CN107429300A - 可目视判定的基因检查 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于:提供一种在临床现场等可以简易且正确地进行检查的DNA检测技术。本发明提供一种以通过连接扩增的单链核苷酸产物为检测样品的、可以更简易且迅速地通过目视进行的基因分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及扩增靶基因的单链DNA并进行检测的技术,以进行可目视判定的基因检查。
背景技术
分析样本(検体)的核苷酸序列(塩基配列)再进行判定的基因检查在基础研究、医疗、食品等领域广泛应用。更具体而言,其用于检测突变、判定基因多态性(在人或动物中是指变化频率为1%以上的基因)、检测病原菌、检查是否存在基因重组等。例如,认为基因多态性的判定可以事先预测药物的副作用或效果,从而在医疗现场等中开始有效运用。
基因检查典型的是利用使用了实时PCR设备的TaqMan法或QP法、使用了DNA微阵列的方法(DigiTag法等)等来进行。但是,这些方法均需要技术学习、高价的荧光检测设备,因此虽然进行了委托分析,但在医疗现场等难以有效运用,这是现状。
另外,公开了在固定有寡核苷酸的固相上检测靶核酸的方法(专利文献1、专利文献2)。这里所说的“固相”是指想要使寡核苷酸在硝酸纤维素膜或尼龙膜等可固定寡核苷酸的膜上结合成线条状或斑点状的所谓“条带”,具体例子有被称作PAS(Printed ArrayStrip,印刷阵列条带)的条带。根据核酸层析(色谱)法的原理,将通过PCR调制的DNA产物在该条带上展开,通过杂交可进行检测。在该方法中,调制的DNA产物具有以下特征:形成双链,在其DNA产物的一条链的末端添加单一标签。但是,由于是通过PCR扩增靶双链DNA序列,因此虽然灵敏度(反应性)高,但存在着以下问题:容易产生引物二聚体等非特异性扩增产物,精度(准确性)低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利5503021号;
专利文献2:国际公开第2012/070618号;
专利文献3:日本专利3103806号;
专利文献4:日本特开2006-101844号;
专利文献5:日本特公平6-36760号;
专利文献6:日本专利3330599号。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于:提供一种即使在临床现场等也可简易且正确地进行检查的基因分析技术。
在现有的条带技术中,使作为靶的DNA扩增,将已扩增的DNA产物在条带上“展开”,通过条带上的寡核苷酸与DNA产物发生杂交来进行判定。在该技术中,通过PCR大量扩增作为靶的DNA,在条带上展开其DNA产物。因此,为了在条带上进行DNA产物的检测,必须通过PCR进行扩增。但是,在通过PCR扩增的DNA产物中,往往会产生引物二聚体等非特异性DNA产物,在条带上检测到本来检测不到的DNA,存在着发生误判的问题。
另外,在使用条带检测SNP(单核苷酸多态性)时采用以下方法:通过使PCR中使用的引物的3’末端与SNP所对应的碱基配合,扩增SNP所对应的双链DNA。但是,在SNP的PCR的扩增工序中,有时会错误地发生引物的杂交,出现精度进一步降低的问题。
而且,在使用了条带的检测中,还考虑使用单链DNA序列进行检测的方法。例如考虑如下:在单链DNA的一个末端添加单一标签、在另一末端添加标记物质,通过PCR扩增的双链DNA产物通过热变性分离成单链DNA而获取。在该方法中,在PCR中出现上述问题,不仅精度降低,而且DNA产物还因热变性而发生分离,因此将其在条带上展开时,已分离的单链DNA的一部分又返回到双链DNA中,出现灵敏度进一步降低的问题。
因此,确立在临床现场等可以简易且高精度地进行检查的DNA检测技术是重要课题之一。特别是,着眼于使用了条带的基因检查技术,所述基因检查技术不需要大的装置等,在临床现场等可以简易且高精度地进行检查。
为了解决上述课题,本发明人着眼于:在用于检查的样品中不制作双链DNA产物,从而不扩增引物二聚体等非特异性双链DNA产物。因此,以通过连接扩增的单链DNA产物作为检测样品,来研究开发精度更高的基因检测技术。
一直以来都存在获得单链DNA的技术。作为有名的技术,可以列举Digitag法(专利文献3、专利文献4)及LCR(专利文献5、专利文献6)这样的技术。但是,在这些技术中,可知用于反应的寡核苷酸非特异性地与核酸样品结合,而被误判为假阳性。
对作为获得单链DNA的技术的Digitag法的工序进行说明。通过PCR扩增作为核酸样品的靶的基因序列。进行热变性,分离所得的PCR产物,之后使用Query oligo(クエリーオリゴ)和Common oligo(コモンオリゴ)进行连接反应,获得单链DNA的连接产物。以所得的单链DNA为模板,再次通过PCR进行扩增。所得的PCR产物通过热变性以单链形式分别注入微阵列上。微阵列上的寡核苷酸探针与单链DNA杂交,通过仪器读取由杂交的单链DNA发出的荧光并进行检测。此时,所得的单链DNA包括绿和红这两种荧光标记的引物。通过这些荧光形成绿和红、以及绿和红混合成的黄色。因此,在Digitag法中,在单色的绿或红的荧光检测中,即使另一个荧光标记的DNA发生杂交,但由于是微量,所以检测不到。因此,即使生成微量的二聚体也不会成为问题。
但是,将通过上述的Digitag法所得的单链DNA在条带上展开时,即使是微少的基因量,也会以线条的形式进行反应,有时被检测为假阳性。因此,虽然Digitag法作为获得单链DNA的技术是优异的,但从精度方面考虑,无法在条带中使用。
接下来,对作为获得单链DNA的技术的LCR反应的工序进行说明。通过PCR扩增作为核酸样品的靶的基因序列。PCR后,将Query oligo和Common oligo、以及与Query oligo和Common oligo互补的C Query oligo和C Common oligo、与连接酶等混合。将所得PCR产物进行热变性使之分离,之后使用Query oligo和Common oligo进行连接反应,获得单链DNA的连接产物。再利用与所得连接产物互补的C Query oligo和C Common oligo获得互补的连接产物。使用所得的连接产物和F Query oligo和F Common oligo获得连接产物。重复进行该工序,可以获得大量的单链DNA。
