KR101367859B1 - ａｂｌ 유전자 다형의 검출용 프로브 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

abl 유전자의 다형(多型)을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P1∼P9로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 125∼133을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 125에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P2) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼146을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 146에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P3) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P3’) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P4) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 134∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 134에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P5) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 138∼142를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 138에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P6) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼153을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 153에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P7) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼150을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 150에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P8) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드, (P9) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드.

Description

ａｂｌ 유전자 다형의 검출용 프로브 및 그 용도{PROBE FOR DETECTION OF POLYMORPHISM IN ABL GENE, AND USE THEREOF}
본 발명은, 백혈병에 관련하는 abl 유전자의 다형(多型)을 검출하기 위한 프로브 및 그 용도에 관한 것이다.
백혈병은, 골수 중의 조혈간세포(造血幹細胞)가 암화함으로써 일어나는 질환이다. 그 중에서도 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia : CML)은, 9번째의 염색체와 22번째의 염색체와의 전좌(轉座)에 의해 형성되는 bcr-abl 융합 유전자가 발증 원인으로서 알려져 있으며, 그 치료에는, ABL 키나아제 저해제인 이마티닙(imatinib) 등이 널리 사용되고 있다. 그러나, 이 abl 유전자(상기 융합 유전자에 있어서의 abl 유전자를 포함)에 점 돌연변이가 존재하면, 이마티닙에 대하여 내성을 발현한다는 문제가 있어, 그 경우, 치료에 있어서 이마티닙 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경, 골수 이식 등으로의 전환 등이 필요해진다. 따라서, 백혈병, 특히 CML의 치료에 있어서는, abl 유전자에 있어서의 점 돌연변이의 유무를 검출하는 것이 매우 중요하게 되어 있다.
abl 유전자에 있어서의 점 돌연변이의 검출 방법으로서는, abl 유전자 변이를 RT-PCR로 증폭하여 클로닝한 후, 시퀀스 해석하는 방법(PNAS August 6, 2002 vol.99 no.16 10700-10705), abl 유전자 변이를 PCR-RFLP법으로 검출하는 방법(Leukemia (2002)16, 2190-2196), abl 유전자 변이를 DHPLC법으로 검출하여, 시퀀스 해석하는 방법(Clin Cancer Res 2006; 12(24) December 15,2006) 등을 들 수 있다. 그러나, PNAS 2002에 기재된 방법은 실험 조작에는 전문 지식이나 스킬이 필요하며, 자동화가 곤란하다. 또한 실험 조작에 수고를 요하며, 결과를 얻을 때까지 수일간을 필요로 한다. Leukemia 2002에 기재된 방법도 조작이 번잡하여 결과를 얻을 때까지 하루 정도를 필요로 한다. 또한 증폭 산물이 별도의 반응을 오염시킬(컨태미네이션 할) 우려가 있다. 또한 자동화가 곤란하다. Clin Cancer Res 2006에 기재된 방법도 조작이 번잡하고 자동화가 곤란하다. 또한 DHPLC법으로는 변이 타입의 구별이 어려워, 시퀀스법 등으로 별도 변이 타입을 검출할 필요가 있다.
이와 같은 문제로부터, 최근, 유전자 다형의 검출 방법으로서, 융해 곡선 분석(Tm 분석)을 이용한 검출이 행해지고 있다(일본국 특개2001-286300, 일본국 특개2002-119291). 이는, 검출 목적의 유전자 다형을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용하여, 검출 시료의 표적 단일 가닥 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중 가닥 DNA)를 형성시켜, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하여 온도 상승에 수반하는 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널 측정에 의해 검출하고, 이 검출 결과에 의거하여 Tm값을 결정함으로써 목적 다형의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은, 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 목적 다형을 함유하는 검출 대상 서열과 그에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준치)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일 가닥 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정치)을 측정하여, 측정치가 평가 기준치와 동일하면 매치, 즉 표적 DNA에 목적 다형이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정치가 평가 기준치보다 낮으면 미스 매치, 즉 표적 DNA에 목적 다형이 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
그러나, 이와 같은 Tm 분석을 이용한 검출 방법은, 감도(感度)가 낮다는 문제가 있다. 이는, 특히, 백혈병 환자의 혈액 세포 유래 DNA에 대해서 점 돌연변이를 검출할 때에 문제가 되고 있다(일본국 특표2004-537992). 즉, 한 사람의 CML 환자의 혈액이어도, 그 혈액 세포에는 abl 유전자에 점 돌연변이가 발생하여 있는 것(변이 유전자)과 발생하여 있지 않은 것(정상 유전자)이 함유되어 있으며, 양자의 차이는, 점 돌연변이 즉 1염기의 서열에 지나지 않는다. 그렇다면, 점 돌연변이를 검출하기 위한 프로브는, 점 돌연변이를 함유하는 변이 서열(검출 대상 서열)에 하이브리다이즈(매치)하지만, 또한, 점 돌연변이를 함유하지 않는 정상 서열(비검출 대상 서열)에도 하이브리다이즈(미스 매치)한다는 현상이 일어나 버린다. 이와 같은 경우에, Tm 분석에 의해 시그널의 강도와 온도와의 관계를 나타내는 융해 곡선을 작성하면, 매치하고 있는 변이 서열에 대한 고온측의 피크가, 미스 매치인 정상 서열에 대한 저온측의 피크의 존재에 의해 검출하기 어려워진다는 문제가 있다. 즉, 종래의 프로브에서는, 변이를 함유하는 변이 서열이 존재할 경우에도, 변이를 함유하지 않는 정상 서열의 존재에 의해 그 검출이 곤란해져, 검출 감도의 저하가 발생해 버린다는 문제가 있었다.
WO2008／018305에는, Tm 분석을 이용한 검출 방법에 사용하기 위한 abl 유전자에 있어서의 점 돌연변이인 A758T(Y253F), G756C(Q250E), G763A(E255K), 및 A758T(Y253F)를 검출하는 프로브가 기재되어 있다. 또한, 일본국 특개2008-199965에는, A730G(M244V), G749A(G250E), A943G(T315A), C944T(T315I), C951G(F317L), T1052C(M351T), A1064G(E355G), T1075G(F359V), 및 A1187G(H396R)를 검출하는 프로브가 기재되어 있다. 그러나, T1076G(F359C), T757C(Y253H), A764T(E255V), 및 G895C／T(V299L)를 검출하는 프로브는, 어느 문헌에도 기재되어 있지 않다.
본 발명은, abl 유전자에 있어서의 점 돌연변이인 T1076G(F359C), T757C(Y253H), A764T(E255V), 및 G895C／T(V299L)를 검출하기 위해 유효한 검출용 프로브를 특정하고, abl 유전자에 있어서의 점 돌연변이인 T1076G(F359C), T757C(Y253H), A764T(E255V), 및 G895C／T(V299L)를 검출하는 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는, abl 유전자에 있어서의 점 돌연변이인 T1076G(F359C), T757C(Y253H), A764T(E255V), 및 G895C／T(V299L)를 포함하는 특정의 영역에 의거하여 프로브를 설계하고, 당해 프로브를 사용하는 Tm 분석을 행함으로써 당해 변이 부위에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) abl 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P1∼P9로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 125∼133을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 125에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P2) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼146을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 146에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P3) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P3’) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P4) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 134∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 134에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P5) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 138∼142를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 138에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P6) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼153을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 153에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P7) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼150을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 150에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P8) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
(P9) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드.
