CN102453766A - 多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法及多态性检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法及多态性检测用试剂盒。具体地,本发明提供了MRD1基因的多态性检测用探针,所述探针包含选自包括下述P1寡核苷酸及P2寡核苷酸的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸,(P1)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第288~300位的碱基的碱基长为13~68的第一碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第288位的碱基互补的碱基用第一荧光染料标记,(P2)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第300~305位的碱基的碱基长为6~93的第二碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第305位的碱基互补的碱基用第二荧光染料标记。
Description
技术领域
本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法及多态性检测用试剂盒。
背景技术
多药耐药基因MDR1(ABCB1)为编码各种药剂的转运蛋白的基因,其限定了以地高辛为代表的各种药剂的体内动力学。
一般认为,外显子26的第3435位的C置换为T的突变(C3435T突变)存在时,源自MDR1基因的P糖蛋白的表达量变动,各种药剂的体内动力学改变(例如:Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2000年,第97卷,第7号,p.3473-3478)。
已知:源自MDR1基因的P糖蛋白的表达量也由于MDR1基因的外显子21的第2677位的G置换为A或T的突变(G2677A/T突变)而受影响。还已知:上述C3435T突变和G2677A/T突变以高频率同时发生。
作为C3435T突变的检测方法,已知有以下方法:使用为了扩增包含MDR1基因的外显子26的第3435位的碱基的部分而设计的引物进行PCR,用能根据第3435位的碱基中有无突变来区分切断与否的限制性酶进行切断,然后用电泳检测是否切断(PCR-RFLP法)(例如:Genet.Mol.Res.,2010年,第9卷,第1号,p.34-40)。
作为检测C3435突变及G2677A/T突变的方法,已知有下述方法:通过PCR-RFLP法检测C3435突变,通过序列分析法检测G2677A/T突变(例如:Br.J.Clin.Pharmcol.、2005年、第59卷、第3号、p.365-370)。
一方面,已知有下述方法:在用PCR法扩增包含突变的区域后,使用用荧光染料标记的核酸探针进行解链曲线分析,基于解链曲线分析的结果 分析碱基序列的突变(例如:Clin.Chen.,2000年,第46卷,第5号,p.631-635,日本特开2002-119291号公报)。
已知有使用与上述同样的核酸探针来检测MDR1基因的外显子26中C3435T突变的方法(例如:日本特许4454366号公报)。
发明内容
发明要解决的问题
在Genet.Mol.Res.,2010年,第9卷,第1号,p.34-40及Br.J.Clin.Pharmcol.,2005年,第59卷,第3号,p.365-370中记载的PCR-RFLP法中,需要在PCR反应后取出扩增产物并进行限制性酶处理。因此,有时扩增产物有可能混入之后的反应体系中,由此得到假阳性、假阴性的结果。并且,在PCR结束后,用限制性酶进行处理,然后进行电泳,因此,有时到检测出为止所需要的时间也会非常长。另外,由于操作复杂,因此难以自动化。
在日本特许4454366号公报中记载的技术中,即使能够检测MDR1基因的外显子26中的C3435T突变,也无法检测MDR1基因的外显子21中的G2677A/T突变。
本发明提供了能够以高灵敏度简便地检测MDR1基因的外显子21中的G2677A/T突变的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法及药效评价方法以及多态性检测用试剂盒。
用于解决问题的手段
用于解决上述问题的具体方法如下所示。
<1>MRD1基因的多态性检测用探针,其包含选自包括下述P1寡核苷酸及P2寡核苷酸的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸,其中,
(P1)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第288~300位的碱基的碱基长为13~68的第一碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第288位的碱基互补的碱基用第一荧光染料标记,
(P2)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第300~305位的碱基的碱基长为6~93的第二碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第305位的碱基互补的碱基用第二荧光染料标记。
<2>如上述<1>所述的多态性检测用探针,其中,上述P1寡核苷酸在从上述P1寡核苷酸的3’末端起数第1~3位中的任意位置具有用上述第一荧光染料标记的碱基,
上述P2寡核苷酸在从上述P2寡核苷酸的5’末端起数第1~3位中的任意位置具有用上述第二荧光染料标记的碱基。
<3>如上述<1>或<2>所述的多态性检测用探针,其中,上述P1寡核苷酸在上述P1寡核苷酸的3’末端具有用上述第一荧光染料标记的碱基,
上述P2寡核苷酸在上述P2寡核苷酸的5’末端具有用上述第二荧光染料标记的碱基。
<4>如上述<1>至<3>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,上述荧光标记寡核苷酸与目标序列杂交时的荧光强度比未与目标序列杂交时的荧光强度小或大。
<5>如上述<1>至<4>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,上述荧光标记寡核苷酸与标记的序列杂交时的荧光强度比未与标记的序列杂交时的荧光强度小。
<6>如上述<1>至<5>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,上述P1寡核苷酸的碱基长为13~56,上述P2寡核苷酸的碱基长为6~29。
<7>如上述<1>至<6>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,上述P1寡核苷酸的碱基长为13~26,上述P2寡核苷酸的碱基长为6~23。
<8>如上述<1>至<7>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,上述P1寡核苷酸的碱基长为13~21,上述P2寡核苷酸的碱基长为6~18。
<9>如上述<1>至<8>中任一项所述的多态性检测用探针,其中,上述探针为用于解链曲线分析的探针。
<10>如上述<1>至<9>中任一项所述的多态性检测用探针,所述探针包含下述至少两种荧光标记寡核苷酸,所述至少两种荧光标记寡核苷酸中 与序列号2所示的碱基序列的第300位的碱基互补的碱基互不相同且上述互补的碱基为C、T或A。
<11>MDR1基因的多态性检测方法,其使用上述<1>至<10>中任一项所述的多态性检测用探针。
<12>如上述<11>所述的多态性检测方法,包含:
(I)使上述<1>至<10>中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触,使上述荧光标记寡核苷酸及上述单链核酸杂交而得到杂交体;
(II)通过改变包含上述杂交体的上述试样的温度,使上述杂交体解离,测定基于上述杂交体的解离的荧光信号的变动;
(III)基于上述荧光信号的变动,评价杂交体的解离温度的Tm值;和
(IV)基于上述Tm值,确认MDR1基因的多态性的存在。
<13>如上述<11>或<12>所述的多态性检测方法,还包括得到上述单链核酸的步骤,上述得到单链核酸的步骤包括在上述(1)之前或与(1)同时扩增核酸。
<14>如上述<11>至<13>中任一项所述的多态性检测方法,其还包括:使能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的突变的多态性检测用探针与上述试样中的上述单链核酸接触。
<15>如上述<14>所述的多态性检测方法,其中,上述能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的突变的多态性检测用探针为:具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸。
<16>药剂的药效评价方法,包括:通过上述<11>至<15>中任一项所述的多态性检测方法,检测MDR1基因中的多态性;和
基于检测的多态性的有无,对针对源自上述试样的药剂的耐受性或源自上述试样的药剂的药效进行评价。
<17>多态性检测用试剂盒,其包含上述<1>至<10>中任一项所述的多态性检测用探针。
<18>如上述<17>所述的多态性检测用试剂盒,其还包含:能够以序列号2所示的碱基序列中包含与上述P1或P2寡核苷酸杂交的碱基序列的区域为模板进行扩增的引物。
<19>如上述<17>至<18>中任一项所述的多态性检测用试剂盒,其还包含:具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始的9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸。
根据本发明,可以提供能够以高灵敏度简便地检测MDR1基因的外显子21中G2677A/T突变的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法以及药效评价方法及多态性检测用试剂盒。
附图说明
图1(A)是表示核酸混合物的解链曲线的一个示例的图,以及图1(B)是表示微分解链曲线的一个示例的图;
图2(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;图2(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;
图3(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;图3(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;
图4(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;图4(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图。
图5(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;图5(B)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图。
图6(A)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图;图6(B)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图;
图7(A)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图;图7(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;
图8是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;
图9是表示本发明的多态性检测用探针和与其互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图;
图10是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图。
具体实施方式
多态性检测用探针
本实施方式的多态性检测用探针(以下,也简称为“探针”),包括选自包括下述P1及P2的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸(以下,也称为“特定荧光标记寡核苷酸”)。
(P1)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第288~300位的碱基的碱基长为13~68的第一碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第288位的碱基互补的碱基用第一荧光染料标记,
(P2)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第300~305位的碱基的碱基长为6~93第二碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第305位的碱基互补的碱基用第二荧光染料标记。
通过包含至少一种所述特定的荧光标记寡核苷酸,能够以高灵敏度简便地检测MDR1基因的外显子21的G2677A/T突变。
序列号2所示的碱基序列为MDR1基因的外显子21的部分碱基序列,MDR1基因的外显子21中第2677位的碱基与序列号2所示的碱基序列的第300位的碱基对应。
序列号2所示的碱基序列的第300位的碱基在野生型(wild type)中为G(鸟嘌呤),但在突变型中突变为A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)。
在P1寡核苷酸中,所谓“与第288位的碱基互补的碱基”是指相对序列号2所示的碱基序列中第288位的碱基G(鸟嘌呤)而言互补的碱基C(胞嘧啶)。
此外,在本公开中,所谓相对某碱基序列而言“同源的序列”是指与该碱基序列相似性为80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为95%以上的碱基序列。
在P1寡核苷酸中,与该荧光标记互补的碱基C优选存在于从3’末端起数第1~3位的任意位置,更优选存在于3’末端。
P1寡核苷酸为能够检测序列号2所示的碱基序列的第300位碱基的多态性的探针。该碱基与MDR1基因的外显子21的第2677位的碱基相应,在野生型中为G,在突变型中为T或A。因此,与该碱基互补的P1寡核苷酸中的碱基优选为C、A或T。
即,P1寡核苷酸优选包含:选自包括(i)具有与野生型互补的互补序列的寡核苷酸、(ii)具有与(i)同源的序列的寡核苷酸、(iii)具有与突变型互补的互补序列的寡核苷酸、以及(iv)具有与(i)同源的序列的寡核苷酸的组中的至少一种。
P1寡核苷酸的碱基长为13~68,优选为13~56,更优选为13~26,进一步优选为13~21。通过该范围的碱基长,例如使多态性检测灵敏度进一步提高。
通过改变P1寡核苷酸的碱基长,可以使P1寡核苷酸与其互补序列形成的杂交体的解离温度的Tm值成为期望的值。
以下,将本发明中的P1寡核苷酸的碱基序列的示例示于表1,但本发明并不限于这些。
