KR20230099758A - 정전기적 상호작용을 이용한 압타머-기반 표적 분자 검출 - Google Patents

정전기적 상호작용을 이용한 압타머-기반 표적 분자 검출 Download PDF

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임종훈
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Abstract

본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출 방법은 표적 분자에 대한 압타머와 시료를 접촉시키는 단계; 상기 압타머와 표지 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 표지 물질과 표지 포집 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

정전기적 상호작용을 이용한 압타머-기반 표적 분자 검출{Aptamer-based target molecule detection using electrostatic interaction}
본 발명은 정전기적 상호작용을 이용한 압타머-기반 표적 분자 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 1종의 압타머만을 사용하여 표적 분자를 효율적으로 검출할 수 있으며, 작은 크기의 분자도 효율적으로 검출할 수 있고, 압타머에 대한 별도의 가공(예를 들어, 작용기 부착, 링커 연결 등)없이도 표적 분자의 검출이 가능한 압타머-기반 표적 분자 검출 방법, 센서 및 키트에 관한 것이다.
압타머(aptamer)는 특정 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 또는 펩타이드 분자로, 이러한 특이적 결합을 제공하는 기능으로 인해 표적 분자 검출 분야에서 항체의 대체 기술로 사용되고 있다. 압타머(예를 들어, 핵산-기반 압타머)는 화학적 합성을 통해 생산이 가능하기 때문에 동물세포 등을 이용하여 생산하는 항체에 비해 생산이 용이하고, 열이나 화학물질에 보다(항체에 비해) 안정적이기 때문에 다루기 용이하다는 장점이 있다.
압타머를 활용한 표적 분자 검출 기술들이 개발되어 사용되고 있는데, 이들 기존 압타머-기반 검출 기술은 대부분 표지 물질이 연결되거나 링커를 통해 특정 표면에 고정된 2종의 압타머를 사용하는 샌드위치(sandwich) 방식을 사용한다.
그러나 이러한 기존의 방식은 2종의 압타머를 필요로 하는 문제(즉 2종의 압타머를 제작해야 하는 문제), 표적 분자에 2종의 압타머가 결합할 수 있어야 하므로(즉 표적 분자에 2곳의 압타머 결합 위치가 존재해야 하므로) 작은 크기의 분자를 검출하기 어려운 문제, 표지 물질 또는 표면 고정을 위해 압타머에 작용기, 링커 등을 부착해야 하는 문제 및/또는 압타머의 표지 물질 연결 및 표면 고정의 정확도에 따라 표적 검출 효율이 달라지는 문제 등이 있어, 이를 개선할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 기존 압타머-기반 검출 방식의 문제점을 해소할 수 있는 새로운 검출 방식을 개발하고자 하였다.
한국등록특허 제10-1332847호
따라서 본 발명의 주된 목적은 상기와 같은 기존 압타머-기반 표적 분자 검출 방식의 문제점을 해소하기 위한 것으로서, 여러 종류의 압타머를 사용하지 않고도 표적 분자를 효율적으로 검출할 수 있으며, 작은 크기의 분자도 효율적으로 검출할 수 있고, 압타머에 대한 별도의 가공(예를 들어, 작용기 부착, 링커 연결 등)없이도 수행할 수 있는 압타머-기반 표적 분자 검출 방법, 센서 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 압타머-기반 표적 분자 검출 방법으로서, 표적 분자에 대한 압타머와 시료를 접촉시키는 단계; 상기 압타머와 표지 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 표지 물질과 표지 포집 물질을 접촉시키는 단계를 포함하는, 압타머-기반 표적 분자 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서로서, 표적 분자에 대한 압타머; 시료가 투입되는 시료투입부; 상기 시료투입부로부터 시료가 전개되는 경로에 위치하며 표지 물질을 포함하는 반응부; 및 상기 시료투입부로부터 시료가 전개되는 경로에서 상기 반응부 다음에 위치하며 표지 포집 물질을 포함하는 검출부를 포함하고, 상기 압타머는 상기 시료투입부에 또는 상기 시료투입부와 상기 반응부의 사이에 위치하는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 측방유동 센서를 포함하는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 압타머 함유 조성물 및 측방유동 센서를 포함하여 상기 압타머 함유 조성물을 시료와 혼합하고 상기 압타머 함유 조성물과 상기 시료의 혼합물을 상기 측방유동 센서에 적용하는 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트로서, 상기 압타머 함유 조성물은 표적 분자에 대한 압타머를 포함하고, 상기 측방유동 센서는 상기 압타머 함유 조성물과 상기 시료의 혼합물이 투입되는 압타머-시료 혼합물 투입부; 상기 압타머-시료 혼합물 투입부로부터 혼합물이 전개되는 경로에 위치하며 표지 물질을 포함하는 반응부; 및 상기 압타머-시료 혼합물 투입부로부터 혼합물이 전개되는 경로에서 상기 반응부 다음에 위치하며 표지 포집 물질을 포함하는 검출부를 포함하는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면 1종의 압타머만을 사용하여 표적 분자를 효율적으로 검출할 수 있으며, 작은 크기의 분자도 효율적으로 검출할 수 있고, 압타머에 대한 별도의 가공(예를 들어, 작용기 부착, 링커 연결 등)없이도 표적 분자의 검출이 가능하다.
