WO2014007384A1

WO2014007384A1 - 検体検査部材

Info

Publication number: WO2014007384A1
Application number: PCT/JP2013/068564
Authority: WO
Inventors: 研吉永井; 英正奥村
Original assignee: 日本碍子株式会社
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2014-01-09
Also published as: JPWO2014007384A1

Abstract

　イムノクロマトグラフィー法に加え、核酸クロマトグラフィー法にも好適に用いることのできるストリップ状の検体検査部材を提供する。コンジュゲートパッド部が、水中でその表面電位がプラスに帯電しない材料からなるストリップ状の検体検査部材。

Description

検体検査部材

　本発明は、イムノクロマトグラフィー法又は核酸クロマトグラフィー法に基づき、感染症やアレルギー等の分野において、各種の抗原や抗体、核酸の検査に用いられるストリップ状の検体検査部材に関する。

　上記の検体検査部材としては、従来、主としてインフルエンザウイルスやＲＳＶ、クラミジア、Ｏ１５７等の検出に用いられる抗原抗体反応を原理としたイムノクロマトグラフィー法によるものが知られている（特許文献１参照）。

　イムノクロマトグラフィー法は、毛細管現象により試料液体が検体検査部材に展開されるような試験方法である。具体的には、まずは、血液、体液、組織、粘膜、微生物、ウイルスなどから抽出した抽出液と展開液とからなる試料液体を、ストリップ状の検体検査部材の幅以上の径からなる試験管や容器内に溜めておく。そして、検体検査部材をその試料液体が溜まっている試験管や容器に挿入すること、またはストリップ状の検体検査部材の試料導入部に試料溶液を滴下することによって、試料液体を検体検査部材に展開させる。

　より具体的には、試料液体中に含まれる標的物質を、まずはコンジュゲートパッドにおいて酵素、貴金属コロイド、着色ラテックス粒子などの標識物と反応させて複合体を形成させる。そしてその複合体を、続いて展開する多孔性シートの表面に固定された標的物質と特異的に反応するプローブによって捕獲し、プローブを着色させることにより、多孔性シートの表面に標的物質の検出を表示する。このように、クロマトグラフィー検査部材では、試料液体中に標的物質が含まれている場合には多孔性シートの表面に着色が現れる一方、試料液体中に標的物質が含まれていない場合には多孔性シートの表面に着色が現れないという、極めて単純な仕組みで標的物質の有無を判定することが可能である。

特開２００９－１１５８２２号公報

　既述したストリップ状の検体検査部材は、一般的に、長軸方向における一方の端部（展開開始端部）に試料液体を検査部材内に導入する試料導入部がある。そして、試料導入部に続くコンジュゲートパッド部及び多孔性シートを経て、反対側の端部（展開終了端部）にある吸収パッド部に向かって試料液体が浸潤して行く。このように、ストリップ状の検体検査部材の一方の端面から他方の端面に向かって、標的物質が移動（展開）する構造を有している。

　しかし近年、イムノクロマトグラフィー法に用いるストリップ状の検体検査部材の適応範囲は、遺伝子検査にまで拡大した。遺伝子検査は標的物質として核酸を用いるものであり、ＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ法等の核酸増幅技術を使うことにより、抗原抗体反応により標的物質を検出してきたイムノクロマトグラフィー法よりも、高感度な検出を可能とした。従来のイムノクロマトグラフィー用検体検査部材の適応範囲を遺伝子検査にまで拡大することは、簡便な操作性を有するストリップ状の検体検査部材に飛躍的な検出感度の向上をもたらすと同時に、高い検出感度を有する遺伝子検査の汎用性を高めることとなった。

　一方で、従来のイムノクロマトグラフィー用の検体検査部材を核酸クロマトグラフィーに用いた場合、コンジュゲートパッド部が核酸を吸着してしまうという問題があった。その結果、多孔性シートへと展開する検体が少なくなり十分な検体反応が検出できなくなる、また、貴重な検体を無駄にしてしまうという課題が生じた。これらの課題を解決するため、核酸クロマトグラフィーを行う際には、イムノクロマトグラフィー用のストリップ状検体検査部材からコンジュゲートパッド部を取り外して試験を行う等の対策を講じることもあった。しかしながらそのような対策は、作業効率やコンタミネーションの観点からも好ましくない。このように、従来の機能を保持しつつも、核酸を吸着しないコンジュゲートパッド部を搭載した検体検査部材が求められていた。