(2) P1의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 125에 대응하는 염기를 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P2의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 146에 대응하는 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P3 및 P3’의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 144에 대응하는 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P4의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 134에 대응하는 염기를 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P5의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 138에 대응하는 염기를 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P6의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 153에 대응하는 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P7의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 150에 대응하는 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P8의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖고,
P9의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 129에 대응하는 염기를 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는 (1)에 기재된 프로브.
(3) P1의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 125에 대응하는 염기를 3’ 말단에 갖고,
P2의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 146에 대응하는 염기를 5’ 말단에 갖고,
P3 및 P3’의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 144에 대응하는 염기를 5’ 말단에 갖고,
P4의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 134에 대응하는 염기를 3’ 말단에 갖고,
P5의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 138에 대응하는 염기를 3’ 말단에 갖고,
P6의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 153에 대응하는 염기를 5’ 말단에 갖고,
P7의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 150에 대응하는 염기를 5’ 말단에 갖고,
P8의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 135에 대응하는 염기를 3’ 말단에 갖고,
P9의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기 번호 129에 대응하는 염기를 3’ 말단에 갖는 (1)에 기재된 프로브.
(4) 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 프로브.
(5) 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소하는 (4)에 기재된 프로브.
(6) P1, P3, P3’, P4, P5, P7, P8 및 P9의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 10∼30이며, P2 및 P6의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 12∼30인 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 프로브.
(7) 상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 프로브.
(8) abl 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
(9) abl 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서 하기 공정 (Ⅰ)∼(Ⅳ)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 프로브를 첨가하여 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,
(Ⅱ) 온도를 변화시켜 상기 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드 형성체를 해리시키고, 하이브리드 형성체의 해리에 의거하는 시그널의 변동을 측정하는 공정,
(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정하는 공정, 및
(Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 목적의 다형의 유무 또는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정하는 공정.
(10) (Ⅰ)의 공정 전 또는 (Ⅰ)의 공정과 동시에 DNA를 증폭하는 것을 더 포함하는 (9)에 기재된 방법.
(11) (8)∼(10) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 abl 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 공정, 및 다형의 유무에 의거하여 항(抗)백혈병약에 대한 내성 또는 항백혈병약의 약효를 판정하는 공정을 포함하는 항백혈병약에 대한 내성 또는 항백혈병약의 약효의 판정 방법.
(12) abl 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 프로브를 포함하는 키트.
(13) abl 유전자의 서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 P1의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서의 P2, P3, P3’, P4, P5, P6, 혹은 P7의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역, 또는 서열번호 6에 나타내는 염기 서열에 있어서의 P8 혹은 P9의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 (12)에 기재된 시약 키트.
또한, 상기에 있어서 abl 유전자의 다형은 동(同)유전자의 근방 영역의 다형도 포함한다.
본 발명의 프로브에 의하면, 검출 목적의 변이를 갖는 abl 유전자(bcr-abl 융합 유전자에 있어서의 abl 유전자를 포함한다. 이하 동일)(변이 유전자)와 변이가 발생하여 있지 않은 abl 유전자(정상 유전자)가 공존하고 있는 경우에도, 상기 목적의 변이가 발생한 검출 대상 서열을 검출할 수 있다. Tm 분석에 있어서는, 프로브가 1염기만 다른 변이 유전자와 정상 유전자의 쌍방에 하이브리다이즈하면, 융해 곡선에 있어서 양자의 시그널이 겹쳐, 변이 유전자의 존재를 검출하는 것이 매우 곤란하다. 이에 대하여 본 발명의 프로브에 의하면, 변이 유전자와 정상 유전자의 쌍방에 하이브리다이즈하지만, 융해 곡선에 있어서, 양자의 시그널을 충분히 분리할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 의하면, 종래보다도 우수한 감도로, 변이 유전자를 검출할 수 있다.
본 발명의 프로브를 PCR 등의 유전자 증폭계 중에 첨가해 두면, 유전자 증폭 반응 종료 후, Tm 분석을 행함만으로, 고감도이며 복수의 유전자 변이형의 타이핑이 가능해진다. 또한, 전혈이나 구강 점막 현탁액 등을 직접 검사하는 것이 가능하기 때문에, 수고나 비용을 저감할 수 있다.
본 발명의 프로브는 특이성이 높고, 검출 감도가 높다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, PCR을 행할 경우에도, 증폭 산물을 취출(取出)할 필요가 없기 때문에, 컨태미네이션의 위험성이 거의 없다. 또한, 본 발명의 방법은, 순서가 간단하므로 자동화가 용이하다.
도 1은 (A) 핵산 혼합물의 융해 곡선, 및 (B) 미분 융해 곡선의 일례를 나타내는 도면.
도 2는 검량선의 일례를 나타내는 도면.
도 3a는 실시예 1의 T1076G(F359C)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 2.5％)에 대한 서열번호 9(3’ 말단 표지)의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 3b는 비교예 1의 T1076G(F359C)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 2.5％)에 대한 서열번호 9(5’ 말단 표지)의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 4a는 실시예 2-1의 T757C(Y253H)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 0％(Ⅰ), 10％(Ⅱ), 20％(Ⅲ))에 대한 서열번호 10의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 4b는 실시예 2-2의 T757C(Y253H)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 10％)에 대한 서열번호 11의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 4c는 실시예 2-3의 T757C(Y253H)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 10％)에 대한 서열번호 12의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 5a는 실시예 3-1의 A764T(E255V)를 함유하는 프로브의 상보 가닥(변이 함유율 10％)에 대한 서열번호 13의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 5b는 실시예 3-2의 A764T(E255V)를 함유하는 프로브의 상보 가닥(변이 함유율 10％)에 대한 서열번호 14의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 5c는 실시예 3-3의 A764T(E255V)를 함유하는 프로브의 상보 가닥(변이 함유율 10％)에 대한 서열번호 15의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 5d는 실시예 3-4의 A764T(E255V)를 함유하는 프로브의 상보 가닥(변이 함유율 10％)에 대한 서열번호 16의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 6a는 실시예 4-1의 G895C(V299L)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 5％)에 대한 서열번호 17의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 BODIPY FL의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 6b는 실시예 4-2의 G895C(V299L)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 5％)에 대한 서열번호 18의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 BODIPY FL의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 6c는 실시예 4-3의 G895T(V299L)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 5％)에 대한 서열번호 19의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
도 6d는 실시예 4-4의 G895T(V299L)를 함유하는 플라스미드(변이 함유율 5％)에 대한 서열번호 20의 프로브를 사용한 Tm 분석에 있어서의 단위 시간당 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t)의 변화를 나타낸다. 종축은 단위 시간당 형광 강도의 변화량(d 형광 강도 증가량／t), 횡축은 온도(℃)이다.