도 1 및 2는 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서(압타머가 포함된 형태)(제1형 센서)의 일 실시형태 및 이의 작동 원리를 도식화하여 나타낸 것이다. 도 1은 시료에 표적 분자가 존재하는 경우를, 도 2는 시료에 표적 분자가 존재하지 않는 경우를 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트(압타머가 센서에 포함되지 않고 별도로 제공되는 형태)(제2형 센서를 포함함)의 일 실시형태 및 이의 작동 원리를 도식화하여 나타낸 것이다. 도 3은 압타머 함유 조성물을 시료에 혼합하는 과정을 나타낸 것이고, 도 4는 압타머 함유 조성물과 시료의 혼합물을 측방유동 센서의 압타머-시료 투입부에 투입함으로써 이루어지는 작동 원리를 나타낸 것이다.
도 5는 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(Bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)에 대한 압타머(서열번호 2)를 적용한 본 발명의 일 실시형태의 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트를 사용하여 시료 내 DEHP를 검출한 결과 그래프이다. Control, 대조군(DEHP가 첨가되지 않은 시료를 사용한 경우); DEHP, 실험군(DEHP가 첨가된 시료를 사용한 경우).
본 발명에서 압타머는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 또는 펩타이드 분자를 의미하는 것으로, 예를 들어 DNA 압타머, RNA 압타머 및 펩타이드 압타머, 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출에 사용되는 압타머는 전하를 띄는 모이어티를 가져 반대의 전하를 띄는 물질(예를 들어, 본 발명의 표지 물질)과 결합가능하지만 표적 분자와 결합하면 상기 반대의 전하를 띄는 물질과의 결합력이 상실 또는 감소되는 압타머이다. 일반적인 단일 가닥(single stranded) DNA 또는 RNA 압타머는 양전하를 띄는 질소-함유 염기를 가져 표면이 음전하를 띄는 금나노 입자와 정전기적 결합이 가능하므로(문헌[Wang et al., Adv. Mater. 19, 3943-3946(2007)] 참조; 이의 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 단일 가닥 DNA 압타머 또는 단일 가닥 RNA 압타머와 같은 핵산-기반 압타머는 별도의 처리(특정 모이어티가 특정 전하를 띄도록 하는 처리) 없이 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출에 사용될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명에서 압타머는 바람직하게는 단일 가닥 DNA 압타머 또는 단일 가닥 RNA 압타머와 같은 핵산-기반 압타머이다. 또한, 바람직하게는 100 이하의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 50 내지 100 뉴클레오타이드의 단일 가닥 DNA 압타머 또는 단일 가닥 RNA 압타머이다.
본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출에서 표적 분자는 압타머가 특이적으로 결합할 수 있는 분자로서, 예를 들어 화합물, 핵산 및/또는 단백질일 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에서, 표적 분자는 생체에서 분비되는 호르몬 또는 환경 호르몬이다.
본 발명에서 표지 물질은 표시나 특징으로 특정 물질 또는 상태를 구별하게 하는 물질로서, 예를 들어 화합물, 핵산, 단백질 등과 같은 분자의 검출에 사용되는 표지 물질일 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 표지 물질은 압타머가 결합할 수 있으며 이러한 결합 여부 또는 결합 수준을 표시하는 역할을 한다. 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출에서 사용되는 표지 물질은 압타머의 모이어티, 즉 압타머가 갖는 전하를 띄는 모이어티가 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 갖지만 상기 압타머와 결합하면 표면 전하가 상실되거나 표면 전하량이 감소되는 것이다. 예를 들어, 압타머가 양전하를 띄는 모이어티를 갖는 압타머인 경우 표지 물질은 음전하를 띄는 표면을 갖는 것이고, 압타머가 음전하를 띄는 모이어티를 갖는 압타머인 경우 표지 물질은 양전하를 띄는 표면을 갖는 것이다. 본 발명에서 표지 물질은 바람직하게는 1마이크로미터 이하, 보다 바람직하게는 100나노미터 이하, 보다 바람직하게는 50나노미터 이하의 평균직경을 갖는 입자이며, 크기의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 5나노미터 이상일 수 있다. 이러한 표지 물질과 관련하여 기존에 표면 전하를 바탕으로 예를 들어 DNA, RNA 및/또는 단백질을 검출하기 위한 다양한 입자, 예를 들어 양자점, 금나노입자, 은나노입자 등의 입자에 대한 사용방법, 제조방법 등이 알려져 있어 이를 참조할 수 있다. 양자점, 금나노입자 또는 은나노입자는 기존의 항체, 압타머 등의 포획체를 이용한 표적 분자의 검출 분야에서 표지 물질로 많이 사용 및 개발되어 왔기 때문에 많은 정보가 축적되어 있고, 비교적 용이하게 입수 또는 제작할 수 있으며, 특히 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출에서의 경우, 크기가 작아 적은 수의 압타머와의 결합으로도 표면 전하가 상실되거나 표면 전하량이 감소될 수 있어 검출 효율의 측면에서 유리하기 때문에, 본 발명에서 표지 물질은 바람직하게는 양자점, 금나노입자 또는 은나노입자이다.