此外,在表1中一并示出序列号2的第300位的碱基为G、T及A的情况时的寡核苷酸和与各个荧光标记寡核苷酸的杂交体的Tm值。这里,Tm信使用Meltcalc 99 free(http://www.meltcalc.com/),在设定条件为Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件下算出。
[表1]
在表1中,仅例示了与序列号2中的第300位的碱基为G(野生型)的情况对应的寡核苷酸,但也可以同样地例示与该碱基为T或A的情况对应的寡核苷酸,即表1中的“C”为A或T的寡核苷酸。
P1寡核苷酸与具有互补的碱基序列的DNA杂交的情况下的Tm值和与仅序列号2的第300位的碱基不互补的DNA杂交的情况下的Tm值之差优选为3.0℃以上,更优选为7.0℃以上,进一步优选为9.0℃以上。通过将上述Tm值之差设为3.0℃以上,例如,可以以更高灵敏度检测序列号2的第300位的碱基的突变。
在P2寡核苷酸中,所谓“与第305位的碱基互补的碱基”是指相对序列号2所示的碱基序列中第305位的碱基G(鸟嘌呤)而言互补的碱基C(胞嘧啶)。
P2寡核苷酸中,与该荧光标记互补的碱基C优选存在于从5’末端起数第1~3位的任意位置,更优选存在于5’末端。由此,可以进一步提高多态性检测灵敏度。另外,可以以好的生产率得到P2荧光标记寡核苷酸。
上述P2寡核苷酸为能够检测序列号2所示的碱基序列中第300位碱基的多态性的探针。该碱基与MDR1基因的外显子21中第2677位的碱基相应,在野生型中为G,在突变型中为T或A。因此,与该碱基互补的P2寡核苷酸的碱基优选为C、A或T。
即,P2寡核苷酸优选包含:选自(i)具有与野生型互补的互补序列的寡核苷酸、(ii)具有与(i)同源的序列的寡核苷酸、(iii)具有与突 变型互补的互补序列的寡核苷酸、以及(iv)具有与(iii)同源的序列的寡核苷酸中的至少一种。
P2寡核苷酸的碱基长为6~93,优选为6~29,更优选为6~23,进一步优选为6~18。根据该范围的碱基长,例如可以使多态性检测灵敏度进一步提高。
通过改变P2寡核苷酸的碱基长,可以使P2寡核苷酸与其互补序列形成的杂交体的解离温度的Tm值成为期望的值。
以下,将本发明中的P2寡核苷酸的碱基序列的示例示于表2,但本发明并不限定于此。
此外,在表2中一并示出序列号2的第300位的碱基为T、G及A的情况时的寡核苷酸和与各荧光标记寡核苷酸的杂交体的Tm值。Tm值以与上文所述同样地算出。
[表2]
在表2中,仅例示了与序列号2的第300位的碱基为T(突变型)的情况对应的寡核苷酸,但也可以同样地例示与该碱基为G或A的情况对应的寡核苷酸,即表2中的“A”为C或T的寡核苷酸。
P2寡核苷酸与具有互补的碱基序列的DNA杂交的情况下的Tm值和与仅序列号2中的第300位的碱基不互补的DNA杂交的情况下的Tm值之差优选为2.8℃以上,更优选为4.0℃以上,进一步优选为6.0℃以上。通 过上述Tm值之差为2.8℃以上,例如可以以更高灵敏度地检测序列号2的第300位的碱基的突变。
上述荧光标记寡核苷酸(即上述探针)优选地为:与未与目标序列杂交时的荧光强度相比,与目标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中,更优选为:与未与目标序列杂交时的荧光强度相比,与目标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。利用了这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针通常称为鸟嘌呤淬灭探针,其作为所谓的QProbe(注册商标)已知。其中,寡核苷酸的3’末端或5’末端设计为C、以其末端的C靠近G时发光变弱的方式用荧光染料标记的寡核苷酸是特别优选的。
上述荧光染料没有特别限制。例如可以是荧光黄、磷光体、若丹明、聚甲炔染料(polymethine dye)衍生物等。作为这些荧光染料的市售品,例如可以是Pacific Blue、BODIPY FL(商标名,Molecular Probe公司(モレキユラ一·プロ一ブ社)制)、Fluore Prime(商品名,Amersham Fharmacia公司(アマシヤムフアルマシア社)制)、Fluoredite(商品名,Millipore公司(ミリポア社)制)、FAM(ABI公司制)、Cy3及Cy5(Amersham Fharmacia公司制)、TAMRA(Molecular Probe公司制)等。
荧光标记寡核苷酸的检测条件没有特别限制,可以根据使用的荧光染料适当地确定。例如Pacific Blue可以以检测波长445~480nm来检测、TAMRA可以以检测波长585~700nm来检测、BODIPY FL可以以检测波长520~555nm来检测。如果使用具有这样的荧光染料的探针,则可以根据各荧光信号的变动容易地确认杂交和解离。
上述荧光标记寡核苷酸例如还可以在3’末端添加磷酸基。如下文所述,可以通过PCR等基因扩增法来制备要检测有无多态性的DNA(目的DNA)。此时,通过使用在3’末端添加了磷酸基的荧光标记寡核苷酸,可以使其共存于扩增反应的反应液中。
通过在荧光标记寡核苷酸的3’末端上添加磷酸基,可以充分抑制探针自身由于基因扩增反应的延伸。另外,通过在3’末端添加如上所述的标记化物质(荧光染料),也可以得到同样的效果。
将具有上述碱基序列且5’末端或3’末端的C用荧光染料标记的寡核苷酸的具体例子示于以下(大写字母的碱基表示突变点,P表示磷酸基)。但是,荧光标记寡核苷酸并不限于以下示例。
[表3]
上述荧光标记寡核苷酸可以用作检测MDR1基因的多态性(特别是检测外显子21的多态性)的多态性检测用探针。
作为多态性检测用探针,通过使用与序列号2的第300位的碱基互补的碱基互不相同且该互补的碱基为C、T或A的至少两种荧光标记寡核苷酸,可以识别MDR1基因的外显子21中第2677位的碱基为G、A及T中的任一个。
上述至少两种荧光标记寡核苷酸优选包含互不相同的荧光染料。由此,可以以更高灵敏度或更简便地识别多态性。
多态性的检测方法只要是利用上述荧光标记核苷酸和检测对象序列的杂交的方法即可,对其没有特别限制。作为使用上述荧光标记核苷酸的多态性检测方法的示例,对利用了Tm分析的多态性检测方法进行以下说明。
多态性检测方法
本发明的多态性检测方法是检测MDR1基因的多态性的方法,其特征在于,包含下述工序(I)~(IV)。此外,本发明的多态性检测方法的特 征在于使用上述荧光检测用探针,其它的构成及条件并不限制于以下记载。
(I)使上述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触,将上述荧光标记寡核苷酸和上述单链核酸杂交而得到杂交体。
(II)通过改变包含上述杂交体的试样的温度,使上述杂交体解离,测定基于上述杂交体的解离的荧光信号的变动。
(III)基于上述荧光信号的变动评价杂交体的解离温度的Tm值。
(IV)根据上述Tm值,评价MDR1基因中多态性的存在。
在(III)中评价Tm值不仅包含评价杂交体的解离温度,还包含评价杂交体形成体的解链时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。可以根据微分值的大小,评价具有多态性的碱基序列(DNA)的丰度比。
关于定量确定具有多态性的碱基序列的丰度比的方法,以确定野生型和特定的突变型的丰度比的方法为例示于下文。但是,该方法仅为示例,并不限于此。
首先,制备野生型的核酸(Wt)和突变型的核酸(Mt)两种核酸的丰度比各不相同的多种核酸混合物。针对得到的多种核酸混合物,使用解链曲线分析装置等分别得到解链曲线。