但是,将通过上述LCR所得的单链DNA在条带上展开时,有时会被检测为假阳性。这是由于:为了生成大量的单链DNA,而在探针和模板之间发生错配杂交,以可作为假阳性的无意图的单链DNA的形式生成连接产物。另外,由于探针彼此发生错配杂交,而进一步生成无意图的单链DNA。因此,虽然LCR作为获得单链DNA的技术是优异的,但从精度方面考虑,无法在条带中使用。
而且,如Digitag法所示,在通过多重PCR扩增的基因的种类增加时,容易发生反应的基因优先被扩增,而不易反应的基因的扩增效率有时会变差,没有检测到本来应该检测的核酸样品,还有可能误判为假阴性。
用于解决课题的手段
为了解决这些问题,本发明人着眼于不同于PCR或LCR、且不使用互补链DNA的基因扩增处理,找到了可以更简易且高精度地获取单链DNA的方法,完成了本发明。以往,制作单链DNA被指出存在以下问题:DNA的扩增效率较PCR差、灵敏度低。但是,与该指出相反,在本技术中实现了即使在临床现场等也可简易地进行检查的灵敏度。
即,本发明提供以下内容:
(1) 基因分析方法,该方法包括:使下述的(i)和(ii)杂交,形成可通过目视进行检测的状态,
(i) 寡核苷酸探针,其固定在条带上;
(ii) 单链连接产物,该产物是将下述的(a)和(b)供给以核酸样品为模板且经过一次或多次热循环处理的连接处理进行扩增而获得的:
(a) Query oligo,其包括与上述核酸样品互补的第一单链寡核苷酸和可与上述探针杂交的标签序列或标记部分;
(b) Common oligo,其包括与上述核酸样品互补且与上述第一单链寡核苷酸相邻的第二单链寡核苷酸和标签序列或标记部分;
(2) (1)的方法,该方法进行循环连接反应;
(3) (1)或(2)的方法,其中核酸样品和寡核苷酸为DNA;
(4) (1)~(3)中任一项的方法,其中条带为层析本体,所述层析本体具备:探针区,固定有配置在条带上的不同位置的多个探针;以及位置标记区,配置在不同于上述探针区的位置;
(5) (1)~(4)中任一项的方法,该方法是用于检测基因差异的方法;
(6) (1)~(5)中任一项的方法,该方法是用于检测基因多态性的方法;
(7) 试剂盒,其用于(1)~(6)中任一项的基因检查方法,包括:
固定有寡核苷酸探针的条带;
单链寡核苷酸,其包括与作为对象的核酸样品互补的序列和可与上述探针杂交的标签序列;以及
单链寡核苷酸,其包括与作为对象的核酸样品互补且与上述单链寡核苷酸相邻的单链寡核苷酸和标记物质或标签序列。
发明效果
根据本发明,可以更简易且迅速地通过目视进行基因分析。
附图说明
图1是显示本发明的样品处理的图。
图2是显示通过PCR扩增实施例1的样品而获得的片段的确认结果的图。
图3是实施例1中使用的PAS(Printed Array Strip)的示意图。
图4是显示实施例1的检测结果的图。
图5是显示普通的连接反应的温度变化的具体例子的图。
图6是显示循环连接反应的温度变化的具体例子的图。
图7是显示本发明的样品处理(循环连接)的图。
图8是显示通过PCR扩增实施例2的样品而获得的片段的确认结果的图。
图9是实施例2、实施例5中使用的PAS的示意图。
图10是显示实施例2的检测结果的图。
图11是显示通过PCR扩增实施例3的样品而获得的片段的确认结果的图。
图12是实施例3、实施例4中使用的PAS的示意图。
图13是显示实施例3的检测结果的图。
图14是显示通过PCR扩增实施例4的样品而获得的片段的确认结果的图。
图15是显示实施例4的检测结果的图。
图16是显示实施例5的检测结果的图。
具体实施方式
在一个方案中,本发明涉及:核酸样品的可目视检测状态下的多个基因多态性分析等基因分析方法。更具体而言,涉及以下方法:通过使利用核酸样品调制的包含标签序列和标记部分的单链连接产物与结合在固相载体上的寡核苷酸探针杂交,可以通过目视进行靶核酸的检测。
本发明的基因分析方法可用于所有基因的序列分析。例如,可用于细菌、病毒、植物、包括人在内的动物、除人以外的动物的基因分析,例如可用于变异、基因多态性、突变等基因变异的检测等。更具体而言,例如可用于HPV、登革热、流感病毒等的检测和型判定、动植物的种的判定、基因重组作物的检测、病毒耐药株基因、耐药性菌基因、单核苷酸多态性(SNP)、微卫星、取代·缺失·插入等的检测。例如,本发明的基因分析方法被用于基因多态性的检测。
(核酸样品)
作为本发明对象的核酸样品是核苷酸聚合而获得的分子,包括寡核苷酸、多肽等。另外,还包括所有种类的单链或双链DNA等。而且还包括:仅由天然核苷酸形成的样品;以及一部分中包括非天然碱基、核苷酸、核苷的样品;或者合成核酸。典型的是,核酸样品为DNA。
另外,作为本发明对象的核酸样品可以使用来自各种动植物的样品、例如血液、尿、鼻涕、唾液、组织、细胞、种子、植物组织、植物培养物等、以及来自微生物的样品,通过本领域技术人员所周知的方法、例如提取等而获得。所得核酸在处理前可以进行纯化也可以不进行纯化。另外,还可以进行人工合成而获得。优选核酸样品在后述的连接处理前通过PCR进行扩增。这种情况下,用于PCR的引物可由本领域技术人员根据作为对象的样品来适当选择、设计、调制。
通过PCR扩增核酸样品的特定部位未必是必要的工序,但在后述的连接处理中,能够以更高的精度获得扩增产物。
PCR可以是能够同时扩增多个基因的多重PCR。可扩增的基因数为2~15。优选为3~10,进一步优选为4~8。若基因数超过16而进行PCR,则生成多个二聚体,精度降低,在现场等无法简易地进行使用。
PCR的Tm值优选60~80℃。进一步优选为65~75℃。通过设定为较高温度,核酸样品与引物的退火呈特异性,可减少多重PCR的错配。
(固相载体)