본 발명에 있어서, 이하, 검출 목적의 변이를 갖는 abl 유전자를 「변이 유전자」, 검출 목적의 변이를 갖는 서열을 「변이 서열」, 검출 목적의 변이가 발생하지 않는 ablbl 유전자를 「정상 유전자」, 검출 목적의 변이가 발생하지 않는 서열을 「정상 서열」, 변이의 유무를 검출하는 시료 중의 DNA를 「표적 DNA」라고도 한다.
본 발명에 있어서 검출하는 다형으로서는, 예를 들면 1염기 다형(SNP) 등을 들 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, T1076G(F359C)란 abl 유전자의 1076번째의 염기에 있어서의 T(야생형)로부터 G(변이형)로의 변이를 나타내고, 괄호 내는 염기의 변이에 수반하여 359번째의 아미노산이 F로부터 C로 변화하는 것을 의미한다. 그 밖의 변이의 표기에 대해서도 같다.
또한, abl 유전자의 염기 서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 액세션 No.NG_012034에 등록되어 있다. 하기에 나타내는 서열번호 1,3,6의 서열은 모두 이들 서열에 포함되어 있다.
이하에, 본 발명의 프로브에 대해서 설명한다.
<프로브>
본 발명의 프로브는, 상술한 바와 같이, abl 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 상기 P1∼P9로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
(P1) 서열번호 1 또는 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 125∼133을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 125에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 125에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 1 및 2의 염기 번호 125의 g(구아닌)에 대응하는 상보 염기 c(시토신)를 의미한다. P1의 프로브에 있어서는, 이 c가 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 3’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P1의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 1의 염기 서열에 있어서의 133번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다. 이 염기는 T1076G 변이의 염기에 해당하고, 야생형이면 T, 변이형이면 G이다. T1076을 함유하는 영역의 서열을 서열번호 1(야생형 : 133번째가 T) 및 2(변이형 : 133번째가 G)에 나타낸다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P1의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 125∼133을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 125에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 2에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 125∼133을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 125에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 9의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-cctgtggatgCagtttttc*-3’(서열번호 9)
여기에서, c*는 3’측에 형광 표지된 c를 나타낸다(이하 동일).
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 C가 A이다.
(P2) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼146을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 146에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 146에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 4의 염기 번호 146의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P2의 프로브에 있어서는, 이 c가 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 5’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 135번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다. 이 염기는 T757C 변이의 염기에 해당하고, 야생형이면 T, 변이형이면 C이다. T757C를 함유하는 영역의 서열을 서열번호 3(야생형 : 135번째가 T) 및 4(변이형 : 135번째가 C)에 나타낸다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 12∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼30 염기 길이이며, 더 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼146을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 146에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 4에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 135∼146을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 146에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 10의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다(대문자가 변이 염기를 나타낸다, 이하 동일).
5’-*cacctccccgtGctg-3’(서열번호 10)
여기에서, *c는 5’측에 형광 표지된 c를 나타낸다(이하 동일).
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 G가 A이다.
(P3) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 144에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 4의 염기 번호 144의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P3의 프로브에 있어서는, 이 c가 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 5’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P3의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 135번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P3의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 11의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-*cctccccgtGctggc-3’(서열번호 11)
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 G가 A이다.
(P3’) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 144에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 5의 염기 번호 144의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P3’의 프로브에 있어서는, 이 c가 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 5’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P3’의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 142번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다. 이 염기는 A764T 변이의 염기에 해당하고, 야생형이면 A, 변이형이면 T이다. A764T를 함유하는 영역의 서열을 서열번호 3(야생형 : 142번째가 A) 및 5(변이형 : 142번째가 T)에 나타낸다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이며, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 142∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 16의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-*ccAccccgtactggcc-3’(서열번호 16)
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 A가 T이다.
(P4) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 134∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 134에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 134에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 4의 염기 번호 134의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P4의 프로브에 있어서는, 이 c가 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 3’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 135번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 134∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 134에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 4에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 134∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 134에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 12의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-gtacacctccccgtGc*-3’(서열번호 12)
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 G가 A이다.
(P5) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 138∼142를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 138에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 138에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 5의 염기 번호 138의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P5의 프로브에 있어서는, 이 c가 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 3’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 142번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 138∼142를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 138에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 138∼142를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 138에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 13의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-cctcgtacaccAcccc*-3’(서열번호 13)
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 A가 T이다.
(P6) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼153을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 153에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 153에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 5의 염기 번호 153의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P6의 프로브에 있어서는, 이 c가 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 5’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 142번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 12∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼30 염기 길이이며, 더 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼153을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 153에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼153을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 153에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 14의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-*cctcgtacaccAcccc-3’(서열번호 14)
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 A가 T이다.
(P7) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼150을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 150에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 150에 대응하는 염기」란, 상기 상보 서열 또는 상동 서열에 있어서, 서열번호 3 및 5의 염기 번호 150의 g에 대응하는 상보 염기 c를 의미한다. P7의 프로브에 있어서는, 이 c가 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 5’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P7의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3의 염기 서열에 있어서의 142번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P7의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 3에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼150을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 150에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼150을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 150에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽이어도 되고, 양쪽이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 15의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-*cgtacaccAccccgta-3’(서열번호 15)
또한, 이에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 A가 T이다.
(P8) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 135에 대응하는 염기」란, 상기 서열에 있어서, 서열번호 6∼8의 염기 번호 135의 c를 의미한다. P8의 프로브에 있어서는, 이 c가 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 3’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 6의 염기 서열에 있어서의 126번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다. 이 염기는 G895C／T 변이의 염기에 해당하고, 야생형이면 G, 변이형이면 C 또는 T이다. G895C를 함유하는 영역의 서열을 서열번호 6(야생형 : 126번째가 G), 서열번호 7(변이형 : 126번째가 C) 및 8(변이형 : 126번째가 T)에 나타낸다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 6에 나타내는 염기 서열에 있어서, 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 7에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 하나여도 되고, 둘 또는 셋이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 17 또는 19의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-cctgCtgcagctcc*-3’(서열번호 17)
5’-aacctgTtgcagctcc*-3’(서열번호 19)
또한, 이들에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 C 또는 T가 G이다.
(P9) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드
여기에서, 「염기 번호 129에 대응하는 염기」란, 상기 서열에 있어서, 서열번호 6∼8의 염기 번호 129의 c를 의미한다. P9의 프로브에 있어서는, 이 c가 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 존재하는 것이 바람직하고, 이 c가 3’ 말단에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
P9의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 6의 염기 서열에 있어서의 126번째의 염기의 다형을 검출하기 위한 프로브이다.
당해 다형을 검출하기 위한 프로브의 길이는, 바람직하게는 10∼30 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼25 염기 길이이다.