图1(A)中示出了由某一种核酸混合物的温度(横轴)和荧光强度(纵轴)的关系所示的解链曲线,以及图1(B)中示出了由温度(横轴)和荧光强度的微分值(纵轴)的关系所示的解链曲线(也称为微分解链曲线)。通过由该微分解链曲线检测峰,来评价核酸Wt的解链温度TmW及核酸Mt的解链温度TmM,设定各个包含TmW及TmM的温度范围。作为包含TmW的温度范围ΔTW,例如可以设定为以在TmW和TmM之间荧光强度的微分值为最小时的温度作为下限,以与荧光强度的峰脚(裾野)对应的温度作为上限的温度范围。另外,作为包含TmM的温度范围的ΔTM,例如可以设定以在TmW和TmM之间荧光强度的微分值为最小时的温度作为上限,将与荧光强度的峰脚对应的温度作为下限的温度范围。此外,可以进行设定以使温度范围ΔTW及温度范围ΔTM为相同幅度(例如,10℃)或不同幅度(温度范围ΔTW为10℃,温度范围ΔTM为7℃)。
另外,温度范围ΔTW及温度范围ΔTM也可以由各个解链温度Tm加X℃、减X℃的范围(X℃例如为15℃以下,优选为10℃以下)的方式进行设定。
接着,针对各个温度范围ΔTW及温度范围ΔTM,计算经过与微分解链曲线的温度范围的下限对应的点及与上限对应的点的直线和微分解链曲线所包围的面积(图1(B)的斜线部分)。作为计算面积的方法的示例,具体而言,可以如下所述进行计算。以温度T中的荧光强度的微分值作为f(T),温度T中的基准值作为B(T),通过下述(1)式求得。
面积S={f(Ts+1)-B(Ts+1)}+{f(Ts+2)-B(Ts+2)}+…+{f(Te-1)-B(Te-1)}…(1)
其中,Ts为各温度范围中的下限值、Te为上限值。另外,各温度T的基值B(T)为通过下述(2)式求得的值,表示荧光强度的检测信号中所含的背景水平。通过从荧光强度的微分值中扣除该基值,除去荧光强度的检测信号中所含的背景的影响。
B(T)=a×(T-Ts)+f(Ts)…(2)
其中,a={f(Te)-f(Ts)}/(Te-Ts)
试样中的核酸可以为单链核酸,也可以是双链核酸。在上述核酸为双链核酸的情况下,例如,优选包括:在与上述荧光标记寡核苷酸进行杂交之前,通过加热使上述试样中的双链核酸解链(解离)而制成单链核酸。通过使双链核酸解离为单链核酸,可以与上述荧光标记寡核苷酸进行杂交。
试样中所含的核酸例如可以为生物试样中原本所含的核酸,但为了提高检测精度,优选为:以生物试样中原本所含的核酸为模板、通过PCR等扩增了包含MDR1基因的突变位点的区域的扩增产物。扩增产物的长度没有特别限制,例如为50~1000元(mer),优选为80~200元。另外,试样中的核酸例如可以是通过RT-PCR(逆转录PCR,Reverse Transcription PCR)从源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)合成的cDNA。
应用多态性检测方法的试样只要是存在MDR1基因的试样即可,对其没有特别限制。作为具体例子,其可以是白血球细胞等血球试样、全血试 样等。此外,试样的采取方法、包含核酸的试样的制备方法等没有限制,可以采用现有公知的方法。
上述探针相对于上述试样的核酸的添加比例(摩尔比)没有特别限制。相对于试样中的DNA而言优选为1倍以下,更优选为0.1倍以下。由此,例如可以充分地确保检测信号。
在此,试样中的核酸例如可以为发生了检测目标的多态性的检测对象核酸和未发生上述多态性的非检测对象核酸的合计,也可以为包含发生了检测目标的多态性的检测对象序列的扩增产物和包含未发生上述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外,试样中的核酸中上述检测对象核酸的比例通常是不清楚的,但结果上,上述探针的添加比例(摩尔比)优选相对于检测对象核酸(包含检测对象序列的扩增产物)为10倍以下,更优选为5倍以下,进一步优选为3倍以下。另外,其下限没有特别限制,例如为0.001倍以上,优选为0.01倍以上,进一步优选为0.1倍以上。
上述探针相对于上述DNA的添加比例例如可以为相对于双链核酸的摩尔比,也可以为相对于单链核酸的摩尔比。
所谓解链温度Tm,通常定义为吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。通常,加热包含双链DNA的溶液时,260nm下的吸光度上升。这是因为双链DNA的两链之间的氢键因加热而解开,解离为单链DNA(DNA的解链)。由此,全部的双链DNA解离成为单链DNA时,该吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右,由此可以判断为解链结束。基于该现象,解链温度基于该现象定义。
在本发明中,虽然为了确定Tm值对伴随温度变化的信号变动的测定也可以由如上所述的原理通过测定260nm的吸光度来进行,但优选测定基于添加于上述多态性检测用探针上的标记的信号的信号,即根据单链DNA和上述多态性检测用探针的杂交体形成的状态而变动的信号。因此,作为上述多态性检测用探针,优选使用上述荧光标记寡核苷酸。作为上述荧光标记寡核苷酸,例如可以是与未和目标序列杂交时的荧光强度相比、与目标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸,或与未 和目标序列杂交时的荧光强度相比、与目标序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。
如果为前者那样的探针,则与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示荧光信号或荧光信号弱,但因加热而探针解离时,开始显示荧光信号或荧光信号增加。
另外,如果为后者的探针,则通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)来显示荧光信号,因加热而探针解离时,荧光信号减少(消失)。因此,通过在荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的改变,可以与上述260nm下的吸光度测定同样地进行解链以及进行Tm值的确定。
接着,举出具体的例子对检测基于荧光染料的信号变化的多态性检测方法进行说明。此外,上述多态性检测方法的特征在于使用上述多态性检测用探针,其它的工序及条件没有任何限制。
作为包含成为进行核酸扩增时的模板的核酸的试样,只要包含核酸即可,没有特别限制。例如可以是血液、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、洗胃液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或可源自生物学起源的物质。成为模板的核酸可以由该起源得到而直接原样使用,或为了改变该样品的特性在进行预处理后使用。
例如在以全血为试样的情况下,可以通过公知的方法进行从全血中分离基因组DNA。例如可以使用市售的基因组DNA分离试剂盒等(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit;GE Healthcare Bio-Sciences公司(GEヘルスケアバイオサイエンス社)制)等。
接着,在包含经分离的基因组DNA的试样中添加包含上述荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针。
上述多态性检测用探针可以添加到包含经分离的基因组DNA的液体试样中,也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。上述溶剂没有特别限制,例如可以是Tris-HCL等缓冲液、包含KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等的溶剂、PCR反应液等现有公知的溶剂。
添加上述多态性检测用探针的时机没有特别限制,例如在进行下文所述的PCR等扩增处理的情况下,可以在扩增处理后对PCR扩增产物添加,也可以在扩增处理前添加。
