KR101402316B1 - 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법 - Google Patents

핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101402316B1
KR101402316B1 KR1020120108106A KR20120108106A KR101402316B1 KR 101402316 B1 KR101402316 B1 KR 101402316B1 KR 1020120108106 A KR1020120108106 A KR 1020120108106A KR 20120108106 A KR20120108106 A KR 20120108106A KR 101402316 B1 KR101402316 B1 KR 101402316B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
aptamer
nucleic acid
edipokines
detecting
Prior art date
Application number
KR1020120108106A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140041120A (ko
Inventor
구만복
이수진
박지웅
김인애
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020120108106A priority Critical patent/KR101402316B1/ko
Publication of KR20140041120A publication Critical patent/KR20140041120A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101402316B1 publication Critical patent/KR101402316B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G01N33/541Double or second antibody, i.e. precipitating antibody
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/16Aptamers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/125Sandwich assay format

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산 앱타머 및 항체를 사용한 에디포카인의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 종래 항체 기반의 분석이나 종래 앱타머 검출기법에 비하여 더 민감하게 에디포카인을 검출해내어 당뇨병의 진단이 가능하게 하는 에디포카인의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 에디포카인의 검출방법은, 기존에 사용되고 있는 오로지 항체만을 이용하는 분석보다 더 민감하고 정확하게 혈중 에디포카인의 농도를 측정하며, 또한 상기 DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 제작에 유리하다. 아울러, 본 발명에 따른 검출기법은 종래 앱타머 검출기법에 비하여도 매우 높은 검출 민감도를 가진다. 이에 혈중 RBP4, 베스핀, 남트 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서로서, 2형 당뇨의 진단의 정확성을 증가시킬 수 있는바 유용하다.

Description

핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법{ELAAS (Enzyme-linked Antibody Aptamer Sandwich) Method of Detecting Adipokines Using Necleic Acid Aptamer and Antibody}
본 발명은 핵산 앱타머 및 항체를 사용한 에디포카인의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 종래 항체 기반의 분석이나 종래 앱타머 검출기법에 비하여 더 민감하게 에디포카인을 검출해내어 당뇨병의 진단이 가능하게 하는 에디포카인의 검출방법에 관한 것이다.
에디포카인(adipokine)은 지방 세포에서 분비되는 사이토카인 단백질로서 면역계와 신경계의 대사 작용에 중요한 역할을 한다. 그중에서도 retinol binding protein-4(RBP4), 베스핀(Vaspin), 남트 (Nampt)은 비만에 의해 발병되는 제 2형 당뇨병과 밀접한 관련이 있음이 보고 되고 있다. 구체적으로는 비만과 제2형 당뇨 환자에서 위의 에디포카인의 혈중 농도가 증가하는 것이 확인이 되었으며 이들을 바이오마커로 활용하여 혈중의 RBP4, Vaspin, Nampt 레벨을 측정함으로써 제2형 당뇨를 신속, 정확하게 진단할 수 있다.
기존 에디포카인의 진단방법 중 일반적으로는 항체를 이용한 면역진단법 감지방법이 잘 알려져 있다. 효소면역측정법 (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)은 항원과 항체의 결합을 효소반응을 이용하여 측정한다. 대개 측정하고자 하는 물질에 결합하는 항체에 효소를 미리 부착시켜놓고 항원항체 반응을 일으킨다. 그 후 결합한 효소에 반응하는 기질을 넣어주면 효소반응이 일어나게 된다. 흔히 이용하는 효소는 알카리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), 당근 과산화효소(horseradish peroxidase), 베타갈라토시다제(-galactosidase) 등이 있다. 효소반응의 산물은 대개 색깔을 띠는 물질로 이를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정한다.