　本発明の発明者等は、上記課題に鑑み、従来のコンジュゲートパッド部について鋭意実験及び検討を行った結果、従来のコンジュゲートパッド部はガラス繊維からなるため、試料液体中で、プラスに帯電しているコンジュゲートパッド部とマイナスに帯電している核酸とが反応し、核酸がコンジュゲートパッド部に吸着されてしまうという現象を引き起こしていることを見出した。即ち、本発明によれば、以下の検体検査部材が提供される。

［１］　標的物質を含む試料液体を展開し、前記標的物質を検出して表示する細長形状の多孔性シートと、前記多孔性シートに沿って貼り付けられた細長形状のバッキング部材と、前記多孔性シートにおける前記試料液体の展開開始端部の、前記バッキング部材とは反対側の面に配置されたコンジュゲートパッド部と、前記多孔性シートにおける前記試料液体の展開終了端部の、前記バッキング部材とは反対側の面に配置された吸収パッド部と、を備え、前記コンジュゲートパッド部が、水中でその表面電位がプラスに帯電しない材料からなる検体検査部材。

［２］　前記コンジュゲートパッド部が、前記コンジュゲートパッド部に展開した前記試料液体に含まれる前記標的物質と反応するための、酵素、貴金属コロイド、着色ラテックス粒子などの標識物を含浸した前記［１］に記載の検体検査部材。

［３］　前記コンジュゲートパッド部が、セルロース系繊維又はシリカ系繊維からなる前記［１］又は［２］に記載の検体検査部材。

［４］　前記コンジュゲートパッド部が、ガラス繊維又は樹脂繊維の表面をカルボキシル基、ヒドロキシル基、又はスルホ基によって修飾した材料からなる前記［１］又は［２］に記載の検体検査部材。

［５］　前記コンジュゲートパッド部が、６０～９０％の気孔率を有する材料からなる前記［１］～［４］のいずれかに記載の検体検査部材。

［６］　前記コンジュゲートパッド部が、０．１～５．０μｍの直径を有する材料からなる前記［１］～［５］のいずれかに記載の検体検査部材。

［７］　前記コンジュゲートパッド部における前記試料液体の前記展開開始端部に、試料液体採取部を更に備えた前記［１］～［６］のいずれかに記載の検体検査部材。

　本発明の検体検査部材によれば、核酸クロマトグラフィー法において、高精度な検出結果を簡便に得ることが可能である。

本発明の検体検査部材の一実施形態を示す平面図（Ａ）、分解側面図（Ｂ）、及び側面図（Ｃ）である。

　以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。

　図１は、本発明の検体検査部材の一実施形態を示す平面図（Ａ）、分解側面図（Ｂ）、及び側面図（Ｃ）である。図１に示す検体検査部材１においては、従来汎用されているイムノクロマトグラフィー用の検体検査部材と同様、細長いバッキング部材２の表面に、固相化されたテストライン３ａ及びコントロールライン３ｂが形成された多孔性シート３が貼り付けられている。多孔性シート３のバッキングシート２とは反対側の面には、試料液体の展開開始端部にコンジュゲートパッド部４及び試料採取部５が、また試料液体の展開終了端部には吸収パッド部６が、それぞれ配置されている。試料採取部５は、試料液体に含まれる異物の濾過フィルターとしても機能する。よって、異物含有率の低い核酸抽出液を用いる核酸クロマトグラフィーにおいては、試料採取部５を備えない検体検査部材を用いることも可能であるが、図１に示すように試料採取部５を備えていてもよい。

　バッキング部材２は、従来用いられていた薄いプラスチック板やセルロースなどある程度張りのある材質のもので形成され、通常は幅が２～８ｍｍ程度で、長さが４０～１００ｍｍ程度のものが用いられる。

　コンジュゲートパッド部４には、標的物質に対して特異的に結合する標識物（酵素、貴金属コロイド、着色ラテックス粒子など）、あるいは、これらの標識物とあらかじめ結合された、標的物質と特異的に反応する物質が含浸されている。試料採取部５で採取された試料液体の浸潤・展開に伴い、コンジュゲートパッド部４において標識物と標的物質とが結合する。結合した標識物と標的物質との複合体は、試料液体の更なる浸潤に伴って、多孔性シート３へと移動していく。

　多孔性シート３には、標的物質と特異的に反応する物質、例えば抗原、抗体、あるいは核酸などがテストライン３ａとして固相化されている。コンジュゲートパッド部４において結合した標識物と標的物質との複合体は、テストライン３ａ上に固相化された、標的物質と特異的に反応する物質と反応し、テストライン３ａを着色する。標的物質と結合しなかった標識物は更に浸潤に伴う移動をし、標識物と結合する物質（例えば抗原、抗体、あるいは核酸など）を固相化したコントロールライン３ｂ上で捕捉され、コントロールライン３ｂを着色する構成となっている。