在这样PCR等的扩增处理前添加上述检测用探针的情况下,例如,优选如上述在其3’末端添加荧光染料或添加磷酸基。
作为核酸扩增的方法,使用聚合酶的方法是优选的,其例子可以是PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)、ICAN法、LAMP法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification,基于核酸序列的扩增)等。在通过使用聚合酶的方法进行扩增的情况下,优选在存在本发明探针的情况下进行扩增。根据使用的探针及聚合酶调整扩增的反应条件等对于本领域技术人员而言是容易的。由此,仅通过在扩增核酸后分析探针的Tm值即可评价多态性,因此,不需要处理反应结束后的扩增产物。因此,没有扩增产物引起污染的担忧。另外,可以用与扩增所需要的设备相同的设备进行检测,因此,不需要移动容器,也容易自动化。
用于PCR的引物对只要能扩增本发明探针能杂交的区域即可,对其没有特别限制,可以以与通常的PCR的引物对的设定方法同样的方式来设定。引物的长度及Tm值通常为12元~40元、40~70℃,优选为16元~30元、55~60℃。引物对的各引物的长度也可以不同,但优选两引物的Tm值大致相同(或两引物的Tm值之差为2℃以内)。
以下示出可以用于本发明的多态性检测方法的检测对象序列的扩增中的引物组的示例。此外,这些为例示,本发明并不限于此。
[表4]
名称 | 碱基序列 | 序列号 |
MDR1外显子21-F引物 | AAATGTTGTCTGGACAAGCACTG | 序列号3 |
MDR1外显子21-R引物 | AATTAATCAATCATATTTAGTTTGACTCAC | 序列号4 |
作为用于PCR法的DNA聚合酶,可以没有特别限制地使用通常使用的DNA聚合酶。例如可以是GeneTaq(nippongene公司(ニツポンジ一ン社)制)、Prime STAR Max DNA Polymerase(Takara-bio公司(タカラバイオ社)制)等。
可以通过适宜选择通常使用的条件进行PCR。
在扩增时,也可以通过实时PCR来监测扩增,调查试样中所含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即,随着PCR的DNA(检测对象序列)的扩增,形成杂交体的探针的比例增加,因此,荧光强度变动。可以通过对其进行监测来评价试样中所含的检测对象序列(野生型DNA或突变型DNA)的拷贝数及丰度比。
在上述多态性检测方法中,使上述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触而使两者杂交。试样中的单链核酸,例如可以通过解离如上所述得到的PCR扩增产物来制备。
上述PCR扩增产物的解离(解离工序)中的加热温度只要为上述扩增产物可以解离的温度即可,没有特别限制。例如为85~95℃。加热时间也没有特别限制。通常为1秒钟~10分钟,优选为1秒钟~5分钟。
另外,解离的单链DNA和上述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在上述解离工序之后通过降低上述解离工序的加热温度来进行。温度条件例如为40~50℃。
杂交工序的反应液中的各组成成分的体积及浓度没有特别限制。作为具体例,上述反应液中的DNA的浓度例如为0.01μM~1μM,优选为0.1μM~0.5μM,上述荧光标记寡核苷酸的浓度例如优选满足相对于上述DNA的添加比例的范围,例如为0.001μM~10μM,优选为0.001μM~1μM。
而且,对得到的上述单链DNA和上述荧光标记寡核苷酸的杂交体徐徐加热,测定伴随温度上升的荧光信号的变动。例如在使用Qprobe的情况下,在与单链DNA杂交的状态下,与解离的状态相比,荧光强度减少(或淬灭)。因此,例如徐徐加热荧光减少(或淬灭)的杂交体,测定伴随温度上升的荧光强度的增加即可。
测定荧光强度的变动时的温度范围没有特别限制。例如开始温度为室温~85℃,优选为25~70℃,结束温度例如为40~105℃。另外,温度的上升速度也没有特别限制。例如为0.1~20℃/秒,优选为0.3~5℃/秒。
接着,分析上述信号的变动并确定为Tm值。具体而言,可以由得到的荧光强度算出各温度下的微分值(-d荧光强度/dt),将示出的最低值的温度确定为Tm值。另外,也可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光 强度增加量/t)的最高点确定为Tm值。此外,作为标记化探针,在不使用淬灭探针而使用由于杂交体形成而信号强度增加的探针的情况下,相反地,测定荧光强度的减少量即可。
另外,如上所述,对杂交体加热,测定伴随温度上升的荧光信号的变动(优选荧光强度的增加),但代替该方法,例如也可以进行杂交体形成时的信号变动的测定。即,也可以测定使添加了上述探针的试样的温度降低而形成杂交体时的伴随上述温度的降低的荧光信号的变动。
作为具体例子,在使用与未和目标序列杂交时的荧光强度相比、和目标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针(例如,QProbe)的情况下,将上述探针添加到试样中时,上述探针处于解离状态,因此荧光强度大,但因温度的下降而形成杂交体时,上述荧光减少(或淬灭)。因此,例如徐徐降低上述加热的试样的温度,测定伴随温度下降的荧光强度的减少即可。
另一方面,在使用因杂交体形成而信号增加的标记化探针的情况下,在试样中添加上述探针时,上述探针处于解离状态,因此荧光强度小(或淬灭),但因温度的降低而形成杂交体时,荧光强度变为增加。因此,例如徐徐降低上述试样的温度,测定伴随温度下降的荧光强度的增加即可。
上述多态性检测方法的特征在于,使用至少一种能够检测MDR1基因的外显子21中的突变的上述荧光标记寡核苷酸(特定荧光标记寡核苷酸)。此外,优选一并使用能够检测MDR1基因的外显子26中的突变的第3荧光标记寡核苷酸。通过检测外显子21及外显子26的突变两者,例如可以精度更良好地预测源自MDR1基因的P糖蛋白的表达量。
作为上述第3荧光标记寡核苷酸,只要能够检测序列号1所示的碱基序列中的第256位的碱基的突变即可,对其没有特别限制。上述第3荧光标记寡核苷酸可以与已经描述过的特定荧光标记寡核苷酸同样地构成。例如,在本发明中也可以使用在日本特开2005-287335号公报中记载的荧光标记寡核苷酸。
另外,序列号1所示的碱基序列为MDR1基因的外显子26的部分序列,外显子26的第3435位的碱基与序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基对应。
作为第3荧光标记寡核苷酸,具体而言,可以是具有与序列号1所示的碱基序列中从第243位的碱基开始14~50个碱基长的碱基序列互补的序列的荧光标记寡核苷酸、具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的序列的荧光标记寡核苷酸。
本发明中的第3荧光标记寡核苷酸优选具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸,更优选为具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列,且在5’末端上具有荧光染料的荧光标记寡核苷酸。通过这种荧光标记寡核苷酸,例如可以使突变检测灵敏度进一步提高。
将具有上述碱基序列且5’末端或3’末端的C用荧光染料标记的探针的具体例示于以下(大写字母的碱基表示突变点,P表示磷酸基)。但是,上述荧光标记寡核苷酸并不限定于以下物质。
[表5]
名称 | 序列 | 碱基长 | 序列号 |
MDR1外显子26探针 | (Pacific Blue)-ctgccctcacAatctcttc-P | 19 | 序列号7 |
