KR20110075280A

KR20110075280A - 베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머, 그 앱타머의 제조방법 그리고 그 앱타머의 용도

Info

Publication number: KR20110075280A
Application number: KR1020090131694A
Authority: KR
Inventors: 구만복; 김인애; 이수진; 윤병수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단; 주식회사 에디포젠
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2011-07-06
Also published as: KR101200553B1

Abstract

본 발명은 제 2형 당뇨의 바이오마커로 사용될 수 있는 지방세포 유래 에디포카인 중의 하나인 vaspin에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체인 앱타머 및 그 앱타머의 제조방법 그리고 그 앱타머의 용도에 관한 것이다.

앱타머, 베스핀, 당뇨

Description

베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머, 그 앱타머의 제조방법 그리고 그 앱타머의 용도{An Aptamer of specifically binding vaspin, a method of preparing the same and a use of the same}

에디포카인은 지방 세포에서 우세하게 분비되는 사이토카인 단백질로서 면역계와 신경계의 대사 작용에 중요한 역할을 한다. 에디포카인 중 하나인 Vaspin은 복부지방세포에서 분비되는 호르몬의 일종으로 비만과 포도당 대사 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 비만과 제2형 당뇨병의 예방과 진행에 중요한 역할을 한다는 사실이 알려져 있다. 비만 정도와 체지방분포, 인슐린 민감성, 포도당 대사능력 등이 다른 187명과 제2형 당뇨병 환자 및 포도당 대사능력에 차이가 있는 60명을 대상으로 4주간 운동프로그램을 진행하며 혈중 Vaspin 농도를 조사한 결과 포도당 대사능력이 정상인 사람은 혈중 Vaspin 농도는 체질량지수[BMI:몸무게(kg)를 키의 제곱(m²)으로 나눈 값]에 비례하여 증가하고 인슐린 민감성과 비례하여 감소하는 것으로 나타났다. 하지만 제2형 당뇨병 환자의 경우에는 체중과 Vaspin 농도 사이에 비례관계가 성립하지 않는 것으로 드러났다. 그러나 이들의 경우에도 운동을 하면 혈중 Vaspin 농도가 크게 증가하는 것으로 나타나 혈중 Vaspin 농도를 비만과 제2형 당뇨병의 진단 및 치료효과의 임상적 지표로 활용할 수 있을 것으로 보인다. 즉 혈중 Vaspin 농도의 변화추이는 비만과 혈당 대사와 연관되어 있으므로 Vaspin의 혈중 농도를 측정함으로써 제 2형 당뇨를 진단할 수 있다.

한편 기존 바이오센서 분야에서 이용되는 다양한 감지방법 중 민감도가 탁월한 것은 항체를 이용한 타깃물질의 검출 방법이다. 항체는 생체의 면역시스템을 통해 만들어지기 때문에 cell culture와 동물이 필요하고 항체를 확보를 위해 정제 과정을 거치기 때문에 제작에 많은 비용과 시간이 요구되는 것이 문제점이라고 할 수 있다. 또한 타깃물질에 있어 제약이 거의 없는 앱타머에 비해 항원으로 사용할 수 있는 타깃물질이 제한적이어서 독성물질과 같은 저분자 화학물질들에 대한 항체의 제작에 어려움이 있다. 일반적으로 항체는 그 크기가 150K Da 내외의 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 등의 바이오센서로 응용 시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있고, 화학적 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 즉 기존의 혈중 바이오마커의 진단에 있어 항체를 이용한 기술은 비용과 시간 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다.

이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타깃물질에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다.

앱타머 (Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 'fitting'의 의미를 가지는 라틴어 'aptus'에서 그 어원이 유래했다. 앱타머는 1990년에 Colorado 대학의 Larry Gold 연구팀에 의해 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 346:818-822 (1990)), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 'chemical antibody'라 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다. 먼저 앱타머의 장점들을 살펴보면 다음과 같다.

1) 항체는 분자 구조가 크기 때문에 (~150 kDa) 생산하는데 어려움이 있고 변형 (modification)또한 용이하지 못한 반면, 앱타머는 약 20~60 mer 정도 길이의 핵산으로 구성되어 있는 작은 분자 구조이고, 여러 필요한 변형이 용이한 장점을 가지고 있다.

2) 앱타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 단백질이나 항체 의약품의 경 우 실온에서 보관이나 운반이 불가능하지만 앱타머는 가능하고, 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있으며, 만약 변성 (denaturation)이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생 (regeneration)이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다.

3) 항체의 경우 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 생산하는데 많은 시간과 비용이 요구되며, 또한 만든 시기에 따라 기능성이 달라질 가능성도 있다

(batch to batch variation). 하지만 앱타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며 또한 고순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다.

4) 항체나 다른 의약용 단백질의 경우에 쉽게 나타나는 생체내 면역거부반응이 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며, 이는 치료용으로의 개발연구에 매우 중요한 장점이 될 수 있다.

5) 항체를 만들기 어려운 독소 (toxin), 복잡한 단백질 복합체 또는 당과 단백질 복합체에 대한 앱타머를 만들 수 있으며, 또한 새로운 물질에 대한 결합 물질로의 변형이 용이하여 (flexibility) 새로운 앱타머 발굴에 활발히 응용될 수 있다.

전세계 항체 의약품 시장을 살펴볼 때, 2007년 FDA 승인을 받은 22개의 제품이 약 248억 달러 규모를 차지하였고, 2015년에는 635억 달러 규모로 확대될 전망이다. 국내 시장 또한 2006년 300억원 규모에서 2016년 3,000억원 규모로 급성장할 것으로 전망하고 있다. 항체를 이용한 진단 시장 또한 2005년 전세계에서 약 300억달러 규모이었고, 2020년경 약 800억 달러로 전망되고 있다(항체, 치료용 항체, 단세포군 항체, 2008년 12월, 기술평가정보유통시스템;2008 대덕특구 산업시장정보: 진단시약, 2008년 12월, 대덕연구개발특구지원본부). 이런 항체를 이용한 치료 및 진단시장에 비추어 앱타머의 시장성을 가늠해 본다면 항체보다 빠른 개발 시간, 낮은 생산 비용, 적은 면역 거부반응, 안정성 등의 장점을 가지고 있는 앱타머가 앞으로 항체 시장의 일부를 대체하거나 틈새시장을 충분히 개척할 수 있을 것으로 보인다. 실제 앱타머 시장 동향을 살펴 보면 2004년에 Macugen이 출시되어 2006년에만 1억 300만 달러의 매출을 기록하여 앱타머 시장의 가능성을 보여 주었고 이후 새로운 앱타머 치료제를 개발하기 위해 대형 제약사들의 공동연구 참여가 급격히 늘어나고 있는 추세이다.