在本发明的基因分析方法中,使用固定有寡核苷酸探针的固相载体。优选将作为在膜上结合有寡核苷酸探针的阵列的“条带”用作固相载体。这样的固相载体可以在实施基因分析方法之前调制,也可以使用市售品。固相载体优选具有探针区,所述探针区优选在不同位置固定有多个探针。另外,优选在有别于探针区的位置具有位置标记区。在本说明书中,将固定在条带上的寡核苷酸探针还称作检测探针。
使用的条带是可移动展开溶剂的层析本体,只要能够用于本发明的基因分析即可,没有特别限定。例如可以列举:在玻璃或塑料等基板上通过涂布或粘附等固定有二氧化硅、膜物质等的本体;或者在纸片上固定有硝酸纤维素等膜物质的本体等。优选的条带市售品的例子为PAS (TBA公司制造)。
对检测探针的长度没有特别限定,本领域技术人员根据作为对象的核酸样品可以适当设定。优选的例子为20个碱基以上且50个碱基以下。检测探针优选为DNA。
(Query oligo和Common oligo)
本发明的基因分析方法包括调制Query oligo和Common oligo。
本说明书中的Query oligo是指,包括与核酸样品互补的第一单链寡核苷酸和可任意与检测探针杂交的标签序列、或任意的标记部分的Query oligo。在本发明中,Queryoligo包括标签序列或标记部分。典型的是,在第一单链寡核苷酸的5’末端侧结合有标签序列或标记部分。在标签序列与第一单链寡核苷酸之间可以结合有间隔序列,标签序列与第一单链寡核苷酸也可直接结合而无间隔序列。
本说明书中的Common oligo是指,包括与核酸样品互补且与第一单链寡核苷酸相邻的第二单链寡核苷酸、以及任意的标记部分、或者可任意与检测探针杂交的标签序列的Common oligo。在本发明的一个实施方式中,Common oligo包括标记部分或标签序列。典型的是,在第二单链寡核苷酸的3’末端侧结合有标记部分或标签序列。另外,在第二单链寡核苷酸的5’末端可以添加也可以不添加磷酸。但是,在未添加磷酸的情况下,可以在后述的连接反应前插入在5’末端添加磷酸的工序。
在本发明的优选实施方式中,Query oligo包括标签序列,且Common oligo包括标记部分。另外,在另一优选实施方式中,Query oligo包括标记部分,且Common oligo包括标签序列。而且,在又一优选实施方式中,Query oligo包括标签序列,且Common oligo包括标签序列。
标记部分只要是能够检测与检测探针杂交的单链寡核苷酸的标记部分即可,没有特别限定。例如可以列举:荧光素、德克萨斯红、罗丹明和绿色荧光蛋白等荧光物质;鲁米诺、aclidinium衍生物等发光物质;3H、125I、35S、14C和32P等放射性物质;磁珠等磁性物质;过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶等酶;颜料和染料等色素;生物素、抗生物素蛋白和链霉亲和素等亲和性标记等。本发明的方法可用于目视检查,优选使用荧光物质、发光物质、色素等标记部分。另外,还优选使标记部分为生物素,通过使着色的结合有珠粒等的抗生物素蛋白或链霉亲和素与该生物素结合来进行检测。另外,还可以使标记部分为抗体和/或半抗原,在其上结合作为标记物质的选自荧光、放射能、磁性、酶、磷光、化学发光和着色的1种或2种以上来实现检测。半抗原是指虽然单独与抗体结合、但其本身不具有产生免疫应答的能力的物质,例如包括生物素、洋地黄毒苷和FITC等。
第一单链寡核苷酸、第二单链寡核苷酸的长度可由本领域技术人员根据作为对象的样品来适当设定。例如,第一单链寡核苷酸为10~60个碱基、第二单链寡核苷酸为20~70个碱基。优选第一单链寡核苷酸为12~40个碱基、第二单链寡核苷酸为20~50个碱基。
将本发明的基因分析方法用于检测基因变异时,可以在Query oligo、Commonoligo的任一者中包括变异部分。优选在Query oligo中包括变异部分。更优选变异部分位于Query oligo的3’末端。
Query oligo和Common oligo的优选浓度可由本领域技术人员根据作为对象的样品、作为检测目标的序列等适当调整。作为优选浓度的例子,以终浓度计Common oligo为100nM~5μM、Query oligo为1μM~10μM等。
(连接)
通过将上述Query oligo和Common oligo供给以核酸样品为模板的连接反应,可获得与固相载体杂交的连接产物。本说明书中所说的连接是指连接与对应的核酸样品结合的Query oligo和Common oligo的工序。由于与核酸样品结合的Query oligo和Common oligo形成彼此相邻的状态,因此通过使连接酶等发生作用进行连接反应,可以经由连接部分连接Query oligo和Common oligo。此时的连接反应可以是能够同时扩增多个基因的多重反应。可扩增的基因数为2~15。优选为3~10,进一步优选为4~8。
能够用于Oligo彼此连接的优选试剂包括栖热水生菌(Thermus aquaticus)的TaqDNA连接酶,但并不限于此。另外,改为酶的方法,通过化学方法可以连接两个Oligo组。
更具体而言,如图5所示,使核酸样品与Query oligo、Common oligo结合,之后在90℃以上的高温(例如90~100℃)下反应数分钟,接下来在50℃左右的温度(例如40~60℃)下反应数十分钟,从而使Query oligo和Common oligo连接,可以利用条带(这里使用PAS)进行基因多态性的判定等。更具体而言,连接处理可通过如下操作来实施:在90℃以上的高温下放置数分钟,接下来在50℃左右的温度下放置10~20分钟,再于90℃以上的高温下放置数分钟,之后降至40℃左右。进一步优选通过进行后述的循环连接反应可以提高灵敏度。
(循环连接反应)
为了获得大量的连接产物而采用LCR时,如上所述,存在着检查精度的问题。因此,本发明人没有加入Query oligo和Common oligo的互补链,而是将90℃以上的热处理和50℃左右的连接反应组合,从而能够进一步以高灵敏度且正确地进行基因多态性的判定等(图6)。该温度调节方法不同于单纯的连接反应,另外,由于没有加入Query oligo和Common oligo的互补链,所以还是不同于LCR的新的连接方法。本发明人将热处理和连接反应组合的该温度调节方法命名为循环连接反应(CLR: Cycling Ligation Reaction)。在本说明书中,将该反应称作“循环连接反应”。