또한, P9의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 서열번호 6에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 야생형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 7에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 변이형 검출용 올리고뉴클레오티드의 어느 하나여도 되고, 둘 또는 셋이어도 된다.
바람직하게는, 변이형 검출용의 하기 서열번호 18 또는 20의 염기 서열을 갖는 프로브를 들 수 있다.
5’-accctaacctgCtgc*-3’(서열번호 18)
5’-tcaaacaccctaacctgTtgc*-3’(서열번호 20)
또한, 이들에 대응하는 야생형 검출용 프로브는 대문자의 C 또는 T가 G이다.
본원에 있어서의 「상동」이란, 특정의 염기 서열에 있어서, 염기 서열의 상보 가닥 또는 당해 염기 서열에 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 서열을 갖고 있는 염기 서열을 가리킨다.
본 발명의 프로브는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브인 것이 바람직하다. 그 중에서도 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브인 것이 보다 바람직하다. 이와 같은 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브로서는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리고 있으며, 소위 QProbe(등록 상표)로서 알려져 있다. 그 중에서도, 올리고뉴클레오티드를 3’ 말단 혹은 5’ 말단이 C가 되도록 설계하고, 그 말단의 C가 G에 가까워지면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 프로브가 바람직하다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째」와 같은 경우에는, 5’ 말단을 1번째로서 세고, 「3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째」와 같은 경우에는, 3’ 말단을 1번째로서 센다.
상기 형광 색소는 제한되지 않지만, 예를 들면 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판의 형광 색소로서는, 예를 들면 BODIPY FL(상표명, 몰레큘라 프로브사제), FluorePrime(상품명, 애머샴 파마시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(ABI사제), Cy3 및 Cy5(애머샴 파마시아사제), TARMA(몰레큘라 프로브사제) 등을 들 수 있다. 프로브의 검출 조건은 특히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 의해 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들면 퍼시픽 블루(Pacific Blue)는 검출 파장 445∼480㎚, TAMRA는 검출 파장 585∼700㎚), BODIPY FL은 검출 파장 520∼555㎚로 검출할 수 있다. 이와 같은 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브는, 예를 들면 3’ 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있고, 이때, 본 발명의 프로브를 유전자 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다. 이와 같은 경우에, 프로브의 3’ 말단에 인산기를 부가시켜 두면, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분히 방지할 수 있다. 또한, 3’ 말단에 상술한 바와 같은 표지화 물질을 부가하는 것에 의해서도, 같은 효과를 얻을 수 있다.
상기 염기 서열을 갖고, 5’ 말단 또는 3’ 말단의 C가 형광 색소로 표지된 프로브의 구체예를 이하의 표 1에 나타낸다(대문자의 염기는 변이점을 나타내고, P는 인산기를 나타냄). 단, 본 발명의 프로브는 이하의 것에 한정되지 않는다.
[표 1]
Figure 112011053246949-pat00001
본 발명의 프로브는, abl 유전자의 다형의 검출에 사용할 수 있다. 검출 방법은 하등 제한되지 않고, 검출 대상 서열과 프로브와의 하이브리다이즈를 이용하는 방법이면 된다. 본 발명의 프로브를 적용하는 방법의 일례로서, Tm 분석을 이용한 다형의 검출 방법에 대해서, 이하에 설명한다.
<다형 검출 방법>
본 발명의 다형 검출 방법은, 상술한 바와 같이, abl 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 하기 공정 (Ⅰ)∼(Ⅳ)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 프로브를 사용하는 것이 특징이며, 그 밖의 구성이나 조건 등은 이하의 기재에 제한되지 않는다.
(Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에, 본 발명의 프로브를 첨가하고, 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정
(Ⅱ) 상기 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서, 온도 변화에 수반하는 시그널의 변동을 측정하는 공정
(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정하는 공정
(Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 목적 다형의 유무 또는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정하는 공정
또한, (Ⅲ)에서 Tm값을 결정하는 것에는, Tm의 온도를 결정하는 것뿐만 아니라, Tm의 피크의 높이를 결정하는 것을 포함한다. 피크의 높이에 따라, 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정할 수 있다. 또한, 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 보다 정량적으로 결정하기 위해서는, 하기에 나타내는 바와 같은 검량선을 작성하고, 그것에 의거하여 존재비를 결정하는 것이 바람직하다.
다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 정량적으로 결정하는 방법에 대해서, 야생형과 특정의 변이형의 존재비의 결정을 예로 들어 이하에 나타낸다. 단, 이 방법은 일례에 지나지 않고, 다형을 갖는 염기 서열의 존재비의 결정의 방법은 이에 한정되지 않는다.
우선, 야생형의 핵산 Wt와 변이형의 핵산 Mt의 2종류의 핵산의 존재비를 각각 다르게 한 복수의 핵산 혼합물을 제작하고, 복수의 핵산 혼합물의 각각에 대해서, 융해 곡선 해석 장치 등을 사용하여 융해 곡선을 얻는다.
도 1(A)에, 어느 1개의 핵산 혼합물의 온도와 형광 강도와의 관계로 나타난 융해 곡선, 및 도 1(B)에 온도와 형광 강도의 미분값과의 관계로 나타난 융해 곡선(미분 융해 곡선이라고도 함)을 나타낸다. 이 미분 융해 곡선으로부터 피크를 검출함으로써, 핵산 Wt의 융해 온도 TmW 및 핵산 Mt의 융해 온도 TmM를 검출하고, TmW 및 TmM을 포함하는 온도 범위의 각각을 설정한다. TmW를 포함하는 온도 범위 ΔTW로서는, 예를 들면 TmW와 TmM의 사이에서 형광 강도의 미분값이 최소가 되는 온도를 하한, 형광 강도의 피크의 발치(foot of peak)에 대응하는 온도를 상한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또한, TmM을 포함하는 온도 범위 ΔTM로서는, 예를 들면 TmW와 TmM의 사이에서 형광 강도의 미분값이 최소가 되는 온도를 상한, 형광 강도의 피크의 발치에 대응하는 온도를 하한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또한, 온도 범위 ΔTW 및 온도 범위 ΔTM는, 동일한 폭(예를 들면 10℃) 또는 다른 폭(예를 들면 온도 범위 ΔTW가 10℃, 온도 범위 ΔTM가 7℃)이 되도록 설정할 수 있다. 또한, 온도 범위 ΔTW 및 온도 범위 ΔTM는, 각각의 융해 온도 Tm로부터 플러스 X℃, 마이너스 X℃의 폭(X℃는 예를 들면 15℃ 이내, 바람직하게는 10℃ 이내)과 같이 설정할 수 있다.
다음으로, 온도 범위 ΔTW 및 온도 범위 ΔTM의 각각에 대해서, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 지나는 직선과 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적(도 1(B)의 사선 부분)을 구한다. 면적을 구하는 방법의 일례로서, 구체적으로 이하와 같이 구할 수 있다. 온도(T)에 있어서의 형광 강도의 미분값을 f(T)라 하고, 온도(T)에 있어서의 베이스값을 B(T)라 하여, 하기 (1)식에 의해 구한다.