새로운 앱타머 발굴 방법은 다음과 같다.

SELEX를 통해 새로운 앱타머를 선별하는 과정을 살펴보면 먼저 (i) DNA 합성 및 in vitro transcription 방법 (RNA인 경우) 을 이용하여 다양한 형태를 가지는 핵산 라이브러리 (>1015)를 만든다. (ii) 항체가 여러 종류의 항원과 결합하는 것처럼 핵산 구조체 라이브러리 안에 있는 다양한 핵산 구조체들 (앱타머 후보 분자들)은 다양한 표적물질과 결합할 수 있는 능력을 가지고 있고 따라서 다음 과정으로 원하는 표적분자와 결합할 수 있는 핵산 구조체만을 선별하는 과정을 거치게 된다. (iii) Affinity chromatography 와 같은 방법을 통해 결합하지 않은 핵산 구조체는 제거되고(washing) 표적분자에 결합하는 것만을 선택적으로 얻을 수 있게 된 다. (iv) 마지막으로 표적분자로부터 핵산 구조체를 분리(elution)하게 되고 그 핵산을 증폭시킨 후 얻은 핵산 구조체를 이용하여 다시 이 과정들을 5~15번 정도 더 반복함으로써 매우 우수한 결합력과 특이성을 보이는 앱타머를 발굴할 수 있다.

위와 같이 SELEX를 통해 얻어진 초기의 앱타머 들은 더 안정적이고 강력한 앱타머로 개량하고자 하는 post-SELEX 과정을 수행하기도 한다. 대표적인 예로 RNA 앱타머의 Ribose 2'-OH를 2'-F 나 2'-NH₂, 2'-O-methyl group으로 치환하는 것이다. 이런 변화를 거치게 되면 핵산 분해효소에 대한 저항성이 우수하여 blood 내에서 안정성이 10,000배 이상 증가된 앱타머를 얻을 수 있게 된다. 이 외에도 앱타머를 polyethylene glycol (PEG)과 같은 고분자나 diacylglycerol 혹은 cholesterol 을 접합시켜 blood 내에서 빠르게 clearance 되는 것을 줄일수 있다. 그리고 5'말단이나 3'말단에 biotin을 결합시킨 앱타머를 만들어 streptavidin support에 부착시켜 바이오 센서/칩 분야에서 사용될 수 있다(Dausse E. et al. Aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline, Curr. Opin. Pharmacol, 2009).

앱타머 기반 치료제의 개발의 현황을 살펴 보면 다음과 같다

다양한 종류의 표적분자에 결합하는 앱타머가 보고됨에 따라 여러 질환에 매개 되는 표적분자에 결합하는 앱타머를 치료제로 이용하고자 하는 노력이 지속적으로 진행되어 왔고 특히 질환을 유발하는 분자에 길항적으로 작용하는 앱타머를 발굴하면 targeted therapy에 이용할 수 있을 것이란 기대를 하게 되었다. 그 결과로 2004년 말에 Pfizer사와 Eyetech사가 공동으로 개발한 앱타머 치료제인 Macugen이 처음으로 FDA로부터 신약 승인을 받고 판매되기 시작했다. Macugen은 28개 nucleotide가 연결된 핵산구조이고 마지막 3'말단에 monomethoxy polyethylene glycol(~20 kDa)이 연결되어 있다. 노화와 연관된 황반 변성 (age-related macular degeneration, AMD)을 유발하는 VEGF165 단백질과 특이적으로 결합하며 그 결과 VEGF165 단백질이 VEGF 리셉터와 결합하는 것을 막음으로써 AMD에 탁월한 치료 효능이 있다.

물론 Macugen은 전신에 투입되지 않고 국소 투입되는 치료제이고 아직까지 부작용이나 면역 거부반응에 대한 보고는 없는 상황이지만, 실제 효율적인 의약품 제제로서는 전신에 투여했을 때 독성이나 면역거부반응이 없는 의약제제로서의 앱타머의 개발이 앞으로의 연구에 있어 매우 중요한 부분이라 할 수 있다. 현재 대표적인 앱타머 연구회사로서 Archemix사를 들 수 있으며 과도한 혈전 형성을 유발하는 vWF에 선택적으로 결합함으로써 혈전형성을 억제하는 ARC1779 (혈전성 미세혈관 질환 치료)등을 비롯한 여러 신약 후보들을 개발하고 여러 임상단계에 진입해 있다. Ophthotech사에서는 AMD 치료와 관련하여 platelet-derived growth factor (PDGF)와 면역반응에서 작용하는 보체 (complement)의 C5 component, 각각을 표적으로 하는 두 개의 다른 앱타머 치료제를 개발 중에 있다. 바이러스가 매개하는 질환에 대한 앱타머 치료제 연구도 활발하게 진행되고 있는데, T4 DNA polymerase에 결합하는 앱타머가 최초로 보고 된 이후 특히 HIV-1과 HCV가 만들어 내는 단백질에 대한 앱타머가 많이 발굴되었다. HIV-1의 reverse transcriptase (RT), Tat 그리고 Rev 단백질, HCV의 polymerase NS5B 과 프로테아제 NS3A 등이 그 예이다. 최근에는 Hemagglutinin에 대한 앱타머가 개발되어 Influenza B virus가 숙주세포에 감염되는 것을 저해하는 치료제가 연구 중에 있다.

앱타머의 진단 및 센서로의 응용 가능성에 대해서 살펴보면 다음과 같다.