更具体而言,如图7所示,在将Query oligo和Common oligo与核酸样品杂交的连接中,杂交和连接的时间设为10~30秒左右的短时间,温度设为较高温度。在该反应后快速升至高温,使形成了双链的核酸样品和DNA产物离开,再次降温,进行连接反应,上述工序要进行20次以上的循环。该反应的特征在于,在短时间内重复进行如下的4个工序:1. 急剧升高温度、2. 在短时间内进行高温处理、3. 急剧降温、4. 在短时间内进行连接反应。通过该循环连接反应,可以在短时间内正确地仅扩增目标单链DNA,在条带中可以进行高精度的检测。
在循环连接反应中,重复进行90℃以上的高温(例如90~100℃)和50℃左右的温度(例如40~60℃)(例如30个循环的90℃ 15秒和58℃ 30秒)。优选的循环连接反应的循环数例如为10次以上、20次以上、或30次以上。对循环数的下限、上限没有特别限定,下限例如是2次以上、3次以上、4次以上、5次以上等,上限例如是100次以下、90次以下、80次以下、70次以下、60次以下、50次以下、40次以下等。对1个循环的时间也没有特别限定,下限例如为10秒以上、20秒以上、30秒以上等,上限为10分钟以下、5分钟以下、3分钟以下、2分钟以下、1分钟以下等。杂交和连接的时间可以相同也可以不同,可以根据调制的样品等适当设定。对各时间的上限、下限没有特别限定,下限例如是10秒以上、15秒以上、30秒以上、40秒以上、50秒以上等,上限例如为5分钟以下、3分钟以下、2分钟以下、1分钟以下、50秒以下、40秒以下、30秒以下等。
在以往的使用条带的方法中,由于是将双链DNA供给检测,所以在单链的标签序列和样品之间需要使用间隔序列,但在本发明的方法中,将单链连接产物供给杂交处理而未进行PCR扩增,所以不需要间隔序列,可以简便地在短时间内进行基因分析。
在进行连接处理时,优选准备可与核酸样品同时生成的阳性对照。作为阳性对照,可以列举G3PDH基因等。通过使用样品和阳性对照的基因产物同时进行检测,即使在条带上没有显现出线条,也可判别是否存在连接处理的错误、或者是否包含该样品。
(基于固相载体的检测)
通过连接处理获得的连接产物被供给固定有检测探针的固相载体进行检测。例如,在使用条带等层析本体的情况下,在展开液中加入连接产物,根据需要加入缓冲液、显色液等进行混合,通过层析进行杂交反应。若采用本发明的方法,则形成可通过目视检测基因分析结果的状态。
这里所说的“可目视检测的状态”当然包括通过目视进行检测的方案,但实际上不必通过目视进行检测,例如还包括由阅读器等设备读取的方案。另外,还包括通过进行追加的操作、例如光照射而可以进行目视检查的状态。
如上所述,本发明的方法被用于各种用途。作为具体用途的例子,并不限于这些,可以列举:医疗现场中的遗传病的基因诊断、病原体的型判别、海关中的检疫、食品工厂或食品销售店中的食肉或植物的品种检查、是否使用了基因重组原料的判定等。
在其他方案中,本发明涉及可用于基因分析的试剂盒。
在一个实施方式中,本发明的试剂盒包含Query oligo和Common oligo,所述Query oligo包含具备检测探针的条带、可与检测探针杂交的标签序列和第一单链寡核苷酸,所述Common oligo包含第二单链寡核苷酸和标记部分。在另一个实施方式中,本发明的试剂盒包含Query oligo和Common oligo,所述Query oligo包含具备检测探针的条带、标记部分和第一单链寡核苷酸,所述Common oligo包含第二单链寡核苷酸和可与检测探针杂交的标签序列。而且,在又一个实施方式中,本发明的试剂盒包含Query oligo和Commonoligo,所述Query oligo包含具备检测探针的固相载体、可与检测探针杂交的标签序列和第一单链寡核苷酸,所述Common oligo包含第二单链寡核苷酸和可与标记探针杂交的标签序列。
另外,本说明书中所说的标记探针典型的是指,当单链DNA产物的两末端具有标签序列时,和不与检测探针杂交的Common oligo的标签序列杂交且具有标记部分的寡核苷酸探针。
优选本发明的试剂盒还包含连接酶。只要可用于连接处理即可,可以使用任何一种连接酶。优选的连接酶的例子为Taq DNA连接酶。
本发明的试剂盒可用于所有基因的序列分析。例如可用于细菌、病毒、植物、包括人在内的动物、除人以外的动物的基因分析,例如可用于变异、基因多态性、突变等基因变异的检测等。更具体而言,例如可用于:HPV、登革热、流感病毒等的检测和型判定;动植物的种的判定、基因重组作物的检测、清真(Halal)认证的检查、病毒耐药株基因、耐药性菌基因、单核苷酸多态性(SNP)、微卫星、取代·缺失·插入等的检测。例如,本发明的试剂盒可用于基因多态性的检测、或者牛或猪等食品假冒的鉴定、病毒感染的简易检查。
以下,详细地记载本发明的具体应用例,但本发明未必限于这些。
本发明所涉及的人的基因检查,通过由人的血液提取基因,可以容易地进行检查。作为基因,例如可以列举:细胞色素基因,可以获悉药物的代谢能力。例如,可以获悉体内的尼古丁代谢的容易程度、伊立替康或他莫昔芬这样的抗癌药的副作用或药效等。
本发明所涉及的动物的基因检查,例如通过使用各种动物的线粒体基因,可以进行其种的判别。因此,无需特别在动物生存的状态下采集血液等,即使是食品用的食肉也可获取基因。此外,还可以是加工品或汤的原料等。作为动物,并不限于牛或猪、鸟,还可以是绵羊、山羊、鱼等。
本发明所涉及的病原菌或病毒等的检查,例如通过由感染者直接采取,可以容易地进行检查。对病原菌或病毒没有特别限定,另外,不仅可以判别是否存在病原菌或病毒的感染,还可以进行型判别。
上述检查并非特别需要特殊的装置,只要有台式装置即可。可以设想:在医院等临床现场的应用,在食品工厂的工序检查、海关等的假冒食品混入的检查、动物的亲子鉴定、农作物的品种鉴定等多种情况下进行其应用。
以下,利用实施例来详细地说明本发明,但实施例是为了例示,本申请发明未必限于实施例。