특히 하나의 타겟에 결합하는 2 종의 항체를 이용한 ELISA 기법이 많이 사용된다. ELISA는 capture antibody 와 detection antibody사이의 target 양을 측정하는 방법이다. 이때 target 은 항체가 결합할 수 있는 최소한 2개의 antigenic site를 가져야 한다. 따라서 에디포카인의 진단에 있어 사용해야 할 항체쌍 (antibody pair)을 test해 보고 최적화 시켜야 하기 때문에 그 과정이 다른 실험보다 어려울 수 있다.
또한 타겟을 감지하는 역할로서의 항체는 생체의 면역시스템을 통해 만들어지기 때문에 cell culture와 동물이 필요하고 항체를 확보를 위해 정제과정을 거치기 때문에 제작에 고비용과 많은 시간이 요구되는 것이 문제점이라고 할 수 있다. 일반적으로 항체는 그 크기가 150KDa 내외의 매우 큰 단백질이기 plate well 등의 제한된 면적안에서 고정할 수 있는 양이 얼마 되지 않는 등의 물리적인 제약이 있고, 화학적 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 즉 기존의 혈중 에디포카인의 진단에 있어 항체만을 이용한 기술은 비용과 시간 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다.
항체가 가지는 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타깃물질에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 앱타머(Aptamer)는 안정된 삼차구조를 가지면서 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 'chemical antibody'라 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다. 앱타머는 분자 구조가 큰 항체와는 달리 약 20~80 mer 정도 길이의 핵산으로 구성되어 있는 작은 분자 구조이고, 여러 가지 필요한 변형이 용이한 장점이 있다. 또한 열 안정성이 우수하여 실온 보관, 운반 등이 가능하고 만약 변성 (denaturation)이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생 (regeneration)이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다. 앱타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며 또한 고순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있어 비용면에서도 기존의 센서 분야에서 이용되는 감지물질들 보다도 우위에 있다. 또한 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서 등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 새로운 에디포카인 검출방법을 제공하고자 예의 연구노력한 결과, 제 2형 당뇨병의 바이오마커인 RBP4, 베스핀, 남트에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머와 항체를 동시에 이용한 검출법이 종래 항체 기반의 분석보다 더 민감하고 일관성있게 에디포카인을 검출하고 이를 통해 제2형 당뇨병을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 종래 에디포카인 검출방법의 문제점들을 해소하고 보다 신속하고 정확하게 당뇨병을 진단할 수 있도록 하는 새로운 에디포카인의 검출방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 검출방법을 제공한다:
(a) 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머에, 시료 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 항체의 결합여부를 분석하여 에디포카인을 검출하는 단계.
본 발명은 또한, 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머; 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 에디포카인의 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머; 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 당뇨병의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 에디포카인의 검출방법은, 기존에 사용되고 있는 오로지 항체만을 이용하는 분석보다 더 민감하고 정확하게 혈중 에디포카인의 농도를 측정하며, 또한 상기 DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 제작에 유리하다. 아울러, 본 발명에 따른 검출기법은 종래 앱타머 검출기법에 비하여도 매우 높은 검출 민감도를 가진다. 이에 혈중 RBP4, 베스핀, 남트 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서로서, 2형 당뇨의 진단의 정확성을 증가시킬 수 있는바 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 에디포카인의 검출방법의 일 실시예를 보이는 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 에디포카인 검출방법의 선택 특이성을 나타내는 그래프이다 (RBA: RBP4 binding aptamer, VBA: vaspin binding aptamer, NBA:Nampt binding aptamer).
도 3은 본 발명에 따른 에디포카인의 검출방법을 농도 의존적으로 테스트한 결과로, 3가지 에디포카인의 검출한계를 나타내는 그래프이다 (A: RBP4, B: Vaspin, C: Nampt).
도 4는 인간 세럼 내 에디포카인의 검출 결과를 나타내는 그래프이다 (A: RBP4, B: Vaspin, C: Nampt).
도 5는 인공 세럼 내 RBP4 검출 결과를 나타내는 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "핵산 앱타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다.
본원에서 "시료"란, 에디포카인, 즉, RBP4 (retinol-binding protein-4), 베스핀(Vaspin, visceral adipose tissue-derived serpin), Nampt (nicotinamide phosphoribosyltransferase)를 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 동물 장내, 동물 조직, 동물 체액 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 체액은 혈청, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 동물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.
