KR101332847B1

KR101332847B1 - 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법

Info

Publication number: KR101332847B1
Application number: KR1020100013905A
Authority: KR
Inventors: 김소연
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-16
Filing date: 2010-02-16
Publication date: 2013-11-27
Also published as: KR20100093502A

Abstract

본 발명은 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 고체상에 고정된 제1 압타머에 시료 및 제2 압타머를 첨가하여, 제1 압타머, 타겟물질 및 제2 압타머간 샌드위치 결합이 형성되도록 하는 것을 특징으로 하는 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은, 종래 검출이 어려웠던 저분자량 물질도 검출해 낼 수 있게 함으로써, 용액 상에 존재하는 질병과 관련된 대사물질, 환경 오염물 및 식품 독소 등의 검출이 가능하게 하였으며, 일관성있는 재생산이 가능하며 낮은 비용으로 생산이 가능한 압타머를 이용함으로써 경제성도 높인바, 매우 유용하다.

Description

압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법 {Method for Detecting Target Molecules Using Aptamers}

본 발명은 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 고체상에 고정된 제1 압타머에 시료 및 제2 압타머를 첨가하여, 제1 압타머, 타겟물질 및 제2 압타머간 샌드위치 결합이 형성되도록 하는 것을 특징으로 하는 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트에 관한 것이다.

용액 중에 있는 작은 분자를 민감하고 특이적으로 검출하기 위한 신규한 센서 플랫폼을 개발하는 것은 질병과 관련된 대사물질, 환경 오염물 및 식품 독소의 모니터닝에 매우 중요한 일이다. 최근까지 대사물질, 환경 오염물 및 독소와 같은 저분자량을 갖는 분석물의 분석은 일반적으로 GC/MS 또는 HPLC와 같은 복잡한 실험으로 진행되어 왔는데, 이는 숙련된 작업자조차도 오랜 시간이 걸리고 온-사이트 분석(on-site analysis)에 적용할 수 없는 문제점이 있었다 (Stales, C.A. et al, Environ. Toxicol. Chem., 20:2450, 2001). 이에 현지에서의(on-site) 리얼-타임 검출에 성공하기 위해서는 작은 스케일의 장치 및 특이적으로 결합하는 시약이 요구되었다.

이에 작은 물질을 검출하기 위한 휴대용 플랫폼으로서, 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance) 등과 같은 검출 플랫폼이 알려져 있으나, 이는 그 원리상 분자량 400 이하의 극저분자량의 물질의 검출은 어려운 것으로 알려져 있으며, 더욱이 17 베타-에스트라디올 (β-estradiol, MW: 272) 결합 특이적인 압타머를 사용한 1μM (272ppb) 농도분석을 수행한 결과, 도 1과 같이 상기와 같은 저분자량의 물질의 농도 분석은 불가능한 것으로 보고되었다 (Kim et al., Biosens. Bioelecrtron., 22:2525, 2007). 따라서, 저분자량의 물질도 특이적이고 민감하게 검출해낼 수 있는 새로운 플랫폼의 개발이 요청되었다.

또한, 분석물의 특이적이고 민감한 검출을 위해서는 항체와 같은 분석물에 특이적으로 결합하는 시약이 요구된다. 그러나, 저분자량의 작은 물질의 경우 통상 동물에서 항체를 발생시키기에는 너무 작거나 너무 독성이 강하여 항체를 생성할 수 없기 때문에, 작은 분자를 타겟팅하는 새로운 특이적으로 결합하는 시약이 요청되었다.

한편, 압타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA분자로서, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 압타머는 검출분석 시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 일 요소로 이용될 수 있어 항체의 대체물질로 인식되어 오고 있다. 특히, 압타머는 항체와 달리 독소를 비롯한 다양한 유기물 및 무기물의 표적 분자로 이용될 수 있고, 일단 특정 물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리해내면 자동화된 올리고머 합성 방법으로 낮은 비용과 일관성으로 재생산이 가능한 바 경제적이었다. 이에 1996년 처음으로 형광표지된 앱타머를 이용하여 표적 단백질을 측정한 압타머 기반의 바이오센서가 개발된 이후로 이와 같은 압타머의 장점과 구조적 특성을 기반으로 하여 다양한 압타머 바이오센서들이 개발되고 있다 (김연석&구만복, NICE, 26(6): 690, 2008).

