JP2023504683A - 試料の標的分子集団に対するプロファイルを得る方法 - Google Patents

試料の標的分子集団に対するプロファイルを得る方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、アプタマーを用いて、未知の標的分子を含む試料の標的分子集団に対するプロファイルを得る方法を開示する。本発明の方法は、試料中の標的分子集団が未知の標的分子を含めてアプタマープロファイルとして提供されることができ、このようなアプタマープロファイルは、薬物処方の適合性の判断（例えば、抗がん剤同伴診断など）、疾患診断情報の提供、薬物治療のモニタリング、薬物コンプライアンスの判断、薬物処理に対するＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞反応の有無や程度、生物種の分類や同定など、ヒトに有用な情報を提供することに使用できる。【選択図】なし

Description

本発明は、試料の標的分子集団に対するプロファイルを得る方法に関する。
試料を構成するタンパク質などの生体分子の量的状態を総合化した全体的な情報であるプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を生産する技術は、物理学、生化学、生物情報学などの発達により多様に開発されてきたが、コスト、精度、敏感度、プロファイルの大きさなどにおいて依然として新しい技術の必要性が求められる。
核酸チップに対応する従来のタンパク質チップは、狭い面積のマイクロアレイに抗体を固定したものであり、その集積度に限界にあるため、２５，０００個以上の遺伝子の相対的発現レベルをプロファイリングすることができる核酸チップとは異なり、既知の（既に同定された）タンパク質に対して数百種の分子のプロファイリングを可能にするだけである。
特に、生体試料は、数百万個のタンパク質を含んでいるが、現在、既知の（同定された）タンパク質の数は数万個に過ぎないため、未知のタンパク質を含む試料の生体分子集団に対するプロファイリング技術は、その必要性が非常に高いと言える。
生体分子のプロファイルは、各種疾患の診断や薬物治療モニタリングなどに有用に使用できるが、そのプロファイルが含めているタンパク質情報が様々で大きいほど、そのプロファイルの有用性は高くなる。
本発明は、アプタマーを用いて、未知の標的分子を含んでいる試料の標的分子集団に対してプロファイリングする技術を開示する。
本発明の目的は、アプタマーを用いて、未知の標的分子を含んでいる試料の標的分子集団に対するプロファイルを得る方法を提供することにある。
本発明の他の目的や具体的な目的は、以下に提示されるであろう。
本発明の一態様によれば、試料の標的分子集団に対するプロファイルを生成する方法に関する。
本発明の方法は、（ａ）試料の標的分子集団に特異的であり、第１捕捉成分と結合することが可能な第１タグが付いたアプタマーライブラリーを、第１捕捉成分が接合された固体支持体に処理して、前記第１捕捉成分と前記第１タグとを結合させることにより、前記アプタマーライブラリーを第１固体支持体に固定する段階と、（ｂ）前記アプタマーライブラリーが固定された第１固体支持体に、前記試料と同類の分析対象試料を処理して、その分析対象試料中の標的分子集団の各標的分子と前記アプタマーライブラリーの各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的分子とアプタマーの複合体集団を得る段階と、（ｃ）未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階と、（ｄ）前記分離された複合体集団の各複合体の標的分子に、第２捕捉成分と結合することが可能な第２タグを付ける段階と、（ｅ）前記第２タグが付いた複合体の集団を、第２捕捉成分が接合された第２固体支持体に処理して、前記第２捕捉成分と前記第２タグとを結合させることにより、前記複合体集団を第２固体支持体に固定する段階と、（ｆ）前記第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態に分離する段階と、（ｇ）前記分離された、第１固体支持体に固定されているアプタマー集団からそのアプタマー集団の各アプタマーを定量してアプタマープロファイルを生成する段階と、を含む。
こうして得られるアプタマープロファイルは、試料の標的分子集団から分離されたアプタマー集団の各アプタマーの量（すなわち、アプタマー検出値からのアプタマーの定量結果）の全体的な（すなわち、集団的な）分布となるが、ここで、各アプタマーの量は、そのアプタマーが結合する試料中の標的分子の量に比例し、その標的分子の量を示すので、アプタマープロファイルは、試料の各標的分子の量の全体的な（集団的な）分布である標的分子集団に対するプロフィールとなる。
したがって、本発明の試料の標的分子集団に対するプロファイルを生成する方法は、実質的には試料の標的分子集団に対するアプタマープロファイルを得る方法であると理解されることもできる。このアプタマープロファイルは、前述したように、結局は試料の標的分子集団に対するプロファイルとなる。
本発明の方法は、ある特定の試料の標的分子集団、例えば、ヒト血漿の標的分子集団に対して特異的なアプタマーライブラリーを、その試料と同類の分析対象試料、例えば、ヒトの血漿試料に処理してその分析対象試料中の標的分子集団に対するアプタマープロファイルを生成することによる、その試料の標的分子集団に対するプロファイルを生成するための方法であって、このようなアプタマープロファイルやその標的分子集団に対するプロファイルは、薬物処方の適合性判断（例えば、抗がん剤同伴診断など）、疾患診断情報の提供、薬物治療のモニタリング、薬物コンプライアンスの判断、薬物処理に対するＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞反応の有無や程度、生物種の分類や同定など、ヒトに有用な情報を提供することに使用できる。
本発明において、標的分子とは、試料に存在する、検出しようとする任意の分子を意味する。代表的には、標的分子は、タンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、ウイルス、バクテリアなどの病原体、薬物、染料、細胞などであり得る。好ましくは、タンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質、ペプチド分子である。
本発明において、このような標的分子は、同定された既知の分子であるか、或いは同定されていない未知の分子であり得るが、本発明は、標的分子集団に対するプロファイルをアプタマープロファイルとして得るという点で、試料中に含まれた、検出しようとする標的分子が、同定された既知の分子であるか、同定されていない未知の分子であるかは重要ではない。本発明では、ある標的分子の検出結果（定量結果）は、その標的分子が同定された既知の分子であるか、同定されていない未知の分子であるかを問わず、いずれもアプタマー検出結果（すなわち、定量結果）として現れるためである。このようなアプタマー定量結果は、全体としてアプタマープロファイルを形成する。
また、本発明において、標的分子集団は、２種以上の互いに異なる分子の集合体を意味するが、後述するように、試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、ランダム配列を持つため、多様な標的分子に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを処理し、標的分子との複合体全体を分離し、その複合体の一本鎖核酸を増幅して得たものであるので、相当数の標的分子が集団的に検出されることができる。したがって、標的分子集団は、少なくとも５００種以上の標的分子からなる標的分子集団の意味で理解でき、好ましくは１０００種以上、より好ましくは１５００種以上、さらに好ましくは２０００種以上の標的分子からなる標的分子集団と理解できる。
また、本発明において、試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、その標的分子集団に特異的に結合することにより、標的分子を集団的に検出することができるアプタマーの集合体を意味する。したがって、標的分子集団のサイズが例えば１０００種の標的分子で構成されていれば、アプタマーライブラリーも少なくとも１０００種以上のアプタマーで構成されるであろう。ここで、「少なくとも１０００種以上のアプタマーで構成される」というのは、どんな特定の標的分子にアプタマーライブラリーを反応させれば、いずれか１種の特定のアプタマーのみが前記標的分子に特異的に結合するのではなく、エピトープを異ならせて２種以上の特定のアプタマーが前記標的分子に特異的に結合する場合もあるからである。一般には、アプタマーライブラリーは、これを構成するアプタマーの種類が、標的分子集団を構成する標的分子の種類よりも多いであろう。前記アプタマーライブラリーの各アプタマーは、必要に応じては次世代配列分析技術（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）、又は既存の公知のＢＡＣライブラリー構築を用いたクローニングによる配列決定方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００１ Ｍａｒ；１１（３）：４８３－４９６）を適用してその配列が予め決定されているアプタマーであってもよく、そのように配列が既に決定されたアプタマーライブラリーを使用することが好ましい場合がある。
本発明の方法において、前記（ａ）段階の試料の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、以下に概念的に叙述され、以下の実施例で実験的に開示されたアプタマーライブラリーの製造方法に従って得られるか、或いは従来の公知の方法によって得られることも可能である。
従来の公知の方法としては、名称が「次世代配列決定法を用いた標的タンパク質の集団的定量方法とその用途」である韓国公開特許第１０－２０１９－０１３５４５６号、又はその国際出願である国際公開ＷＯ２０１８／０８４５９４に開示された方法、また、名称が「未知の生体分子と一本鎖核酸の結合プロファイルを生成するための核酸チップ、核酸チップの製造方法、及び核酸チップを用いた未知の生体分子分析方法」である韓国特許第１０－０９２３０４８号に開示された方法が挙げられる。
前記韓国公開特許第１０－２０１９－０１３５４５６号などの文献に開示された方法は、（ｉ）互いに異なる様々な配列（すなわち、ランダム配列）を持つため、様々な標的分子に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを製作し、（ｉｉ）この一本鎖核酸ライブラリーを試料の標的分子集団と反応させ、各一本鎖核酸と各標的分子との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合した一本鎖核酸を除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団の一本鎖核酸を増幅して得られることができる。
このような試料の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーの製造方法において、標的分子集団が標的タンパク質集団である場合、タンパク質を固定することができるニトロセルロース膜ディスク（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｃ）に試料を処理して標的タンパク質を集団的に固定し、ここに一本鎖核酸ライブラリーを処理することにより行われることができる。
前記アプタマーライブラリーの製作過程において、前記（ｉ）段階の互いに異なる様々な配列を有する一本鎖核酸ライブラリーは、一般に、一本鎖のＲＮＡ又はＤＡＮオリゴヌクレオチド核酸プールを意味するが、このオリゴヌクレオチドは、一般に、既知の配列からなる５’末端保存領域と３’末端保存領域、及びそれらの間に位置し、ランダム配列からなる可変領域を含んで構成される。この既知の配列からなる保存領域には、順方向／逆方向プライマーが結合する配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、クローニングなどの操作のための制限酵素認識配列などが含まれることができる。前記ランダム配列からなる可変領域は、通常４０～６０個のヌクレオチドからなるため、５’末端領域と３’末端領域を含むオリゴヌクレオチド全体の長さは、通常６０～１５０個のヌクレオチドの長さとなる。このようなオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野における周知のものであり、そのような方法として、固相オリゴヌクレオチド合成技術、トリエステル合成方法などの溶液相合成技術などが挙げられる。具体的なものは、文献［Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １４：５３９９－５４６７，１９８６］、文献［Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２７：５５７５－５５７８．１９８６］、文献［Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ４：２５５７、１９７７］、文献［Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９，１９７８］などを参照することができる。また、市販の自動化された核酸合成装置を用いることもでき、このような装置を用いる場合、１０１４～１０１６個のオリゴヌクレオチドを含む、十分なサイズの一本鎖核酸ライブラリーを得ることができる。また、一本鎖核酸ライブラリーとして一本鎖ＲＮＡライブラリーを使用する場合、このようなＲＮＡライブラリーは、ＤＮＡライブラリーをＴ３、Ｔ４、Ｔ７などのＲＮＡポリメラーゼに転写させて得ることができる。