본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는, 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 검출방법에 관한 것이다:
(a) 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머에, 시료 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 항체의 결합여부를 분석하여 에디포카인을 검출하는 단계.
본원에서, "고체상"은 앱타머가 고정되는 고체상태의 지지체로서, 앱타머가 고정될 수 있는 한 그 모양이나 물질이 제한되지 않는다. 분석방법 수행의 편의를 위하여 멀티 웰 타입의 마이크로 플레이트가 일반적으로 사용될 수 있으나, 센서 칩, 플라스틱, 폴리프로필렌, 또는 세파로즈나 아가로스와 같은 비드로 채워진 컬럼과 같이, 다른 형상도 사용될 수 있다.
상기 앱타머는 상기 고체상에 일반적인 방법에 의하여 고정될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 고체상에 스텝타비딘을 고정시키고, 핵산 앱타머에 비오틴을 결합시켜, 스텝타비딘과 비오틴의 결합을 이용하여 고정시켰으나, 이에 한정되지 않음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 상기의 고정된 앱타머에 시료와 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 반응시키는 단계로서, 여기서 "반응"이란 앱타머에 시료 및 항체를 가하고 배양하여 시료 중 존재하는 타겟물질, 즉 에디포카인 RBP4, 베스핀, Nampt는 고정되어 있는 앱타머에 결합하고, 항체는 타겟물질에 결합하도록 반응시키는 것을 의미한다. 이때 시료와 항체를 먼저 혼합한 다음, 상기 앱타머에 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 시료와 항체를 혼합하여 시료 중 타겟물질과 항체간의 특이적인 결합이 이루어지도록 한 후 결합된 타겟물질-항체를 고정되어 있는 앱타머에 첨가하여 앱타머와 결합이 이루어지도록 할 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계는 시료를 먼저 첨가한 다음, 항체를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 시료 중 타겟물질이 먼저 고체상에 고정되어 있는 앱타머와 결합하도록 한 다음, 순차적으로 항체를 가하여 결합시킴으로써 순차적인 결합반응이 이루어지도록 할 수 있다.
이때, 상기 항체는 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 즉, 서열번호 1의 핵산 앱타머가 고체상에 고정되어 있는 경우 항체는 RBP4에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 서열번호 2의 핵산 앱타머가 고체상에 고정되어 있는 경우 항체는 베스핀에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 서열번호 3의 핵산 앱타머가 고체상에 고정되어 있는 경우 항체는 Nampt에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 특정 타겟에 대한 앱타머와 항체가 존재하더라도 앱타머와 항체가 동일한 영역에 결합하는 경우 본 발명에 따른 방법을 적용할 수 없을 것이며, 공지된 앱타머를 그대로 적용한다고 하여 에디포카인의 민감한 검출이 가능하다고 볼 수 없는바, 앱타머의 선정은 매우 중요하며 반드시 실험적인 확인이 요구된다.
이때, 상기 각 핵산 앱타머의 서열은 다음과 같다.