그러나, 종래 압타머를 이용한 분석방법들은 특정물질에 부착되어 있던 압타머를 떼어내거나 다른 물질로 결합하게 하는 등 경쟁 분석방법이 사용되어져 온 바, 더 직접적이고 간편한 방법으로 압타머를 이용하여 물질을 검출해 내는 방법의 개발이 요청되어져 왔다.

이에 본 발명자들은 작은 분자, 특히 용액 중에 존재하는 작은 분자도 검출해낼 수 있는 새로운 검출방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 고체상에 고정되어 있는 제1 압타머에 시료 및 제2 압타머를 첨가하여, 제1 압타머, 타겟물질 및 제2 압타머간 샌드위치 결합을 형성시킨 다음, 비스페놀 A와 같은 무극성의 저분자량의 물질도 검출해 낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 용액 상에 존재하는 저분자 물질도 검출해 낼 수 있는 새로운 타겟물질의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 용액 상에 존재하는 저분자 물질도 검출해 낼 수 있는 타겟물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법을 제공한다:

(a) 고체상에 고정되어 있고 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 타겟물질을 함유하는 시료; 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하며 표지물질이 부착되어 있는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법을 제공한다:

(a) 고체상에 고정되어 있고 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 타겟물질을 함유하는 시료 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계;

(b) 상기 제2 압타머에 표지물질을 결합시키는 단계; 및

(c) 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계.

본 발명은 또한, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머가 고정되어 있는 고체상, 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 함유하는 검출시약을 포함하는 타겟물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 제1 압타머가 고정되어 있는 고체상, 및 표지물질이 부착되어 있는 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 함유하는 검출시약을 함유하고, 상기 제1압타머 또는 제2 압타머는 서열번호 2 내지 28의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택되는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 표지물질이 부착되어 있고 압타머 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 압타머 표지용 핵산 단편을 제공한다.

본 발명은 압타머를 이용한 새로운 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 검출방법은, 종래 검출이 어려웠던 저분자량 물질도 검출해 낼 수 있게 함으로써, 용액 상에 존재하는 질병과 관련된 대사물질, 환경 오염물 및 식품 독소 등의 검출이 가능하게 하였으며, 직접적이고 간편한 방법으로서 일관성있는 재생산이 가능하며 낮은 비용으로 생산이 가능한 압타머를 이용함으로써 경제성도 높인바, 매우 유용하다.

도 1은 종래 SPR을 이용한 방법에 따라 압타머를 이용하여 17 베타-에스트라디올 검출을 수행한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 방법에 따라 고정된 압타머에 비스페놀 A 및 표지된 압타머를 결합시키는 과정의 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법에 따라 샌드위치 결합을 통하여 비스페놀 A 검출을 수행한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 "압타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다.

본원에서 "시료"란, 관심있는 타겟물질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물로, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.

본 발명은 일 관점에서 다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법에 관한 것이다:

(b) 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계.

본원에서, "고체상"은 압타머가 고정되는 고체상태의 지지체로서, 압타머가 고정될 수 있는 한 그 모양이나 물질이 제한되지 않는다. 분석방법 수행의 편의를 위하여 멀티 웰 타입의 마이크로 플레이트가 일반적으로 사용될 수 있으나, 센서 칩, 플라스틱, 폴리프로필렌, 또는 세파로즈나 아가로스와 같은 비드로 채워진 컬럼과 같이, 다른 형상도 사용될 수 있다.