면적 S＝{f(Ts+1)-B(Ts+1)}+{f(Ts+2)-B(Ts+2)}
+…+{f(Te-1)-B(Te-1)} …(1)
단, Ts는 각 온도 범위에 있어서의 하한치, Te는 상한치이다. 또한, 각 온도 T에 있어서의 베이스값 B(T)는, 하기 (2)식에 의해 구해지는 값으로, 형광 강도의 검출 신호에 포함되는 백그라운드 레벨을 나타내는 것이다. 이 베이스값을 형광 강도의 미분값으로부터 감산함으로써, 형광 강도의 검출 신호에 포함되는 백그라운드의 영향을 제거한다.
B(T)＝a×(T-Ts)+f(Ts) …(2)
단, a＝{f(Te)-f(Ts)}／(Te-Ts)이다.
상기 (1)식 및 (2)식을 따라, 각 핵산 혼합물에 대해서, 온도 범위 ΔTW에 있어서의 면적 SW 및 온도 범위 ΔTW에 있어서의 면적 SM을 구하고, 면적비와 각 핵산 혼합물의 존재비와의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다. 도 2에, 횡축에 존재비(핵산 혼합물의 총량에 대한 핵산 Mt의 비율)를 취하고, 종축에 면적비 SM／SW를 취한 검량선의 일례를 나타낸다. 또한, 면적비는 SW／SM로 정해도 된다.
실제의 시료를 사용하여 얻어진 융해 곡선과 미분 융해 곡선으로부터 면적비를 산출하고, 상기한 바와 같이 하여 미리 작성한 검량선에 의거하여 실제의 시료 중에 함유되는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료 중의 DNA는, 단일 가닥 DNA여도 되고 이중 가닥 DNA여도 된다. 상기 DNA가 이중 가닥 DNA인 경우에는, 예를 들면 상기 하이브리다이즈 공정에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 이중 가닥 DNA를 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 해리함으로써, 다음의 하이브리다이즈 공정에 있어서, 검출용 프로브와의 하이브리다이즈가 가능해진다.
본 발명에 있어서, 시료에 함유되는 DNA는, 예를 들면 생체 시료에 원래 함유되는 DNA여도 되지만, 검출 정밀도를 향상시킬 수 있는 점에서, 생체 시료에 원래 함유되어 있는 DNA를 주형으로서 PCR 등에 의해 abl 유전자의 변이 개소를 함유하는 영역을 증폭시킨 증폭 산물인 것이 바람직하다. 증폭 산물의 길이는 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 50∼1000mer이며, 바람직하게는 80∼200mer이다. 또한, 시료 중의 DNA는, 예를 들면 생체 시료 유래의 RNA(토털 RNA, mRNA 등)로부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성한 cDNA여도 된다.
본 발명의 다형 검출 방법을 적용하는 시료는, abl 유전자가 존재하는 시료를 들 수 있다. 구체예로서는, 백혈구 세포 등의 혈구 시료, 전혈 시료 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 시료의 채취 방법, DNA의 조제 방법 등은 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율(몰비)은 제한되지 않지만, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있는 점에서, 시료 중의 DNA에 대하여 1배 이하가 바람직하고, 0.1배 이하가 보다 바람직하다. 이때, 시료 중의 DNA란, 예를 들면 검출 목적의 다형이 발생하여 있는 검출 대상 DNA와 상기 다형이 발생하여 있지 않은 비검출 대상 DNA의 합계여도 되고, 검출 목적의 다형이 발생하여 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하여 있지 않은 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계여도 된다. 또한, 시료 중의 DNA에 있어서의 상기 검출 대상 DNA의 비율은 통상 불분명하지만, 결과적으로, 상기 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 DNA(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여 10배 이하가 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5배 이하, 더 바람직하게는 3배 이하이다. 또한, 그 하한은 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 0.001배 이상이고, 바람직하게는 0.01배 이상이며, 보다 바람직하게는 0.1배 이상이다.
상기 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면 이중 가닥 DNA에 대한 몰비여도 되고, 단일 가닥 DNA에 대한 몰비여도 된다.
Tm값에 대해서 설명한다. 이중 가닥 DNA를 함유하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 이중 가닥 DNA에 있어서의 양 가닥 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 단일 가닥 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중 가닥 DNA가 해리하여 단일 가닥 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(이중 가닥 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료되었다고 판단할 수 있다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로 흡광도가, 흡광도 전(全)상승분의 50％에 달했을 때의 온도라고 정의된다.
본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 수반하는 시그널 변동의 측정은, 상술한 바와 같은 원리로부터 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 본 발명의 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거하는 시그널로서 DNA와 프로브와의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 프로브로서, 상술한 표지화 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예를 들면 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중 가닥 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않거나, 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 유리(遊離)하면 시그널을 나타내게 되거나, 시그널이 증가한다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중 가닥 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의거하는 시그널의 변화를 시그널 특유의 조건(흡광도 등)으로 검출함으로써, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 같이, 융해의 진행 그리고 Tm값의 결정을 행할 수 있다. 표지화 프로브에 있어서의 표지화 물질은, 예를 들면 상술한 바와 같지만 형광 색소 표지화 프로브가 바람직하다.
다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대해서, 본 발명의 프로브로서, 형광 색소로 표지화된 표지화 프로브를 사용하는 예를 들어 설명한다. 또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 밖의 공정이나 조건에 대해서는 하등 제한되지 않는다.
우선, 전혈로부터 게놈 DNA를 단리(單離)한다. 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE 헬스케어바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.
다음으로, 단리한 게놈 DNA를 함유하는 시료에 표지화 프로브를 첨가한다. 상기 표지화 프로브로서는, 예를 들면 QProbe가 있다. 이 QProbe란, 일반적으로 프로브 말단의 시토신 염기를 형광 색소로 표지화한 프로브로, 이것이 검출 대상 서열에 하이브리드함으로써 상기 형광 색소와 검출 대상 서열의 구아닌 염기가 상호 작용하고, 그 결과 형광이 감소(또는 소광)하는 것이다. 표지화 프로브의 서열은 상술한 바와 같으며, 검출 목적의 다형에 따라, 적절히 선택하면 된다.
상기 검출용 프로브는, 단리한 게놈 DNA를 함유하는 액체 시료에 첨가해도 되고, 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매로서는 특히 제한되지 않고, 예를 들면 Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl2, MgSO4, 글리세롤 등을 함유하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.