また、前記アプタマーライブラリーの製作において、前記（ｉｉｉ）段階の複合体集団の分離のために、前記非結合した一本鎖核酸の除去は、当技術分野における公知の適切な方法を適用することにより、例えば適切な洗浄バッファーで洗浄段階を１回以上行うことにより可能である。このように非結合一本鎖核酸を除去し、複合体集団を「選択」的に分離した後には、その複合体集団の一本鎖核酸のみを「増幅」させることにより、試料の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーを製作することができる。このような選択と増幅を１回だけ行って得られたアプタマーライブラリーを、本発明の方法の前記（ａ）段階にそのまま使用することができるが、前記選択と増幅過程を２回以上繰り返し行うことにより、すなわち、前記複合体集団の一本鎖核酸のみを増幅して得られたアプタマーライブラリーを、再び試料の標的分子集団と反応させて再び複合体集団を形成させ、複合体集団を分離し、その複合体のアプタマーのみを再び増幅させる過程を２回以上繰り返し行うことにより、分析対象試料の標的分子集団に対する特異的結合能力を高めたアプタマーライブラリーを使用することもできる。しかし、アプタマーライブラリーは、分析対象試料の標的分子を多様に反映することにより、より多様な標的分子を集団的に検出、分析することができることが、標的分子集団に対して得られるアプタマーライブラリーの有用性の観点から好ましいので、前記選択と増幅過程を繰り返し行う代わりに、１回の選択及び増幅過程でアプタマーライブラリーを製作するが、様々な洗浄バッファーを用いて洗浄段階を２回以上行うことにより、アプタマーライブラリーを製作することが好ましい場合がある。洗浄溶液は、当技術分野で広く用いられるものを購入して利用するか或いは適切に調製して使用することができるが、このような洗浄溶液には、一般に界面活性剤及び／又は塩（カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ））が含まれる。界面活性剤としては、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ３０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ９０８、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＰＥＧ ９００、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｅｔｈｅｒ Ｗ－１、Ｓｐａｎ２０、Ｓｐａｎ４０、Ｓｐａｎ８５、これらの混合物が使用でき、塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びアンモニウムの酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、塩化物塩、その混合物（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）が使用できる。特に、洗浄溶液は、ＴＢＳＴ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）、ＰＢＳＴ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ３０などを含むＳＳＰＥ溶液（０．２Ｍリン酸緩衝液、２．９８Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、ＳＢ１８溶液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）、ＳＢ１７溶液（１ｍＭ ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡが添加されたＳＢ１８溶液）、ＳＢ１７Ｔ溶液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）などを使用することができ、１～６００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液なども使用することができる。
前記非結合した一本鎖核酸を除外させるための洗浄段階を行う前に、前記一本鎖核酸が非標的分子と非特異的に結合することを防止して、その標的分子との特異的結合を向上させるために、前記（ｉｉ）段階の一本鎖核酸ライブラリーを試料の標的分子集団と反応させて複合体を形成するとき又は複合体集団を形成した後に、試料中の任意の分子と非特異的複合体を形成することが可能な任意の競合分子（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を添加することができる。このような競合分子が添加される場合、前記一本鎖核酸が非標的分子と非特異的に結合することが防止され、結果として、前記一本鎖核酸の標的分子との特異的結合（又は特異的結合力）が向上することができる。このような競合分子は、オリゴヌクレオチド、ヘパリン、ニシンの精子ＤＮＡ、一本鎖のサケ精子ＤＮＡなどの多重陰イオン分子、デキストラン硫酸などのポリデキストラン、非塩基性ホスホジエステルポリマー（ａｂａｓｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ｄＮＴＰｓ、ピロリン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などであってもよく、スペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、ポリアルギニン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ）などの多重陽イオン分子、アルギニン、リジンなどのアミノ酸などであってもよい。このような競合分子は、標的分子の予想濃度又は使用される一本鎖核酸の濃度を考慮して、これよりも高い濃度で使用されることが、一本鎖核酸の標的分子との特異的結合を向上させるのに有利であり得る。また、このような競合分子は、前記洗浄段階の際に洗浄バッファーに添加されて使用されることもできる。
本明細書において、他に定義しない限り、アプタマーは、特定の標的分子に特異的な結合力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する核酸リガンドを意味するものとして使用されるが、このようなアプタマーは、特定の標的分子に潜在的な結合能力を有する候補核酸から前述のように選択と増幅過程を経て得られる。ここで、アプタマーが、標的分子に特異的な結合力を有するというとき、その特異的結合力の意味は、標的分子とのみ特異的に結合して複合体を形成し、他の分子に対しては実質的にそのような複合体を形成しない場合を意味する。実質的に複合体を形成しなければよいので、洗浄などによって除去できる非特異的結合によって複合体が形成されることを排除する意味ではない。
また、本発明において、標的分子と特異的な結合力を有するアプタマーは、人為的に製作され、選択、増幅されることにより得られる非自然発生的核酸リガンドである。このようなアプタマーは、一般に、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡであり、標的分子との結合能力を有する限り、自然的ヌクレオチド（ｎａｔｕｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）だけでなく、修飾ヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むことができる。このような修飾ヌクレオチドは、その糖であるリボースやデオキシリボース、そのリン酸塩及び／又はその塩基で修飾されたものであり得る。そのような糖、リン酸塩及び／又は塩基で修飾されたヌクレオチドは、当技術分野におけるその製造方法を含めて具体的に広く知られている。例えば、糖で修飾されたヌクレオチドは、その糖の２’位がハロゲン基（特に、フッ素（Ｆ））、脂肪族基、エーテル基、アミン基で修飾されるか、或いは特にＯＭｅ、Ｏ－アルキル、Ｏ－アリル、Ｓ－アルキル、Ｓ－アリル又はハロゲンなどで修飾されたもの、糖であるリボース又はデオキシリボース自体がそれに代わることができる糖類似体α－アノマー糖（α－ａｎｏｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒｓ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅｓ）又はリキソース（ｌｙｘｏｓｅｓ）などのエピマー糖（ｅｐｉｍｅｒｉｃ ｓｕｇａｒｓ）、ピラノース糖（ｐｙｒａｎｏｓｅ ｓｕｇａｒｓ）、フラノース糖（ｆｕｒａｎｏｓｅ ｓｕｇｒａｓ）などで置換されたものが挙げられる。また、例えば、リン酸塩での修飾は、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（ｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（ａｍｉｄａｔｅ）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）で修飾されたものなどが挙げられる。ここで、前記Ｒ又はＲ’は、Ｈ又は置換もしくは無置換のアルキルなどであり、リン酸で修飾される場合、その連結基は－Ｏ－、－Ｎ－、－Ｓ－又は－Ｃ－となり、このような連結基を介して隣接ヌクレオチドが互いに結合する。修飾ヌクレオチド、その修飾ヌクレオチドを含む一本鎖核酸などに関しては、文献［Ｓｐｒｏａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：７３３－７３８（１９９１）］、文献［Ｃｏｔｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：２６２９－２６３５（１９９１）］、文献［Ｈｏｂｂｓ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８－５１４５（１９７３）］など、当該分野に相当な文献が広く知られており、より具体的なものは、これらの文献を参照することができる。これらの文献を含めて、本明細書で引用される文献はいずれも、本明細書の一部として見なされる。
また、本発明において、試料は、検出しようとする１つ以上又は相当数の標的分子を含んでいる、或いは含んでいると疑われて検出の必要性を有する任意の混合物又は溶液であり得る。試料は、ヒト又は動物から得られた生体試料だけでなく、そのような生体試料を加工して、検出しようとする標的分子の濃度を高めた加工試料であってもよく、さらには、標的分子が含まれている、或いは含まれていると考えられる、例えば水、食品、産業廃水など、環境汚染因子、毒性因子などの検査が必要な試料であってもよい。このような試料は、適正な希釈剤、緩衝溶液を含むことができ、細菌やウイルスの存否を検出しようとする場合には、培地又は培地成分が含まれている細菌培養物、細菌溶解物、ウイルス培養物であってもよい。
また、本発明の方法において、試料は、好ましくは、ヒト又は動物から得られた生体試料又はその加工試料であってもよい。生体試料は、血液、尿、唾液、精液、羊水、リンパ液、喀痰、組織など、検出しようとする標的分子を含んでいる、或いは含んでいると疑われて検出の必要性を有するヒト又は動物から得られたものであり得る。加工試料は、例えば、血漿、血清、生体試料にタンパク質抽出キットを適用してタンパク質の濃度を高めた試料、組織抽出物、組織から得られた細胞、細胞溶解物、細胞培養物などであってもよい。また、加工試料は、生体試料から、その生体試料中に多くの量で存在する、標的タンパク質としての有用性（例えば、特定の疾患に対するバイオマーカーとして使用される可能性など）に劣るタンパク質を除去した加工試料であってもよい。例えば、血液試料では、非常に少ない数の特定の幾つかのタンパク質がその試料中のタンパク質量の９９．９％を占めており、このように多くの量で存在するタンパク質は、通常、標的タンパク質としての有用性が低い（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔ（２００６）５（１０）：１７２７－１７４４）。生体試料中に多くの量で存在するタンパク質を除去した加工試料を使用する場合、有用性の高い標的タンパク質の検出敏感性を向上させることができる。このように多くの量で存在するタンパク質としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物の血液試料の場合、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、フィブリノーゲンなどが挙げられる。これらの多くの量で存在するタンパク質は、当技術分野における公知の適切な方法（例えば、免疫親和性除去方法（ｉｍｍｕｎｏ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ））、或いは市販の適切なキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍなど）を用いて除去できる。
本発明において、前記（ｂ）段階の分析対象試料が前記（ａ）段階の試料と「同類」であるというのは、前記（ｂ）段階の分析対象試料が任意の特定のヒトに由来する試料、例えば、血清であるとき、前記（ａ）段階の試料は、同じ起源（前記ヒトと同じ個体）又は他の起源（前記ヒトとは異なる個体）に由来する試料、例えば血清を意味する。また、例えば、同類の試料とは、前記（ａ）段階のある試料が特定の菌株に属する大腸菌溶解物であるとき、前記（ｂ）段階の分析対象試料は、そのような菌株に属する大腸菌溶解物であるか、或いは他の菌株に属する大腸菌溶解物であり得る。通常、本発明の方法では、前記（ａ）段階の試料の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、既に準備された（すなわち、製作され、必要に応じてその配列が明らかになった）状態で本発明の方法に使用される。
また、本発明において、前記（ｃ）段階の未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階は、使用された第１固体支持体の性質に応じて、当技術分野における公知の任意の方法を介して行われることができる。例えば、第１固体支持体が磁性ビーズである場合、磁石を用いて、複合体集団が固定された第１固体支持体を収去し、残りの未結合標的分子を除去するか、或いは遠心分離して未結合標的分子を含む上層部分を除去し、沈殿した下層部分を回収することにより行われることができる。
本発明において、捕捉成分は、タグと共有的又は非共有的に結合することができる任意の分子である。捕捉成分は、タグが結合されている一本鎖核酸又はアプタマーを固体支持体に固定する機能を行う。このような捕捉成分は、タグがビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）又はビオチン類似体である場合、ストレプトアビジン（ｓｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）又はその類似体であり得る。ビオチン類似体としては、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）などが例示され、ストレプトアビジンの類似体としては、アビジン、Ｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ、ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、米国）などが例示されることができる。
タグと捕捉成分とは特異的に相互結合するので、これらが相互交換的に使用できる。例えば、ストレプトアビジン又はその類似体がタグとして使用され、ビオチン又はその類似体が捕捉成分として使用されることもできる。
タグを一本鎖核酸又はアプタマーに共有的又は非共有的に結合するが、タグを一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ核酸又はアプタマーに結合させる方法に関しては、当業分野に様々な方法が広く知られており、相当な文献（文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８７ Ｊｕｎ １１；１５（１１）：４５１３－４５３４］、文献［ＲＮＡ ２０１４ Ｍａｒ；２０（３）：４２１－４２７］、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００９；４９８：１８５－１９６］など）が蓄積されており、様々なキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、ＡＰＥＸＢＩＯ社製）などが市販されている。