항체에 버금가는 표적 친화력을 가지고 있고 항체에 비해 크기가 월등히 작고 또한 다양한 표적분자들과 높은 결합력으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있는 앱타머의 진단 및 분석으로의 응용은 어찌 보면 매우 당연하다 볼 수 있다. 1997년 형광표지된 앱타머를 이용한 Human-neutrophil elastase 를 광학적으로 검출하는 앱타머 센서(aptasensor)가 처음 개발된 이후(Charlton, J. et al., In viva imaging of inflammation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elastase. Chem. Biol. 4:809-816 (1997)) 크게 (i) 앱타머와 표적분자간의 결합 전후에 나타나는 전자 전달정도를 감응하여 반응하는 전기화학적 (electrochemical) 방식의 센서, (ii) 형광물질등의 형광측정을 통한 광학적 (optical) 방식의 센서, 그리고 (iii) 표적 물질과의 결합 전후에 나타나는 질량의 차이를 분석하여 측정하는 질량 분석 (mass-sensitive) 방식의 앱타머 센서 들이 주로 개발되고 있다(Song S et al. Aptamer-based biosensors. Trends Anal. Chem, 27:108-117 (2008);Cho EJ et al. Applications of aptamers as sensors. Annu. Rev. Anal. Chem. 2:241-264 (2009)). 전기화학적 방식의 예로서 Methylene blue (MB)로 표지된 앱타머를 전극에 고정화하고 나서 표적물질과 결합을 하게 되면 앱타머의 구조 변화를 유발하면서 앱타머에 표지된 MB가 전극으로부터 멀어지게 되고 결과적으로 MB로부터의 전기화학적 신호가 줄어들게 되어 표적물질 결합 전후의 전기화학적 신호를 감지하면서 앱타머와의 결합여부를 진단할 수 있게 된다. 또한 앱타머의 hairpin-loop 구조에 chelating 되어 있던 MB가 표적물질 결합 후 나타나는 변형구조로인해 MB가 앱타머로부터 빠져나가면서 신호의 감소를 주는 label-free 방식도 있다. 또한 전극 대신 탄소 나노튜브(CNT-FET)를 사용하는 방식은 표적물질 결합 전후에 나타나는 전기전도도 (conductance)의 변화를 감응함으로써 신호를 얻을 수 있는 방식이다.

현재 앱타머 센서 개발을 진행하고 있는 회사들을 살펴보면 미국의 SomaLogic사가 변형핵산을 이용한 고효율 SELEX 기술을 이용하여 진단용 aptamer를 개발하고자 연구하고 있고, LC Science사는 앱타머를 이용한 단백질 측정용 microarray 기술을 개발하고 있다. Promega사에는 광우병 진단에 이용될 수 있는 prion detection 앱타머 기술개발을 수행 중이다. 또한 말라카이트, ATP, 에스트라다이올 등의 저분자 대사물질, 환경 또는 식품 유해물질들에 대한 앱타머 개발 연구가 현재 진행되고 있고 특히 코카인과 같은 마약류를 검출하기 위한 앱타머 센서에 대한 연구도 보고되고 있다.

따라서 이러한 앱타머 관련 기술을 이용하여 Vaspin에만 특이적으로 결합하는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 개발해냄으로써 비만 관련 제 2형 당뇨를 보다 정확하고 신속하게 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 vaspin에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 앱타머를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 앱타머를 포함하는 베스핀 검출 및 정량용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 앱타머를 포함하는 당뇨 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 앱타머를 고정된 고상 담체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 vaspin을 검출 및 정량하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 vaspin을 정제 농축하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병을 진단하는 방법을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 베스핀(vaspin)에 대하여 특이적인 결합활성을 갖는 앱타머를 제공한다.

본 발명에서 '앱타머'란, 소정의 표적 분자에 대한 결합활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 DNA, RNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형 태일 수 있다.

본 발명에서 '베스핀(vaspin)'이란 아디포사이토카인(adipocytokine)으로 알려졌으며, 풀 네임은 'visceral adipose tissue-derived serpin (vaspin)'이다.

Vaspin cDNA는 Otsuka Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) 랫트의 내장부위 백색 지방 조직(WATs)으로부터 분리되었고, 랫트, 마우스 및 인간 베스핀은 각각 392, 394, 및 395 아미노산으로 구성되었고, 알파1-앤티트립신과 약 40%의 호모로지를 나타낸다.(Hida K, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jul 26;102(30):10610-5)

또한 '베스핀에 대한 특이적 결합활성'이란 최광의 의미로, 상기 정의된 베스핀에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다.

또한 본 발명은 a) 프라이머 결합 부위를 양끝으로 하여 가운데 임의의 염기로 구성된 랜덤 DNA 라이브러리를 베스핀이 고정되어 있는 자성 비드와 반응시킨 후 베스핀과 결합하지 못한 DNA를 제거하는 단계;

b) 상기 자성비드 표면에 고정된 베스핀과 결합한 DNA를 자성비드로부터 분리시키고, 분리된 단일가닥 DNA를 정제, 농축하는 단계;

c) 상기 얻어진 DNA 풀을 다시 베스핀이 고정되어 있는 자성비드와 반응시키는 단계를 포함하는 베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머의 수득 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 프라이머 결합 부위는 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 앱타머를 포함하는 베스핀 검출 및 정량용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 앱타머를 포함하는 당뇨 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 a) 검출 표지체와 결합된 베스핀에 선택적으로 결합하는 상기 본 발명의 앱타머와 검체 시료를 접촉시키는 단계;

b) 검출 표지체와 결합된 베스핀에 선택적으로 결합하는 상기 본 발명의 앱타머와 대조 시료를 접촉시키는 단계;

c) 상기 a) 및 b) 단계에서 수득된 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c)단계의 결과를 비교하는 단계를 포함하는 검체 시료 내의 베스핀 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 정량 검출 방법은 효소 면역 측정법(EIA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법, 면역조직 화학적 염색법, 셀소팅(cell sorting)법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 및 금입자(gold particle) 착물법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며,

본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않으 나, 대략 76 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, post-SELEX 과정을 통해 보다 효율적인 20-30 뉴클레오티드 크기로 modification 되어 사용될 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다.