实施例
实施例1
按照以下程序进行了基于本发明方法的靶基因变异的检测。以下,按照它们的顺序进行说明。截止至连接反应的程序见图1。
1. 引物的调制;
2. 靶基因的扩增;
3. 连接用探针的调制;
4. 连接反应;
5. 使用了层析本体(PAS:Printed Array Strip)的检测。
另外,将来自人的基因组DNA 的4个样品(A04、B03、C03、D03)用于实验。
1. 引物的调制
1-1. 引物的调制
准备了人基因组中的CYP2D6基因特异性的下述表1所示的引物C12~C14(ユーロフィンジェノミクス公司制造)。这些引物按照普通的寡核苷酸合成方法进行合成,调整至100μM的浓度。C12引物设计成扩增包含作为CYP2D6基因的基因多态性的rs16947(C突变为T)的基因区,C14引物设计成扩增包含作为该基因多态性的rs1065852(C突变为T)的基因区。需要说明的是,在附图中,将rs16947记为2850C>T、将rs1065852记为100C>T。
[表1]
2. 靶基因的扩增
2-1. 反应液调制
用于靶基因扩增的基因组DNA使用来自人的基因组DNA。使用表1的引物如下扩增了基因组DNA。需要说明的是,作为样品扩增用试剂,使用QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒。作为热循环仪,使用eppendorf公司的Mastercycler(注册商标) gradient。针对各样品调制表2所示的试剂。
[表2]
2-2. PCR反应
将所调制的样品溶液移入PCR管中,进行热循环反应(95℃下15分钟后,进行40个循环的95℃下30秒、68℃下2分钟,之后降至4℃)。然后,使用Agilent Technologies公司的生物分析仪对已扩增的样品进行电泳,确认获得了目标尺寸的扩增产物。结果见图2。
3. 连接用探针的调制
3-1. 连接用探针的调制
准备了与2.中获得的扩增样品结合的连接用探针(Common oligo由ユーロフィンジェノミクス公司制造、Query oligo由TBA公司制造)。探针的核苷酸序列见表3。关于连接用探针,针对各基因多态性制作了Common oligo 1种、Query oligo 2种。Query oligo包括与未发生基因变异的野生型结合者(标记为WT)和与发生基因变异的变异型结合者(标记为MT)。在Common oligo的3’末端标记有生物素[Biotin],在Query oligo的5’末端添加有与固定在层析本体(PAS)上的寡DNA互补的标签序列(序列信息未公开)。另外,在Query oligo和标签序列之间插入有Spacer C3(间隔C3)。固定在层析本体上的寡DNA的位置记载在图3中。
[表3]
3-2. Common oligo的5’末端的磷酸化
为了进行连接反应,在Common oligo的5’末端添加磷酸基。作为添加磷酸基的试剂,使用东洋纺公司的T4多核苷酸激酶。
3-3. 反应液调制
调制了表4所示的试剂。需要说明的是,为了研究Common oligo的最适浓度,加入到调制液中的Common oligo浓度设为1μM、10μM、50μM、100μM这4种。
[表4]
3-4. 反应条件
将Common oligo溶液移入PCR管中,放置在热循环仪上。温度条件如下:37℃下30分钟,之后95℃下3分钟,然后降至4℃,结束反应。
3-5. 反应液调制
在进行了磷酸基添加反应的Common oligo溶液总量(20μL)中混合20μLQuery oligo。需要说明的是,按照表5的组成向各Common oligo溶液中混合Query oligo。
[表5]
4. 连接反应
4-1. 反应液调制
连接反应中的组成如表6所示。需要说明的是,作为用于进行连接的酶,使用了NEWENGLAND BioLabs公司的Taq DNA连接酶。
[表6]
4-2. 连接反应
将连接溶液移入PCR管中,放置在热循环仪上。温度条件如下:95℃下5分钟,之后58℃下15分钟、95℃下2分钟,之后降至37℃,结束反应。
5. 使用了层析本体的检测
5-1. 杂交反应
使用4.中获得的单链DNA,进行了基于核酸层析的杂交反应及其检测。
5-2. 反应液调制
使用将展开液(TBA公司制造)、胶乳液(TBA公司制造)、含30%甲酰胺的TE缓冲液和连接产物混合而调制的反应液,实施了杂交反应和检测。反应液的组成见表7。
[表7]
反应液组成
5-3. 杂交工序
在1.5mL的管中加入各50μL的上述反应液,插入层析本体的各下端部,进行了基于层析的杂交反应。用约20分钟吸上全部的反应液,在全部吸上的阶段完成了基于层析的杂交反应。反应结束后,将层析本体风干,通过目视确认反应部位并拍摄图像。
5-4. 检测工序
通过目视确认了层析本体在干燥后是否显色。结果见表8和图4。如图4所示,在3.连接用探针的调制中将Common oligo的浓度设为500nM、Query oligo设为2.5μM时在预想的位置看到了显色,可以确认到该方法有效。
5-5. 结果
[表8]
实施例2
作为进一步提高基于本发明检测方法的靶基因变异的检测灵敏度的方法,按照以下程序进行了实验。以下,按照它们的顺序进行说明。截止至连接反应的程序见图7。
1. 引物的调制;
2. 靶基因的扩增;
3. 连接用探针的调制;
4. 循环连接反应;
5. 使用了层析本体(PAS:Printed Array Strip)的检测;
另外,将来自人的基因组DNA(A、B、C、D、E、F、G)用于实验。
1. 引物的调制
准备人基因组中的CYP2D6基因特异性的下述表9所示的引物C09、C10、C12、C14和作为阳性对照的G3PDH基因特异性的引物对照(ユーロフィンジェノミクス公司制造)。这些引物按照普通的寡核苷酸合成方法进行合成,调整至100μM的浓度。C09引物设计成扩增包含作为CYP2D6基因的基因多态性的rs1135840(G突变为C)的基因区,C10引物设计成扩增包含作为该基因的基因多态性的rs5030865(G突变为A)的基因区,C12引物设计成扩增包含作为该基因的基因多态性的rs16947(C突变为T)的基因区,C14引物设计成扩增包含作为该基因多态性的rs1065852(C突变为T)的基因区。需要说明的是,在附图中,rs1135840记为4180G>C、rs5030865记为1758G>A、rs16947记为2850C>T、rs1065852记为100C>T。