起因于第3荧光标记寡核苷酸的荧光信号的变化可以与已经描述过的特定荧光标记寡核苷酸同样地进行测定。
在使用第3荧光标记寡核苷酸的情况下,第3荧光标记寡核苷酸中所含的荧光染料优选为与上述特定荧光标记寡核苷酸中所含的荧光染料发射波长不同的荧光染料。由此,例如可以同时测定起因于特定荧光标记寡核苷酸的荧光信号变化和起因于第3荧光标记寡核苷酸的荧光信号变化。
在多态性检测方法中,在一并使用上述第3荧光标记寡核苷酸的情况下,优选地进一步包括:扩增包含序列号1所示的碱基序列中的第256位的碱基的碱基长50~1000的区域,上述区域的碱基长更优选为80~200。
由此,例如可以以更高的灵敏度检测MDR1基因的外显子26的突变。
扩增包含上述序列号1所示的碱基序列中的第256位的碱基的碱基长50~100的区域的方法没有特别限制。例如,可以使用已经描述过的PCR。
应用于PCR的引物,只要能够扩增作为目标的、包含上述序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的区域就没有特别限制。例如,也可以将日本特开2005-287335号公报中记载的引物应用于本发明。
以下示出可以用于本发明的多态性检测方法中的、扩增包含上述序列号1所示的碱基序列中的第256位的碱基的区域的引物组的示例。
[表6]
名称 | 碱基序列 | 序列号 |
MDR1外显子26-F引物 | ACTGCAGCATTGCTGAGAAC | 序列号5 |
MDR1外显子26-R引物 | CAGAGAGGCTGCCACATGCTC | 序列号6 |
在上述多态性检测方法中,通过使用与序列号2所示的碱基序列中第300位的碱基(突变位点)互补的碱基互不相同、上述互补的碱基为C、T或A的至少两种荧光标记寡核苷酸,可以识别上述突变位点的碱基的种类。
例如,参照附图对使用P1荧光标记寡核苷酸(以下,也称为“探针1”)和P2荧光标记寡核苷酸(以下,也称为“探针2”),识别MDR1基因的外显子21中的突变位点的碱基的方法进行说明,其中P1荧光标记寡核苷酸具有序列号8所示的碱基序列,且在3’末端具有荧光染料(例如,TAMRA),P2荧光标记寡核苷酸具有序列号9所示的碱基序列,且在5’末端具有荧光染料(例如,BODIPY FL)。
另外,上述探针1与野生型(即,突变位点为G)的碱基序列互补,上述探针2与突变位点为T的碱基序列互补。
图2~图7分别示出使用了作为检测对象的各种DNA的微分解链曲线的示例。在各个附图中,横轴为温度,纵轴为荧光强度的微分值,另外,上图(A)表示探针2的荧光染料的测定波长的微分解链曲线,下图(B)表示探针1的荧光染料的测定波长的微分解链曲线。
在本发明的多态性检测方法中,通过确认试样的解链曲线的峰的位置和野生型及T突变型的Tm值的关系,具体地说明用识别试样中的DNA的突变的种类的方法。
即,在解链曲线的峰与野生型的Tm值一致的情况下,可以判断为在试样中的DNA中包含野生型。另一方面,在解链曲线的峰与和T型突变对应的Tm值一致的情况下,可以判断为在试样中的DNA中包含T型突变。在解链曲线的峰与和野生型的Tm值及T型突变对应的Tm值均不一致的情况下,可以判断为仅包含均不对应的A型突变。另外,如果解链曲线的峰为1个,则是指仅野生型及T型突变的任一者,如果解链曲线的峰为2个,则可以判断为包含野生型突变及T型突变的两者的异源型(hetero型)。通过应用组合了这些信息的方法,可以判断试样中的DNA的突变。
例如,图2是检测对象的DNA为野生型(即,突变位点为G)的情况的微分解链曲线的一个示例。应用上述方法的话,图2(B)中,荧光强度变化的峰和与野生型对应的Tm值(图2(B)的虚线位置)一致,由此可知检测对象的DNA包含野生型。另外,在图2(A)中,在比突变位点为T的Tm值(图2(A)的虚线位置)低的温度处有单一的荧光强度变化的峰,由此可知检测对象的DNA仅包含野生型。
同样,通过应用上述方法,由图3~图7所示的解链曲线分别可知,图3表示检测对象的DNA的突变仅为A型突变的情况,图4表示检测对象的DNA中仅包含T型突变的情况,图5表示包含野生型和A型突变的情况,图6表示包含野生型和T型突变的情况,图7表示包含A型和T型突变的情况。
如上所述,通过使用与序列号2所示的碱基序列中第300位的碱基(突变位点)互补的碱基互不相同且上述互补的碱基为C、T或A的至少两种荧光标记寡核苷酸,可以以高灵敏度且简便地识别上述突变位点的碱基的种类。
接着,参照附图对本发明的多态性检测方法中检测序列号1所示的碱基序列中的第256位的碱基的突变的方法进行说明。
例如,通过使用具有序列号7所示的碱基序列、且在5’末端具有荧光染料的第3荧光标记寡核苷酸(以下,也称为“外显子26探针”),可以检测MDR1基因的外显子26中的C3435T突变。
此外,上述外显子26探针与突变位点为T(胸腺嘧啶)的碱基序列互补。
图8是检测对象的DNA为野生型的情况的微分解链曲线的一个示例。在图9中,在比与T突变型对应的Tm值(图9的虚线位置)低的温度处,存在荧光强度变化的峰,由此可知检测对象的DNA包含野生型。
另外,图9是检测对象的DNA为T突变型的情况的微分解链曲线的一个示例。在图10中与T突变型对应的Tm值(图9的虚线位置)的温度处,存在荧光强度变化的峰,由此可知检测对象的DNA包含T突变型。
此外,图10是检测对象的DNA为野生型和T突变型的异源型的情况的微分解链曲线的一个示例。在图10中与T突变型的Tm值(图10的虚线位置)的温度和比其低的温度处,存在两个荧光强度变化的峰,由此可知检测对象的DNA包含野生型和T突变型。
药效评价方法
根据本实施方式的MDR1基因的多态性检测方法,可以检测MDR1基因的外显子21的突变的有无和种类,进而也可以一并检测有无外显子26中的突变。由此,可以基于有无多态性及突变序列和正常序列的丰度比,评价对药剂的耐受性及药剂的药效。而且,本实施方式的药效评价方法对于基于有无突变及突变序列的丰度比确定疾病的治疗方针(药剂的给药量的增加、向其它的治疗药的变更等的改换等)是有用的。
多态性检测用试剂盒
本实施方式的多态性检测用试剂盒包含含有至少一种上述特定荧光标记寡核苷酸的多态性检测用探针,根据需要还包含引物等而构成。本发明的多态性检测用试剂盒能够检测MDR1基因的外显子21中的突变。
上述多态性检测用探针可以包含一种荧光标记寡核苷酸,也可以包含两种以上。本发明中,优选地,包含与序列号2所示的碱基序列中的第300位的碱基互补的碱基互不相同且上述互补的碱基为C、T或A的至少两种荧光标记寡核苷酸,更优选还包含至少一种可以检测序列号1所示的碱基序列中第256位碱基的突变的多态性检测用探针。
在包含两种以上荧光标记寡核苷酸作为多态性检测用探针的情况下,可以以混合状态包含各个荧光标记寡核苷酸,也可以单独包含。
另外,在以混合有两种以上的本发明的探针的状态包含于上述多态性检测用试剂盒的情况下,或在作为个别的试剂而被包含,但例如在使用时在相同反应体系中进行各荧光标记寡核苷酸和各检测对象序列的Tm分析的情况下,优选地,两种以上的各探针用发射波长互不相同的荧光染料标记化。
通过这样改变荧光物质的种类,即使在相同的反应系中,也可以同时进行各个探针的检测。
上述检测试剂盒,除探针之外,还可以包含进行本发明的检测方法的核酸扩增时所需的试剂类,特别是用于使用DNA聚合酶进行扩增的引物。另外,探针、引物及其他的试剂类可以单独收纳,也可以将它们的一部分制成混合物。
上述多态性检测用试剂盒优选还含有能够以序列号2所示的碱基序列中包含与上述P1或P2寡核苷酸杂交的序列的区域作为模板进行扩增的引物。
并且,上述多态性检测试剂盒在包含可以检测序列号1所示的碱基序列中第256位碱基的突变的多态性检测用探针的情况下,该探针优选为具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸,另外,该试剂盒优选还含有如下引物,所述引物能够扩增包含序列号1所示的碱基序列中第256位碱基的碱基长50~100的区域,更优选80~200的区域。