본 발명에서 표지 포집 물질은 표지 물질을 포집하는 물질을 의미하는 것으로, 본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출에서 표지 포집 물질은 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 압타머와 결합하지 않거나 시료에 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 압타머와 결합한 표지 물질을 포집하는 것이다. 예를 들어, 표지 물질이 음전하를 띄는 표면을 갖는 물질인 경우 표지 포집 물질은 양전하를 띄는 표면을 갖는 것이고, 반대로 표지 물질이 양전하를 띄는 표면을 갖는 물질인 경우 표지 포집 물질은 음전하를 띄는 표면을 갖는 것이다. 표지 물질의 표면과 반대의 전하를 띄어 압타머와 결합하지 않거나 시료에 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 압타머와 결합한 표지 물질을 포집할 수 있는 물질이라면 어떤 것이든 본 발명에서 표지 포집 물질로 사용될 수 있으며, 예를 들어 표면에 양전하 또는 음전하를 띄는 고분자일 수 있다. 고분자는 다양한 형태로 용이하게 성형할 수 있으므로, 이러한 적용성의 측면에서, 본 발명에서 표지 포집 물질은 바람직하게는 고분자 성형물이다. 상기 고분자에는 폴리(다이알릴다이메틸암모늄 클로라이드)(Poly(diallyldimethylammonium chloride), PDDA), 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 아민(Poly(ethylene glycol) methyl ether amine), 폴리(에틸렌 글리콜) 다이아민(Poly(ethylene glycol) diamine), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 아민(Methoxypolyethylene glycol amine), 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 압타머-기반 표적 분자 검출 방법으로서, 표적 분자에 대한 압타머와 시료를 접촉시키는 단계(압타머-시료 접촉 단계); 상기 압타머와 표지 물질을 접촉시키는 단계(압타머-표지 물질 접촉 단계); 및 상기 표지 물질과 표지 포집 물질을 접촉시키는 단계(표지 물질-표지 포집 물질 접촉 단계)를 포함하고, 상기 압타머는 전하를 띄는 모이어티를 가져 반대의 전하를 띄는 상기 표지 물질과 결합가능하지만 상기 표적 분자와 결합하면 상기 표지 물질과의 결합력이 상실 또는 감소되고, 상기 표지 물질은 상기 모이어티가 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 갖지만 상기 압타머와 결합하면 표면 전하가 상실되거나 표면 전하량이 감소되고, 상기 표지 포집 물질은 상기 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 상기 압타머와 결합하지 않거나 상기 시료에 상기 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 상기 압타머와 결합한 상기 표지 물질을 포집하는, 압타머-기반 표적 분자 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출 방법에서, 압타머-시료 접촉 단계는 시료에 압타머를 첨가하거나, 압타머가 포함된 용액(예를 들어 완충액)에 시료를 첨가하거나, 측방유동 방식에서 압타머가 포함된 패드에 시료를 첨가하는 등의 방법으로 실시할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 압타머-시료 접촉 단계는 완충액 중에서 압타머와 시료를 접촉시키는 단계이다. 이에 따르면, 압타머와 시료 내 표적 분자의 원활한 결합 및/또는 압타머 모이어티의 전하 유지를 도와 보다 효율적인 표적 분자의 검출이 가능하다. 완충액은 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.5의 중성 pH 부근을 유지할 수 있는 완충액이며, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 8을 유지할 수 있는 완충액이다. 이 단계에서 시료에 표적 분자가 존재하며 압타머가 정상적으로 작동하면, 압타머와 표적 분자의 결합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 압타머-시료 접촉 단계는 측방유동 센서에서 압타머가 포함된 시료투입패드(110)에 시료를 투입하는 단계이다(도 1 및 2 참조). 본 발명의 바람직한 다른 실시형태에서, 압타머-시료 접촉 단계는 시험관에서 시료와 압타머 포함 완충액을 혼합하는 단계이다(도 3 참조).