본 발명의 앱타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예, -O-CHO기), 아미노기(예, -NH₂기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한 적어도 1종(예, 1,2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 앱타머의 일례는, 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 인터널 루프 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 부분을 포함하는 잠재적 2차 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 앱타머의 다른 예는, 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 인터널 루프 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 부분을 포함하는 잠재적 2차 구조를 가질 수 있다.

본 명세서에서 기재된 '잠재적 2차 구조'란, 생리 조건하에서 안정적으로 존재할 수 있는 2차 구조를 말하고, 예컨대 잠재적 2차 구조를 갖는지의 여부는, 실시예에 기재한 구조 예측 프로그램에 의해 결정할 수 있다. 스템 부분이란, 2 이상의 연속하는 뉴클레오티드에서의 염기쌍(예, G-C, A-U, A-T)에 의해, 2중쇄가 형성되는 부분을 말한다. 인터널 루프 부분이란, 2개의 상이한 스템 부분 사이에서 형성되는 비스템 부분을 말한다.

헤어핀 루프 부분이란, 하나의 스템 부분에 의해 형성되는 부분 구조로서, 앱타머쇄의 5' 말단 및 3' 말단에 대하여 반대측에 형성되는 루프 부분을 말한다. 단일쇄 부분이란, 폴리뉴클레오티드쇄의 말단 부분으로서, 상기한 스템 부분, 인터널 루프 부분 및 헤어핀 루프 부분에 해당하지 않는 부분을 말한다.

본 발명의 앱타머는 또한, (a) 서열 번호 1∼8 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)을 포함하는 앱타머, (b) 서열 번호 1∼8 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)에 있어서 1 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또 는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머, (c) 상기 (a)의 복수의 연결물, 상기 (b)의 복수의 연결물, 상기 (a) 및 (b)의 복수의 연결물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연결물일 수 있다. 상기 (b)에 있어서, 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 뉴클레오티드수는, 수개인 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 약 30개 이하, 바람직하게는 약 20개 이하, 보다 바람직하게는 약 10개 이하, 또한 보다 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 4개, 3개, 2개 또는 1개일 수 있다. 상기 (c)에 있어서 연결은 탄댐(tandem) 결합으로써 행해질 수 있다. 또한, 연결시에 링커를 이용하여도 좋다. 링커로서는 뉴클레오티드쇄(예, 1∼약 20 뉴클레오티드), 비뉴클레오티드쇄[예,-(CH₂)n-링커, -(CH₂CH₂O)n-링커, 헥사에틸렌글리콜 링커, TEG 링커, 펩티드를 포함하는 링커, -S-S-결합을 포함하는 링커, -CONH-결합을 포함하는 링커, -OPO3-결합을 포함하는 링커]를 들 수 있다.

상기 복수의 연결물에서의 복수란, 2 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 2개, 3개 또는 4개일 수 있다. 상기 (a)∼(c)에서의 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 기(예, 수소원자, 불소원자 또는-0-Me기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 앱타머에서는 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 헤어핀 루프 부분에서, 수개의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부 가가 허용될 수 있다. 예컨대 본 앱타머에서는 단일쇄 부분에 대한 수개의 뉴클레오티드의 삽입, 제1 스템 부분에 대한 수개의 뉴클레오티드의 삽입, 3' 말단의 단일쇄 부분에 대한 수개의 뉴클레오티드의 부가가 허용될 수 있다.

본 발명의 앱타머는, 베스핀에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예,리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화,O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예,-NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991)Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs etal., (1973)Biochemistry 12, 5138-5145 참조).

본 발명의 앱타머는 또한, 베스핀에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다.

또한 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이도록, 본 발명의 앱타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR₂(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH₂(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕.

연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다.

변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, Myristoyl,Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, 그 외 지질, 스테로이드,콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조.

본 발명의 앱타머는, 본 명세서중의 개시 및 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.

앱타머는, 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합, 리보오스를 이용한 소수결합 및 수소결합, 핵산염기를 이용한 수소결합이나 스태킹(stacking)결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만 큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합은 강하게, 단백질의 표면에 존재하는 리신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관련되어 있지 않은 핵산염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 핵산 염기는, 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 앱타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프 구조 등 염기쌍을 만들지 않은 구조에서도,핵산 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다. 리보오스의 2'부위의 수식에 관해서는, 드물게 리보오스의 2'부위의 관능기가 표적 분자와 직접적으로 상호 작용하고 있는 경우가 있지만, 대부분의 경우 무관계이고, 다른 수식 분자로 치환 가능하다. 이와 같이 앱타머는, 표적 분자와의 직접적인 결합에 관련되어 있는 관능기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 유지하고 있는 경우가 많다.

또한, 전체의 입체 구조가 크게 변하지 않는 것도 중요하다.

앱타머는, 통상적으로 SELEX법, 그 개량법[예컨대 Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al.,(1990) Science, 249, 505-510]을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX법으로는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머가 농축되고, 선별된다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나, 및/또는 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에 는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.

SELEX에서 얻어지는 앱타머는 표적 물질에 대하여 친화성이 높은 핵산이고, 그것은 표적 물질의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX에서 얻어지는 앱타머는 반드시 표적 물질의 기능에 작용하는 것으로는 한정하지 않는다.

앱타머는 그 프라이머 설계에 의존하여, 그 후의 최소화 작업의 용이성이 변한다. 프라이머를 잘 설계하지 않으면, SELEX에 의해 활성이 있는 앱타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그 후의 개발이 불가능해진다.

그러나 앱타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 개변이 용이하다. 앱타머는 mfold 프로그램을 이용하여 2차 구조를 쉽게 예측할 수 있으며 보다 정확한 입체 구조 분석을 위해서는 X선 해석이나 NMR 해석이 필요하다. 이러한 구조분석과 여러 앱타머 시퀀스상에서 나타나는 동일 시퀀스 영역(conserved region) 분석을 바탕으로, 특정 염기가 치환 또는 결손된 앱타머 연구 (truncation study)를 통해 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또한 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입 가능한지 어느 정도 예측할 수 있다. 이러한 연구를 통해 보다 안정적이고 강력한 앱타머를 개발할 수 있으며 앱타머의 전체 염기서열 중 결합과 관련된 중요한 부위 (binding motif)를 찾아낼 수 있다. 예측된 새로운 서열의 앱타머는 용이하게 화학 합성할 수 있고, 그 앱타머가 활성을 유지하고 있는지의 여부를 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다.