通过包含用于扩增包含这样的多态性位点的序列(探针杂交的区域)的引物组,例如可以以更高灵敏度来检测多态性。
并且,上述多态性检测用试剂盒优选还包含记载有以下内容的操作说明书,所述内容包括使用上述多态性检测用探针,对包含检测对象的核酸的试样制作微分解链曲线,进行其Tm值分析,检测MDR1基因的突变。
实施例
以下,通过实施例更具体地说明本发明,但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、Arkray公司(ア一クレイ社)制)和下述表7中记载的处方的检查用试剂,进行PCR及Tm分析。
PCR在于95℃下进行60秒处理后,以在95℃下1秒及在58℃下30秒作为1个循环,反复进行50个循环。
另外,Tm分析在PCR之后,在95℃下进行1分钟处理,在40℃下进行60秒处理,接下来,以1℃/3秒的温度的上升速度,使温度由40℃上升至75℃,测定其间荧光强度随时间的变化。另外,测定波长采用585~700nm及520~555nm,分别测定源自MDR1外显子21探针1和MDR1外显子21探针2的荧光强度的变化。
[表7]
(其中,glycerol=甘油;exon=外显子;probe=探针;primer=引物)
将表7中记载的引物及探针的详细示于以下。探针中的P表示3’末端被磷酸化。
[表8]
名称 | 结构/碱基序列 | 序列号 |
MDR1外显子26探针 | (Pacific Blue)-ctgccctcacAatctcttc-P | 序列号7 |
MDR1外显子21探针1 | cttcccagCaccttctagttc-(TAMRA) | 序列号8 |
MDR1外显子21探针2 | (BODYPY FL)-cccagAaccttctagttc-P | 序列号9 |
MDR1外显子21-F引物 | AAATGTTGTCTGGACAAGCACTG | 序列号3 |
MDR1外显子21-R引物 | AATTAATCAATCATATTTAGTTTGACTCAC | 序列号4 |
MDR1外显子26-F引物 | ACTGCAGCATTGCTGAGAAC | 序列号5 |
MDR1外显子26-R引物 | CAGAGAGGCTGCCACATGCTC | 序列号6 |
以1μl(100cp/μl)的量使用由全血精制得到的人类基因组作为突变的检测对象试样。另外,使用的人类基因组的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为野生型(G)。将得到的微分解链曲线示于图2A及图2B。另外,图2A为使用MDR1外显子21探针2得到的微分解链曲线,图2B是使用MDR1外显子21探针1得到的微分解链曲线。
由图3A及图3B可知,检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为野生型。
实施例2
在实施例1中,使用1μl具有MDR1的外显子21中的第2677位的碱基突变为A(腺嘌呤)的碱基序列的25μM的人工寡核苷酸(碱基长50)作为突变的检测对象试样,不进行PCR,除此之外,与实施例1同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线示于图3(A)及图3(B)。另外,图3(A)为使用MDR1外显子21探针2得到的微分解链曲线,图3(B)为使用MDR1外显子21探针1得到的微分解链曲线。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为规定的突变型的情况对应。
实施例3
以1μl(100cp/μl)的量使用由全血精制得到的人类基因组作为突变的检测对象试样。另外,使用的人类基因组的MDR1基因的外显子21中的 第2677位的碱基突变为T(胸腺嘧啶)。在实施例1中,使用具有MDR1的外显子21中的第2677位的碱基突变为T(胸腺嘧啶)的碱基序列的试样作为突变的检测对象试样,除此之外,与实施例1同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线示于图4(A)及图4(B)。另外,图4(A)是使用MDR1外显子21探针2得到的微分解链曲线,图4(B)是使用MDR1外显子21探针1得到的微分解链曲线。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为规定的突变型的情况对应。
实施例4
在实施例1中,使用1μlMDR1的外显子21中的第2677位的碱基为野生型的25uM人工寡核苷酸(碱基长50)和具有突变为A(腺嘌呤)的碱基序列的25uM人工寡核苷酸(碱基长50)的核酸混合物(混合比例1∶1)作为突变的检测对象试样,不进行PCR,除此之外,与实施例1同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线示于图5(A)及图5(B)。另外,图5(A)是使用MDR1外显子21探针2得到的微分解链曲线,图5(B)是使用MDR1外显子21探针1得到的微分解链曲线。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为规定的突变型的情况对应。
实施例5
在实施例1中,以1μl(100cp/μl)的量使用由全血精制得到的人类基因组作为突变的检测对象试样。另外,使用的人类基因组的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为异源型(G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)),除此之外,与实施例1同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线示于图6(A)及图6(B)。另外,图6(A)是使用MDR1外显子21探针2得到的微分解链曲线,图6(B)是使用MDR1外显子21探针1得到的微分解链曲线。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为规定的突变型的情况对应。
实施例6
在实施例1中,以1μl(100cp/μl)的量使用由全血精制得到的人类基因组作为突变的检测对象试样。另外,使用的人类基因组的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为异源型(A(腺嘌呤)和T(胸腺嘧啶)),除此之外,与实施例1同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线示于图7(A)及图7(B)。另外,图7(A)是使用MDR1外显子21探针2得到的微分解链曲线,图7(B)是使用MDR1外显子21探针1得到的微分解链曲线。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子21中的第2677位的碱基为规定的突变型的情况对应。
实施例7
以1μl(100cp/μl)的量使用由全血精制得到的人类基因组作为突变的检测对象试样。另外,使用的人类基因组的MDR1基因的外显子26中的第3435位的碱基为野生型,将测定波长设为445~480nm,除此之外,与实施例1同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线中与MDR1外显子26探针对应的微分解链曲线示于图8。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子26中的第3435位的碱基为野生型的情况对应。
实施例8