RBP4에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATTACAGTAGTGAGGGGTCCGTCGTGGGGTAGTTGGGTCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT-3' (서열번호 1)
베스핀에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGGCGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT-3' (서열번호 2)
Nampt에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATTGGGCAGGACAGGTGTCGGCTTGATAGGCTGGGGTGTGTGTAGATAGTAAGTGCAATCT-3' (서열번호 3)
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 항체의 결합여부는, 그 결합여부를 확인할 수 있는 것이면 어떤 형태의 신호처리 기법도 적용될 수 있는데, 예로 항체 또는 상기 항체에 2차적으로 결합되는 2차 항체에 표지물질을 결합시켜 표지물질 자체 또는 그 반응을 검출함으로서 결합여부를 확인할 수 있다. 표지물질은 상기 항체 또는 2차 항체에 간접적 또는 직접적인 방법으로 부착될 수 있으며, 표지물질로는 이로 제한되는 것은 아니나, 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 금 나노입자, 효소, 효소 기질, 및 전기화학적 작용기 (electrochemical functional group) 등이 사용될 수 있고, 이때, 형광물질의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광색소나, 루시퍼라아제(luciferase), GFP와 같은 형광 단백질과 같은 공지의 형광물질이 사용될 수 있다. 아울러, 상기 표지물질 또는 그 반응의 검출은 일반적으로 알려진 표지물질 또는 그 반응의 분석방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대 형광물질을 표지물질로서 사용한 경우 타겟물질의 존재 시 발광 또는 색변화가 발생하는바, 이를 측정함으로써 타겟물질을 검출할 수 있다. 예시적으로 형광염료를 탐지할 수 있는 이미지 스캐너 등을 통하여 반응을 일으킨 웰을 스캔하여 타겟물질의 검출여부를 확인할 수 있고, 이미지를 소프트웨어를 통해 진하기 정도를 측정함으로써 검출량을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 검출방법을 이용하여서도 ADPN이나 다른 혈중 단백질이 아닌 각 에디포카인을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 다른 일 실시예에서는, 종래 사용되는 앱타머 검출기법에 비하여, 검출한계가 약 20배 (서열번호 1), 29배(서열번호 2), 68배 (서열번호 3) 낮아진 것으로 나타나, 검출 민감도가 매우 향상되었음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 고체상에 고정되어 있고, 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머; 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 에디포카인의 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 실제 혈액 중 에디포카인의 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 인간 세럼 내 가각의 에디포카인을 spiking한 샘플을 테스트한 결과, 버퍼 상에서 테스트한 것과 동일한 검출한계를 얻을 수 있었으며, 이는 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 혈중의 많은 단백질이나 생리학적 물질 등에 방해 받지 않고 특이적 검출이 가능함을 나타낸다. 특히, RBP4와 Nampt의 검출한계는 실제 2형 당뇨 환자의 세럼 내 수치를 충분히 커버할 수 있는 범위에 해당하는바, 실제 병원 등의 진단 분야에서 선택적이고 민감한 에디포카인의 검출이 가능하며, 이에 유용하게 당뇨병 진단에 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머; 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 당뇨병의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법을 적용한 에디포카인 검출 또는 당뇨병 진단 시스템은, 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 이는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
에디포카인 진단의 선택성 테스트
먼저, 표 1의 각 RBP4, 베스핀, Nampt에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 비오틴으로 라벨링 시킨 후, 이를 스트렙타비딘이 코팅된 플레이트에 고정시켰다. 이때, DNA 앱타머의 고정 전 스테렙타비딘이 코팅된 96 micro well plate를 활성화시키기 위하여, 각각의 microwell은 200㎕의 세정버퍼 (washing buffer (WB): 150mM NaCl, 25mM Tris, 0.1% BSA, and 0.05% Tween-20, pH 7.2)로 3번 세척하였고, 0.4 μM의 각 비오틸화된 앱타머 용액을 100㎕씩 각 well에 주입한 후 실온에서 2시간 incubation 하였다.