[表9]
2. 靶基因的扩增
2-1. 反应液调制
用于靶基因扩增的基因组DNA使用来自人的基因组DNA。使用表9的引物如下扩增了基因组DNA。需要说明的是,使用KAPABIOSYSTEMS公司的KAPA2G FAST Multiplex作为样品扩增用试剂。使用eppendorf公司的Mastercycler(注册商标) gradient作为热循环仪。针对各样品调制了表10所示的试剂。
[表10]
2-2. PCR反应
将所调制的样品溶液移入PCR管中,进行热循环反应(95℃下3分钟,之后进行30个循环的95℃下15秒、60℃下30秒、72℃下1分钟,之后在72℃下5分钟、最后降至4℃)。然后,使用Agilent Technologies公司的生物分析仪对所扩增的样品进行电泳,确认获得了目标尺寸的扩增产物。结果见图8。
3. 连接用探针的调制
3-1. 连接用探针的调制
准备了与2.中获得的扩增样品结合的连接用探针(Common oligo由ユーロフィンジェノミクス公司制造、Query oligo由TBA公司制造)。探针的核苷酸序列见表11。关于连接用探针,针对各基因多态性制作了Common oligo 1种、Query oligo 2种。Query oligo包含与未发生基因变异的野生型结合者(标记为WT)和与发生基因变异的变异型结合者(标记为MT)。在Common oligo的5’末端修饰有磷酸基[P],在3’末端标记有生物素[Biotin]。需要说明的是,实施例1中是进行了在Common oligo的5’末端修饰磷酸基的反应,而这次是以缩短操作时间为目的,在寡核苷酸合成阶段使用了在5’末端修饰有磷酸基的Common oligo。在Queryoligo的5’末端添加有与固定在层析本体(PAS)上的寡DNA互补的标签序列(序列信息未公开)。另外,在Query oligo和标签序列之间插入有Spacer C3。固定在层析本体上的寡DNA的位置记载在图9中。需要说明的是,在本实施例中,使用TBA公司销售的层析本体的E12系列。所固定的寡DNA数较实施例1中使用的D6系列有所增加,达到12种(F-1~F-12)。
[表11]
4. 循环连接反应
4-1. 反应液调制
连接反应中的组成如表12所示。需要说明的是,作为用于进行连接的酶,使用了NEWENGLAND BioLabs公司的Taq DNA连接酶。
[表12]
4-2. 连接反应
将连接溶液移入PCR管中,放置在热循环仪上。温度条件如下:95℃下1分钟,之后58℃下5分钟,然后进行30个循环的95℃下15秒、58℃下30秒,之后在95℃下加热1分钟,将温度降至37℃,结束反应。
5. 使用了层析本体的检测
5-1. 杂交反应
使用4.中获得的单链DNA,进行了基于核酸层析的杂交反应及其检测。
5-2. 反应液调制
使用将展开液(TBA公司制造)、胶乳液(TBA公司制造)、TE缓冲液和连接产物混合而调制的反应液,实施了杂交反应和检测。反应液的组成见表13。
[表13]
反应液组成
5-3. 杂交工序
在1.5mL的管中加入各20μL的上述反应液,插入层析本体的各下端部,进行了基于层析的杂交反应。杂交反应在37℃下进行。用约20分钟吸上全部的反应液,在全部吸上的阶段完成了基于层析法的杂交反应。反应结束后,将层析本体风干,通过目视确认反应部位并拍摄图像。
5-4. 检测工序
通过目视确认了层析本体在干燥后是否显色。如图10所示,已知的基因多态性和基于层析本体的基因多态性分析结果均一致。通过循环连接反应,层析本体上的线条相比实施例1可以充分地目视到。由此显示出:该方法作为简便的基因多态性的判定方法是有效的。
实施例3
为了显示本发明的检测方法不仅能够用作人基因的基因多态性的判定方法、而且还可用作动物种的判定方法,按照下述程序进行了实验。
1. 引物的调制;
2. 靶基因的扩增;
3. 连接用探针的调制;
4. 循环连接反应;
5. 使用了层析本体(PAS:Printed Array Strip)的检测。
另外,将来自人的基因组DNA、来自牛的基因组DNA、来自猪的基因组DNA、来自鸡的基因组DNA、来自牛和猪和鸡的DNA以1:1:1混合的DNA用于实验。
1. 引物的调制
从人、牛、猪、鸡的基因组中的线粒体DNA中找出与这4种共通的DNA序列,准备表14所示的引物(ユーロフィンジェノミクス公司制造)。这些引物按照普通的寡核苷酸合成方法进行合成,调整至100μM的浓度。
[表14]
2. 靶基因的扩增
2-1. 反应液调制
用于靶基因扩增的基因组DNA使用来自人、牛、猪、鸡的基因组DNA。使用表14的引物如下扩增了基因组DNA。需要说明的是,使用KAPABIOSYSTEMS公司的KAPA2G FAST Multiplex作为样品扩增用试剂。作为热循环仪,使用eppendorf公司的Mastercycler (注册商标)gradient。针对各样品调制了表15所示的试剂。
[表15]
2-2. PCR反应
将所调制的样品溶液移入PCR管中,进行热循环反应(95℃下3分钟,之后进行30个循环的95℃下15秒、57℃下30秒、72℃下1分钟,之后72℃下5分钟、最后降至4℃)。然后,使用Agilent Technologies公司的生物分析仪对所扩增的样品进行电泳,确认获得了目标尺寸的扩增产物。结果见图11。
3. 连接用探针的调制
3-1. 连接用探针的调制