特に、本発明において、標的分子がタンパク質であり、第２タグがビオチンである場合、第２タグの付着は、タンパク質、特に、タンパク質のリジン残基にビオチンを共有的に結合させることができるＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンを用いて行われることができる。
本発明の方法において、固体支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、捕捉分子が共有結合又は非共有結合を介して直接的に（捕捉成分が直接固体支持体に結合）又は間接的に（捕捉成分が他の成分を媒介として固体支持体に結合）結合されることができる表面を有する任意の不溶性支持体をいう。
固体支持体は、ガラス、シリコーン、合成樹脂（例えば、ポリカルボン酸塩、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４－メチルブテン）（ｐｏｌｙ（４―ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｅｎｅ）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン）、グラファイト（ｇｒａｐｈｉｔｅ）、アガロース、ゲルマニウム、金、銀などの材料からなることができる。
固体支持体は、ストリップ（ｓｔｒｉｐ）、基板（ｐｌａｔｅ）、円盤（ｄｉｓｋ）、ロッド（ｒｏｄ）、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド材質の膜）、粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ビーズ（ｂｅａｄ）、チューブ（ｔｕｂｅ）、ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）、ウェーハ（ｗａｆｅｒ）などの形態で製作できる。
固体支持体は、多孔性（ｐｏｒｏｕｓ）、非多孔性（ｎｏｎ－ｐｏｒｕｓ）、磁性（ｍａｇｎｅｔｉｃ）、常磁性（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）、非磁性（ｎｏｎｍａｇｎｅｔｉｃ）、多分散性（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）、単分散性（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）などの特性を有することができる。
固体支持体は、タンパク質、核酸などの生体分子又は捕捉分子などとの結合ができるようにカルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、シロキサン基などの官能基が導入されたものであり得る。このような官能基の導入方法は、当技術分野における公知の方法であり、例えば、米国特許第６，０２７，９４５号、米国特許第６，６７３，６３１号、米国特許第７，１８３，００２号、日本特許第３，２５３，６３８号、日本公開特許第２００１－１３６９７０号、韓国公開特許第２００９－００８８２９９号などを参照することができる。
本発明において、固体支持体、特に第１固体支持体は、好ましくは、磁石による容易な分離が可能な磁性粒子（又は磁性ビーズ）であり得る。磁性粒子は、米国特許第５，６６５，５５４号、米国特許第６，０２７，９４５号、米国特許第７，０７８，２２４号、韓国公開特許第２００６－００６１４９４号、韓国登録特許第０５４１２８２号などに開示されているように、当業分野においてタンパク質、核酸、細胞、細菌などの分離に広く用いられてきた素材であり、ミクロン乃至ナノ単位のサイズ（数ミクロンのサイズ、数十乃至数百ナノサイズ）を有する。バイオ物質の分離に代表的に使用されてきた磁性粒子は、酸化鉄磁性粒子であり、そのような酸化鉄磁性粒子として、マグネタイト（ｍａｇｎｅｔｉｔｅ、Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（ｍａｇｈｅｍｉｔｅ、Ｆｅ２Ｏ３）、ヘマタイト（ｍｅｍａｔｉｔｅ、Ｆｅ２Ｏ３）などが使用されてきた。磁性粒子は、タンパク質、核酸などの生体分子の分離に使用されるためには、磁性粒子間の相互作用と凝集を防止することができるようにシリカ、高分子、金、銀の非磁性物質で改質され、生体分子などとの結合が可能なカルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、シロキサン基などの官能基が導入されている。市中には、このような官能基を介して既にビオチンやストレプトアビジンなどが導入されたものが市販されている。
本発明において、タグとしてビオチンを用いた場合、ストレプトアビジンが導入された磁性粒子などの固体支持体を、市販のものの中から適切なものを選択・購入して使用することが好ましい。そのような固体支持体としては、例えば、ダイナビーズＭ－２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ダイナビーズマイワンストレプトアビジン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ダイナビーズＭ－２７０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトアビジンアガロースレジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ；Ｐｉｅｒｃｅ）、ストレプトアビジンウルトラリンクレジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ）、マグナビンドストレプトアビジンビーズ（ＭａｇｎａＢｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｅａｄｓ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、バイオマグストレプトアビジン（ＢｉｏＭａｇ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、プロマグストレプトアビジン（ＰｒｏＭａｇ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、シリカストレプトアビジン（Ｓｉｌｉｃａ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ストレプトアビジンポリスチレンマイクロスフェア（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ－Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ストレプトアビジンコーティングされたポリスチレン粒子（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）などが挙げられる。
本発明において、第２固体支持体は、第１固体支持体とは異なる特性を有するものを使用することが好ましい。これは、本発明が、前記（ｃ）段階の複合体集団又は（ｇ）段階でアプタマー集団を第１固体支持体に固定された状態で分離するが、この場合、第２固体支持体が第１固体支持体とは異なる特性を有すれば、複合体集団又はアプタマー集団が固定されている第１固体支持体の分離が容易だからである。したがって、第１固体支持体が磁性支持体である場合、第２固体支持体は非磁性支持体であり得る。
本発明において、前記（ｂ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を形成させるとき、前述した競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることができる。このような競合分子は、複合体を形成させた後、前記（ｃ）段階で前述したような洗浄バッファーを処理することによる未結合標的分子の除去前に添加されることもでき、また、（ｃ）段階で前述したような洗浄バッファーを処理することによる未結合標的分子を除去するとき、その洗浄バッファーに添加されて使用されることもできる。また、競合分子は、前記（ｅ）段階の第２固体支持体に固定した後、未反応成分（例えば、標的分子が付着していない未反応第２タグ、標的分子と結合していない第１固体支持体に固定されたアプタマーなど）を除去するために、その第２固体支持体に固定された複合体集団に前述の洗浄バッファーを処理してその複合体集団を洗浄するとき、その洗浄バッファーの処理前にその複合体集団に添加されるか、或いはその洗浄バッファーと共に添加されることができる（すなわち、洗浄バッファーに添加されて処理されることができる）。このような競合分子の処理は、アプタマーと非標的分子との非特異的結合を防止し、アプタマーと標的分子との特異的結合を高める効果をもたらすことができる。
本発明において、前記（ｆ）段階の第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階は、第２固体支持体－標的分子－アプタマー－第１固体支持体の配向に結合されている複合体集団から、標的分子とアプタマーとの非共有結合を破壊してアプタマーを第１固体支持体に結合された状態で分離する段階であるが、このような段階は、標的分子とアプタマーとの非共有結合を破壊することが可能な当技術分野における公知の任意の方法を用いて行われることができる。そのような方法で加熱（ｈｅａｔｉｎｇ）、前記洗浄に関連して前述したカオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）の処理、ｐＨの強酸性又は強塩基性への変化の誘導、前記洗浄に関連して前述した界面活性剤の処理、これらの複合処理などが挙げられる。
本発明において、アプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離した後には、前記（ｇ）段階でそのアプタマー集団からアプタマープロファイルを生成するが、これは、アプタマー集団の各アプタマーを定量し、総合することにより可能である。
このようなアプタマーの定量方法も、当業分野における公知のものであるが、そのような方法として、例えば、次世代配列分析技術（Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を用いた方法、マイクロアレイを用いた方法、多重リアルタイムＰＣＲ法（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）などが挙げられる。
ＮＧＳ方法を適用してアプタマーを定量する場合、Ｒｏｃｈｅ社の４５４プラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑプラットフォーム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＩｏｎ ＰＧＭプラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社のＰａｃＢｉｏプラットフォームなどを用いることができ、当該機器のプロトコルに従ってアプタマーの定量結果を得ることができる。このＮＧＳ技術は、ゲノムＤＮＡを断片化して得たＤＮＡライブラリーを基板又はエマルジョン（ビーズ）上でそれぞれの断片に空間的に分離し、ＰＣＲで増幅して各断片のクローンを形成した後、数十万個乃至数十億個のクローンに対して大量並列方式で同時に配列決定反応を行うことにより、各クローンの配列を同時に読み取る方式である。この配列決定反応は、各クローンの単一ＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）にモノヌクレオチドを一つずつ付して、そのときに出てくるシグナルを物理化学的に検出する。各断片に対して得られた配列情報であるリード（Ｒｅａｄ）は、既に分析されて得られた参照配列（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｃｅ）と比較され、生物情報学的手法で計数されて定量化されることができる。
マイクロアレイを用いた方法は、アプタマーに相補的なプローブを支持体上に１つ以上のスポット（ｓｐｏｔ）に固定し、ここにアプタマーを処理してハイブリダイゼーションを誘導し、そのハイブリダイゼーション程度を信号発生物質を用いて検出する方法である。
使用できる支持体は、ガラス、シリコーン、合成樹脂などの材料からなることができ、その形態は、スライド、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの平面基板の形態、又は繊維束体の断面形態、ビーズ、粒子の形態であり得る。
信号発生物質は、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、酵素などであり得るが、例えば、シアニン蛍光染料（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、４３０など）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ＳＹＴＯ（ＳＹＴＯ－１１など）、エチジウムブロミド、エチジウムホモダイマー－１、エチジウムホモダイマー－２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム－アクリジンヘテロダイマー、エチジウムモノアジド、プロピジウムヨージド、７－アミノアクチノマイシンＤ、ＰＯＰＯ－１、ＴＯＴＯ－３などであり得る。これらの信号発生物質は、アプタマーの製造時に標識化されて使用されるか、或いはインターカレーターの場合にハイブリダイゼーションの後に添加されて使用されることができる。アプタマー製造の際に、標識化方法は、当技術分野における公知のものであり、例えば、文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌａｔｅｓｔ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｓｈｕｊｕｎｓｈａ，Ｊａｐａｎ）に記載された方法などを参照することができる。
ハイブリダイゼーション程度の検出は、蛍光イメージスキャナなど、バイオチップの画像イメージスキャナで検出し、画像イメージのシグナルを統計的・数値的に処理することが可能なソフトウェアを介してハイブリダイゼーション程度を定量的に算出することができる。
多重リアルタイムＰＣＲ法は、ＤＮＡ合成酵素の５’－３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性を用いて、増幅しようとする複数の鋳型配列（ここでは、アプタマー）を合成しながら、各鋳型配列に相補的に結合されているプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を分解するときに、各鋳型に応じて発生する互いに異なる信号を同時に検出するか、或いは複製過程中に互いに異なる信号を出す挿入性蛍光物質を用いて、各鋳型に応じて発生する互いに異なる信号を同時に検出する方法である。複製の程度に応じてシグナルが増加し、ＰＣＲ産物である複製物の量は、アプタマーの開始濃度だけでなく、行われた複製サイクルの数に左右される。