얻어진 앱타머의 표적 물질과의 결합에 중요한 부분이, 상기와 같은 시행 착오를 반복함으로써 특정할 수 있는 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하여도, 대부분의 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것이 아니다.

변형에 관해서도 서열과 마찬가지로 고도로 설계 또는 개변이 가능하다.

이상과 같이, 앱타머는 고도로 설계 또는 변형이 가능하다. 본 발명은 또한, 소정의 서열(예, 스템 부분, 인터널 루프 부분, 헤어핀 루프 부분 및 단일쇄 부분으로부터 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라서 고정 서열로 생략함)을 포함하는 앱타머를 고도로 설계 또는 개변 가능한 앱타머의 제조방법을 제공한다.

예컨대, 이러한 앱타머의 제조방법은, 하기:

[식 1]

상기에 있어서, (N)a는 a개의 N으로 이루어지는 뉴클레오티드쇄를 나타내고, (N)b는, b개의 N로 이루어지는 뉴클레오티드쇄를 나타내며, N은 각각, 동일 또는 상이하여, A, G, C, U 및 T(바람직하게는 A, G, C 및 U)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이다. a, b는 각각, 동일 또는 상이하여, 임의의 수일 수 있지만,예컨대 1∼약 100개, 바람직하게는 1∼약 50개, 보다 바람직하게는 1∼약 30개, 보다 바람직하게는 1∼약 20개또는 1∼약 10개일 수 있다.〕로 나타내는 뉴클 레오티드 서열로 이루어지는 단일종의 핵산 분자 또는 복수종의 핵산 분자(예, a, b의 수 등이 상이한 핵산 분자의 라이브러리), 및 프라이머용 서열(i), (ii)에 각각 대응하는 프라이머 쌍을 이용하여, 고정 서열을 포함하는 앱타머를 제조하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 본 발명의 엡타머를 제조하는 방법은 상기 과제해결 수단과 실시예 1 및 청구항 4항 및 5항에 잘 기재되어 있고 상기 프라이머용 서열(i), 및 (ii)는 각각 서열번호 9 및 10인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 앱타머 및 그것에 결합한 기능성 물질을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에서의 앱타머와 기능성 물질 사이의 결합은 공유 결합, 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 복합체는,본 발명의 앱타머와 1 이상(예, 2 또는 3개)의 동종 또는 이종의 기능성 물질이 결합한 것일 수 있다. 기능성 물질은, 본 발명의 앱타머에 어떠한 기능을 새롭게 부가하는 것, 또는 본 발명의 앱타머가 유지할 수 있는 어떠한 특성을 변화(예, 향상)시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 기능성 물질로서는, 예컨대 단백질,펩티드, 아미노산, 지질, 당질, 단당, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드를 들 수 있다. 기능성 물질로서는 또한, 예컨대 친화성 물질(예, 비오틴, 스트렙트아비딘, 표적 상보 서열에 대하여 친화성을 갖는 폴리뉴클레오티드,항체, 글루타티온세파로스, 히스티딘), 표지용 물질(예, 형광물질, 발광물질, 방사성 동위체), 효소(예, 양고추 냉이 페록시다아제, 알칼리포스파타아제), 약물 송달 매체(예, 리포솜, 미크로스페어, 펩티 드, 폴리에틸렌글리콜류), 이들의 기능성 분자는 최종적으로 제거되는 경우가 있다. 또한 트롬빈이나 매트릭스메탈프로테아제(MMP),FactorX 등의 효소가 인식되어 절단할 수 있는 펩티드, 뉴클레아제나 제한 효소를 절단할 수 있는 폴리뉴클레오티드여도 좋다.

본 발명의 앱타머는 당뇨, 비만 등의 질환의 진단 또는 예방에 유용하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 앱타머 및 복합체가 고정화된 고상 담체를 제공한다. 고상 담체로서는, 예컨대 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은 DNA칩이나 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다.

수지로서는, 예컨대 아가로스(agarose) 입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자,셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스(Sepharose), 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지도 포함된다.

본 발명의 고상 담체는, 예컨대 베스핀의 정제, 및 베스핀의 검출, 정량에 유용할 수 있다.

본 발명의 앱타머및 복합체는, 자체 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이나 소정의 관능기를 본 발명의 앱타머 및 복합체에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 방법을 제공한다. 소정의 관능기는, 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 관능기가 도입된 앱타머를 제공한다.

본 발명은 또한, 베스핀의 정제 및 농축 방법을 제공한다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은, 본 발명의 고상 담체에 베스핀을 흡착시키고, 흡착한 베스핀을 용출액에 의해 용출시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명 고상 담체에의 베스핀의 흡착은 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대 베스핀을 함유하는 시료(예, 박테리아 또는 세포의 배양물 또는 배양상청, 혈액)를, 본 발명의 고상 담체 또는 그 함유물에 도입한다. 베스핀의 용출은, 중성 용액 등의 용출액을 이용하여 행할 수 있다. 중성 용출액은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예컨대 pH 약 6∼약 9, 바람직하게는 약 6.5∼약 8.5, 보다 바람직하게는 약 7∼약 8일 수 있다. 중성 용액은 또한, 예컨대 칼륨염(예, NaCl, KCl), 마그네슘염(예, MgCl), 계면활성제(예, 트윈 20, 트리톤, NP40), 글리세린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 베스핀의 흡착 후, 세정액을 이용하여 고상 담체를 세정하는 것을 포함할 수 있다. 세정액으로서는, 예컨대 요소, 킬레이트제(예, EDTA), Tris, 산, 알칼리를 포함하는 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 정제 및 농축 방법은 또한, 고상 담체를 가열 처리하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 공정에 의해, 고상 담체 의 재생, 멸균이 가능하다.