제1 압타머는 상기 고체상에 일반적인 방법에 의하여 고정될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 졸-겔 분주법에 의하여 고정되었으나, 이에 한정되지 않음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 상기의 고정된 제1 압타머에 시료와 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계로서, 여기서 "반응"이란 제1 압타머에 시료 및 제2 압타머를 첨가하고 배양하여 시료 중 존재하는 타겟물질은 고정되어 있는 제1 압타머에 결합하고, 제2 압타머는 타겟물질에 결합하도록 반응시키는 것을 의미한다. 이때 시료와 제2 압타머를 먼저 혼합한 다음, 상기 제1 압타머에 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 시료와 제2 압타머를 혼합하여 시료 중 타겟물질과 제2 압타머간의 특이적인 결합이 이루어지도록 한 후 결합된 타겟물질-제2 압타머를 고정되어 있는 제1 압타머에 첨가하여 제1 압타머와 결합이 이루어지도록 할 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계는 시료를 먼저 첨가한 다음, 제2 압타머를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 시료 중 타겟물질이 먼저 고체상에 고정되어 있는 제1 압타머와 결합하도록 한 다음, 순차적으로 제2 압타머를 가하여 결합시킴으로써 순차적인 결합반응이 이루어지도록 할 수 있다.

상기 제2 압타머에 부착되어 있는 표지물질은 간접적 또는 직접적인 방법으로 부착될 수 있으며, 표지물질로서 형광물질, 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 형광물질의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광색소나, 루시퍼라아제(luciferase), GFP와 같은 형광 단백질과 같은 공지의 형광물질이 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 (b) 단계는 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계로서, 고체상에 고정된 제1 압타머에, 타겟물질과 제2 압타머가 결합하는 경우 발생하는 표지물질의 변화를 분석하여 타겟물질을 검출하게 된다. 이때, 표지물질의 분석은 일반적으로 알려진 표지물질 분석방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대 형광물질을 표지물질로서 사용한 경우 타겟물질의 존재 시 발광 또는 색변화가 발생하는바, 이를 측정함으로써 타겟물질을 검출할 수 있다. 예시적으로 형광염료를 탐지할 수 있는 이미지 스캐너 등을 통하여 반응을 일으킨 웰을 스캔하여 타겟물질의 검출여부를 확인할 수 있고, 이미지를 소프트웨어를 통해 진하기 정도를 측정함으로써 검출량을 측정할 수 있다.

한편, 상기 제2 압타머에 표지물질을 부착하여 사용하는 것 이외에 상기 (a) 단계에서 제1 압타머에 시료와 제2 압타머를 결합시킨 다음, 표지물질을 제2 압타머에 결합시킴으로써 타겟물질을 검출할 수 있으며, 이에 본 발명은 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법에 관한 것이다:

(a) 고체상에 고정되어 있고 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 타겟물질을 함유하는 시료; 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계;

(b) 상기 제2 압타머에 표지물질을 결합시키는 단계; 및

(c) 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 표지물질의 결합은, 상기 제2 압타머에 상보적으로 결합하는 핵산 단편을 상기 제2 압타머와 상보적으로 결합시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이때, "상보적으로 결합'이란 합성된 핵산 단편의 서열이 상기 제2 압타머에 대하여 약 80~90% 이상, 보다 바람직하게는 약 90~95% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95~99% 이상 서열이 서로 상보적이거나 완전히 상보적으로 혼성화 될 수 있음을 의미한다. 상기 핵산단편은 바람직하게는 제2 압타머의 말단과 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, 제2 압타머는 상기 결합을 위하여 말단에 부가적인 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 검출방법이 용액 중 저분자량의 물질을 검출해 낼 수 있는지 확인하기 위하여, 환경호르몬으로 잘 알려져 있으나 검출이 극히 어려운 것으로 알려져 온 비스페놀 A의 검출여부를 실험하였다. 그 결과, 저분자량의 비스페놀 A도 특이적으로 검출함을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 검출방법이 종래 용액 중 대사물질, 독소 등의 검출이 매우 어려웠던 것과 달리 본 발명에 따른 방법을 이용함으로써 용액 중의 대사물질, 독소 등의 검출을 가능하게 함을 의미한다.

