限定。 
【实施例1】 
abl基因的1076位碱基的点突变(T→G)
使用本发明的探针，利用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)，对abl基因中的1076位碱基的点突变(T→G)，进行PCR和Tm分析。 
将插入了序列号1所示的133位的碱基T处不具有变异的正常abl基因序列(序列号1)的质粒(wtDNA)、和插入了前述133位的碱基T突变成G的变异abl基因(abl酪氨酸激酶T1076G(F359C)，序列号2)的质粒(mtDNA)按照规定比例(mtDNA∶wtDNA＝25拷贝∶975拷贝)混合(变异含有率2.5％)，稀释制备成1000拷贝/μL，将其作为模板核酸。反应溶液配方如表2所示。PCR反应：在95℃下处理60秒后，以95℃1秒和64℃30秒为1个循环，重复进行50个循环。然后再在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒，接着使温度的上升速度为1℃/3秒，从40℃持续加热至95℃，测定经时的荧光强度变化(波长3：585～700nm)。 
【表2】 
Figure BSA00000540232700331
正义引物 序列号21 
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’ 
反义引物 序列号22 
5’-tccatggcgcaggctgcctg-3’ 
(实施例1) 
检测用探针P1 序列号9 
5’-cctgtggatgCagtttttc-(TAMRA)-3’ 
(比较例1) 
检测用探针 序列号9 
5’-(TAMRA)-cctgtggatgCagtttttc-P-3’ 
该探针与实施例1的检测用探针序列相同，但5’末端的c(作为序列号2的碱基号143的g的互补碱基的c)被荧光染料标记。 
其结果如图3所示。图3A为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析图。使用检测用探针P1进行PCR和Tm分析的结果是，在51℃附近可观察到wtDNA的峰，在61℃附近可观察到mtDNA的峰。 
由该结果可知，利用检测用探针P1，即使是mtDNA和wtDNA共存的情况下也可以提高mtDNA的检测灵敏度。 
与此相对，根据图3B，使用比较例1的检测用探针的情况下，几乎无法确认检测峰，无法获知有无变异。由以上的结果可以理解的是， 并非探针的任意一个c进行荧光标记均可，125位的g的互补碱基c被荧光标记是很重要的。 
【实施例2】 
abl基因的757位碱基的点突变(T→C)
使用本发明的探针，利用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)，对abl基因中的757位碱基的点突变(T→C)，进行PCR和Tm分析。 
将插入了序列号3所示的135位的碱基T处不具有变异的正常abl基因序列(序列号3)的质粒(wtDNA)、和插入了前述135位的碱基T变异为C的变异abl基因(abl酪氨酸激酶T757C(Y253H)，序列号4)的质粒(mtDNA)按照规定比例(mtDNA∶wtDNA＝100拷贝∶900拷贝)混合(变异含有率10％)，稀释调制成1000拷贝/μL，将其作为模板核酸进行反应。予以说明，对于检测用探针P2，就变异含有率20％和0％进行了评价。反应溶液配方如表3所示。PCR反应：在95℃下处理60秒后，以95℃1秒和58℃30秒为1个循环，重复进行50个循环。然后再在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒，接着使温度的上升速度为1℃/3秒，从40℃持续加热至95℃，测定经时的荧光强度变化(波长3：585～700nm)。 
【表3】 
正义引物 序列号23 
5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’ 
反义引物 序列号24 
5’-cacggccaccgtcagg-3’ 
(实施例2-1) 
检测用探针P2 序列号10 
5’-(TAMRA)-cacctccccgtGctg-P-3’ 
(实施例2-2) 
检测用探针P3 序列号11 
5’-(TAMRA)-cctccccgtGctggc-P-3’ 
(实施例2-3) 
检测用探针P4 序列号12
5’-gtacacctccccgtGc-(TAMRA)-3’ 
这些的结果如图4所示。图4是表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析图。图4中，(A)为实施例2-1的结果，(B)为实施例2-2的结果，(C)为实施例2-3的结果。根据(A)，使用检测用探针P2进行PCR和Tm分析的结果是，在变异含有率为0％时，仅能在52℃附近观察到wtDNA的峰(I)，在变异含有率为10％(II)、20％(III)时，可观察到wtDNA的峰且在58℃附近可观察到mtDNA的峰，mtDNA的峰随着变异含有率的增加而增大。使用检测用探针P3进行PCR和Tm分析的结果是，在56℃附近可观察到wtDNA的峰，在62℃附近可观察到mtDNA的峰(B)。使用检测用探针P4进行PCR和Tm分析的结果是，在57℃附近可观察到wtDNA的峰，在63℃附近可观察到mtDNA的峰(C)。 