　吸収パッド部６は、多孔性シート３を通過した試料を吸収するためのものであって、既知の材料を用いることができる。

　試料採取部５を構成する吸水性の柔軟材については、例えば、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、セルロース、ナイロン、ＣＭＦ、あるいは不織布などの多孔質の吸水性材料であって、試料液体に浸った状態でストリップ状の検体検査部材１から容易に脱落しない程度の耐久性と、また試料液体に浸らない状態（自由状態）では折れ曲がらない程度の保形性を維持できる強度が望まれる。

　本願の検体検査部材１において、コンジュゲートパッド部４は、水中でその表面電位がプラスに帯電しない材料からなることが好ましい。水中でプラスに帯電する材料は、マイナスに帯電している核酸と反応し核酸を吸着してしまい、検出に十分な量の核酸を展開させることを阻害するため好ましくない。即ち、本願の検体検査部材１のコンジュゲートパッド部４は、少なくとも中性であることが好ましく、マイナスに帯電していることが更に好ましい。より具体的には、本願発明のコンジュゲートパッド部４は、セルロース系繊維又はシリカ系繊維からなることが好ましい。

　また、本願発明のコンジュゲートパッド部４は、本来水中でプラスに帯電するガラス繊維又は樹脂繊維等であっても、その表面をカルボキシル基、ヒドロキシル基、又はスルホ基によって修飾したものであれば、その材料として好適に用いることが可能である。樹脂繊維としては、ポリオレフィン系、ポリエステル系、ポリアミド系、アクリル系、ナイロン系などの樹脂繊維、及びこれらの樹脂繊維の複合繊維を好適に使用することができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの樹脂繊維に界面活性剤、撥水剤などを含有させても良い。

　更に、コンジュゲートパッド部４の材料は、好適な気孔率及び繊維径を有していることが望まれる。これは、コンジュゲートパッド部４において標的物質が物理的にブロックされ、十分な展開が妨げられることを防止し、また、コンジュゲートパッド部４の吸水速度低下を防止するためである。具体的には、本願のコンジュゲートパッド部４は、６０～９０％の気孔率、及び０．１～５．０μｍの直径を有する材料からなることが好ましい。

　また、本願のコンジュゲートパッド部４は、例えば長さ×幅が６０ｍｍ×５ｍｍの多孔性シート３を用いた場合、長さ×幅×厚さが０．５～２０ｍｍ×３～５ｍｍ×０．０５～０．３ｍｍの範囲であることが好ましく、１１ｍｍ×５ｍｍ×０．１ｍｍ程度であることがより好ましい。即ち、コンジュゲートパッド部４は、多孔性シート３の２０％程度の長さと、多孔性シート３と同程度の幅を有することが好ましい。

　以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。

（多孔性シートの作製）
　ミリポア社製のニトロセルロースメンブレン（長さ４５ｍｍ×幅３．５ｍｍ×厚み０．２３５ｍｍ）に、５’端末又は３’端末に２０塩基のｐｏｌｙＴ（２０Ｔ）を付加した合成オリゴＤＮＡの水溶液をキャプチャープローブとし、スポッターを用いてスポットした。スポット後、ニトロセルロースメンブレンを８０℃で１時間ベークし、合成オリゴＤＮＡの固定化を行い、ニトロセルロースメンブレン上にテストラインを形成した。

（ストリップ状検査部材の作製）
　合成オリゴＤＮＡを固定したニトロセルロースメンブレンの、展開開始端部にコンジュゲートパッド部（長さ１０ｍｍ×幅３．５ｍｍ×厚み０．１ｍｍ）を、展開終了端部に吸収パッド部（長さ２０ｍｍ×幅３．５ｍｍ×厚み０．８３ｍｍ）をそれぞれ貼り合わせ、検体検出用のストリップ状の検査部材を作製した。コンジュゲートパッド部の材料は、表１に示す通りとし、比較例１及び実施例１～３の４種類の検体検査部材を作製した。また、コンジュゲートパッド部には１０μｌの標識物を含浸させた。