상기 실시예의 비스페놀 A를 검출하기 위하여 사용되는 압타머는 바람직하게는 서열번호 2 내지 28의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택될 수 있다. 이때, 핵산 압타머는 단일가닥 DNA 또는 RNA로서 제공되는 것인 바, 상기 핵산이 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

한편, 본 발명에 따른 방법은 휴대성을 높이기 위하여, 키트의 형태로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명은 다른 관점에서, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머가 고체상에 고정되어 있는 고체상, 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 함유하는 검출시약을 포함하는 타겟물질 검출용 키트에 관한 것이다. 이때, 상기 제2 압타머를 함유하는 검출시약은 별도의 용기에 담기어 제공되거나 샌드위치 결합을 수행할 반응부에 담기어 제공될 수 있다. 상기에 더하여 상기 검출키트는 검출용 완충용액 등을 포함할 수 있으며, 아울러 바람직하게는 상기 검출시약과 검출하고자 하는 시료액을 혼합시킬 수 있는 도구를 추가로 포함할 수 있다.

상기 타겟물질 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용하여 비스페놀 A의 검출효과를 확인하였으나, 다른 타겟물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용하여 본 발명에 따른 방법을 다른 타겟물질의 검출에도 적용할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1: 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머의 분리 및 이를 고정한 졸-겔 칩의 제조

1-1: 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머의 분리

먼저, 다음의 서열을 가지는 랜덤한 ssDNA 라이브러리를 화학적으로 합성하고 PAGE(Genotech Inc., Korea)로 분리하였다.

5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-N₆₀-GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGG-3' (서열번호 1)

상기 ssDNA 풀에 대하여, 비스페놀 A-아가로스 친화성 컬럼을 이용하여 SELEX의 선별과 증폭과정을 12회 수행하여, 다음의 총 27개의 비스페놀 A 특이적인 압타머를 선별하였다.

#31 5'-CGGCCCTAGG ATGACCTGAG TACTGTCCCT CACCCCTACT TCCGCCACTG GCCCAACAGC-3' (서열번호 2)

#23 5'-TGCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAGGC TCCGACCTTG TCCCTGCCGC CACTCTCCCA-3' (서열번호 3)

#47 5'-GCGGACGGGC TCGGCTCACC TAGGATGACC TGAGTACTGT CCCCGTGGCG CTAATTCGGG-3' (서열번호 4)

#50 5'-CGGCCCGCCC CTAGGATGAC CTGAGTACTG TCCGCGGGAC GGTATCGCTG AGACAGGTGC-3' (서열번호 5)

#41 5'-CGGCAGCCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCGAAAGAC TCCATGGTAC CCGGTGCTTA-3' (서열번호 6)

#27 5'-GGGGGCGTCG NCCTAGGATG ACCTGAGTAC TGTCCGCACN CAGGGAGGAT GCATTGAC-3' (서열번호 7)

#45 5'-GTGTCCCCAC GTCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAATG CCGCTCCTCC CGATGCAGAC-3' (서열번호 8)

#11 5'-CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGACCTGA GGTCTGCCCA ACGGTGTTTA GAACCCCTTG-3' (서열번호 9)

#12-3 5'-CGCAGCGCGC CCCTGAGTAC TGTCCGCCCA ACGGTGTGAC GGCCCTGCGA TCAACGATTG-3' (서열번호 10)

#12-4 5'-GGGCCGTCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCCCAACGG TGTGACGGCC CTGCGATCAA-3' (서열번호 11)

#22 5'-CCCTCGCCCT GAGTACTGTC CCCCGTCCGT CCGGTGAGGG CCACTATCGC TAACTGATCA-3' (서열번호 12)

#4 5'-AGGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3' (서열번호 13)

#12-5 5'-CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3' (서열번호 14)

#6 5'-CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (서열번호 15)

#12-7 5'-CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CCAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (서열번호 16)

#12-2 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGAG-3' (서열번호 17)

#12-9 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGGGG-3' (서열번호 18)

#12-6 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGGTCGGG-3' (서열번호 19)

#2 5'-GCCGACAGGG CATGGGACGC TATCAGCGGT GTCAATCGAA TTCCCGCGGC CGCCATGCGG-3' (서열번호 20)