由这些结果可知，利用检测用探针P2～4，即使mtDNA和wtDNA共存的情况下也能提高mtDNA的检测灵敏度。 
可以理解的是，序列号4的碱基号146、144或134位的g的互补碱基c被荧光标记是重要的。 
【实施例3】 
abl基因的764位碱基的点突变(A→T)
使用本发明的探针，利用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)，对abl基因中的764位碱基的点突变(A→T)，进行PCR和Tm分析。 
合成了序列号3所示的142位的碱基A处不具有变异的正常abl基因序列(wtDNA)的互补链寡核苷酸(序列号27)、和前述142位的碱基A变异为T的变异abl基因(abl酪氨酸激酶A764T(E255V))(mtDNA)的互补链寡核苷酸(序列号28)。然后将两者按照规定比例(mtDNA∶wtDNA＝1μM∶9μM)混合(变异含有率10％)。就探针的杂交和荧光强度的检测而言，将以下表4的组成的反应液添加到反应管中，在95℃处理1秒、40℃处理60秒，接着使温度的上升速度为1℃/3秒，从40℃持续加热至95℃，测定经时的荧光强度变化(波长3：585～700nm)。 
【表4】 
Figure BSA00000540232700361
互补链寡核苷酸 序列 
  序列号27(Wt)   ggcgggggccagtacggggAggtgtacgagggcgtgtgga
  序列号28(Mt)   ggcgggggccagtacggggTggtgtacgagggcgtgtgga
(实施例3-1) 
检测用探针P5 序列号13 
5’-cctcgtacaccAcccc-(TAMRA)-3’ 
(实施例3-2) 
检测用探针P6 序列号14 
5’-(TAMRA)-cctcgtacaccAcccc-P-3’ 
(实施例3-3) 
检测用探针P7 序列号15 
5’-(TAMRA)-cgtacaccAccccgta-P-3’ 
(实施例3-4) 
检测用探针P3’序列号16 
5’-(TAMRA)-ccAccccgtactggcc-P-3’ 
这些的结果如图5所示。图5是表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析图。图5中，(A)为实施例3-1的结果，(B)为实施例3-2的结果，(C)为实施例3-3的结果，(D)为实施例3-4的结果。使用检测用探针P5进行Tm分析的结果是，在56℃附近可观察到wtDNA的峰，在62℃附近可观察到mtDNA的峰(A)。使用检测用探针P6进行Tm分析的结果是，在55℃附近可观察到wtDNA的峰，在62℃附近可观察到mtDNA的峰(B)。使用检测用探针P7进行Tm分析的结果是，在50℃附近可观察到wtDNA的峰，在59℃附近可观察到mtDNA的峰(C)。使用检测用探针P3’进行Tm分析的结果是，在58℃附近可观察到wtDNA的峰，在63℃附近可观察到mtDNA的峰(D)。 
由这些结果可知，利用检测用探针P3’、5～7，即使mtDNA和wtDNA共存的情况下也能提高mtDNA的检测灵敏度。 
可以理解的是，序列号5的碱基号138、153、150或144位的g的互补碱基c被荧光标记是重要的。 
【实施例4】 
abl基因的895位碱基的点突变(G→C/T)
使用本发明的探针，利用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)，对abl基因中的895位碱基的点突变(G→C/T)，进行PCR和Tm分析。 
将插入了序列号6所示的126位的碱基G处不具有变异的正常abl基因序列(序列号6)的质粒(wtDNA)、和插入了前述126位的碱基G变异为C或T的变异abl基因(abl酪氨酸激酶G895C/T(V299L)，序列号7 或8)的质粒(mtDNA)按照规定比例(mtDNA∶wtDNA＝50拷贝∶950拷贝)混合(变异含有率5％)，稀释调制成1000拷贝/μL，将其作为模板核酸进行反应。反应溶液配方如表5所示。PCR反应：在95℃下处理60秒后，以95℃1秒和64℃15秒为1个循环，重复进行50个循环。然后再在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒，接着使温度的上升速度为1℃/3秒，从40℃持续加热至95℃，测定经时的荧光强度变化(波长2：520～555nm、波长3：585～700nm)。 
【表5】 
正义引物 序列号25 
5’-gaaagaagctgcagtcatgaaagagat-3’ 
反义引物 序列号26 
5’-cgcgagaccctctcttcagagc-3’ 
(实施例4-1) 
检测用探针P8 序列号17 
5’-cctgCtgcagctcc-(BODIPY FL)-3’ 
(实施例4-2) 
检测用探针P9 序列号18 
5 ’-accctaacctgCtgc-(BODIPY FL)-3’ 
(实施例4-3) 
检测用探针P8 序列号19 
5’-aacctgTtgcagctcc-(TAMRA)-3’ 
(实施例4-4) 
检测用探针P9 序列号20 
5’-tcaaacaccctaacctgTtgc-(TAMRA)-3’ 