본 발명은 또한, 베스핀의 검출 및 정량 방법을 제공한다. 본 발명의 검출 및 정량 방법은, 본 발명의 앱타머를 이용하여(예, 본 발명의 복합체 및 고상 담체의 사용에 의해) 베스핀을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 베스핀의 검출 및 정량 방법은, 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 이용하는 것 이외는, 면역학적 방법과 같은 방법에 의해 행하여질 수 있다. 따라서, 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 이용함으로써, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA,간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법(예,웨스턴블롯법에서의 2차 항체 대신에 사용), 면역조직 화학적 염색법, 셀소팅(cell sorting)법 등의 방법과 같은 방법에 의해, 검출 및 정량을 행할 수 있다.

이러한 방법은, 예컨대 생체 또는 생물학적 샘플에서의 베스핀 양의 측정, 베스핀이 관련되는 질환(예를 들어, 당뇨 또는 비만)의 진단에 유용할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 일 구체예는 표면에 Vaspin을 고정한 자성 비드를 이용하여 Random DNA Library에서부터 Vaspin에만 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 선별하고, 선별된 앱타머의 특성을 분석하는 것에 대한 것이다.

본 발명 과정을 좀 더 자세히 설명하면 다음과 같다.

1) 자성 비드에 Vaspin 고정

표면에 tosyl 기능기를 갖는 자성비드와 amino기를 갖는 Vaspin을 버퍼용액 내에서 반응시키면 두 반응기 간에 공유결합이 형성되어 비드 표면에 Vaspin이 고 정되어진다. 이 후 자석을 이용하여 Vaspin이 고정된 비드와 버퍼를 분리하는데 이 때 비드에 고정되지 않은 여분의 Vaspin은 제거된다.

2) Vaspin 결합 특이적 DNA 앱타머 개발

일반적으로 표적 물질에 특이적인 앱타머 개발을 위해 SELEX (Systamatic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법이 사용되나, 본 발명에서는 이를 변형한 FluMag-SELEX process를 이용하여 Vaspin 결합 특이적인 DNA 앱타머를 개발하였다. 프라이머 결합 부위로서 18개의 염기로 이루어진 지역을 양끝으로 하여 가운데 40개의 임의의 염기로 구성된 Random DNA library를 Vaspin이 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액에 넣고 혼합하여 반응시킨 후 자석을 이용하여 Vaspin과 결합하지 못한 DNA를 제거한다. 이 후 자성비드 표면에 고정된 Vaspin과 결합한 DNA는 고온처리를 통해 자성비드로부터 분리시키고, 분리된 단일가닥 DNA는 에탄올 침전법을 시행하여 정제, 농축한다. 이 과정을 통해 얻어진 Vaspin 결합 특이적인 DNA는 PCR과정을 통해 증폭되고, 증폭된 PCR 산물은 정제한 후 고농도의 urea가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동하여 이중나선 구조의 PCR반응물을 두 개의 단일가닥 DNA로 분리한다. 두 개의 ssDNA 밴드 중 원래의 단일가닥 DNA 밴드를 gel extraction과 에탄올침전법을 통해 농축, 정제하여 단일가닥 DNA를 확보한다. 이때의 얻어진 DNA pool은 다시 Vaspin이 고정되어 있는 자성비드와 반응시킨다. 이와 같은 일련의 과정을 반복하여 Vaspin에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA의 비율이 90%이상이 되었을 때의 DNA pool을 확보하여 TOPO cloning kit를 이용하여 클로닝을 시행한다. 얻어진 콜로니에서부터 플라스미드 DNA를 추출하 여 염기분석을 시행하였으며 그 결과 최종적으로 8개의 서로 다른 염기서열을 가진 ssDNA를 확보하였다.

3) Vaspin 결합 특이적 DNA 앱타머 분석

Vaspin에 특이적으로 결합하는 앱타머의 다른 단백질에 대한 친화성 여부와 Vaspin 농도에 따른 결합력의 크기를 비교하기 위한 방법으로 표면자기공명장치(SPR)를 이용하였다. 이를 위해 bare gold chip의 표면에 SELEX를 통해 얻어진 각각의 DNA 앱타머를 칩 위에 고정시킨 후 Vaspin을 농도별로 반응시켜 결합력 정도를 분석하였으며, 다른 에디포카인(Adiponectin, RBP4, Visfatin)과 HSA(Human Serum Albumin)의 결합력 정도를 측정, 분석하여 Vaspin 앱타머의 결합 특이성을 테스트하였다.

본 명세서 중에 기재된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 모두가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 삽입되는 것이다.

인슐린 민감효과를 나타내는 에디포카인인 Vaspin의 지방세포 내에서의 mRNA 발현은 비만과 혈당 대사의 척도로서, 혈중 Vaspin의 양의 변화를 통해 인슐린 민감도의 변화 및 비만과 제 2형 당뇨의 진단이 가능하다. 즉 지방세포에서 유래하는 에디포카인인 Vaspin의 혈중 농도를 민감하게 측정하는 것은 제 2형 당뇨 진단을 위해 매우 중요하다. 본 발명에 따른 Vaspin 결합 특이적인 DNA 앱타머는 항체에 비해 보다 빠르게 화학적 합성이 가능하고 열 안정성이 뛰어나며 화학적인 변형이 용이하기 때문에 보다 효율적으로 바이오센서로의 응용이 가능할 것으로 기대된다.

즉 Vaspin농도를 보다 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 DNA 앱타머를 이용한 바이오센서는 제 2형 당뇨의 조기 진단 등에 응용이 가능할 것이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1

Vaspin의 아미노기와 자성비드의 토실 기가 공유결합을 형성함으로써 Vaspin이 자성비드 표면에 고정되는 과정은 다음과 같다. Vaspin (에디포젠, 한국)은 버퍼용액(0.1 M borate buffer, pH 9.5) 내에서 자성비드(Dynal bead, Invitrogen, USA)와 상온에서 48시간 반응시켰다. 이 후 자석을 이용하여 자성비드에 결합하지 않는 Vaspin은 제거하고 Vaspin이 결합된 자성비드만을 분리하였다. Vaspin이 고정된 자성비드는 버퍼용액 (PBS pH 7.4, 0.1% BSA 포함)을 이용하여 세척한 후, 0.2 M Tris pH 8.5(0.1% BSA 포함) 용액 내에서 20℃, 24시간 반응시켜 자성비드 표면상의 Vaspin과 결합하지 않은 tosyl 기를 불활성시킨다. 이 후 Vaspin이 결합된 자성비드는 버퍼용액 (PBS, pH 7.4, 0.1% BSA 포함)과 혼합하여 4℃에서 보관하였다.