상기 검출용 프로브의 첨가의 타이밍은 특히 제한되지 않고, 예를 들면 후술하는 PCR 등의 증폭 처리를 행할 경우, 증폭 처리 후, PCR 증폭 산물에 대하여 첨가해도 되고, 증폭 처리 전에 첨가해도 된다. 이와 같이 PCR 등에 의한 증폭 처리 전에 상기 검출용 프로브를 첨가할 경우에는, 예를 들면 상술한 바와 같이, 그 3’ 말단에 형광 색소를 부가하거나, 인산기를 부가하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 단리한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 검출 목적의 다형을 발생하는 부위를 포함하는 서열(검출 대상 서열 및／또는 비검출 대상 서열)을 증폭시킨다. 상기 유전자 증폭법은 제한되지 않고, 예를 들면 PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있지만, PCR법이 바람직하다. 또한, 이하, PCR법을 예로 들어 본 발명을 설명하지만, 이에는 제한되지 않는다. 또한, PCR의 조건은 특히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
PCR의 프라이머의 서열은, 목적의 검출 대상 서열 및／또는 비검출 대상 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않고, 목적의 서열에 따라, 종래 공지의 방법에 의해 적절히 설계할 수 있다. 프라이머의 길이는 특히 제한되지 않고, 일반적인 길이(예를 들면 10∼50mer)로 설정할 수 있다. 이하에, 상기 P1∼P9의 프로브를 사용할 때의, 검출 대상 서열의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머 세트의 일례를 나타낸다. 또한, 이들은 예시이며, 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
P1 프로브용의 프라이머 세트
센스 프라이머 서열번호 21
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’
안티센스 프라이머 서열번호 22
5’-tccatggcgcaggctgcctg-3’
P2∼P4 프로브용의 프라이머 세트
센스 프라이머 서열번호 23
5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’
안티센스 프라이머 서열번호 24
5’-cacggccaccgtcagg-3’
P8∼P9 프로브용의 프라이머 세트
센스 프라이머 서열번호 25
5’-gaaagaagctgcagtcatgaaagagat-3’
안티센스 프라이머 서열번호 26
5’-cgcgagaccctctcttcagagc-3’
P5∼P7 프로브용의 프라이머 세트도 서열번호 3에 의거하여 용이하게 설계할 수 있다.
또한, 증폭시, 리얼 타임 PCR에 의해 증폭을 모니터링하여, 시료에 함유되는 DNA(검출 대상 서열)의 카피 수를 조사할 수도 있다. 즉, PCR에 의한 DNA(검출 대상 서열)의 증폭에 따라 하이브리드를 형성하는 프로브의 비율이 증가하므로 형광 강도가 변동한다. 이를 모니터링함으로써, 시료에 함유되는 검출 대상 서열(정상 DNA 또는 변이 DNA)의 카피 수나 존재비를 조사할 수 있다.
다음으로 얻어진 PCR 증폭 산물의 해리, 및 해리에 의해 얻어진 단일 가닥 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다.
상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 85∼95℃이다. 가열 시간도 특히 제한되지 않지만, 통상 1초∼10분이며, 바람직하게는 1초∼5분이다.
또한, 해리한 단일 가닥 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리다이즈는, 예를 들면 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면 40∼50℃이다.
하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는 특히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서의 DNA의 농도는, 예를 들면 0.01∼1μM이며, 바람직하게는 0.1∼0.5μM, 상기 표지화 프로브의 농도는, 예를 들면 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 충족시키는 범위가 바람직하고, 예를 들면 0.001∼10μM이며, 바람직하게는 0.001∼1μM이다.
그리고, 얻어진 상기 단일 가닥 DNA와 상기 표지화 프로브의 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 수반하는 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면 QProbe를 사용한 경우, 단일 가닥 DNA와의 하이브리다이즈한 상태에서는 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는 형광을 발한다. 따라서, 예를 들면 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 개시 온도가 실온∼85℃이고, 바람직하게는 25∼70℃이며, 종료 온도는, 예를 들면 40∼105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 0.1∼20℃／초이며, 바람직하게는 0.3∼5℃／초이다.
다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 값(-d 형광 강도 증가량／dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량／t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또한, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니라, 단독으로 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.
상기 Tm값은, 예를 들면 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http:／／www.meltcalc.com／) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한, 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 상술한 바와 같이, 하이브리드 형성체를 가열하여, 온도 상승에 수반하는 시그널 변동을 측정하는 방법에 대신하여, 예를 들면 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 수반하는 시그널 변동을 측정해도 된다.
구체예로서, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들면 QProbe)를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가한 때에는, 상기 프로브는 해리하여 있기 때문에 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면 상기 가열한 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.
다른 한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리하여 있기 때문에 형광을 발하고 있지 않지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예를 들면 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
본 발명의 abl 유전자 다형 검출 방법에 의하면, abl 유전자의, 백혈병에 대한 약제(예를 들면 이마티닙)에의 내성에 관여하는 변이의 유무를 조사할 수 있다. 다형의 유무나 변이 서열과 정상 서열의 존재비에 의거하여 항백혈병약에 대한 내성이나 항백혈병약의 약효를 판정할 수 있다. 그리고, 본 발명의 방법은, 변이의 유무나 변이 서열의 존재비에 의거하여 약제의 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경, 골수 이식 등으로의 전환 등의 백혈병의 치료 방침을 결정하기 위해 유용하다.
<abl 유전자 다형 검출용 시약 키트>
본 발명의 abl 유전자 다형 검출용 시약 키트는, abl 유전자의 다형의 검출에 사용하는 시약 키트이며, 본 발명의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 시약 키트에 있어서, 본 발명의 프로브는, 1종류여도 되고 2종류 이상이어도 된다. 후자의 경우, 2종류 이상의 프로브는, 혼합된 상태로 포함되어도 되고, 별개의 시약으로서 포함되어 있어도 된다. 또한, 2종류 이상의 본 발명의 프로브가 혼합된 상태로 본 발명의 프로브 키트에 포함될 경우나, 별개의 시약으로서 포함되어 있지만, 예를 들면 사용시에 동일한 반응계에서, 각 프로브와 각 검출 대상 서열의 Tm 분석을 행할 경우, 각 프로브는 별개의 형광 물질로 표지화되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 형광 물질의 종류를 바꿈으로써 동일한 반응계여도, 각각의 프로브에 대한 검출이 가능해진다. 상기 형광 물질로서는, 예를 들면 검출 파장이 다른 물질인 것이 바람직하다.
또한, abl 유전자 다형 검출용 시약 키트는 상기 다형 부위를 포함하는 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 것이어도 된다.
상술한 바와 같이, abl 유전자에는, 백혈병에 관련하는 복수의 변이가 알려져 있으며, 본 발명의 프로브에 의하면, 상술한 각종 변이를 검출하는 것이 가능하다. 백혈병에 관여하는 abl 유전자는, 어느 1개소의 변이만이 검출될 경우도 있지만, 복수 개소의 변이가 검출될 경우도 있으므로, 복수의 변이를 검출하여, 그들의 결과를 종합적으로 판단함으로써, 보다 좋은 진단이나 치료가 가능해진다. 따라서, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 본 발명의 프로브를 2종류 이상 포함시킴으로써 진단이나 치료 등을 위한 변이의 검출을 보다 간편하게 행할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다. 단, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 제한되지 않는다.