본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출 방법에서, 압타머-표지 물질 접촉 단계는 압타머-시료 접촉 단계에서 생성된 압타머와 시료의 혼합물에 표지 물질을 첨가하거나, 측방유동 방식을 사용하여 압타머와 시료의 혼합물이 표지 물질이 포함된 패드로 전개되도록 하는 등의 방법으로 달성할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 측방유동 센서를 사용하여 달성한다. 압타머-시료 접촉 단계를 통해 결합체(압타머와 표적 분자의 결합체)가 형성된 경우, 이 단계에서 표적 분자와 결합한 압타머는 전하를 띄지 않게 되거나 전하량이 줄어 표지 물질과 결합하지 못하게 되며, 반대로 표적 분자와 결합하지 못한 압타머는 표지 물질과 결합하게 된다.
본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출 방법에서, 표지 물질-표지 포집 물질 접촉 단계는 압타머-표지 물질 접촉 단계를 거친 혼합물에 표지 물질의 표면과 반대의 전하를 띄는 표지 포집 물질(예를 들어 비드)을 첨가하거나, 측방유동 방식을 사용하여 압타머-표지 접촉 단계를 거친 혼합물이 표지 포집 물질이 포함된 패드로 전개되도록 하는 등의 방법으로 달성할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 측방유동 센서를 사용하여 달성한다. 압타머-표지 접촉 단계에서 압타머가 결합하지 못하거나 충분한 수준(예를 들어 충분한 수)의 압타머가 결합하지 못한 표지 물질은 표면에 여전히 전하를 띄게 되어 반대 전하를 띄는 표지 포집 물질에 결합하게 되며, 반대로 충분한 수준(예를 들어 충분한 수)의 압타머가 결합한 표지 물질은 표면에 전하를 띄지 않게 되거나 전하량이 줄어 표지 포집 물질에 결합하지 못하게 된다.
따라서 표지 물질-표지 포집 물질 접촉 단계에서 생성되는 표지 물질과 표지 포집 물질의 결합 여부 또는 수준의 확인을 통해 시료 내 표적 분자의 존재 여부 또는 수준을 확인할 수 있다. 이러한 표지 물질과 표지 포집 물질의 결합 여부 또는 수준의 확인은 표지 물질-표지 포집 물질 접촉 단계 이후 표지 포집 물질을 혼합물로부터 분리하고 표지 포집 물질에 결합된 표지 물질의 존재 여부 또는 수준을 확인하는 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 비드 형태의 표지 포집 물질을 혼합물에 첨가하는 방법으로 표지 물질-표지 포집 물질 접촉 단계를 실시한 경우, 원심분리를 통해 혼합물로부터 표지 포집 물질을 분리할 수 있으며, 측방유동 방식을 사용하여 표지 물질-표지 포집 물질 접촉 단계를 실시한 경우 혼합물이 표지 포집 물질 포함 패드를 지나 계속해서 전개되도록 하는 방법으로 혼합물로부터 표지 포집 물질을 분리할 수 있다. 이후 표지 포집 물질에 결합된 표지 물질의 존재 여부 또는 수준의 확인은 표지 물질 고유의 표지 특성을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 압타머-기반 표적 분자 검출 방식은 압타머 고유의 특정 분자와 결합할 수 있는 능력, 그리고 압타머와 표지 물질, 표지 물질과 표지 포집 물질 사이의 정전기적 인력을 이용하는 방식으로, 1종의 압타머만 표적 분자에 결합하면 검출이 가능하기 때문에, 2종 이상의 압타머가 표적 분자에 결합해야 하는 기존 압타머-기반 표적 분자 검출 방식과 비교하여, 더 작은 분자를 검출할 수 있으며, 여러 종류의 압타머를 제작할 필요가 없어 더 효율적일 수 있다.
본 발명에서, 상기와 같은 압타머-기반 표적 분자 검출 방법을 용이하게 실시할 수 있는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서로서, 압타머가 포함된 제1형 센서 및 압타머가 센서에 포함되지 않고 별도로 제공되는 제2형 센서가 제공된다. 제2형 센서는 본 발명에서 압타머 함유 조성물과 함께 키트로서 제공된다. 제1형 센서는 압타머가 센서 자체에 포함되어 있는 형태이므로 시료를 직접 적용하는 것이 가능한 방식이며, 제2형 센서가 포함되는 키트는 예를 들어 별도의 시험관에서 시료를 압타머와 혼합한 다음 적용하는 방식이다.