#14 5'-GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTCCAGCG TAATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC-3' (서열번호 21)

#46 5'-GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCACATC GAGTGCCCCC GGCCGGTGCT-3' (서열번호 22)

#12 5'-GTATTGTCAT TCATATCCTC GTGCTTGCTG TCCTCACCCC ACCCACCAGA ATGGAAA-3' (서열번호 23)

#13 5'-CCTGGTATTG TCTTGCCAAT CCTCGCCCTG GCTGTCTTAC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG-3' (서열번호 24)

#48 5'-GTCGACTCGC GGGTACCGTG CTCAATGTCC CAATCCGGGG AAGCGTTTAG ACCCGCAGCC CAC-3' (서열번호 25)

#40 5'-GTCGCCACTG CGGGTACCGT GCTTGGGCNA CCGATGNACC NTGNNACCGT GTTTNGCC-3' (서열번호 26)

#3 5'-CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3' (서열번호 27)

#32 5'-GGGCGGTGGG TGGCGAGTTG TGAGACGCTG GAGGAGGTTG CTGCCCCCGG CACATTGGGA-3' (서열번호 28)

1-2: 졸-겔 칩의 제조

다음과 같이 제1 압타머를 고정한 센서 칩을 제조하였다. 즉, 졸-겔 스팟을 음성 대조군, 압타머들(압타머 #3 및 #12-5), 양성 대조군과 함께, 도 3에 나타난 바와 같은 순서로 양성대조군 (P), #12-5 압타머, #3 압타머 및 음성대조군(N) 순으로 OmniGrid Accent Microarrayer (DIGI LAB, USA)를 이용하여 PMMA 코팅된 96-웰 상에 고정화하여 졸-겔 칩을 제조하였다.

상기에서 사용된 졸-겔 스팟을 위한 졸 조성물은 다음과 같이 제조하였다. 먼저 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS) 과 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS) 를 혼합하여 졸 조성물을 제조하였다. 그리고, 용액I으로는 100mM HCl을 준비하였다.

한편, 100mM SP 완충용액(pH 5.8) 및 2차 증류수(double distilled water, DDW) 20㎕를 섞은 다음, 상기 혼합물에 양성대조군의 경우 Cy3 항체(Santa Cruz, USA)를, 음성대조군의 경우 PBS 완충용액을, 실험군의 경우 선별한 압타머(압타머 #3 및 #12-5)을 10㎕씩 첨가하여 5초 동안 볼텍싱하고 스핀-다운하여 용액 II를 제조하였다.

그리고나서, 순차적으로 상기 졸 조성물, 용액 I 및 용액 II를 순차적으로 분주하고 졸-겔 스팟을 13~15시간동안 겔화시켜, 졸-겔 칩을 제조하였다.

실시예 2: 졸-겔 칩을 이용한 비스페놀 A의 검출

먼저, 압타머 #3 및 #12-5를 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; Fermentas, Canada)와 Cy3-dUTP (GeneChem, Korea)를 이용하여 라벨링하여 본 실험에서 사용하였다. 다만, 라벨링은, 제2 압타머로 사용되는 압타머 #3 및 #12-5의 말단에 각각 5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-3' (서열번호 29)와 같은 단편을 연결한 다음, 이에 상보적으로 결합할 수 있는 서열 즉, 5'-CATGCTCGTGTTCGAACGGCCC-3'(서열번호 30)와 같은 핵산단편에 Cy3를 부착하여 상기 제2 압타머의 상기 말단 단편에 Cy3 표지된 상기 핵산단편이 상보적으로 결합하게 함으로써 이루어질 수도 있다.