前記多重リアルタイムＰＣＲ法には、ＤＮＡを鋳型として用いる多重リアルタイムＰＣＲ法の他に、最初の鋳型としてＲＮＡを用いる多重リアルタイム逆転写ＰＣＲ法（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ）も含まれる。
他の態様において、本発明は、２つ以上の分析対象試料の区分方法に関する。
本発明の方法は、（ａ）試料の標的分子集団に特異的であり、第１捕捉成分と結合することが可能な第１タグが付いたアプタマーライブラリーを、第１捕捉成分が接合された固体支持体に処理して、前記第１捕捉成分と前記第１タグとを結合させることにより、アプタマーライブラリーを第１固体支持体に固定する段階と、（ｂ）前記アプタマーライブラリーが固定された第１固体支持体に、前記試料と同類の分析対象試料を処理して、その分析対象試料中の標的分子集団の各標的分子と前記アプタマーライブラリーの各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的分子とアプタマーの複合体集団を得る段階と、（ｃ）未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階と、（ｄ）前記分離された複合体集団の各複合体の標的分子に、第２捕捉成分と結合することが可能な第２タグを付ける段階と、（ｅ）前記第２タグが付いた複合体の集団を、第２捕捉成分が接合された第２固体支持体に処理して、前記第２捕捉成分と前記第２タグとを結合させることにより、前記複合体集団を第２固体支持体に固定する段階と、（ｆ）前記第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階と、（ｇ）前記分離された第１固体支持体に固定されているアプタマー集団からそのアプタマー集団の各アプタマーを定量してアプタマープロファイルを生成する段階と、（ｈ）前記（ａ）～（ｇ）段階を、前記分析対象試料とは異なる１種以上の分析対象試料に対して同一に行うことにより、その１種以上の他の分析対象試料の標的分子集団に対するアプタマープロファイルを生成する段階と、（ｉ）前記（ｇ）段階によって生成したアプタマープロファイルと前記（ｈ）段階によって生成したアプタマープロファイルとを比較して、アプタマー定量結果に差異がある１つ以上のアプタマーを決定することにより、前記２種以上の分析対象試料を区分する段階と、を含む。
本発明の方法は、前記（ｈ）段階で１種の他の分析対象試料に対してアプタマープロファイルを生成し、そのアプタマープロファイルを、前記（ｇ）段階によって得られたアプタマープロファイルと比較して、２種の試料の区分に使用されるか、或いは前記（ｈ）段階で２種の他の分析対象試料に対してアプタマープロファイルを生成し、その２種のアプタマープロファイルを前記（ｇ）段階によって得られたアプタマープロファイルと比較して、合計３種の試料の区分に使用されることができる。このような方式で、本発明の方法は、２種以上の試料の区分に使用できる。
特に、本発明の方法は、前記（ｈ）段階で２種以上の他の分析対象試料に対して各アプタマープロファイルを生成した後、その生成された各アプタマープロファイルを平均化させた平均化アプタマープロファイルを生成する段階が追加でき、この場合、前記（ｉ）段階は、この平均化アプタマープロファイルと、前記（ｇ）段階によって得られたアプタマープロファイルとを比較して試料の区分に用いられることができる。
平均化アプタマープロファイル（ｔｒａｉｎｅｄ ａｐｔａｍｅｒ ｐｒｏｆｉｌｅ）は、前記２種以上のアプタマープロファイルにおける各同一アプタマー（例えば、Ａ試料のアプタマープロファイルにおけるａ’アプタマーと、Ｂ試料のアプタマープロファイルにおける同じａ’アプタマー）の定量結果を平均値として算出し、その各同一アプタマー平均値の全体分布から導出することにより得られる。
平均化アプタマープロファイルは、２種であり得るが、例えば、疾患者の２種以上のアプタマープロファイルから得られた１種と、健常人の２種以上のアプタマープロファイルから得られたもう１種であり得る。
もし１種の平均化アプタマープロファイルが疾患者の数百種の試料、数千種の試料に対して得られたものであり、もう１種の平均化アプタマープロファイルが健常人の数百種の試料、数千種の試料に対して得られたものである場合、被検者の分析対象試料に対するアプタマープロファイルを、前記２種の平均化アプタマープロファイルと比較して、その被検者を疾患者又は健常者に分類するときにその正確性が高まることができる。
本発明の方法において、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーは、２種以上の分析対象試料に対して同一のアプタマーライブラリーが使用されることが好ましい。ここで、同じアプタマーライブラリーとは、同じアプタマーの組成を有するアプタマーライブラリーをいう。同じアプタマーライブラリーが使用されるとき、各標的タンパク質に対するアプタマーが同一であるため（すなわち、同一配列を有するアプタマーであるため）、標的タンパク質とそれに対するアプタマーとの間に結合力が同一であって結合力による定量結果の差が発生しないので、結局、こうして得られた定量結果は、２種以上の試料の区分においてより有用に使用できる。
また、本発明の方法において、本発明は、前記（ｉ）段階で得られた定量結果に差異があるものと決定された１つ以上のアプタマーを用いて、そのアプタマーが特異的に結合する標的分子を分離し、当業分野における公知の方法（例えば、標的分子がタンパク質である場合、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦなどの方法）を用いてその標的分子を同定する段階を、前記（ｉ）段階の後にさらに含むことができる。このような標的分子の同定は、有用な疾患特異的バイオマーカーの候補などを提供することができるという効果を持つ。
また、本発明において、前記（ｉ）段階で得られた定量結果に差異があるものと「既に」決定された１つ以上のアプタマーを、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーの代わりに用いて、前記（ａ）段階乃至前記（ｉ）段階をさらに行う段階を含むことができる。この場合、前記１つ以上のアプタマーは、前記２種以上の分析対象試料の間で既に定量結果に差異があるものと確認されたアプタマーであるため、２種以上の分析対象試料の区分をより容易に行うことができるという効果を持つ。前記１つ以上のアプタマーは、これを用いて前記（ａ）段階乃至前記（ｉ）段階を行う前に、既にその配列が決定され、製造されて準備された状態であり得る。
本発明の方法において、前記標的分子は、好ましくはタンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質又はペプチドである。
また、本発明の方法において、前記標的分子集団は、未知の標的分子を含むことができる。
また、本発明の方法において、前記試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、好ましくは、（ｉ）互いに異なる多様なランダム配列を持つため、様々な標的分子に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを製作し、（ｉｉ）この一本鎖核酸ライブラリーを試料の標的分子集団と反応させて各一本鎖核酸と各標的分子との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合した一本鎖核酸を除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団の一本鎖核酸を増幅して得られたものであり得る。この場合、前記（ｉ）段階乃至前記（ｉｖ）段階は、１回行われ、前記非結合した一本鎖核酸を除外させることは、洗浄段階を介して行われ、また、前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理することにより行われることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記アプタマーは、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡは、糖、リン酸塩又は塩基で修飾されたヌクレオチドを含むものであり得る。
また、本発明の方法において、前記試料は、血液などの生体試料、又はその加工試料である血漿、血清などであることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記第１タグと前記第２タグは、ビオチン又はその類似体であり、前記第１捕捉成分と前記第２捕捉成分は、ストレプトアビジン又はその類似体であることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記第１固体支持体は磁性ビーズであり、前記第２固体支持体は非磁性支持体であることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記（ｂ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を形成させるときに、競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記（ｆ）段階の第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階は、加熱、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）の処理、ｐＨの強酸性又は強塩基性への変化の誘導、界面活性剤の処理、又はこれらの複合処理によって行われることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記（ｇ）段階のアプタマーの定量は、次世代配列分析技術、マイクロアレイ法、又は多重リアルタイムＰＣＲ法によって行われることが好ましい。
その他、本発明の試料区分方法について具体的に説明されていない技術的事項については、前記本発明の試料の標的分子集団に対するプロファイルを生成する方法について説明したところがそのまま有効であり、その該当部分を参照することができる。
別の態様において、試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーの製造方法に関する。
本発明のアプタマーライブラリーの製造方法は、（ａ）第１捕捉成分と結合することが可能な第１タグが付いた、ランダム配列を持つため様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを製造する段階と、（ｂ）第１捕捉成分が接合された第１固体支持体に、第１タグが付いた一本鎖核酸ライブラリーを処理して、前記第１捕捉成分と前記第１タグとを結合させることにより、一本鎖核酸ライブラリーを第１固体支持体に固定する段階と、（ｃ）前記一本鎖核酸ライブラリーが固定された第１固体支持体に試料を処理して、試料中の標的分子集団の各標的分子と前記一本鎖核酸ライブラリーの各一本鎖核酸との反応によって標的分子と一本鎖核酸との複合体集団を得る段階と、（ｄ）未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階と、（ｅ）前記分離された複合体集団の各複合体の標的分子に、第２捕捉成分と結合することが可能な第２タグを付ける段階と、（ｆ）前記第２タグが付いた複合体の集団を、第２捕捉成分が接合された第２固体支持体に処理して、前記第２捕捉成分と前記第２タグとを結合させることにより、前記複合体集団を第２固体支持体に固定する段階と、（ｇ）前記第２固体支持体に固定された複合体集団から、標的分子と結合されている一本鎖核酸集団を、第１固体支持体に固定された形態で溶出させる段階と、（ｈ）前記第１固体支持体に固定されている一本鎖核酸集団から、試料中の標的分子集団に特異的な一本鎖核酸集団であるアプタマーライブラリーを製造する段階と、を含む。
また、本発明の試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリー製造方法において、そのライブラリーを構成する各アプタマー配列決定は、ＢＡＣライブラリー構築を用いたクローニングによる配列決定方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００１ Ｍａｒ．１１（３）：４８３－４９６）を適用するか、或いは次世代配列分析技術（Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの当技術分野における公知の方法によって行われることができる。
また、本発明の方法において、前記（ｈ）段階の後に、前記アプタマーライブラリーの各アプタマーの配列を決定する段階をさらに含むことが好ましい。
本発明の方法において、前記標的分子は、タンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質又はペプチドであることが好ましい。
本発明の方法において、前記標的分子集団は、未知の標的分子を含むことが好ましい。
本発明の方法において、前記（ａ）段階の一本鎖核酸ライブラリーは、５’保存領域と３’保存領域を有し、それらの間にランダム配列を有することが好ましい。
本発明の方法において、前記（ａ）段階乃至前記（ｈ）段階は、１回行われ、前記（ｄ）段階の未結合標的分子の除去は、前記（ｃ）段階で形成された複合体集団を洗浄する段階によって行われ、前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理することにより行われることが好ましい。
本発明の方法において、前記（ａ）段階乃至前記（ｈ）段階は、１回行われ、前記（ｆ）段階の後に、第２固体支持体に固定した前記複合体集団を洗浄する段階を介して行われ、前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子、又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理することにより行われることが好ましい。このような洗浄段階は、標的分子と一本鎖核酸との非特異的結合による複合体を除去して、標的分子と一本鎖核酸との特異的結合による複合体のみが分離されるようにするためのものである。
また、本発明の方法において、前記アプタマーは、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡは、糖、リン酸塩又は塩基で修飾されたヌクレオチドを含むことが好ましい。
また、本発明の方法において、前記試料は、生体試料又はその加工試料であることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記第１タグと前記第２タグは、ビオチン又はその類似体であり、前記第１捕捉成分と前記第２捕捉成分は、ストレプトアビジン又はその類似体であることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記第１固体支持体は磁性ビーズであり、前記第２固体支持体は非磁性支持体であることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記（ｃ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を得る際に、競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記（ｃ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を得る際に、競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることが好ましい。