본 발명에서, 제1형 센서로서, 표적 분자에 대한 압타머; 시료가 투입되는 시료투입부; 상기 시료투입부로부터 시료가 전개되는 경로에 위치하며 표지 물질을 포함하는 반응부; 및 상기 시료투입부로부터 시료가 전개되는 경로에서 상기 반응부 다음에 위치하며 표지 포집 물질을 포함하는 검출부를 포함하고, 상기 압타머는 상기 시료투입부에 또는 상기 시료투입부와 상기 반응부의 사이에 위치하고, 상기 압타머는 전하를 띄는 모이어티를 가져 반대의 전하를 띄는 상기 표지 물질과 결합가능하지만 상기 표적 분자와 결합하면 상기 표지 물질과의 결합력이 상실 또는 감소되고, 상기 표지 물질은 상기 모이어티가 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 갖지만 상기 압타머와 결합하면 표면 전하가 상실되거나 표면 전하량이 감소되고, 상기 표지 포집 물질은 상기 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 상기 압타머와 결합하지 않거나 상기 시료에 상기 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 상기 압타머와 결합한 상기 표지 물질을 포집하는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서가 제공된다. 또한, 본 발명에서, 제1형 센서를 포함하는 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트가 제공된다. 제1형 센서의 예시로서 도 1 및 도 2와 같은 센서가 제공된다.
또한, 압타머 함유 조성물 및 제2형 센서(측방유동 센서)를 포함하여 상기 압타머 함유 조성물을 시료와 혼합하고 상기 압타머 함유 조성물과 상기 시료의 혼합물을 제2형 센서에 적용하는 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트로서, 상기 압타머 함유 조성물은 표적 분자에 대한 압타머를 포함하고, 상기 제2형 센서는 상기 압타머 함유 조성물과 상기 시료의 혼합물이 투입되는 압타머-시료 혼합물 투입부; 상기 압타머-시료 혼합물 투입부로부터 혼합물이 전개되는 경로에 위치하며 표지 물질을 포함하는 반응부; 및 상기 압타머-시료 혼합물 투입부로부터 혼합물이 전개되는 경로에서 상기 반응부 다음에 위치하며 표지 포집 물질을 포함하는 검출부를 포함하고, 상기 압타머는 전하를 띄는 모이어티를 가져 반대의 전하를 띄는 상기 표지 물질과 결합가능하지만 상기 표적 분자와 결합하면 상기 표지 물질과의 결합력이 상실 또는 감소되고, 상기 표지 물질은 상기 모이어티가 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 갖지만 상기 압타머와 결합하면 표면 전하가 상실되거나 표면 전하량이 감소되고, 상기 표지 포집 물질은 상기 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 상기 압타머와 결합하지 않거나 상기 시료에 상기 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 상기 압타머와 결합한 상기 표지 물질을 포집하는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트가 제공된다. 제2형 센서의 예시로서 도 4와 같은 센서가 제공된다.
본 발명의 제1형 및/또는 제2형 센서는 측방유동 방식을 적용할 수 있는 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어 멤브레인 스트립의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 시료투입부, 반응부 및 검출부는 하나의 측방유동 멤브레인 상에 위치적으로 구분되어 존재할 수 있다. 예를 들어, 도 1, 2 및 4에서와 같이 시료투입부(110), 반응부(120) 및 검출부(130)의 순서로 위치하여, 시료가 시료투입부(110)로부터 측방유동으로 전개되어 반응부(120)를 통과하여 검출부(130)에 접촉할 수 있도록 이루어질 수 있다. 바람직하게는 시료의 용이한 전개를 위해 검출부 다음에 흡수 패드(140)가 구비된다.
본 발명의 제1형 센서에서 시료투입부(도 1 및 도 2의 110) 및 제2형 센서에서 압타머-시료 혼합물 투입부(도 4의 110)는 시료를 균일하게 분포시키고 시료가 반응부(120)로 전개되도록 이루어질 수 있다. 시료는 이 시료투입부(도 1 및 도 2의 110) 또는 압타머-시료 혼합물 투입부(도 4의 110)로부터 압타머와 함께 예를 들어 모세관 현상에 의해 반응부(120) 방향으로 전개된다. 제1형 센서의 일 실시형태에서, 시료투입부(110)는 압타머를 포함하여 시료가 투입되면 즉시 표적 분자와 압타머의 접촉이 이루어지도록 구성된다. 제1형 센서의 다른 실시형태에서, 압타머는 시료투입부(110)와 반응부(120)의 사이에 위치하여 시료가 투입된 이후 반응부로 전개되면서 표적 분자와 압타머의 접촉이 이루어지도록 구성된다. 제1형 센서의 일 실시형태에서, 압타머는 예를 들어 환원된 산화 그래핀과 같은 압타머 고정 물질에 결합한 상태로 존재할 수 있다. 이때 압타머 고정 물질은 시료가 전개될 때 압타머가 시료에 포함되어 전개될 수 있도록 적절한 결합력으로 압타머를 고정한다.