[실시예 1]
abl 유전자의 1076번째 염기의 점 돌연변이(T→G)
본 발명의 프로브를 사용하여, abl 유전자에 있어서의 1076번째 염기의 점 돌연변이(T→G)에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행했다.
서열번호 1에 나타내는 133번째의 염기 T에 변이를 갖지 않는 정상 abl 유전자 서열(서열번호 1)을 삽입한 플라스미드(wtDNA)와, 상기 133번째의 염기 T가 G로 변이한 변이 abl 유전자(abl 티로신 키나아제 T1076G(F359C), 서열번호 2)를 삽입한 플라스미드(mtDNA)를 소정의 비율(mtDNA : wtDNA＝25카피 : 975카피)로 혼합하고(변이 함유율 2.5％), 1,000카피／μL로 희석 조제하여 이를 주형 핵산으로 했다. 반응 용액은 표 2의 처방으로 했다. PCR 반응은 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 64℃ 30초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 그 후 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 더 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 40℃ 내지 95℃로 가열해 가, 경시(經時)적인 형광 강도의 변화를 측정했다(WAVE3 : 585∼700㎚).
[표 2]
Figure 112011053246949-pat00002
센스 프라이머 서열번호 21
5’-ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3’
안티센스 프라이머 서열번호 22
5’-tccatggcgcaggctgcctg-3’
(실시예 1)
검출용 프로브 P1 서열번호 9
5’-cctgtggatgCagtttttc-(TAMRA)-3’
(비교예 1)
검출용 프로브 서열번호 9
5’-(TAMRA)-cctgtggatgCagtttttc-P-3’
이 프로브는, 실시예 1의 검출용 프로브와 서열은 동일하지만, 5’ 말단의 c(서열번호 2의 염기 번호 143의 g의 상보 염기인 c)가 형광 색소로 표지되어 있는 프로브이다.
이 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3a는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 분석의 그래프이다. 검출용 프로브 P1을 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 51℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 61℃ 부근에 보였다.
이 결과로부터, 검출용 프로브 P1에 의하면, mtDNA와 wtDNA가 공존하는 경우에도, mtDNA의 검출 감도를 향상시킬 수 있음을 알았다.
이에 대하여, 도 3b로부터, 비교예 1의 검출용 프로브를 사용한 경우, 검출 피크를 거의 확인할 수 없어, 변이의 유무가 불분명했다. 이상의 결과로부터, 프로브의 어느 것인가의 c가 형광 표지되어 있으면 된다는 것이 아니라, 125번째의 g의 상보 염기인 c가 형광 표지되어 있는 것이 중요함이 이해되었다.
[실시예 2]
abl 유전자의 757번째 염기의 점 돌연변이(T→C)
본 발명의 프로브를 사용하여, abl 유전자에 있어서의 757번째 염기의 점 돌연변이(T→C)에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행했다.
서열번호 3에 나타내는 135번째의 염기 T에 변이를 갖지 않는 정상 abl 유전자 서열(서열번호 3)을 삽입한 플라스미드(wtDNA)와, 상기 135번째의 염기 T가 C로 변이한 변이 abl 유전자(abl 티로신 키나아제 T757C(Y253H), 서열번호 4)를 삽입한 플라스미드(mtDNA)를 소정의 비율(mtDNA : wtDNA＝100카피 : 900카피)로 혼합하고(변이 함유율 10％), 1000카피／μL로 희석 조제하여 이를 주형 핵산으로 하여 반응을 행했다. 또한, 검출용 프로브 P2에 대해서는 변이 함유율 20％와 0％에 대해서도 평가했다. 반응 용액은 표 3의 처방으로 했다. PCR 반응은 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 58℃ 30초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 그 후 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 더 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 40℃ 내지 95℃로 가열해 가, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다(WAVE3 : 585∼700㎚).
[표 3]
Figure 112011053246949-pat00003
센스 프라이머 서열번호 23
5’-gacaagtgggagatggaacgc-3’
안티센스 프라이머 서열번호 24
5’-cacggccaccgtcagg-3’
(실시예 2-1)
검출용 프로브 P2 서열번호 10
5’-(TAMRA)-cacctccccgtGctg-P-3’
(실시예 2-2)
검출용 프로브 P3 서열번호 11
5’-(TAMRA)-cctccccgtGctggc-P-3’
(실시예 2-3)
검출용 프로브 P4 서열번호 12
5’-gtacacctccccgtGc-(TAMRA)-3’
이들 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 분석의 그래프이다. 도 4에서 (A)는 실시예 2-1, (B)는 실시예 2-2, (C)는 실시예 2-3의 결과이다. (A)로부터, 검출용 프로브 P2를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, 변이 함유율 0％에서는 wtDNA의 피크만이 52℃ 부근에 보이고(Ⅰ), 변이 함유율 10％(Ⅱ), 20％(Ⅲ)에서는 wtDNA의 피크와 함께 mtDNA의 피크가 58℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크는 변이 함유율과 함께 증대했다. 검출용 프로브 P3을 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 56℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 62℃ 부근에 보였다(B). 검출용 프로브 P4을 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 57℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 63℃ 부근에 보였다(C).
이들 결과로부터, 검출용 프로브 P2∼4에 의하면, mtDNA와 wtDNA가 공존하는 경우에도, mtDNA의 검출 감도를 향상시킬 수 있음을 알았다.
서열번호 4의 염기 번호 146, 144 또는 134번째의 g의 상보 염기인 c가 형광 표지되어 있는 것이 중요함이 이해되었다.
[실시예 3]
abl 유전자의 764번째 염기의 점 돌연변이(A→T)
본 발명의 프로브를 사용하여, abl 유전자에 있어서의 764번째 염기의 점 돌연변이(A→T)에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행했다.
서열번호 3에 나타내는 142번째의 염기 A에 변이를 갖지 않는 정상 abl 유전자 서열(wtDNA)의 상보 가닥 올리고뉴클레오티드(서열번호 27)와, 상기 142번째의 염기 A가 T로 변이한 변이 abl 유전자(abl 티로신 키나아제 A764T(E255V))(mtDNA)의 상보 가닥 올리고뉴클레오티드(서열번호 28)를 합성했다. 그리고, 양자를 소정의 비율(mtDNA : wtDNA＝1μM : 9μM)로 혼합했다(변이 함유율 10％). 프로브의 하이브리다이즈 및 형광 강도의 검출을 이하 표 4의 조성의 반응액을 반응 튜브에 첨가하여, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 40℃ 내지 95℃로 가열해 가, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다(WAVE3 : 585∼700㎚).