また、本発明の方法において、前記（ｇ）段階の第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階は、加熱、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）の処理、ｐＨの強酸性又は強塩基性への変化の誘導、界面活性剤の処理、又はこれらの複合処理によって行われることが好ましい。
その他、本発明の試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーの製造方法について具体的に説明されていない技術的事項については、前記本発明の試料の標的分子集団に対するプロファイルを生成する方法、又は前記本発明の２種以上の試料の区分方法について説明したところがそのまま有効であり、その該当部分を参照することができる。
前述したように、本発明によれば、アプタマーを用いて、未知の標的分子を含む試料の標的分子集団に対するプロファイルを得る方法を提供することができる。本発明の方法は、試料中の標的分子集団が未知の標的分子を含めてアプタマープロファイルとして提供されることができ、このようなアプタマープロファイルは、薬物処方の適合性の判断（例えば、抗がん剤同伴診断など）、疾患診断情報の提供、薬物治療のモニタリング、薬物コンプライアンスの判断、薬物処理に対するＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞反応の有無や程度、生物種の分類や同定など、ヒトに有用な情報を提供するために使用できる。
図１は、健常者の血清のタンパク質分子集団に特異的なＲＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図２は、健常者の血清のタンパク質分子集団に特異的なＲＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図３は、健常者の血清のタンパク質分子集団に特異的なＲＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図４は、健常者の血清のタンパク質分子集団に特異的なＲＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図５は、健常者の血清のタンパク質分子集団に特異的なＲＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。
図６は、血清のタンパク質分子集団に特異的なＤＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図７は、血清のタンパク質分子集団に特異的なＤＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図８は、血清のタンパク質分子集団に特異的なＤＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図９は、血清のタンパク質分子集団に特異的なＤＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。 図１０は、血清のタンパク質分子集団に特異的なＤＮＡアプタマーを用いて、肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料中のタンパク質分子集団に対して取得したアプタマーライブラリー、及びこのアプタマーライブラリーを介して前記２種の試料が区分されることを示す結果である。
以下、本発明について実施例を参照して説明する。ところが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞試薬とランダム二本鎖核酸ライブラリーの製造
＜実施例１－１＞試薬
ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２及びＴｗｅｅｎ－２０は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。デキストラン硫酸ナトリウム塩（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＤｘＳＯ４））をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。ＫＯＤポリメラーゼ（ＫＯＤ ｅｘｏ（－）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、Ａｖａｎｔｏｒ社のＶＷＲから購入した。
塩化テトラメチルアンモニウム（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びＣＡＰＳＯ（３－（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１－ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＳＡＰＥ）は、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．社から購入した。４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩及び４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）は、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎでコーティングされた９６ウェルプレート（ピアスストレプトアビジンコーティングプレートＨＢＣ、透明９６ウェル、製品番号１５５００又は１５５０１）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ、製品番号２１３２９）から購入し、無水ＤＭＳＯに溶解させた後、１回用分取量で凍結保管した。酵母ｔＲＮＡ（ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。
ＰＣＲグレードの天然、非天然ヌクレオチドは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
ランダムオリゴヌクレオチド、順方向プライマー、逆方向プライマー、ビオチン結合順方向プライマーは、注文合成した（韓国、バアオニア）。
緩衝液ＳＢ１８は、ＮａＯＨで４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０で構成され、緩衝液ＳＢ１７は、１ｍＭ ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ＥＤ８が添加されたＳＢ１８である。緩衝液ＳＢ１７Ｔは、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で構成される。
緩衝液ＰＢ１は、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整された１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｔｒｉｓｏｉｄｕｍ ＥＤＴＡ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０で構成される。
ＣＡＰＳＯ溶出緩衝液は、１００ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ７．５及び１Ｍ ＮａＣｌから構成される。中和緩衝液は、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＨＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０で構成される。
試料は、ソウル峨山病院（ＩＲＢ承認番号：２０１５－０６０７）で収集した血清を使用した。
＜実施例１－２＞ランダム二本鎖核酸ライブラリーの製造
試料中の標的タンパク質分子集団に特異的に結合するＲＮＡアプタマーライブラリーの製造のために、まず、下記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ランダム一本鎖核酸）を注文製造した（韓国、バイオニア）。
＜一般式Ｉ＞
５’－ＣＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＮ４０ ＧＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧ－３’
前記＜一般式Ｉ＞構造のオリゴヌクレオチドは、５’保存領域－可変領域－３’保存領域で構成されている。
上記における下線付きの塩基配列は、既知の配列からなる固定部位である保存領域であり、可変領域である４０個のヌクレオチドからなるＮ４０は、各位置にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃなどの塩基が同じ頻度で存在する。
前記＜一般式Ｉ＞のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲ法を行うことにより、二本鎖ＤＮＡライブラリーを製造した。このとき、使用されるプライマーは、Ｔ７プロモーター配列が含まれている下記のＤＳ順方向プライマー（配列番号２）とＤＳ逆方向プライマー（配列番号３）である。
＜ＤＳ順方向プライマー＞
５’－ＣＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣ－３’（配列番号１）
＜Ｔ７プロモーター配列が含まれているＤＳ順方向プライマー＞
５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣ－３’（配列番号２）
＜ＤＳ逆方向プライマー＞
５’－ＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣ－３’（配列番号３）
前記Ｔ７プロモーター配列が含まれているＤＳ順方向プライマー（配列番号２）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’保存領域（下線付きの配列）に対するプライマー配列に加えて、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのためのＴ７プロモーター配列（配列番号２における下線付きの部分）を含んでいる。前記ＤＳ逆方向プライマー（配列番号３）は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’保存領域（下線付きの配列）に対するプライマー配列である。
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の実行は、前記＜一般式Ｉ＞構造の一本鎖核酸オリゴヌクレオチドを鋳型として前記順方向プライマー（配列番号２）及び前記逆方向プライマー（配列番号３）を用いて行われた。
具体的には、１，０００ｐｍｏｌの一本鎖核酸オリゴヌクレオチド、２，５００ｐｍｏｌプライマー対（Ｔ７プロモーター配列が含まれているＤＳ順方向プライマー、ＤＳ逆方向プライマー）を５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及び０．１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆ．）を混合してＰＣＲを行った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ－ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ Ｃａｌｉｆ．）で精製した。こうして、Ｔ７プロモーターのある二本鎖核酸ＤＮＡを製造した。このＰＣＲ産物は、Ｔ７プロモータ（下線付きの配列）を含む二本鎖ＤＮＡであり、その一般構造式は、下記＜一般式ＩＩ＞で表現できる。
＜一般式Ｉ＞
５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＮ４０ＧＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧ－３’
＜実施例２＞一本鎖核酸ＲＮＡライブラリーの製造
本実施例では、試料中のタンパク質分子集団と反応させるＲＮＡ一本鎖核酸ライブラリーを製造した。このＲＮＡ一本鎖核酸ライブラリーは、修飾ヌクレオチドである２’－Ｆ－置換ピリミジンを含む一本鎖ＲＮＡライブラリー（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ、ＳＳＮ ｌｉｂｒａｒｙ）であり、＜実施例１＞で製造された＜一般式Ｉ＞構造のＰＣＲ産物を用いて、２’－Ｆ－置換ピリミジンを含むＲＮＡ一本鎖核酸をＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、ＵＳＡ）で生体外転写を行うことにより合成し、精製して製造した。
具体的には、２００ｐｍｏｌｅｓの前記製造された＜一般式Ｉ＞の二本鎖ＤＮＡ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、４％ ＰＥＧ ８０００、５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、並びに１ｍＭ（ＡＴＰ、ＧＴＰ）及び３ｍＭ（２’Ｆ－ＣＴＰ、２’Ｆ－ＵＴＰ）を混合して３７℃で６～１２時間反応させた後、Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ６クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆ．）で精製した後、ＵＶスペクトロメーターを用いて、精製された核酸の量及びその純度を分析した。
＜実施例３＞試料のタンパク質分子集団に特異的に結合するＲＮＡアプタマーライブラリーの製造と試料区分への適用
＜実施例３－１＞ＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーの製造
（１）第１タグが付加されたＳＳＮライブラリーの製造
まず、氷に、３０％ＰＥＧとＤＭＳＯを除いたすべての下記表１の試薬と酵素を解凍した。室温でＤＭＳＯを解凍し、３０％ＰＥＧを３７℃で５～１０分間加熱することにより、液体になるまで加温した。
５μＬのＳＳＮライブラリーをマイクロ遠心分離管に移した。ＳＳＮが線形の一次構造となるように８５℃で３～５分間ＳＳＮライブラリーを加熱した後、氷に直ちにＳＳＮライブラリーを置いた。
次に、下記表１に列挙した順序で試薬及び酵素を添加して、ＳＳＮライブラリーに対するビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）標識反応溶液を準備した。