76개의 염기로 이루어진 Random DNA Library(제노텍, 한국)는 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 결합지역이 있고 그 가운데에 40 개의 임의의 염기로 다음과 같이 구성되었다.

ATACCAGCTTATTCAATT(서열번호 9)-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호 10)

이 DNA pool을 Vaspin이 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2 and 0.02% Tween 20)에 넣고 혼합하여 30 분간 상온에서 반응시킨 후, 반응시킨 튜브를 자석에 고정시켜서 Vaspin과 결합하지 않은 DNA를 제거하고, 결합력이 약한 DNA를 제거하기 위해 버퍼용액으로 5회 세척한다. 이 후 Vaspin과 결합한 DNA는 80℃에서 5 분간 반응시켜 자성비드로부터 분리시키고 에탄올 침전법을 통해 순수한 단일가닥 DNA를 확보한다. 이 후 이 과정을 통해 얻어진 Vaspin에 결합하는 DNA의 농도를 측정하고, 초기 DNA pool과 Vaspin에 특이 결합한 DNA 비율을 계산한다. Vaspin 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 PCR을 수행한다. PCR 산물은 두 가닥의 DNA 이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위해서 하나의 프라이머(제노텍, 한국)에는 fluorescein(형광표지된 primer를 제노텍에서 구매하여 사용)을 고정하였다.

forward FP : fluorescein-ATACCAGCTTATTCAATT(서열번호 11)
reverse RP : poly A_20-X-AGATTGCACTTACTATCT(서열번호 12)

PCR 산물을 purification kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 정제한 후, 두 가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다. 7 %의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6 M의 urea, 20 %의 포름아마이드가 포함되어 있어 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시켜 전기영동 후에는 두 개의 밴드 로 분리되는데 그 사이즈에 따라 fluorescein이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하였다.

Fluorescein이 붙어 있는 DNA 밴드를 잘라내어 gel extraction을 실시한 후 에탄올 침전법을 통해 분리된 DNA를 확보하였다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 Vaspin이 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 일련의 과정을 반복하였다. 도1 모식도는 Vaspin과 random DNA library와의 결합반응, PCR을 통한 증폭, PAGE를 통한 단일가닥 DNA로의 분리 과정을 나타내고 있으며 이러한 일련의 과정을 한 번의 selection 이라 한다. 총 12번의 selection 과정을 거쳐 최종적으로 95 % 이상이 Vaspin 에 결합하는 DNA pool을 얻었다. 3번째와 11번째 selection 후에는 각각 HSA와 다른 에디포카인인 아디포넥틴(adiponectin), RBP4(Retinol Binding Protein 4), Visfatin (에디포젠, 한국)으로 counter selection을 실시함으로써 비특이적으로 결합하는 DNA를 차단하고 Vaspin에만 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA pool을 확보했다. 도 2에 각각의 selection 과정에서 Vaspin에 특이적으로 결합하는 DNA pool의 비율이 증가하는 양상을 제시하였다.

최종적으로 얻어진 DNA pool을 TOPO cloning kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 cloning 하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행한 결과 서로 다른 8 종의 Vaspin 에 결합 특이적인 핵산 구조체를 확보하였다.

실시예 2

Vaspin에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 8 종의 DNA의 염기서열을 분석한 결과는 표 1과 같다. 선택된 8 종의 Vaspin 앱타머의 2차 구 조는 웹서버 기반의 m-fold 프로그램을 이용하여 예측하였으며 그 결과는 도1~8에 제시하였다.

선택된 8 종의 앱타머 (상기 실시예 1을 통하여 8종의 앱타머)들이 다른 에디포카인, 혈중 단백질에는 결합하지 않고 오직 Vaspin 에만 특이적으로 결합하는 특성이 있다는 것을 보여주는 실험을 실시하였다. Vaspin과 유사하게 지방세포에서 유래하는 다른 에디포카인인 Adiponectin, RBP4, Visfatin과 HSA이 특이성을 증명하기 위한 대조군으로 사용되었으며, 특이성 분석을 위해 SPR (Surface Plasmon Resonance)장치(Metrohm Autolab, Netheland)가 사용되었다. 금칩 표면에 3,3'-dithiodipropionic acid를 이용하여 COOH기를 형성시킨 후, EDC/NHS로 SAM(Self Assembly Monolayer)처리를 시행한다. 그 위에 streptavidin을 고정시킨 후에 biotin이 붙어있는 각각의 앱타머를 코팅시켰다. 금 표면에 고정된 앱타머와 Vaspin, Adiponectin, RBP4, Visfatin, HSA은 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.6, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂ 및 0.02% Tween 20 포함)내에서 30분간 반응하게 되고, 그 반응정도에 따라 SPR장치의 singal 변화 값을 분석하여 특이성을 판단하였다. SPR 결과를 분석하여 선택된 앱타머가 다른 에디포카인이나 혈중 단백질보다 Vaspin에 탁월하게 결합한다는 사실을 확인할 수 있다. 결과는 도 4에 제시하였다.

서열번호	APT NO.	서열
1	1	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGGCGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
2	2	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGGTGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
3	3	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGAGGGGTAGTGGGTGTTATGGCGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
4	26	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGGCGATTGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
5	42	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGGCAATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
6	43	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGACAATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT
7	49	ATACCAGCTTATTCAATTGGGAGTCGTGAGTGGGGGTTGGTGGGTGGGTGGCTGTGTGAGATAGTAAGTGCAATCT
8	50	ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGGTGGGGGGGGTAGTGGGTGTTATGTCGATCGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT

상기 표 1은 SELEX를 통해 선별된 Vaspin 에 대해 결합 특이적인 8 종의 DNA 앱타머 염기서열임.