본 발명의 제1형 및/또는 제2형 센서에서 반응부(120)는 표지 물질을 포함함으로써 전개되는 시료에 표지 물질을 제공할 수 있다. 시료투입부(도 1 및 도 2의 110) 또는 압타머-시료 혼합물 투입부(도 4의 110)로부터 전개되는 시료가 반응부(120)를 지날 때, 시료와 함께 전개되는 자유-압타머(표적 분자와 결합하지 않은 압타머)는 반응부(120)의 표지 물질과 결합하며, 표적 분자와 결합한 압타머는 전하를 띄지 않게 되거나 전하량이 줄어 표지 물질과 결합하지 못한다. 시료투입부(110)로부터 전개된 시료는 반응부(120)를 지나 표지 물질과 함께 검출부로 전개된다.
본 발명의 제1형 및/또는 제2형 센서에서 검출부(130)는 표지 포집 물질을 포함함으로써 전개되는 시료 중의 자유-표지 물질(압타머와 결합하지 않은 표지 물질) 또는 시료에 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 압타머와 결합한 표지 물질을 포집할 수 있다. 일 실시형태에서, 검출부(130)는 표지 포집 물질의 코팅층으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 검출부(130)는 입자 형태의 표지 포집 물질이 고정된 형태로 이루어진다. 압타머와 결합하여 표면 전하가 상실되거나 표면 전하량이 감소되어 표지 포집 물질과 결합하지 못한 표지 물질은 시료와 함께 검출부(130)를 지나 센서의 끝부분 또는 흡수패드(140) 방향으로 전개된다.
본 발명의 제1형 및/또는 제2형 센서에서 시료의 전개가 완료된 이후 검출부(130)에 포집된 표지 물질의 존재 여부 또는 수준의 확인을 통해 시료 내 표적 분자의 존재 여부 또는 수준을 확인할 수 있다. 예를 들어, 검출부(130)에 포집된 표지 물질이 존재하는 경우 시료에 표적 분자가 존재하는 것으로 판단할 수 있고, 검출부(130)에 포집된 표지 물질의 수준(예를 들어 표지 물질의 수)이 대조군에 비해 높을 경우 대조군에 비해 높은 수준으로 표적 분자가 시료에 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 표지 물질의 존재 여부 또는 수준은 표지 물질 고유의 표지 특성을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 제2형 센서를 포함하는 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트에서 압타머 함유 조성물은 압타머와 함께 완충제를 더 포함할 수 있다. 완충제는 바람직하게는 시료의 pH를 pH 6.5 내지 8.5의 중성 pH 부근으로 유지할 수 있는 완충제이며, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 8을 유지할 수 있는 완충제이다.
본 발명의 키트(제1형 센서 또는 제2형 센서를 포함하는 키트)는 본 발명의 센서 및/또는 압타머 함유 조성물 이외에 본 발명의 방법을 실시하기 위해 필요한 다른 구성, 예를 들어 시약 또는 도구를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명 방법의 실시를 위한 완충제 및/또는 용기(예를 들어, 시험관), 시료의 채취를 위한 도구 등이 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1. 측방유동 센서 제조
시료투입패드 고정부, 반응패드 고정부, 검출선 및 흡수패드가 구비되며 상기 시료투입패드 고정부에 시료투입패드를 고정하고, 상기 반응패드 고정부에 반응패드를 고정한 다음, 시료투입패드에 시료액을 투입하면 시료액이 반응패드를 거쳐 검출선을 지나도록 이루어진 스트립을 사용하여 측방유동 센서를 제조하였다.
환원된 산화 그래핀(reduced graphene oxide, rGO)과 압타머(비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(Bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)에 대한 DNA 압타머)(예를 들어, 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 서열로 이루어짐(표 1))를 혼합한 다음 시료투입패드에 주입하여 건조시켰다.
양자점(또는 금나노입자)(검출 표시 물질)를 반응패드에 주입하여 건조시켰다.
양전하를 띄는 고분자인 PDDA(Poly(diallyldimethylammonium chloride))(검출 표시 포집 물질) 용액을 스트립의 검출선에 분주하여 건조시켰다.
상기와 같이 준비된 시료투입패드와 반응패드를 스트립에 조립하여 측방유동 센서(도 1 및 2 참조)를 제조하였다.