그 다음, 비고정화된 시약을 제거하기 위하여 앱타머 고정이 된 plate를 상기 세정 버퍼(WB) 로 3번 세척하고, 결합 버퍼 (binding buffer (BB): 100mM NaCl, 20mM TrisHCl, 2mM MgCl2, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 및 0.02% Tween-20, pH 7.6)에 녹아있는 각 5㎍/㎖의 타겟 에디포카인 (RBP4, Vaspin, Nampt)을 각 well에 주입한 후, 앱타머-타겟의 결합이 일어나도록 1 시간 incubation 하였다. 타겟과의 결합이 일어난 후 plate를 세정 버퍼(WB)로 세척하고, 일차적으로 4㎍/㎖의 각 타겟 에디포카인에 결합하는 항체 (AdipoGen, Inc., Korea)를 100㎕씩 주입하고 40 분간 반응 시킨 후 다시 효소가 연결된 이차항체 (HRP-conjugated seondary rabbit IgG antibody, Santa Cruz Biotechnology, INc, USA)를 주입하고 1시간 incubation 시켰다. 이때, 각 반응이 끝난 후에는 세척버퍼(WB)로 워싱후에 다음 과정을 진행하였다. 이때, 에디포카인진단의 선택성을 테스트하기 위하여, 대조군으로서 adiponectin (ADPN)과, HSA, human IgG, Fibrinogen과 같은 혈중 단백질을 DNA 앱타머가 고정된 96 well plate에 각 5㎍/㎖ 결합시켰다. 이때, 상기 인간 RBP4, 베스핀, Nampt, ADPN 및 이들의 항체는 AdigoGen Inc. (Korea)에서 구입하였고, HSA, IgG, Bibrinogen은 Sigma사에서 구입하였다.
끝으로 효소의 기질로 o-phenylenediamine (OPD, Thermo Fisher Scientic Inc. (U.S.A.))를 이용하여 발색반응을 유도하고 490 nm에서 흡광도를 확인하였다. 도 1에 개략적인 발명을 도식화 하였다.
에디포카인 특이적 핵산 앱타머
서열번호 앱타머 염기서열 (5'-3')
1 RBA (RBP4 binding aptamer) ATACCAGCTTATTCAATTACAGTAGTGAGGGGTCCGTCGTGGGGTAGTTGGGTCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
2 VBA (vaspin binding aptamer) ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGGCGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
3 NBA (Nampt binding aptamer) ATACCAGCTTATTCAATTGGGCAGGACAGGTGTCGGCTTGATAGGCTGGGGTGTGTGTAGATAGTAAGTGCAATCT
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 흡광 신호는 오직 각각의 앱타머에 대응하는 타겟 에디포카인을 처리했을 때만 나타났으며, 이로써 본 발명의 검출방법을 이용하여 특이적으로 각 타겟 에디포카인을 검출할 수 있음을 확인하였다.
에디포카인 진단의 민감도 조사
본 발명을 통한 에디포카인 진단의 민감도를 테스트하기 위해, 실시예 1의 결합버퍼(BB)에 2배수로 희석한 에디포카인 샘플(RBP4, Vaspin, Nampt)을 실시예 1과 동일한 방법으로 결합 및 반응시키고 그 반응 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 세 종류의 에디포카인 모두 넓은 범위의 working range 를 보였다.
구체적으로는 RBP4의 경우 78 ng/mL - 5 ug/mL (R2= 0.99), 베스핀의 경우 39 ng/mL - 2.5 ug/mL (R2= 0.99), 남트의 경우 19 ng/mL - 1.25 ug/mL (R2= 0.99)의 daynamic range 를 보였다. 각 에디포카인의 검출 한계는 RBP4: 78 ng/mL, 베스핀: 39 ng/mL, 남트: 19 ng/mL 이며, 이는 표 1과 동일한 핵산 앱타머를 표면자기공명장치 기반(SPR)의 바이오센서에 결합시켜 얻어진 검출한계와 비교할 때, 각 20배, 29배, 68배 낮아진 수치이다.
이러한 결과는 상기 표 1의 핵산 앱타머를 본 발명에 따른 방법을 이용하는 경우, 종래 앱타머 검출방법에 비하여, 검출 민감도가 매우 향상되었음을 보여준다.