실시예 3

서로 다른 8 종의 Vaspin 결합 특이적인 앱타머 중에서 특이성 및 결합력이 가장 높은 서열번호 1 앱타머에 대한 binding assay를 SPR 기반으로 실시하였다. 금칩에 1 uM 앱타머를 고정시킨 후 75 nM 부터 2 uM의 서로 다른 농도의 Vaspin을 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.6,100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2 and 0.02% Tween 20 포함)내에서 30 분간 반응시켰다, 해리상수를 구하기 위해서 각각의 반응 정도는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 Sigmaplot 10.0을 이용하여 plotting 되었고, 여기에 y=B_max* X/K_d + X 식이 이용되었다(y는 포화도, B_max는 최대 결합 위치, K_d는 해리상수, X 는 결합하지 않은 Vaspin).

그 결과로, No.1 앱타머의 Kd 값이 0.30 ±0.05 uM 로서 Vaspin과 높은 친화도를 가지며 결합하는 것이 확인되었고 이에 대한 분석 데이터를 도 5에 제시하였다.

도 1은 Vaspin 결합 특이적 핵산 구조체 앱타머의 개발 방법인 FluMag-SELEX process 모식도임.

도 2는 각 selection 단계마다 사용된 ssDNA pool 중 Vaspin에 결합하는 ssDNA의 퍼센트 비율 증가도임.

도 3-a에서 3h는 m-fold program을 이용하여 예측한 Vaspin 결합 특이적 DNA 앱타머 8종에 대한 2차 구조 모식도임.

도 4는 Vaspin 결합 특이적 DNA 앱타머인 서열번호 1의 앱타머의 다른 에디포카인 및 HSA에 대한 특이성 분석 결과임.

도 5는 결합 특이성이 가장 큰 서열번호 1의 앱타머의 Visfatin 과의 결합력 분석 결과임.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> An Aptamer of specifically binding vaspin, a method of preparing the same and a use of the same <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 1 ataccagctt attcaattgg gcggtggggg gggtagtggg tgttatggcg atcgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 2 ataccagctt attcaattgg gcggtggggg gggtagtggg tgttatggtg atcgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 3 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 3 ataccagctt attcaattgg gcggtgggag gggtagtggg tgttatggcg atcgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 4 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 4 ataccagctt attcaattgg gcggtggggg gggtagtggg tgttatggcg attgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 5 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 5 ataccagctt attcaattgg gcggtggggg gggtagtggg tgttatggca atcgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 6 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 6 ataccagctt attcaattgg gcggtggggg gggtagtggg tgttatgaca atcgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 7 ataccagctt attcaattgg gagtcgtgag tgggggttgg tgggtgggtg gctgtgtgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 8 ataccagctt attcaattgg gcggtggggg gggtagtggg tgttatgtcg atcgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer binding region <400> 9 ataccagctt attcaatt 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer binding region <400> 10 agatagtaag tgcaatct 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ataccagctt attcaatt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agattgcact tactatct 18

Claims

베스핀(vaspin)에 대하여 특이적인 결합활성을 갖는 앱타머.
제 1항에 있어서, 상기 앱타머는 하기 (a) 또는 (b) 중의 어느 하나인 앱타머:

(a)서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 뉴크레오타이드 서열(단 티민은 우라실로 변경되어도 됨)을 포함하고,

앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 불소원자이거나, 또는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,

(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 히드록시기이거나, 또는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 앱타머;

(b) 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 뉴크레오타이드(단, 티민은 우라실로 변경되어도 됨)에 있어서, 1개 또는 수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머로서,

앱타머에 포함되는 뉴클레오티드에 있어서,

(i) 각 피리미딘 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 불소원자이 거나, 또는 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있고,

(ii) 각 푸린 뉴클레오티드의 2'부위가, 동일 또는 상이하며, 히드록시기이거나, 또는 수소원자, 메톡시기 및 불소원자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원자 또는 기로 치환되어 있는 앱타머.
제 1항에 있어서, 상기 앱타머에 포함되는 뉴클레오티드가 변형되어 있는 것인 앱타머.
a) 프라이머 결합 부위를 양끝으로 하여 가운데 임의의 염기로 구성된 랜덤 DNA 라이브러리를 베스핀이 고정되어 있는 자성 비드와 반응시킨 후 베스핀과 결합하지 못한 DNA를 제거하는 단계;

b) 상기 자성비드 표면에 고정된 베스핀과 결합한 DNA를 자성비드로부터 분리시키고, 분리된 단일가닥 DNA를 정제, 농축하는 단계;

c) 상기 얻어진 DNA 풀을 다시 베스핀이 고정되어 있는 자성비드와 반응시키는 단계를 포함하는 베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머의 제조 방법.
제 4항에 있어서, 상기 프라이머 결합 부위는 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는 베스핀에 특이적으로 결합하는 앱타머의 제조 방법.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머를 포함하는 베스핀 검출 및 정량용 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머를 포함하는 당뇨 진단용 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머가 고정화된 고상 담체.
제 8항에 있어서, 상기 고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼, 또는 다공질재인 고상 담체.
제 9항에 있어서, 상기 기판은 DNA 칩 또는 단백질 칩에 사용되는 기판인 고상 담체.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 기판은 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판,유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금 기판, 은 기판 또는 알루미나 기판인 고상 담체.
제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고상 담체는 베스핀 검출 및 정량용 담체인 고상 담체.
제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고상 담체는 당뇨 진단용 담체인 고상 담체.
제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 고상 담체에 베스핀을 흡착시키고, 흡착한 베스핀을 용출액에 의해 용출시키는 베스핀의 농축 및 정제 방법.
a) 검출 표지체와 결합된 베스핀에 선택적으로 결합하는 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머와 검체 시료를 접촉시키는 단계;

b) 검출 표지체와 결합된 베스핀에 선택적으로 결합하는 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 앱타머와 대조 시료를 접촉시키는 단계;

c) 상기 a) 및 b) 단계에서 수득된 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c)단계의 결과를 비교하는 단계를 포함하는 검체 시료 내의 베스핀 검출 방법.
제 15항에 있어서, 상기 정량 검출 방법은 효소 면역 측정법(EIA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법, 면역조직 화학적 염색법, 셀소팅(cell sorting)법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 및 금입자(gold particle) 착물법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 검체 시료 내의 베스핀 검출 방법.