ＳＳＮライブラリーへの第１タグ付加反応
Figure 2023504683000001
前記反応溶液において、３０％ＰＥＧは、追加された最後の試薬である。慎重に反応混合物に３０％ＰＥＧをピペットで追加した後、新しいピペットチップを用いて混合し、１６℃で２時間反応させてビオチンのＳＳＮへの付加（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を行った。
次に、７０μＬのヌクレアーゼフリー水（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）を前記反応溶液に添加し、ここに、ＲＮＡリガーゼを抽出するために１００μＬのクロロホルム：イソアミルアルコールを添加した。反応混合物を軽く混合した後、マイクロ遠心分離機で高速にて２～３分間遠心分離して相を分離した。慎重にビオチン付加ＳＳＮが含まれている上部水溶液層を取り、新しいチューブに移した。
このようにして、ＳＳＮライブラリーのＳＳＮ ３’末端に第１タグであるビオチンが付加された形態のＢｉｏ－ＳＳＮライブラリーを製造した。
製造したＢｉｏ－ＳＳＮライブラリーのストック濃度は、４ｎＭであった。Ｂｉｏ－ＳＳＮライブラリーストックミックスをＳＢ１７緩衝液で４倍希釈し、９５℃で５分間加熱した後、使用前に１５分間３７℃に冷却した。第１固体支持体であるストレプトアビジン結合磁性ビーズを使用する前に、１５０ｍＬの緩衝液ＰＢ１で２回洗浄した。
２）ＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーの製造
１×ＳＢ１７、Ｔｗ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）に溶解した１３３μＬの懸濁状態の第１固体支持体（ｆｉｒｓｔ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ、ＦＳＳ）であるストレプトアビジン結合磁性ビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）をチューブに入れた。約１．１×Ｂｉｏ－ＳＳＮライブラリー（ＳＳＮの３’末端にビオチンが付加されている）をボルテックスして解凍した。１．１×Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＳＮライブラリーを１０分間沸騰し、３０秒間ボルテックスして２０分間水浴（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で２０℃に冷却し、この１００μＬの１．１×Ｂｉｏ－ＳＳＮライブラリーを、前記ＦＳＳ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）入りのチューブに添加した。前記混合物を光から保護し、８５０ｒｐｍに設定されたシェーカー上で２０分、２５℃で培養し、Ｂｉｏ－ＳＳＮライブラリーのビオチン部分とＦＳＳ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の捕捉成分アビジン（ａｖｉｄｉｎ）部分とを反応させて懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーを製造した。
前記製造された懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリー入りのチューブを遠心分離して溶液を除去した。１９０μＬの１×ＣＡＰＳ前洗浄バッファー（ｐｒｅｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ ＣＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗ－２０、ｐＨ１１．０）を添加し、前記懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーを振盪しながら１分間処理した。その後、前記ＣＡＰＳ洗浄溶液を遠心分離によって除去した。次に、前記ＣＡＰＳ洗浄及び遠心分離による除去をもう一度繰り返し行った。
懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーの精製のために、前記懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリー入りのチューブに１９０μＬの１×ＳＸ１７、Ｔｗを添加し、前記懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーを振盪しながら１分間処理した。その後、１×ＳＢ１７、Ｔｗを遠心分離によって除去した。さらに１９０μＬの１×ＳＸ１７、Ｔｗを添加し、前記懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーを振盪しながら１分間処理した。その後、１×ＳＢ１７、Ｔｗは遠心分離（１０００×ｇで１分）によって除去した。
前記懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリー入りのチューブに１５０μＬの保存用バッファー（ｓｔｏｒａｇｅ ｂｕｆｆｅｒ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）を添加して懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳビーズライブラリーを精製した。前記チューブを慎重に密封して使用するまで４℃の暗所に保管した。
追って使用する溶液は、零下２０℃で長期保管してから分析する日、各懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーを１０分間３７℃で解凍して１０分間沸騰水槽に置き、２０分間２５℃に冷やして使用した。
このような加熱、冷却の後、実際使用の際には、それぞれの２×懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリー５５μＬを手作業で９６ウェルＰＣＲプレートにピペッティングし、チューブを箔で密封してから使用した。
＜実施例３－２＞分析試料の準備
試料は、ソウル峨山病院（ＩＲＢ承認番号：２０１５－０６０７）から提供された健常者の血清試料を使用した。
試料は、タンパク質分解防止のために、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡ、０．８ｍＭ ＡＥＢＳＦ、ＳＳＮ濃度の５倍の酵母ｔＲＮＡが含まれている０．９４×ＳＢ１７に希釈して１０％血清試料溶液を製造して使用した。
＜実施例３－３＞ＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーと試料の反応
前記５５μＬの懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリー溶液を、体積５５μＬの試料希釈溶液入りのチューブに添加した。分子集団からなる試料と懸濁状態のＳＳＮ－ＦＳＳライブラリーとをピペッティングして混合し、箔カバーで密封した。その後、前記チューブを３時間３０分、３７℃の処理機で試料のタンパク質分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｍ）集団とＳＳＮ－ＦＳＳとの複合体（Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ）の形成反応を行った。
複合体形成反応の後、前記反応混合液１００μＬ入りのチューブを磁石付きスタンドに置き、溶液層をピペットで注意深く除去した。前記チューブは、１ｍＭのデキストラン硫酸と５００μＭのビオチン（第１捕捉成分を遮断するためのもの）を含む３００μＬの緩衝液ＰＢ１で４回洗浄した。その後、チューブを３００μＬの緩衝液ＰＢ１でさらに３回洗浄してＭ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団を製造した。
＜実施例３－４＞第２タグ付加、第２固体支持体への固定、及びＳＳＮ－ＦＳＳ集団の溶出
前記Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団入りのチューブに、緩衝液ＰＢ１で新たに準備した１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン溶液１５０μＬを添加して、５分間振盪しながら処理して、第２タグであるビオチンを懸濁状態のＭ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体の分子に付加した。
前記チューブを遠心分離し、液体は吸引して除去し、チューブは１０ｍＭのグリセリンが補充された３００μＬの緩衝液ＰＢ１で８回洗浄した。１ｍＭのデキストラン硫酸を補充した１００μＬの緩衝液ＰＢ１を添加した。
前記チューブ中の懸濁状態の第２タグが付加された、ｂｉｏ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団が含まれている緩衝液を、第２固体支持体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ、ＳＳＳ）である、ストレプトアビジンがコーティングされたプレートのウェルに移した。次に、１０分間、常温で８００ｒｐｍにて反応させて、ｂｉｏ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳが第２タグとしてのビオチンを介して第２固体支持体に固定されるように誘導して、固定状態のＳＳＳ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を製造した。
次に、前記プレートのウェルから液体をピペットで注意深く除去し、２５％のプロピレングリコール（又は３０％グリセロール）を補充した３００μＬの緩衝液ＰＢ１で８回洗浄した。ウェルを３００μＬのＳＢ１７Ｔ緩衝液で５回洗浄し、最終洗浄液を吸引した。
１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を添加し、前記固定状態のＳＳＳ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を５分間振盪しながらＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を溶出させた。前記プレートのウェルから９０μＬの溶液を手作業で、１０μＬの中和緩衝溶液入りのＰＣＲプレートのウェルに移してＳＳＮ－ＦＳＳ集団を確保した。
＜実施例３－５＞試料のタンパク質分子集団と特異的に結合するＲＮＡアプタマーライブラリーの製造
上記で確保したＳＳＮ－ＦＳＳ集団に対して、前記実施例１及び実施例２と同様にＲＴ－ＰＣＲと生体外転写を行うことにより、最終的に試料のタンパク質分子集団と特異的に結合するＲＮＡアプタマーライブラリーを製造した。
前記製造したＲＮＡライブラリーに対して、前記実施例３－１から実施例３－５までの過程を１回以上さらに繰り返し行うことにより、より特異度と親和度の高いＲＮＡアプタマーライブラリーを製造することもできる。しかし、試料のタンパク質分子集団に特異的なＲＮＡライブラリーは、その試料に含まれているタンパク質分子の多様性をそのまま反映しなければならないことが理想的であるため、前記実施例３－１から実施例３－５までの過程を１回だけ行うが、上述したように洗浄過程を多様化し、繰り返し行うことにより、試料に含まれているタンパク質分子の多様性をよく反映するＲＮＡアプタマーライブラリーを製造した。
＜実施例３－６＞分析試料と比較試料の区分への適用
前記実施例３－５で得られた健常者の血清試料のタンパク質分子集団に対するＲＮＡアプタマーライブラリーを用いて、肺がん患者の６つの血清試料（分析試料、Ｌ５、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ１０、Ｌ１３及びＬ１４）と健常者の６つの血清試料（比較試料、Ｎ１～Ｎ６）の区分に適用した。
試料は、ソウル峨山病院（ＩＲＢ承認番号：２０１５－０６０７）から提供された肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料を使用した。分析は、各試料に対して前記実施例３－１及び実施例３－４と同様の過程を行うことにより、試験試料と対照試料のタンパク質分子集団に特異的に結合したＲＮＡアプタマー集団を分離した。
具体的には、ＲＮＡアプタマーライブラリーに第１タックを付けた後、第１固体支持体であるストレプトアビジン結合磁性ビーズと反応させて、第１固体支持体に結合されたＲＮＡアプタマーライブラリー（ＳＳＮ－ＦＳＳライブラリー）を製造し、試料と反応させて試料中のタンパク質分子集団と複合体集団（Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団）を製造した後、その複合体のタンパク質分子に第２タグを付け、その後、第２固体支持体である、ストレプトアビジンがコーティングされたプレートのウェルに反応させた後、洗浄し、次いでタンパク質分子集団と結合されたアプタマー集団を、第１固体支持体と結合された形態（ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体）で溶出させた。
溶出した複合体集団を鋳型として、前記実施例１に提示されたプライマーを用いてｃＤＮＡを製造し、このｃＤＮＡに対して一方向ＰＣＲ（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＰＣＲ）を１回行うことにより、集団的二本鎖ＤＮＡ断片を得、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２０（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて製造社のプロトコルに従ってＮＧＳライブラリーを製作した後、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（１０４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて各ＤＮＡ断片の塩基配列を分析し、各ＤＮＡ断片の出現頻度（各ＤＮＡ断片の個数又は量）と各ＤＮＡ断片の出現頻度との全体的な総合であるアプタマープロファイルを取得した。
結果を図１～図５に示した。図１及び図２は、それぞれ分析試料である肺がん試料と比較試料としての非肺がん試料における結合アプタマーの種類の数、総出現頻度（結合アプタマーの総数）、平均頻度及び最大頻度を示し、図３及び図４は、それぞれ６種類の肺がん試料に対する一部のアプタマー（ＢｉｏＳｉｇｎ＿シリアル番号）のアプタマープロファイルと健常試料に対する一部のアプタマーのアプタマープロファイルを示し、図５は、肺がん試料と健常試料における、出現頻度に差異がある一部のアプタマーのアプタマープロファイルを比較して示す。
図１～図５を参照すると、分析試料と反応したＲＮＡアプタマーライブラリーと、比較試料と反応したＲＮＡアプタマーライブラリーのプロファイル（各ＲＮＡアプタマーの総合出現頻度であって、ＲＮＡアプタマー出現頻度はＤＮＡの出現頻度で表示される）が明確に区分されることが分かる。
＜実施例４＞試料のタンパク質分子集団に特異的に結合するＤＮＡアプタマーライブラリーの製造と試料区分への適用