세럼 내 에디포카인의 진단
본 발명의 방법을 이용하여 실제 혈액중의 에디포카인을 검출할 수 있는지를 검증하기 위해 실시예 2와 동일한 방법으로 human serum에 각각의 에디포카인을 spiking 한 샘플을 test 하였다. human serum 은 Invitrogen 사에서 구입하였으며, 이온 강도와 세럼내 다른 단백질들의 방해를 줄이기 위해 10배로 희석하여 사용하였다. binding assay 의 타겟 농도 구간은 실시예 2와 동일하게 두었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 농도의존적으로 흡광 신호가 증가하였고 실시예 2에서 얻어진 결과가 동일하거나 약간 좁은 working range 를 보였다. 구체적으로는 RBP4의 경우 78 ng/mL 2.5 ug/mL (R2= 0.99), 베스핀의 경우 39 ng/mL 625 ng/mL (R2= 0.97), 남트의 경우 19 ng/mL - 1.25 ug/mL (R2= 0.99)의 daynamic range 를 보였다. 검출 한계의 경우 세 에디포카인에 대해서 모두 실시예2, 즉 버퍼 상에서 테스트 한 것과 동일한 값을 얻었으며 이로써 본 발명의 방법을 이용한 에디포카인의 진단은 혈중의 많은 단백질이나 생리학적 물질등에 대해 방해받지 않으며 비특이적인 결합이 거의 없음을 확인하였다. 또한 본 발명을 통한 RBP4 와 Nampt의 검출한계는, 2형 당뇨 환자의 세럼 내 수치를 충분히 커버할 수 있는 범위에 해당하므로 실제 병원 등의 진단 활용 분야에서 선택적이고 민감한 에디포카인의 검출이 가능할 수 있음이 증명되었다.
인공 세럼 내 에디포카인 진단 테스트 및 기존 방법과의 비교
본 발명에 따른 방법을 이용한 에디포카인 진단의 민감도를 타 방법과 비교하기 위해 인공 세럼을 제작하여 이를 RBP4 검출에 이용하였다. 인공세럼은 정상 세럼 수준인 RBP4 70 ug/mL; 베스핀 0.7 ng/mL; 남트 16 ng/mL, 아디포넥틴 30 ug/mL, 알부민 40 mg/mL의 에디포카인들과 알부민을 0.1 M PBS pH7.4 버퍼에 녹여 제작하였다. 준비된 인공세럼을 1:100- 1:1000으로 희석하여 각 희석배수의 샘플을 본 발명의 방법에 적용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 방법을 이용한 결과, 인공세럼 내의 RBP4 검출 실험에서 800X까지 민감도를 보이는 것을 확인하였다. 이에 반하여 같은 조건의 인공세럼에 적용한 앱타머만을 이용한 SPR 기반의 RBP4 의 경우 350X 의 희석배수까지 검출이 되었고, 이로써 본 발명에 따른 방법을 이용한 에디포카인의 검출은 기존의 앱타머만을 단독으로 사용한 방법에 비해 우수한 민감도를 보이는 것이 증명되었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 다음 단계를 포함하는, 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 검출방법:
    (a) 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머에, 시료 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 항체의 결합여부를 분석하여 에디포카인을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는, 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 금 나노입자, 효소, 효소 기질 및 전기화학적 작용기 (electrochemical functional group)으로 구성된 군에서 선택된 표지물질을, 상기 항체 또는 상기 항체에 2차적으로 결합되는 2차 항체에 결합시켜, 상기 표지물질 또는 상기 표지물질의 반응을 검출함으로써 상기 항체의 결합여부를 분석하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  3. 고체상에 고정되어 있고 서열번호 1, 2 및 3으로 구성되는 군에서 선택된 핵산 앱타머; 및 상기 선택된 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 에디포카인의 검출용 조성물.
  4. 고체상에 고정되어 있는 서열번호 1 또는 3의 핵산 앱타머; 및 상기 핵산 앱타머가 타겟으로 하는 에디포카인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 당뇨병의 진단용 조성물.