在实施例7中,使用1uM具有MDR1基因的外显子26中的第3435位的碱基突变为T(胸腺嘧啶)的碱基序列的25uM人工寡核苷酸(碱基长50)作为突变的检测对象试样,不进行PCR,除此之外,与实施例7同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线中与MDR1外显子26探针对应的微分解链曲线示于图9。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子26中的第3435位的碱基为规定的突变型的情况对应。
实施例9
在实施例7中,以1μl(1000cp/μl)的量使用由全血精制得到的人类基因组作为突变的检测对象试样。另外,使用的人类基因组的MDR1基因的外显子26中的第3435位的碱基为异源型(C(胞嘧啶)和T(胸腺嘧啶)),除此之外,与实施例7同样地进行Tm分析。将得到的微分解链曲线中与MDR1外显子26探针对应的微分解链曲线示于图10。
得到的微分解链曲线与检测对象试样中所含的MDR1基因的外显子26中的第3435位的碱基为所定的突变型的情况对应。
比较例1
在实施例1中,仅使用具有以下所示的碱基序列的荧光标记寡核苷酸(MDR1外显子21探针3)作为荧光标记寡核苷酸,除此之外,与实施例1同样地测定荧光强度的变化。
在得到的微分解链曲线中,荧光强度变小,无法评价Tm值。
[表9]
名称 | 结构/碱基序列 | 序列号 |
MDR1外显子21探针3 | (TAMRA)-ctagaaggttctgggaag-P | 序列号10 |
由上可知,通过使用本发明的多态性检测用探针,能够高灵敏度且简便地检测MDR1基因的外显子21的G2677A/T突变。并且,还可知:通过一并使用能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的突变的多态性检测用探针,也能够同时检测MDR1基因的外显子26中的C3435T突变。
Claims (19)
1.MRD1基因的多态性检测用探针,其包含选自包括下述P1寡核苷酸及P2寡核苷酸的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸:
(P1)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第288~300位的碱基的碱基长为13~68的第一碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第288位的碱基互补的碱基用第一荧光染料标记,
(P2)寡核苷酸,其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第300~305位的碱基的碱基长为6~93的第二碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列,所述寡核苷酸中与第305位的碱基互补的碱基用第二荧光染料标记。
2.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述P1寡核苷酸在从所述P1寡核苷酸的3’末端起数第1~3位中的任意位置具有用所述第一荧光染料标记的碱基,
所述P2寡核苷酸在从所述P2寡核苷酸的5’末端起数第1~3位中的任意位置具有用所述第二荧光染料标记的碱基。
3.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述P1寡核苷酸在所述P1寡核苷酸的3’末端具有用所述第一荧光染料标记的碱基,
所述P2寡核苷酸在所述P2寡核苷酸的5’末端具有用所述第二荧光染料标记的碱基。
4.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸与目标序列杂交时的荧光强度比未和目标序列杂交时的荧光强度小或大。
5.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述荧光标记寡核苷酸与目标序列杂交时的荧光强度比未和目标的序列杂交时的荧光强度小。
6.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述P1寡核苷酸的碱基长为13~56,所述P2寡核苷酸的碱基长为6~29。
7.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述P1寡核苷酸的碱基长为13~26,所述P2寡核苷酸的碱基长为6~23。
8.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述P1寡核苷酸的碱基长为13~21,所述P2寡核苷酸的碱基长为6~18。
9.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述探针为用于解链曲线分析的探针。
10.如权利要求1所述的多态性检测用探针,其中,所述探针包含下述至少两种荧光标记寡核苷酸,所述至少两种荧光标记寡核苷酸中与序列号2所示的碱基序列的第300位的碱基互补的碱基互不相同且所述互补的碱基为C、T或A。
11.MDR1基因的多态性检测方法,其中,所述方法包括使用权利要求1~10中任一项所述的多态性检测用探针。
12.如权利要求11所述的多态性检测方法,所述方法包括:
(I)使所述多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触,使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸杂交而得到杂交体;
(II)通过改变包含所述杂交体的所述试样的温度,使所述杂交体解离,测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动;
(III)基于所述荧光信号的变动,评价杂交体的解离温度的Tm值;和
(IV)基于所述Tm值,确认MDR1基因的多态性的存在。
13.如权利要求11所述的多态性检测方法,还包括得到所述单链核酸的步骤,所述得到单链核酸的步骤包括在所述(1)之前或与(1)同时扩增核酸。
14.如权利要求11所述的多态性检测方法,还包括使能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的突变的多态性检测用探针与所述试样中的所述单链核酸接触。
15.如权利要求14所述的多态性检测方法,其中,所述能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的突变的多态性检测用探针为:具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸。
16.药剂的药效评价方法,所述方法包括:通过权利要求11所述的多态性检测方法,检测MDR1基因中的多态性;和
基于检测的多态性的有无,对针对源自所述试样的药剂的耐受性或源自所述试样的药剂的药效进行评价。
17.多态性检测用试剂盒,其包含权利要求1至10中任一项所述的多态性检测用探针。
18.如权利要求17所述的多态性检测用试剂盒,其还包含:能够以序列号2所示的碱基序列中包含与所述P1或P2寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。
19.如权利要求17所述的多态性检测用试剂盒,其还包含:具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9~50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸。
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