＜実施例４－１＞試料のタンパク質分子集団に特異的に結合するＤＮＡアプタマーライブラリーの製造
前記実施例１の＜一般式Ｉ＞のオリゴヌクレオチドを鋳型として用い、注文製作したビオチンが５’末端に接合された順方向プライマー（バイオニア、韓国）と、逆方向プライマー（逆方向プライマーは、ビオチンが接合されていないものである）を用いて、ＰＣＲ反応を介して、ビオチンが付いた二本鎖ＤＮＡを製造した。ここで、鋳型として用いたものが増幅した後、その増幅物を使用したのか、それともオリゴヌクレオチドを使用したのかを確認する。
まず、１×ＳＱ２０緩衝液に、１０μＭのオリゴヌクレオチド鋳型、１２μＭ ５’ビオチン接合プライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、及び０．２５Ｕ／ｍＬ ＫＯＤポリメラーゼ（ＫＯＤ ｅｘｏ（－）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を添加して、ＰＣＲ反応を行うことにより、二本鎖ＤＮＡを製造した後、二本鎖ＤＮＡを室温で２時間、第１固体支持体（ＦＳＳ）である高用量ＭｙＯｎｅ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６５００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）から捕捉し、ランダム配列を有する二本鎖ＤＮＡ－ＦＳＳ複合体ライブラリーを準備した。
前記製造された二本鎖ＤＮＡ－ＦＳＳ複合体ライブラリーを選択緩衝液（ＳＢＴ：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１０２ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で数回洗浄した。次いで、５分間２０ｍＭ ＮａＯＨに懸濁させて修飾センス鎖を溶離した。溶離溶液を７００ｍＭ ＨＣｌ、１８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．４５％Ｔｗｅｅｎ ２０の必要な体積でｐＨ７．４に中和させた後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）遠心分離フィルターで約２５０μＬの残留体積に濃縮した。
このようにランダム配列を有する一本鎖ＤＮＡ－ＦＳＳ（「ＳＳＮ－ＦＳＳ」）複合体ライブラリーを製造した。
次に、前記実施例３－２で準備された健常者の血清試料と≧１０００ｐｍｏｌ（～１０１５個）の前記製造されたＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を、ＳＢ１７Ｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で混合することにより、Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を形成させた。ＳＢ１７Ｔ緩衝溶液で洗浄して未結合血清タンパク質とＳＳＮ（一本鎖ＤＮＡ）とビオチンの複合体を除去した。
前記Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団入りのチューブに、緩衝液ＰＢ１で新たに準備した１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン溶液１５０μＬを添加して５分間振盪しながら処理し、懸濁状態のＭ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体のタンパク質分子に第２タグとしてのビオチンを付加した。このようなタンパク質分子へのビオチンの付加は、製造社のプロトコルに従って、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．２１３２９）とリジン残基との共有結合によって可能であるが、具体的には、前記Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団（５０μＬ中の３００ｐｍｏｌ）をＳＢ１７Ｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）入りのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラムで交換した。ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンを３０μＭとなるように添加し、反応物を４℃で１６時間反応させて、ビオチンが付加されたｂｉｏ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を製造した。未反応のＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラムで除去した。
前記チューブ中の懸濁状態の第２タグが付加されたｂｉｏ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団が含まれている緩衝液を、第２固体支持体（ＳＳＳ）である、ストレプトアビジンがコーティングされたプレートのウェルに移した。次に、１０分間、常温で８００ｒｐｍにて反応させて、ｂｉｏ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳが第２タグとしてのビオチンを介して第２固体支持体に固定されるように誘導して、固定状態のＳＳＳ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を製造した。
次に、前記プレートのウェルから液体をピペットで注意深く除去し、２５％のプロピレングリコール（又は３０％グリセロール）を補充した３００μＬの緩衝液ＰＢ１で８回洗浄した。ウェルを３００μＬのＳＢ１７Ｔ緩衝液で５回洗浄し、最終洗浄液を吸引した。
１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を添加し、前記固定状態のＳＳＳ－Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を５分間振盪しながらＳＳＮ－ＦＳＳ複合体を溶出させた。前記プレートのウェルから９０μＬの溶液を手作業で１０μＬの中和緩衝溶液入りのＰＣＲプレートのウェルに移してＳＳＮ－ＦＳＳ集団を確保した。
上記で確保したＳＳＮ－ＦＳＳ集団に対して、前記実施例１及び実施例２と同様にＰＣＲを行うことにより、二本鎖ＤＮＡを製造し、上記のようにビオチンが接合された順方向プライマーと逆方向プライマーを用いて、ビオチンが接合された二本鎖ＤＮＡを製造した後、これを第１固体支持体（ＦＳＳ）に固定し、さらに上記のようにセンス鎖を溶離させて最終的に試料のタンパク質分子集団と特異的に結合する、第１固体支持体（ＦＳＳ）に固定された形態のＤＮＡアプタマーライブラリーを製造した。
前記製造したＤＮＡライブラリーに対して上記の過程を１回以上さらに繰り返し行うことにより、より特異度と親和度の高いＤＮＡアプタマーライブラリーを製造することもできるが、試料のタンパク質分子集団に特異的なＤＮＡライブラリーは、その試料に含まれているタンパク質分子の多様性をそのまま反映しなければならないことが理想的であるため、上記の過程を１回だけ行うが、前述したように洗浄過程を多様化し、繰り返し行うことにより、試料に含まれているタンパク質分子の多様性をよく反映するＤＮＡアプタマーライブラリーを製造した。
＜実施例４－２＞試料の区分への適用
上記で得られた、第１固体支持体（ＦＳＳ）に固定された形態のＤＮＡアプタマーライブラリーを用いて、肺がん患者の６つの血清試料（分析試料、Ｌ５、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ１０、Ｌ１３及びＬ１４）と健常者の６つの血清試料（比較試料、Ｎ１～Ｎ６）の区分に適用した。
試料は、ソウル峨山病院（ＩＲＢ承認番号：２０１５－０６０７）から提供された肺がん患者の血清試料と健常者の血清試料を使用した。分析は、各試料に対して前記実施例４－１と同様の過程を行うことにより、試験試料と対照試料のタンパク質分子集団に特異的に結合したＤＮＡアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離した。
具体的には、第１固体支持体（ＦＳＳ）に固定された形態のＤＮＡアプタマーライブラリーを試料と反応させ、試料中のタンパク質分子集団と複合体集団（Ｍ－ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体集団）を製造した後、その複合体のタンパク質分子に第２タグを付け、次いで第２固体支持体である、ストレプトアビジンがコーティングされたプレートのウェルに反応させた後、洗浄し、次いでタンパク質分子集団と結合されたアプタマー集団を、第１固体支持体と結合された形態（ＳＳＮ－ＦＳＳ複合体）で溶出させた。
溶出した複合体集団を鋳型として、前記実施例１に提示されたプライマーを用いて、集団的二本鎖ＤＮＡ断片を得、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２０（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて製造社のプロトコルに従ってＮＧＳライブラリーを製作した後、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（１０４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて各ＤＮＡ断片の塩基配列を分析し、各ＤＮＡ断片の出現頻度（各ＤＮＡ断片の個数又は量）と各ＤＮＡ断片の出現頻度との全体的な総合であるアプタマープロファイルを取得した。
結果を図６～図１０に示した。図６及び図７は、それぞれ分析試料である肺がん試料と比較試料である非肺がん試料における結合アプタマーの種類の数、総出現頻度（結合アプタマーの総数）、平均頻度及び最大頻度を示し、図８及び図９は、それぞれ６つの肺がん試料に対する一部のアプタマー（ＢｉｏＳｉｇｎ＿シリアル番号）のアプタマープロファイルと、健常試料に対する一部のアプタマーのアプタマープロファイルを示し、図１０は、肺がん試料と健常試料における、出現頻度に差異がある一部のアプタマーのアプタマープロファイルを比較して示す。
図６乃至図１０を参照すると、分析試料と反応したＤＮＡアプタマーライブラリーと、比較試料と反応したＤＮＡアプタマーライブラリーのプロファイル（各ＤＮＡアプタマーの総合出現頻度である）がはっきりと区分されることが分かる。

Claims (46)

  1. （ａ）試料の標的分子集団に特異的であり、第１捕捉成分と結合することが可能な第１タグが付いたアプタマーライブラリーを、第１捕捉成分が接合された固体支持体に処理して、前記第１捕捉成分と前記第１タグとを結合させることにより、前記アプタマーライブラリーを第１固体支持体に固定する段階と、
    （ｂ）前記アプタマーライブラリーが固定された第１固体支持体に、前記試料と同類の分析対象試料を処理して、その分析対象試料中の標的分子集団の各標的分子と前記アプタマーライブラリーの各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的分子とアプタマーの複合体集団を得る段階と、
    （ｃ）未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階と、
    （ｄ）前記分離された複合体集団の各複合体の標的分子に、第２捕捉成分と結合することが可能な第２タグを付ける段階と、
    （ｅ）前記第２タグが付いた複合体の集団を、第２捕捉成分が接合された第２固体支持体に処理して、前記第２捕捉成分と前記第２タグとを結合させることにより、前記複合体集団を第２固体支持体に固定する段階と、
    （ｆ）前記第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階と、
    （ｇ）前記分離された、第１固体支持体に固定されているアプタマー集団からそのアプタマー集団の各アプタマーを定量してアプタマープロファイルを生成する段階と、を含む、試料の標的分子集団に対するプロファイルを生成する方法。
  2. 前記試料の標的分子集団に対するプロファイルがアプタマープロファイルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アプタマープロファイルが、薬物処方の適合性の判断、疾患診断情報の提供、薬物治療のモニタリング、薬物コンプライアンスの判断、薬物処理に対するＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞反応の有無、薬物処理に対するＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞反応の程度、生物種の分類、又は生物種の同定に使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記標的分子がタンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質又はペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記標的分子集団が未知の標的分子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、
    （ｉ）互いに異なる様々な配列を持つため、様々な標的分子に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを製作し、
    （ｉｉ）該一本鎖核酸ライブラリーを試料の標的分子集団と反応させ、各一本鎖核酸と各標的分子との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、
    （ｉｉｉ）非結合した一本鎖核酸を除外させてその複合体集団を分離し、
    （ｉｖ）その複合体集団の一本鎖核酸を増幅して得られたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 前記（ｉ）段階乃至前記（ｉｖ）段階は、１回行われ、
    前記非結合した一本鎖核酸を除外させることは、洗浄段階を介して行われ、
    前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、
    前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 前記アプタマーが一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  9. 前記一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡが、糖、リン酸塩又は塩基で修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 前記試料が生体試料又はその加工試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１タグと前記第２タグはビオチン又はその類似体であり、