准备了与2.中获得的扩增样品结合的连接用探针(Common oligo由ユーロフィンジェノミクス公司制造、Query oligo由TBA公司制造)。探针的核苷酸序列见表16。关于连接用探针,针对各动物种制作了Common oligo的 1种、Query oligo 1种。另外,作为阳性对照用,制作了与人、牛、猪、鸡共通的Common oligo、Query oligo。在Common oligo的5’末端修饰有磷酸基[P],在3’末端标记有生物素[Biotin]。在Query oligo的5’末端添加有固定在层析本体(PAS)上的与寡DNA互补的标签序列(序列信息未公开)。另外,在本实施例中,在Query oligo和标签序列之间未插入Spacer C3。固定在层析本体上的寡DNA的位置记载在图12中。需要说明的是,在本实施例中,使用了TBA公司销售的层析本体的F12系列。所固定的寡DNA的位置与实施例2中使用的E12系列多少有些不同。
[表16]
4. 循环连接反应
4-1. 反应液调制
连接反应中的组成如表17所示。需要说明的是,作为用于进行连接的酶,使用了NEWENGLAND BioLabs公司的Taq DNA连接酶。
[表17]
4-2. 连接反应
将连接溶液移入PCR管中,放置在热循环仪上。温度条件如下:95℃下1分钟,之后58℃下5分钟,然后进行30个循环的95℃下15秒、58℃下30秒,之后在95℃下加热1分钟,将温度降至37℃,结束反应。
5. 使用了层析本体的检测
5-1. 杂交反应
使用4.中获得的单链DNA,进行了基于核酸层析的杂交反应及其检测。
5-2. 反应液调制
使用将展开液(TBA公司制造)、胶乳液(TBA公司制造)、TE缓冲液和连接产物混合而调制的反应液,实施了杂交反应和检测。反应液的组成见表18。
[表18]
反应液组成
5-3. 杂交工序
在1.5mL的管中加入各20μL的上述反应液,插入层析本体的各下端部,进行了基于层析的杂交反应。杂交反应在37℃下进行。用约20分钟吸上全部反应液,在全部吸上的阶段完成了基于层析的杂交反应。反应结束后,将层析本体风干,通过目视确认反应部位并拍摄图像。
5-4. 检测工序
通过目视确认了层析本体在干燥后是否显色。如图13所示,利用该方法,可以进行基于层析本体判定各动物种。由此显示出:该方法作为简便的动物种判定方法是有效的。
实施例4
为了显示本发明的检测方法不仅可用作人基因的基因多态性的判定方法、还可用作病毒等的型判定方法,按照下述程序进行了实验。检测对象是人乳头瘤病毒的16型和18型。
1. 引物的调制;
2. 靶基因的扩增;
3. 连接用探针的调制;
4. 循环连接反应;
5. 使用了层析本体(PAS:Printed Array Strip)的检测。
另外,作为实验材料,使用导入了HPV16的基因片段和HPV18的基因片段的质粒、以及已知感染了HPV16的1个临床样本。
1. 引物的调制
准备了表19所示的HPV的16型和18型的特异性引物和作为阳性对照的人G3PDH基因特异性引物(ユーロフィンジェノミクス公司制造)。这些引物按照普通的寡核苷酸合成方法进行合成,调整至100μM的浓度。
[表19]
2. 靶基因的扩增
2-1. 反应液调制
用于靶基因扩增的DNA使用了包含来自HPV的16型的DNA序列的质粒和包含来自18型的DNA序列的质粒。这些质粒包含表19所示的HPV16和HPV18的引物序列。另外,为了评价HPV型判定的性能,实验中使用了已知感染HPV16的人基因组DNA。使用表19的引物如下扩增了这些DNA。需要说明的是,使用KAPABIOSYSTEMS公司的KAPA2G FAST Multiplex作为样品扩增用试剂。作为热循环仪,使用了eppendorf公司的Mastercycler(注册商标) gradient。针对各样品调制了表20所示的试剂。
[表20]
2-2. PCR反应
将所调制的样品溶液移入PCR管中,进行了热循环反应(95℃下3分钟,之后是30个循环的95℃下15秒、57℃下30秒、72℃下1分钟,然后在72℃下5分钟、最后降至4℃)。然后,使用Agilent Technologies公司的生物分析仪对所扩增的样品进行电泳,确认获得了目标尺寸的扩增产物。结果见图14。
3. 连接用探针的调制
3-1. 连接用探针的调制
准备了与2.中获得的扩增样品结合的连接用探针(Common oligo由ユーロフィンジェノミクス公司制造、Query oligo由TBA公司制造)。探针的核苷酸序列见表21。关于连接用探针,针对HPV16、HPV18和阳性对照的人G3PDH基因分别制作了Common oligo 1种、Queryoligo 1种。在Common oligo的5’末端修饰有磷酸基[P],在3’末端标记有生物素[Biotin]。在Query oligo的5’末端添加有与固定在层析本体(PAS)上的寡DNA互补的标签序列(序列信息未公开)。另外,在本实施例中,在Query oligo和标签序列之间未插入Spacer C3。固定在层析本体上的寡DNA的位置记载在图12中。需要说明的是,在本实施例中,使用了TBA公司销售的层析本体的F12系列。所固定的寡DNA的位置与实施例2中使用的E12系列多少有些不同。
[表21]
4. 循环连接反应
4-1. 反应液调制
连接反应中的组成如表22所示。需要说明的是,作为用于进行连接的酶,使用了NEWENGLAND BioLabs公司的Taq DNA连接酶。
[表22]
4-2. 连接反应
将连接溶液移入PCR管中,放置在热循环仪上。温度条件如下:95℃下1分钟,之后58℃下5分钟,然后进行30个循环的95℃下15秒、58℃下30秒,之后在95℃下加热1分钟,将温度降至37℃,结束反应。
5. 使用了层析本体的检测
5-1. 杂交反应
使用4.中获得的单链DNA,进行了基于核酸层析的杂交反应及其检测。
5-2. 反应液调制
使用将展开液(TBA公司制造)、胶乳液(TBA公司制造)、TE缓冲液和连接产物混合而调制的反应液,实施了杂交反应和检测。反应液的组成见表23。
[表23]
反应液组成
5-3. 杂交工序
在1.5mL的管中加入各20μL的上述反应液,插入层析本体的各下端部,进行了基于层析的杂交反应。杂交反应在37℃下进行。用约20分钟吸上全部的反应液,在全部吸上的阶段完成了基于层析的杂交反应。反应结束后,将层析本体风干,通过目视确认反应部位并拍摄图像。
5-4. 检测工序
通过目视确认了层析本体在干燥后是否显色。如图15所示,利用该方法,可以基于层析本体判定HPV的16型、18型。由此显示出:该方法作为简便的HPV型判定方法是有效的。