（検出サンプル溶液の調整）
　コスモバイオ社製「ヒト正常組織ゲノムＤＮＡ」をテンプレートＤＮＡとし、日本ジェネティクス社製「ＫＡＰＡ２Ｇ　Ｆａｓｔ　ＨｏｔＳｔａｒｔ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ」をＰＣＲ増幅試薬として用いて、ＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅を行った。その際、フォワードプライマーとして、「５’－（ＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＸＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＡＡ）－３’」（修飾基Ｘ＝ＳｐａｃｅｒＣ３）の配列を用い、リバースプライマーとして、「５’－（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＴＡ）－３’」（修飾基Ｘ＝ＳｐａｃｅｒＣ３）の配列を用いた。また、ＰＣＲ反応液の組成は表２に示す通りとした。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃で３分経過させた後、［９５℃で１５秒→６８℃で２分］のサイクルを４０回繰り返した。反応終了後、反応液を精製カラムによって精製し、吸光度（波長：２６０ｎｍ）を測定した。得られた吸光度と増幅産物（ＤＮＡ）の分子量を用いて、下記の式１から増幅産物（ＤＮＡ）の濃度を算出し、検出サンプル溶液（ＤＮＡ溶液）の濃度が１０ｎＭとなるよう水で希釈した。
　　　式１：ＤＮＡ濃度（ｍＭ）＝吸光度×５０／ＤＮＡの分子量

（クロマトグラフィー反応液の調整）
　１０ｎＭの検出サンプル溶液（ＤＮＡ溶液）５μｌ、サンプルＤＮＡと反応するオリゴＤＮＡを、表面にカルボキシル基を介して付けたラテックスビーズ溶液（ラテックス溶液）５μｌ、及びＰＢＳ緩衝液（クロマトグラフィー展開液）３５μｌを混合し、クロマトグラフィー反応液を調整した。

（検査部材を用いたＤＮＡ検出）
　調整したクロマトグラフィー反応液を２００μｌチューブに入れ、サンプル検出用のストリップ状検査部材を挿入した。挿入１０分後、検査部材を取り外し、浜松ホトニクス社製のクロマトリーダーを用いてテストラインの着色の濃さを吸光度（波長：５６０ｎｍ）によって評価した。結果を表１に示した。

　表１に示す通り、コンジュゲートパッド部をセルロース系繊維及びシリカ繊維で作製した実施例１～３では、テストラインの吸光度が比較例１よりも高く、目視でも着色が確認された。一方、コンジュゲートパッド部をガラス繊維で作製した比較例１では、テストラインの吸光度は、実施例１～３と比較してかなり低くなっており、目視で着色を確認することができなかった。このことより、比較例１では、ＤＮＡがコンジュゲートパッド部に吸着したことにより、十分な量の検体が展開しなかったことが分かった。

　上記の結果より、コンジュゲートパッド部の材料として、水中でマイナスに帯電する材料を用いることによって、プラスに帯電する材料を用いた場合と比べて、核酸の吸着による検体の展開の阻害を大幅に防止することが可能であることが分かった。

　本発明の検体検査部材は、イムノクロマトグラフィー法及び核酸クロマトグラフィー法の両方の検出検査に有用であり、産業上の利用可能性は大なるものである。

１：検体検査部材、２：バッキング部材、３：多孔性シート、３ａ：テストライン、３ｂ：コントロールライン、４：コンジュゲートパッド部、５：試料導入部、６：吸収パッド部。

Claims

　標的物質を含む試料液体を展開し、前記標的物質を検出して表示する細長形状の多孔性シートと、
　前記多孔性シートに沿って貼り付けられた細長形状のバッキング部材と、
　前記多孔性シートにおける前記試料液体の展開開始端部の、前記バッキング部材とは反対側の面に配置されたコンジュゲートパッド部と、
　前記多孔性シートにおける前記試料液体の展開終了端部の、前記バッキング部材とは反対側の面に配置された吸収パッド部と、を備え、
　前記コンジュゲートパッド部が、水中でその表面電位がプラスに帯電しない材料からなる検体検査部材。
　前記コンジュゲートパッド部が、前記コンジュゲートパッド部に展開した前記試料液体に含まれる前記標的物質と反応するための、酵素、貴金属コロイド、着色ラテックス粒子などの標識物を含浸した請求項１に記載の検体検査部材。
　前記コンジュゲートパッド部が、セルロース系繊維又はシリカ系繊維からなる請求項１又は２に記載の検体検査部材。
　前記コンジュゲートパッド部が、ガラス繊維又は樹脂繊維の表面をカルボキシル基、ヒドロキシル基、又はスルホ基によって修飾した材料からなる請求項１又は２に記載の検体検査部材。
　前記コンジュゲートパッド部が、６０～９０％の気孔率を有する材料からなる請求項１～４のいずれか一項に記載の検体検査部材。
　前記コンジュゲートパッド部が、０．１～５．０μｍの直径を有する材料からなる請求項１～５のいずれか一項に記載の検体検査部材。
　前記コンジュゲートパッド部における前記試料液体の前記展開開始端部に、試料液体採取部を更に備えた請求項１～６のいずれか一項に記載の検体検査部材。