서열번호 염기서열(5'-3')
서열번호 1 ATTGGCACTCCACGCATAGGTCCGTCGGACCCACTCCACACATACGGATCGCTGAGCGCTCCTATGC
서열번호 2 ATTGGCACTCCACGCATAGGGTCCTAGAAACACTCCACGATAGGTCTCCTTTCCGGCGACCTATGCGTGCTACCGTGAA
서열번호 3 ATTGGCACTCCACGCATAGGTGCCTCTCGGGGTACCTATGCGTGCTACCGTGAA
서열번호 4 ATTGGCACTCCACGCATAGGTAATGTTGGGTAACACTCCCCGCATAGGATACTTGCCGATCCTATGCG
서열번호 5 ATTGGCACTCCACGCATAGGCTGGTCCGTATCGGAGCCTGGCTATGCGTGGTGTGGTCGCCTATGCGTGCTACCGTGAA
서열번호 6 ATTGGCACTCCACGCATAGGTAGCCCACTCCACGCATAGTGGTGACGCTGGACTTGAACCCCTATGC
서열번호 7 ATTGGCACTCCACGCATAGGACACCACTCCACGCACAAGCATGACTACTGTCGACTCATGCCTATGCG
서열번호 8 ATTGGCACTCCACGCATAGGTACACATGCAACACCACGCATAGGCTGAGGATATCCCCATCCTATGCGTGCTACCGTGAA
서열번호 9 ATTGGCACTCCACGCATAGGAGTACGAGGCAAATCCACGCATAGTCTCAACTGCTTGACCCTATGCGTGCTACCGTGAA
서열번호 10 ATTGGCACTCCACGCATAGGGACCCCACGCATAGGCTATGTTTCAGTTGTCTGAACAAATCCTATGCGTGCTACCGTGAA
실시예 2. 측방유동 센서를 사용한 표적 분자 검출
상기 실시예 1에서 제조된 측방유동 센서의 시료투입패드에 DEHP가 함유되지 않은 전개용액 또는 DEHP가 함유된 전개용액을 투입하여, 시료액이 먼저 시료투입패드의 압타머와 접촉하고 이후 압타머가 포함된 시료액이 반응패드의 양자점(또는 금나노입자)와 접촉하고 이후 압타머 및 양자점(또는 금나노입자)이 포함된 시료액이 검출선의 PDDA에 접촉하도록 전개하였다.
이때 전개용액으로 중성 pH(pH 7 ~ 8)이며 0.5% Tween20이 첨가된 PBS(phosphate buffer saline) 용액을 사용하였다.
실시예 3. 키트 제조
3-1. 압타머-함유 전개용액 제조
1.5㎖ 튜브에서 상기 실시예 1의 압타머와 상기 실시예 2의 전개용액을 혼합하여 압타머-함유 전개용액을 제조하였다.
3-2. 측방유동 센서 제조
상기 실시예 1과 유사한 방식으로 측방유동 센서를 제조하되, 시료투입패드에 환원된 산화 그래핀과 압타머를 적용하지 않은 상태로 측방유동 센서(도 4 참조)를 제조하였다.
실시예 4. 키트를 사용한 표적 분자 검출
상기 실시예 3-1에서 제조된 압타머-함유 전개용액에 DEHP 용액을 첨가하여 혼합하고, 이 혼합액 또는 DEHP 용액을 첨가하지 않은 상기 압타머-함유 전개용액을 상기 실시예 3-2에서 제조된 측방유동 센서의 시료투입패드에 투입하여, 상기 혼합액 또는 상기 압타머-함유 전개용액이 먼저 시료투입패드의 압타머와 접촉하고 이후 압타머가 포함된 상태로 반응패드의 양자점(또는 금나노입자)과 접촉하고 이후 압타머 및 양자점(또는 금나노입자)이 포함된 상태로 검출선의 PDDA에 접촉하도록 전개하였다.
약 15분 후 검출선에 양자점(또는 금나노입자)이 포집되어 형광신호(또는 색)를 나타내는지 확인한 결과, DEHP의 존재여부에 따라 형광신호세기의 차이가 발생하는 것으로 나타났다(도 5).