[표 4]
Figure 112011053246949-pat00004
(실시예 3-1)
검출용 프로브 P5 서열번호 13
5’-cctcgtacaccAcccc-(TAMRA)-3’
(실시예 3-2)
검출용 프로브 P6 서열번호 14
5’-(TAMRA)-cctcgtacaccAcccc-P-3’
(실시예 3-3)
검출용 프로브 P7 서열번호 15
5’-(TAMRA)-cgtacaccAccccgta-P-3’
(실시예 3-4)
검출용 프로브 P3’ 서열번호 16
5’-(TAMRA)-ccAccccgtactggcc-P-3’
이들 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 분석의 그래프이다. 도 5에서 (A)는 실시예 3-1, (B)는 실시예 3-2, (C)는 실시예 3-3, (D)는 실시예 3-4의 결과이다. 검출용 프로브 P5를 사용하여 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 56℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 62℃ 부근에 보였다(A). 검출용 프로브 P6을 사용하여 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 55℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 62℃ 부근에 보였다(B). 검출용 프로브 P7을 사용하여 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 50℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 59℃ 부근에 보였다(C). 검출용 프로브 P3'을 사용하여 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 58℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 63℃ 부근에 보였다(D).
이들 결과로부터, 검출용 프로브 P3', 5∼7에 의하면, mtDNA와 wtDNA가 공존하는 경우에도, mtDNA의 검출 감도를 향상시킬 수 있음을 알았다.
서열번호 5의 염기 번호 138, 153, 150 또는 144번째의 g의 상보 염기인 c가 형광 표지되어 있는 것이 중요함이 이해되었다.
[실시예 4]
abl 유전자의 895번째 염기의 점 돌연변이(G→C／T)
본 발명의 프로브를 사용하여, abl 유전자에 있어서의 895번째 염기의 점 돌연변이(G→C／T)에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행했다.
서열번호 6에 나타내는 126번째의 염기 G에 변이를 갖지 않는 정상 abl 유전자 서열(서열번호 6)을 삽입한 플라스미드(wtDNA)와, 상기 126번째의 염기 G가 C 또는 T로 변이한 변이 abl 유전자(abl 티로신 키나아제 G895C／T(V299L), 서열번호 7 또는 8)를 삽입한 플라스미드(mtDNA)를 소정의 비율(mtDNA : wtDNA＝50카피 : 950카피)로 혼합하고(변이 함유율 5％), 1000카피／μL로 희석 조제하여 이를 주형 핵산으로 하여 반응을 행했다. 반응 용액은 표 5의 처방으로 했다. PCR 반응은 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 64℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 그 후 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 더 처리하고, 계속해서 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 40℃ 내지 95℃로 가열해 가, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다(WAVE2 : 520∼555㎚, WAVE3 : 585∼700㎚).
[표 5]
Figure 112011053246949-pat00005
센스 프라이머 서열번호 25
5’-gaaagaagctgcagtcatgaaagagat-3’
안티센스 프라이머 서열번호 26
5’-cgcgagaccctctcttcagagc-3’
(실시예 4-1)
검출용 프로브 P8 서열번호 17
5’-cctgCtgcagctcc-(BODIPY FL)-3’
(실시예 4-2)
검출용 프로브 P9 서열번호 18
5’-accctaacctgCtgc-(BODIPY FL)-3’
(실시예 4-3)
검출용 프로브 P8 서열번호 19
5’-aacctgTtgcagctcc-(TAMRA)-3’
(실시예 4-4)
검출용 프로브 P9 서열번호 20
5’-tcaaacaccctaacctgTtgc-(TAMRA)-3’
이들 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 분석의 그래프이다. 도 6에서 (A)는 실시예 4-1, (B)는 실시예 4-2, (C)는 실시예 4-3, (D)는 실시예 4-4의 결과이다. 검출용 프로브 P8을 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 47℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 61℃ 부근에 보였다(A). 검출용 프로브 P9를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 44℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 58℃ 부근에 보였다(B). 검출용 프로브 P8을 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 52℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 61℃ 부근에 보였다(C). 검출용 프로브 P9를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행한 결과, wtDNA의 피크가 58℃ 부근에 보이고, mtDNA의 피크가 63℃ 부근에 보였다(D).
이들 결과로부터, 검출용 프로브 P8,9에 의하면, mtDNA와 wtDNA가 공존하는 경우에도, mtDNA의 검출 감도를 향상시킬 수 있음을 알았다.
서열번호 7,8의 염기 번호 135 또는 129번째의 c가 형광 표지되어 있는 것이 중요함이 이해되었다.
실시예 1∼4의 결과로부터, P1∼9(서열번호 9∼20)의 프로브를 사용했을 때, abl 유전자의 다형(T1076G(F359C), T757C(Y253H), A764T(E255V), 및 G895C／T(V299L))에 대해서, Tm 분석으로 해석이 가능한 형광 강도의 변화를 인정할 수 있었다. 즉, 변이형은, 야생형의 피크에 더하여, 다른 피크를 갖는 것이며, 고유의 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다. 따라서, P1∼9(서열번호 9∼20)의 프로브를 사용함으로써, abl 유전자의 다형을 검출할 수 있다.
본 발명은 의료, 진단, 연구 등의 분야에서 호적(好適)하게 이용할 수 있다.
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Claims (14)

  1. abl 유전자의 다형(多型)을 검출하기 위한 프로브로서,
    서열번호 9에 나타내는 염기서열이며 3' 말단의 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는
    다형 검출용 프로브.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 프로브.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈한 때에 형광 강도가 감소하는 프로브.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인 프로브.
  8. abl 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 제1항에 기재된 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. abl 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 하기 공정 (Ⅰ)∼(Ⅳ)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에, 제1항에 기재된 프로브를 첨가하여 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,
    (Ⅱ) 온도를 변화시켜 상기 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드 형성체를 해리시키고, 하이브리드 형성체의 해리에 의거하는 시그널의 변동을 측정하는 공정,
    (Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정하는 공정, 및
    (Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 목적의 다형의 유무 또는 다형을 갖는 염기 서열의 존재비를 결정하는 공정.
  10. 제9항에 있어서,
    (Ⅰ)의 공정 전 또는 (Ⅰ)의 공정과 동시에 DNA를 증폭하는 것을 더 포함하는 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 abl 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 공정, 및 다형의 유무에 의거하여 항(抗)백혈병약에 대한 내성 또는 항백혈병약의 약효를 판정하는 공정을 포함하는 항백혈병약에 대한 내성 또는 항백혈병약의 약효의 판정 방법.
  12. abl 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서, 제1항에 기재된 프로브를 포함하는 시약 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    abl 유전자의 서열번호 1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 제1항에 기재된 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 시약 키트.
  14. 제12항에 있어서,
    하기 P2 내지 P9로부터 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를 더 포함하는 시약 키트.
    (P2) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼146을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 146에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P3) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 135∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P3’) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼144를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 144에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P4) 서열번호 3 또는 4에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 134∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 134에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P5) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 138∼142를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 138에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P6) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼153을 포함하는 12∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 153에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P7) 서열번호 3 또는 5에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 142∼150을 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열에 상보적인 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 150에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P8) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼135를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 135에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드,
    (P9) 서열번호 6∼8에 나타내는 염기 서열에 있어서 염기 번호 126∼129를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기 서열 또는 그에 상동인 서열을 갖고, 염기 번호 129에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드.
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