实施例5
为了研究Query-标签的间隔的存在与否是否会对检查结果产生影响,按照以下程序进行了实验。以下,按照它们的顺序进行说明。
1. 引物的调制;
2. 靶基因的扩增;
3. 连接用探针的调制(无间隔);
4. 循环连接反应;
5. 使用了层析本体(PAS:Printed Array Strip)的检测。
另外,将来自人的基因组DNA的3个样品(A12、B12、C12)用于实验。
1. 引物的调制
准备了人基因组中的CYP2D6基因特异性的下述表24所示的引物C09~C14和作为阳性对照的G3PDH基因特异性的引物对照(ユーロフィンジェノミクス公司制造)。这些引物按照普通的寡核苷酸合成方法进行合成,调整至100μM的浓度。C09引物设计成扩增包含作为CYP2D6基因的基因多态性的rs1135840(G突变为C)的基因区,C12引物设计成扩增包含作为该基因的基因多态性的rs16947(C突变为T)的基因区,C14引物设计成扩增包含作为该基因多态性的rs1065852(C突变为T)的基因区。需要说明的是,在实施例的图中,rs1135840记为4180G>C、rs16947记为2850C>T、rs1065852记为100C>T。
[表24]
2. 靶基因的扩增
2-1. 反应液调制
用于靶基因扩增的基因组DNA使用了来自人的基因组DNA。使用表24的引物如下扩增了基因组DNA。需要说明的是,使用KAPABIOSYSTEMS公司的KAPA2G FAST Multiplex作为样品扩增用试剂。作为热循环仪,使用了eppendorf公司的Mastercycler(注册商标) gradient。针对各样品调制了表25所示的试剂。
[表25]
2-2. PCR反应
将所调制的样品溶液移入PCR管中,进行了热循环反应(95℃下3分钟,之后进行30个循环的95℃下15秒、60℃下30秒、72℃下1分钟,之后在72℃下5分钟,最后降至4℃)。
3. 连接用探针的调制
3-1. 连接用探针的调制
准备了与2.中获得的扩增样品结合的连接用探针(Common oligo由ユーロフィンジェノミクス公司制造、Query oligo由TBA公司制造)。探针的核苷酸序列见表26。关于连接用探针,针对各基因多态性制作了Common oligo 1种、Query oligo 2种。Query oligo包含与未发生基因变异的野生型结合者(标记为WT)和与发生基因变异的变异型结合者(标记为MT)。在Common oligo的5’末端修饰有磷酸基[P],在3’末端标记有生物素[Biotin]。在Queryoligo的5’末端添加有与固定在层析本体(PAS)上的寡DNA互补的标签序列(序列信息未公开)。在Query oligo和标签序列之间未插入Spacer C3。固定在层析本体上的寡DNA的位置记载在图9中。需要说明的是,在本实施例中使用了TBA公司销售的层析本体的E12系列。
[表26]
4. 循环连接反应
4-1. 反应液调制
连接反应中的组成如表27所示。需要说明的是,作为用于进行连接的酶,使用了NEWENGLAND BioLabs公司的Taq DNA连接酶。
[表27]
4-2. 连接反应
将连接溶液移入PCR管中,放置在热循环仪上。温度条件如下:95℃下1分钟,之后58℃下5分钟,之后进行30个循环的95℃下15秒、58℃下30秒,之后在95℃下加热1分钟,将温度降至37℃,结束反应。
5. 使用了层析本体的检测
5-1. 杂交反应
使用4.中获得的单链DNA,进行了基于核酸层析的杂交反应及其检测。
5-2. 反应液调制
使用将展开液(TBA公司制造)、胶乳液(TBA公司制造)、TE缓冲液和连接产物混合而调制的反应液,实施了杂交反应和检测。反应液的组成见表28。
[表28]
反应液组成
5-3. 杂交工序
在1.5mL的管中加入各20μL的上述反应液,插入层析本体的各下端部,进行了基于层析的杂交反应。杂交反应在37℃下进行。用约20分钟吸上全部的反应液,在全部吸上的阶段完成了基于层析的杂交反应。反应结束后,将层析本体风干,通过目视确认反应部位并拍摄图像。
5-4. 检测工序
通过目视确认了层析本体在干燥后是否显色。如图16所示,已知的基因多态性和基于层析本体的基因多态性分析结果均一致,并且,存在Spacer C3时和不存在Spacer C3时的结果也一致。由此显示出:在本方法中是否存在间隔并不会产生影响。
Claims (7)
1.基因分析方法,该方法包括:使下述的(i)和(ii)杂交,形成可通过目视进行检测的状态,
(i) 寡核苷酸探针,其固定在条带上;
(ii)单链连接产物,其是将下述的(a)和(b)供给以核酸样品为模板且经过一次或多次热循环处理的连接处理进行扩增而获得的;
(a)Query oligo,其包含与上述核酸样品互补的第一单链寡核苷酸和可与上述探针杂交的标签序列或标记部分;
(b)Common oligo,其包含与上述核酸样品互补且与上述第一单链寡核苷酸相邻的第二单链寡核苷酸和标签序列或标记部分。
2.权利要求1所述的方法,该方法进行循环连接反应。
3.权利要求1或2所述的方法,其中,核酸样品和寡核苷酸为DNA。
4.权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,条带为层析本体,所述层析本体具备:探针区,固定有配置在条带上的不同位置的多个探针;以及位置标记区,配置在不同于上述探针区的位置。
5.权利要求1~4中任一项所述的方法,该方法是用于检测基因差异的方法。
6.权利要求1~5中任一项所述的方法,该方法是用于检测基因多态性的方法。
7.试剂盒,其用于权利要求1~6中任一项所述的基因分析方法,该试剂盒包括:
固定有寡核苷酸探针的条带;
单链寡核苷酸,其包括与作为对象的核酸样品互补的序列和可与上述探针杂交的标签序列;以及
单链寡核苷酸,其包括与作为对象的核酸样品互补且与该单链寡核苷酸相邻的序列和标记物质或标签序列。
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