100 : 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서
110 : 시료투입부(또는 압타머-시료 혼합물 투입부)
120 : 반응부
130 : 검출부
140 : 흡수 패드
<110> ZEUS CO., LTD. <120> Aptamer-based target molecule detection using electrostatic interaction <130> AHP21028 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 1 attggcactc cacgcatagg tccgtcggac ccactccaca catacggatc gctgagcgct 60 cctatgc 67 <210> 2 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 2 attggcactc cacgcatagg gtcctagaaa cactccacga taggtctcct ttccggcgac 60 ctatgcgtgc taccgtgaa 79 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 3 attggcactc cacgcatagg tgcctctcgg ggtacctatg cgtgctaccg tgaa 54 <210> 4 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 4 attggcactc cacgcatagg taatgttggg taacactccc cgcataggat acttgccgat 60 cctatgcg 68 <210> 5 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 5 attggcactc cacgcatagg ctggtccgta tcggagcctg gctatgcgtg gtgtggtcgc 60 ctatgcgtgc taccgtgaa 79 <210> 6 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 6 attggcactc cacgcatagg tagcccactc cacgcatagt ggtgacgctg gacttgaacc 60 cctatgc 67 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 7 attggcactc cacgcatagg acaccactcc acgcacaagc atgactactg tcgactcatg 60 cctatgcg 68 <210> 8 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 8 attggcactc cacgcatagg tacacatgca acaccacgca taggctgagg atatccccat 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 9 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 9 attggcactc cacgcatagg agtacgaggc aaatccacgc atagtctcaa ctgcttgacc 60 ctatgcgtgc taccgtgaa 79 <210> 10 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for DEHP <400> 10 attggcactc cacgcatagg gaccccacgc ataggctatg tttcagttgt ctgaacaaat 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80

Claims (16)

  1. 압타머-기반 표적 분자 검출 방법으로서,
    표적 분자에 대한 압타머와 시료를 접촉시키는 단계;
    상기 압타머와 표지 물질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 표지 물질과 표지 포집 물질을 접촉시키는 단계
    를 포함하는,
    압타머-기반 표적 분자 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표지 포집 물질은 상기 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 상기 압타머와 결합하지 않거나 상기 시료에 상기 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 상기 압타머와 결합한 상기 표지 물질을 포집하는,
    압타머-기반 표적 분자 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 핵산-기반 압타머인, 압타머-기반 표적 분자 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표지 물질은 양자점, 금나노입자 또는 은나노입자인, 압타머-기반 표적 분자 검출 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 표지 포집 물질은 고분자 성형물인, 압타머-기반 표적 분자 검출 방법.
  6. 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서로서,
    표적 분자에 대한 압타머;
    시료가 투입되는 시료투입부;
    상기 시료투입부로부터 시료가 전개되는 경로에 위치하며 표지 물질을 포함하는 반응부; 및
    상기 시료투입부로부터 시료가 전개되는 경로에서 상기 반응부 다음에 위치하며 표지 포집 물질을 포함하는 검출부
    를 포함하고,
    상기 압타머는 상기 시료투입부에 또는 상기 시료투입부와 상기 반응부의 사이에 위치하는,
    압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 표지 포집 물질은 상기 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 상기 압타머와 결합하지 않거나 상기 시료에 상기 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 상기 압타머와 결합한 상기 표지 물질을 포집하는,
    압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 압타머는 핵산-기반 압타머인, 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 표지 물질은 양자점, 금나노입자 또는 은나노입자인, 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 표지 포집 물질은 고분자 성형물인, 압타머-기반 표적 분자 검출용 측방유동 센서.
  11. 제6항의 측방유동 센서를 포함하는, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트.
  12. 압타머 함유 조성물 및 측방유동 센서를 포함하여 상기 압타머 함유 조성물을 시료와 혼합하고 상기 압타머 함유 조성물과 상기 시료의 혼합물을 상기 측방유동 센서에 적용하는 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트로서,
    상기 압타머 함유 조성물은 표적 분자에 대한 압타머를 포함하고,
    상기 측방유동 센서는
    상기 압타머 함유 조성물과 상기 시료의 혼합물이 투입되는 압타머-시료 혼합물 투입부;
    상기 압타머-시료 혼합물 투입부로부터 혼합물이 전개되는 경로에 위치하며 표지 물질을 포함하는 반응부; 및
    상기 압타머-시료 혼합물 투입부로부터 혼합물이 전개되는 경로에서 상기 반응부 다음에 위치하며 표지 포집 물질을 포함하는 검출부
    를 포함하는,
    압타머-기반 표적 분자 검출용 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 표지 포집 물질은 상기 표지 물질의 표면이 띄는 전하와 반대의 전하를 띄는 표면을 가져 상기 압타머와 결합하지 않거나 상기 시료에 상기 표적 분자가 존재하지 않는 경우와 비교하여 낮은 수준으로 상기 압타머와 결합한 상기 표지 물질을 포집하는,
    압타머-기반 표적 분자 검출용 키트.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 압타머는 핵산-기반 압타머인, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 표지 물질은 양자점, 금나노입자 또는 은나노입자인, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 표지 포집 물질은 고분자 성형물인, 압타머-기반 표적 분자 검출용 키트.
KR1020210188757A 2021-12-27 2021-12-27 정전기적 상호작용을 이용한 압타머-기반 표적 분자 검출 KR20230099758A (ko)

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KR101332847B1 (ko) 2009-02-16 2013-11-27 동국대학교 산학협력단 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법

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