这些的结果如图6所示。图6是表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm分析图。图6中，(A)为实施例4-1的结果，(B)为实施例4-2的结果，(C)为实施例4-3的结果，(D)为实施例4-4的结果。使用检测用探针P8进行PCR和Tm分析的结果是，在47℃附近可观察到wtDNA的峰，在61℃附近可观察到mtDNA的峰(A)。使用检测用探针P9进行PCR和Tm分析的结果是，在44℃附近可观察到wtDNA的峰，在58℃附近可观察到mtDNA的峰(B)。使用检测用探针P8进行PCR和Tm分析的结果是，在52℃附近可观察到wtDNA的峰，在61℃附近可观察到mtDNA的峰(C)。使用检测用探针P9进行PCR和Tm分析的结果是，在58℃附近可观察到wtDNA的峰，在63℃附近可观察到mtDNA的峰(D)。 
由这些结果可知，利用检测用探针P8、9，即使mtDNA和wtDNA共存的情况下也能提高mtDNA的检测灵敏度。 
可以理解的是，序列号7、8的碱基号135位或129位的c被荧光标记是重要的。 
根据实施例1～4的结果，使用P1～9(序列号9～20)的探针时，对abl基因的多态性(T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L))能确认到通过Tm分析能够解析的荧光强度变化。即，就变异型而言，在野生型的峰的基础上还具有其它峰，存在固有的荧光强度变化量图案的变化。因此通过使用P1～9(序列号9～20)的探针能够对abl基因的多态性进行检测。 
产业上的可利用性
本发明适合用于医疗、诊断、研究等领域。 
Figure ISA00000540232900011
Figure ISA00000540232900021
Figure ISA00000540232900031
Figure ISA00000540232900041
Figure ISA00000540232900051
Figure ISA00000540232900061
Figure ISA00000540232900071
Figure ISA00000540232900081
Figure ISA00000540232900091

Claims (13)

1.一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测abl基因的多态性的探针，由选自下述P1～P9的至少1种荧光标记寡核苷酸构成，
(P1)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号1或2所示的碱基序列中的包含碱基号125～133的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号125对应的碱基为胞嘧啶；
(P2)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135～146的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号146对应的碱基为胞嘧啶；
(P3)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号135～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；
(P3’)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～144的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号144对应的碱基为胞嘧啶；
(P4)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或4所示的碱基序列中的包含碱基号134～135的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号134对应的碱基为胞嘧啶；
(P5)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号138～142的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号138对应的碱基为胞嘧啶；
(P6)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～153的12～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号153对应的碱基为胞嘧啶；
(P7)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有与序列号3或5所示的碱基序列中的包含碱基号142～150的10～50碱基长的碱基序列互补或同源的序列，且与碱基号150对应的碱基为胞嘧啶；
(P8)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6～8所示的 碱基序列中的包含碱基号126～135的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号135对应的碱基为胞嘧啶；