KR1020120108106A 2012-09-27 2012-09-27 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법 KR101402316B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120108106A KR101402316B1 (ko) 2012-09-27 2012-09-27 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120108106A KR101402316B1 (ko) 2012-09-27 2012-09-27 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140041120A KR20140041120A (ko) 2014-04-04
KR101402316B1 true KR101402316B1 (ko) 2014-06-02

Family

ID=50651004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120108106A KR101402316B1 (ko) 2012-09-27 2012-09-27 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101402316B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101649729B1 (ko) * 2014-04-10 2016-08-19 고려대학교 산학협력단 베스핀에 특이적으로 결합가능한 앱타머 및 이를 이용한 바이오 센서
CN106841603B (zh) * 2017-01-23 2020-11-06 郑州轻工业学院 一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素b1的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7553631B2 (en) 2003-12-11 2009-06-30 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. RBP4 in insulin sensitivity/resistance, diabetes, and obesity
KR100930974B1 (ko) 2007-09-27 2009-12-10 고려대학교 산학협력단 레티놀 결합 단백질(rbp4)에 특이적으로 결합하는dna 앱타머 및 그 제조방법
KR20110075280A (ko) * 2009-12-28 2011-07-06 고려대학교 산학협력단 베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머, 그 앱타머의 제조방법 그리고 그 앱타머의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7553631B2 (en) 2003-12-11 2009-06-30 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. RBP4 in insulin sensitivity/resistance, diabetes, and obesity
KR100930974B1 (ko) 2007-09-27 2009-12-10 고려대학교 산학협력단 레티놀 결합 단백질(rbp4)에 특이적으로 결합하는dna 앱타머 및 그 제조방법
KR20110075280A (ko) * 2009-12-28 2011-07-06 고려대학교 산학협력단 베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머, 그 앱타머의 제조방법 그리고 그 앱타머의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biosensors and Bioelectronics, 24(2009):1456-1461. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140041120A (ko) 2014-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200096502A1 (en) Analyte Detection
Dzimianski et al. Rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibodies by biolayer interferometry
Islam et al. Direct construction of an open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of thyroid hormone T4
Mishra et al. A novel colorimetric competitive aptamer assay for lysozyme detection based on superparamagnetic nanobeads
CN102112878A (zh) 用于检测流感病毒的装置
US20090117670A1 (en) Detection of target molecules in a sample by using a magnetic field
Lakshmipriya et al. Signal enhancement in ELISA: Biotin-streptavidin technology against gold nanoparticles
JP2007161717A (ja) ポリジアセチレン超分子体とリガンド検出方法。
CN101358969A (zh) 用单一特异性捕获剂定量检测分析物的新方法
Erdem et al. Amperometric immunosensor developed for sensitive detection of SARS-CoV-2 spike S1 protein in combined with portable device
CN113195722B (zh) 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途
Buchegger et al. Four assay designs and on-chip calibration: Gadgets for a sepsis protein array
Cohen et al. Evaluation of antibody biotinylation approaches for enhanced sensitivity of single molecule array (Simoa) immunoassays
Frisk et al. Synaptotagmin II peptide-bead conjugate for botulinum toxin enrichment and detection in microchannels
KR101402316B1 (ko) 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ELAAS(Enzyme-Linked Antibody Aptamer Sandwich) 검출방법
Kim et al. Dual synergistic response for the electrochemical detection of H1N1 virus and viral proteins using high affinity peptide receptors
Akkilic et al. Avidity-based affinity enhancement using nanoliposome-amplified SPR sensing enables low picomolar detection of biologically active neuregulin 1
KR101327249B1 (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 dna 앱타머
KR100930974B1 (ko) 레티놀 결합 단백질(rbp4)에 특이적으로 결합하는dna 앱타머 및 그 제조방법
KR101086026B1 (ko) 비스파틴에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 그 제조방법
TWI521063B (zh) 生物感測裝置及分離生物分子的方法
KR101187674B1 (ko) 이단 면역 크로마토그래피를 이용한 효소 활성 측정법
US8575069B1 (en) Human performance biomarker binding peptides for neuropeptide Y and methods of using the same
JP2011122957A (ja) 高特異的かつ高感度なタンパク質検出方法
US11014088B2 (en) Sensitive ELISA for disease diagnosis on surface modified poly(methyl methacrylate) (PMMA) microfluidic microplates

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170328

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180406

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190411

Year of fee payment: 6