그 다음 상기 실시예 1-2에서 제조한 졸-겔 칩의 각 웰에 50μM의 비스페놀 A와 2μM의 cy3-라벨된 압타머(제2 압타머)를 첨가하였다. 즉, 각 웰에 도 3에 나타난 바와 같이, 상단 우측 웰에는 비스페놀 A(BPA)와 압타머 #12-5를, 하단 좌측 웰에는 완충용액과 압타머 #3만을, 하단 우측 웰에는 BPA와 압타머 #3를 처리하고 배양하였다. 그 다음, 세척과정을 거쳐 Multi-Image 분석기 (FUJIFILM, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A가 존재하는 경우에만 #12-5 압타머 및 #3 압타머를 고정한 위치에 시그널이 나타나 (적색 원으로 표시), 본 발명에 따른 졸-겔 칩을 이용하여 비스페놀 A를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 종래 검출이 어려웠던 무극성 저분자량의 비스페놀 A도 본 발명에 따른 방법에 의하여 특이적으로 검출해 내는 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법:
(a) 고체상에 고정되어 있고 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 타겟물질을 함유하는 시료; 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하며 표지물질이 부착되어 있는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계,
이때, 상기 제 1 압타머는 졸 조성물에 혼합되어 졸-겔 반응에 의해 상기 고체상에 고정되는 것을 특징으로 함; 및
(b) 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 형광물질의 분석은 상기 형광물질의 발광 또는 색변화를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프액, 뇌척수액, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1압타머 또는 제2 압타머는 서열번호 2 내지 28의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 타겟물질은 비스페놀 A 인 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법:
(a) 고체상에 고정되어 있고 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 타겟물질을 함유하는 시료; 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계,
이때, 상기 제 1 압타머는 졸 조성물에 혼합되어 졸-겔 반응에 의해 상기 고체상에 고정되는 것을 특징으로 함;
(b) 상기 제2 압타머에 표지물질을 결합시키는 단계; 및
(c) 상기 표지물질을 분석하여 타겟물질을 검출하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 (b) 단계는 표지물질이 부착되어 있고 상기 제2 압타머에 상보적으로 결합하는 핵산 단편을 상기 제2 압타머와 상보적으로 결합시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 핵산 단편은 제2 압타머의 말단과 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질임을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 형광물질의 분석은 상기 형광물질의 발광 또는 색변화를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 제1압타머 또는 제2 압타머는 서열번호 2 내지 28의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 타겟물질은 비스페놀 A인 것을 특징으로 하는 방법.
타겟물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머가 졸 조성물에 혼합되어 졸-겔 반응에 의해 고정되어 있는 고체상, 및 상기 타겟물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 함유하는 검출시약을 포함하는 타겟물질 검출용 키트.
제14항에 있어서, 상기 제2 압타머는 표지물질이 결합된 것임을 특징으로 하는 타겟물질 검출용 키트.
제14항에 있어서, 표지물질이 부착되어 있고 상기 제2 압타머에 상보적으로 결합하는 핵산 단편을 추가로 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 타겟물질 검출용 키트.
비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 제1 압타머가 졸 조성물에 혼합되어 졸-겔 반응에 의해 고정되어 있는 고체상, 및 표지물질이 부착되어 있는 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 함유하는 검출시약을 포함하고, 상기 제1압타머 또는 제2 압타머는 서열번호 2 내지 28의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택되는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A 검출용 키트.
삭제
다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 무극성(aploar) 저분자 물질의 검출방법:
(a) 고체상에 고정되어 있고 무극성 저분자 물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 무극성 저분자 물질을 함유하는 시료; 및 상기 무극성 저분자 물질에 특이적으로 결합하며 표지물질이 부착되어 있는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 표지물질을 분석하여 무극성 저분자 물질을 검출하는 단계.
다음의 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 무극성 저분자 물질의 검출방법:
(a) 고체상에 고정되어 있고 무극성 저분자 물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머에, 무극성 저분자 물질을 함유하는 시료; 및 상기 무극성 저분자 물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 첨가하여 반응시키는 단계;
(b) 상기 제2 압타머에 표지물질을 결합시키는 단계; 및
(c) 상기 표지물질을 분석하여 무극성 저분자 물질을 검출하는 단계.
무극성 저분자 물질에 특이적으로 결합하는 제1 압타머가 고정되어 있는 고체상, 및 상기 무극성 저분자 물질에 특이적으로 결합하는 제2 압타머를 함유하는 검출시약을 포함하는 무극성 저분자 물질 검출용 키트.