    前記第１捕捉成分と前記第２捕捉成分はストレプトアビジン又はその類似体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  12. 前記第１固体支持体は磁性ビーズであり、
    前記第２固体支持体は非磁性支持体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 前記（ｂ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を形成させるとき、競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  14. 前記（ｆ）段階の第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階は、加熱、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）の処理、ｐＨの強酸性又は強塩基性への変化の誘導、界面活性剤の処理、又はこれらの複合処理によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  15. 前記（ｇ）段階のアプタマーの定量が次世代配列分析技術、マイクロアレイ法又は多重リアルタイムＰＣＲ法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  16. （ａ）試料の標的分子集団に特異的であり、第１捕捉成分と結合することが可能な第１タグが付いたアプタマーライブラリーを、第１捕捉成分が接合された固体支持体に処理して、前記第１捕捉成分と前記第１タグとを結合させることにより、アプタマーライブラリーを第１固体支持体に固定する段階と、
    （ｂ）前記アプタマーライブラリーが固定された第１固体支持体に、前記試料と同類の分析対象試料を処理して、その分析対象試料中の標的分子集団の各標的分子と前記アプタマーライブラリーの各アプタマーとの複合体を形成させることにより、標的分子とアプタマーの複合体集団を得る段階と、
    （ｃ）未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階と、
    （ｄ）前記分離された複合体集団の各複合体の標的分子に、第２捕捉成分と結合することが可能な第２タグを付ける段階と、
    （ｅ）前記第２タグが付いた複合体の集団を、第２捕捉成分が接合された第２固体支持体に処理して、前記第２捕捉成分と前記第２タグとを結合させることにより、前記複合体集団を第２固体支持体に固定する段階と、
    （ｆ）前記第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階と、
    （ｇ）前記分離された第１固体支持体に固定されているアプタマー集団からそのアプタマー集団の各アプタマーを定量してアプタマープロファイルを生成する段階と、
    （ｈ）前記（ａ）乃至前記（ｇ）段階を、前記分析対象試料とは異なる１種以上の分析対象試料に対して同一に行うことにより、その１種以上の他の分析対象試料の標的分子集団に対するアプタマープロファイルを生成する段階と、
    （ｉ）前記（ｇ）段階によって生成したアプタマープロファイルと、前記（ｈ）段階によって生成したアプタマープロファイルとを比較して、アプタマー定量結果に差異がある１つ以上のアプタマーを決定することにより、前記２種以上の分析対象試料を区分する段階と、を含む、２種以上の分析対象試料の区分方法。
  17. 前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーは、前記２種以上の分析対象試料に対して同一のアプタマーライブラリーが使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記（ｈ）段階の分析対象試料は２種以上であり、前記アプタマープロファイルも前記２種以上の分析対象試料に対してそれぞれ得られ、
    前記２種以上のアプタマープロファイルを平均化させた、平均化アプタマープロファイルを生成する段階が、前記（ｈ）段階の後に追加され、
    前記（ｉ）段階は、前記平均化アプタマープロファイルと前記（ｇ）段階によって得られたアプタマープロファイルとを比較することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記（ｉ）段階で得られた定量結果に差異があるものと決定された１つ以上のアプタマーを用いて、そのアプタマーが特異的に結合する標的分子を分離し、その標的分子を同定する段階を、前記（ｉ）段階の後にさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記（ｉ）段階で得られた定量結果に差異があるものと既に決定された１つ以上のアプタマーを、前記（ａ）段階のアプタマーライブラリーの代わりに使用して、前記（ａ）段階乃至前記（ｉ）段階をさらに行う段階をさらに行い、
    前記（ｉ）段階は、前記定量結果に差異があるものと既に決定された１つ以上のアプタマーに対して行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記標的分子がタンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質又はペプチドであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記標的分子集団が未知の標的分子を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  23. 前記試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーは、
    （ｉ）互いに異なる様々なランダム配列を持つため、様々な標的分子に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを製作し、（ｉｉ）該一本鎖核酸ライブラリーを試料の標的分子集団と反応させて、各一本鎖核酸と各標的分子との間に特異的結合を誘導して複合体集団を形成させ、（ｉｉｉ）非結合した一本鎖核酸を除外させてその複合体集団を分離し、（ｉｖ）その複合体集団の一本鎖核酸を増幅して得られることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記（ｉ）段階乃至前記（ｉｖ）段階は、１回行われ、
    前記非結合した一本鎖核酸を除外させることは、洗浄段階を介して行われ、
    前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、
    前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理して行われることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記アプタマーが一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  26. 前記一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡが、糖、リン酸塩又は塩基で修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  27. 前記試料が生体試料又はその加工試料であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  28. 前記第１タグと前記第２タグはビオチン又はその類似体であり、
    前記第１捕捉成分と前記第２捕捉成分はストレプトアビジン又はその類似体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  29. 前記第１固体支持体は磁性ビーズであり、
    前記第２固体支持体は非磁性支持体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  30. 前記（ｂ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を形成させるとき、競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  31. 前記（ｆ）段階の第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階は、加熱、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）の処理、ｐＨの強酸性又は強塩基性への変化の誘導、界面活性剤の処理、又はこれらの複合処理によって行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  32. 前記（ｇ）段階のアプタマーの定量が次世代配列分析技術、マイクロアレイ法又は多重リアルタイムＰＣＲ法によって行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  33. （ａ）第１捕捉成分と結合することが可能な第１タグが付いた、ランダム配列を持つため様々なタンパク質に対する潜在的結合能力を有する一本鎖核酸ライブラリーを製造する段階と、
    （ｂ）第１捕捉成分が接合された第１固体支持体に、前記第１タグが付いた一本鎖核酸ライブラリーを処理して、前記第１捕捉成分と前記第１タグとを結合させることにより、一本鎖核酸ライブラリーを第１固体支持体に固定する段階と、
    （ｃ）前記一本鎖核酸ライブラリーが固定された第１固体支持体に試料を処理して、試料中の標的分子集団の各標的分子と前記一本鎖核酸ライブラリーの各一本鎖核酸との反応によって標的分子と一本鎖核酸との複合体集団を得る段階と、
    （ｄ）未結合標的分子を除去して前記複合体集団を、第１固体支持体に固定された状態で分離する段階と、
    （ｅ）前記分離された複合体集団の各複合体の標的分子に、第２捕捉成分と結合することが可能な第２タグを付ける段階と、
    （ｆ）前記第２タグが付いた複合体の集団を、第２捕捉成分が接合された第２固体支持体に処理して、前記第２捕捉成分と前記第２タグとを結合させることにより、前記複合体集団を第２固体支持体に固定する段階と、
    （ｇ）前記第２固体支持体に固定された複合体集団から、標的分子と結合されている一本鎖核酸集団を、第１固体支持体に固定された形態で溶出させる段階と、
    （ｈ）前記第１固体支持体に固定されている一本鎖核酸集団から、試料中の標的分子集団に特異的な一本鎖核酸集団であるアプタマーライブラリーを製造する段階と、を含む、試料中の標的分子集団に特異的なアプタマーライブラリーの製造方法。
  34. 前記（ｈ）段階の後に、前記アプタマーライブラリーの各アプタマーの配列を決定する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記標的分子がタンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質又はペプチドであることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記標的分子集団が未知の標的分子を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記（ａ）段階の一本鎖核酸ライブラリーは、５’保存領域と３’保存領域を有し、それらの間にランダム配列を有することを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記（ａ）段階乃至前記（ｈ）段階は、１回行われ、
    前記（ｄ）段階の未結合標的分子の除去は、前記（ｃ）段階で形成された複合体集団を洗浄する段階を介して行われ、
    前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、
    前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子、又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理することにより行われることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  39. 前記（ａ）段階乃至前記（ｈ）段階は、１回行われ、
    前記（ｆ）段階の後に、第２固体支持体に固定した前記複合体集団を洗浄する段階を介して行われ、
    前記洗浄段階は、２回以上繰り返し行われ、
    前記洗浄段階は、界面活性剤、塩、競合分子、又はこれらの混合物を含む洗浄バッファーを処理することによって行われることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記アプタマーが一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  41. 前記一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡが、糖、リン酸塩又は塩基で修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  42. 前記試料が生体試料又はその加工試料であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  43. 前記第１タグと前記第２タグはビオチン又はその類似体であり、
    前記第１捕捉成分と前記第２捕捉成分はストレプトアビジン又はその類似体であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  44. 前記第１固体支持体は磁性ビーズであり、
    前記第２固体支持体は非磁性支持体であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  45. 前記（ｃ）段階の標的分子とアプタマーとの複合体を得るとき、競合分子が標的分子とアプタマーとの特異的結合を向上させるために前記試料と共に第１固体支持体に処理されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
  46. 前記（ｇ）段階の第２固体支持体に固定された複合体集団からアプタマー集団を、第１固体支持体に固定された形態で分離する段階は、加熱、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）の処理、ｐＨの強酸性又は強塩基性への変化の誘導、界面活性剤の処理、又はこれらの複合処理によって行われることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015520385A (ja) * 2012-06-07 2015-07-16 ソマロジック・インコーポレーテッド アプタマーに基づく多重化アッセイ
WO2018084594A1 (ko) * 2016-11-02 2018-05-11 김성천 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도

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