(P9)为被荧光染料标记的寡核苷酸，其具有序列号6～8所示的碱基序列中的包含碱基号126～129的10～50碱基长的碱基序列或与该碱基序列同源的序列，且与碱基号129对应的碱基为胞嘧啶。
2.根据权利要求1所述的探针，
P1的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号125对应的碱基，
P2的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号146对应的碱基，
P3和P3’的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基，
P4的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号134对应的碱基，
P5的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号138对应的碱基，
P6的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号153对应的碱基，
P7的寡核苷酸在从5’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号150对应的碱基，
P8的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号135对应的碱基，
P9的寡核苷酸在从3’末端数第1～3位的位置具有被荧光染料标记的与碱基号129对应的碱基。
3.根据权利要求1所述的探针，
P1的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号125对应的碱基，
P2的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号146对应 的碱基，
P3和P3’的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号144对应的碱基，
P4的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号134对应的碱基，
P5的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号138对应的碱基，
P6的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号153对应的碱基，
P7的寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的与碱基号150对应的碱基，
P8的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号135对应的碱基，
P9的寡核苷酸在3’末端具有被荧光染料标记的与碱基号129对应的碱基。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光且杂交到目标序列时荧光强度减少或增加。
5.根据权利要求4所述的探针，前述荧光标记寡核苷酸未杂交到目标序列时发出荧光，杂交到目标序列时荧光强度减少。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的探针，P1、P3、P3’、P4、P5、P7、P8和P9的寡核苷酸的碱基长为10～30，P2和P6的寡核苷酸的碱基长为12～30。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的探针，前述探针为熔解曲线分析用探针。 
8.一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，使用权利要求1～7中任一项所述的探针。
9.一种abl基因中的多态性的检测方法，其特征在于，包括下述工序(I)～(IV)：
(I)在含有DNA的试样中添加权利要求1～7中任一项所述的探针使前述探针杂交到前述DNA的工序；
(II)改变温度而使前述DNA和前述探针的杂交产物解离并测定基于杂交产物的解离的信号变动的工序；
(III)解析前述信号变动而确定Tm值的工序；和
(IV)由前述Tm值确定有无目的多态性或具有多态性的碱基序列的存在比的工序。
10.根据权利要求9中所述的方法，还包括在(I)工序之前或与(I)工序同时地扩增DNA的步骤。
11.对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的判断方法，其包括：根据权利要求8～10中任一项所述的方法检测abl基因中的多态性的工序、和基于有无多态性而判断对抗白血病药的耐受性或抗白血病药的药效的工序。
12.一种用于检测abl基因中的多态性的试剂盒，其含有权利要求1～7中任一项所述的探针。
13.根据权利要求12中所述的试剂盒，其还含有用于扩增abl基因的下述区域的引物，所述区域为：序列号1所示的碱基序列中的、包含P1的寡核苷酸所杂交的序列的区域，序列号3所示的碱基序列中的、包含P2、P3、P3’、P4、P5、P6或P7的寡核苷酸所杂交的序列的区域，或序列号6所示的碱基序列中的、包含P8或P9的寡核苷酸所杂交的序列的区域。 
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