JP5223086B2 - 血管内皮増殖因子結合性アプタマー - Google Patents
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1.VEGFに結合するDNAアプタマーのスクリーニング
(1) アプタマーブロッティングによるスクリーニング (2,4,5 ラウンド)
ニトロセルロース膜の各面に、VEGF(入手先 R&D systems)及びPQQGDH(入手先:有限会社Ultizyme International)を含む緩衝液を添加し(各物質の添加量を下記表1に示す)、自然乾燥させることにより固定化した後に、4 %の血清でブロッキングし、Binding Buffer(10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、0.05 mM EDTA、0.05 % Tween(商品名))で洗浄した。DNA自動合成機により化学合成した、DNAライブラリーをFITC修飾し、Binding Buffer中でフォールディングさせた後に、終濃度80 nMになるよう調製し、蛋白質を固定化した膜と室温で1時間インキュベートした。DNAライブラリーは、1nt〜18nt(以下、「5'側領域」と呼ぶことがある)及び49nt〜66nt(以下、「3'側領域」と呼ぶことがある)が配列番号1に示される配列中の1nt〜18nt及び49nt〜66ntとそれぞれ同一で、19nt〜48ntの30塩基の領域がランダムなものであった。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)修飾された抗FITC抗体を用い、化学発光によりssDNAのターゲット蛋白質への結合を確認した。また、フェノールクロロホルム処理することにより、蛋白質を固定化した部分からDNAを抽出・回収し、PCR増幅後、一本鎖調製することで次のラウンドのライブラリーを作製した。PCRは、具体的には、前記5'側領域と同じ塩基配列を有する18塩基のフォワード側プライマーと、前記3'側領域に相補的な塩基配列を有する18塩基のリバース側プライマーとを用い、95℃、60秒の変性工程、52℃、60秒のアニーリング工程及び72℃、60秒の伸長工程から成るサイクルを40サイクル繰り返すことにより行った。一本鎖調製は、具体的には、PCR産物に、その1/10倍量の×50 TE Bufferおよび1/5倍量の5 M NaClを添加し、この溶液をアビジン固定化アガロースに加え、30分インキュベートした。その後、上清を取り除き、Column buffer (30 mM HEPES、500 mM NaCl、5mM EDTA、pH7.0)で2回洗浄した。上清を取り除いた後、0.15 M NaOHを加えて10分間攪拌し、上清を回収する操作を2回繰り返し行うことにより、ssDNAを溶出させた。ssDNAを含む上清を2M HClで中和し、エタノール沈殿によりssDNAを回収した。
FITC修飾されたssDNAライブラリーをbinding buffer中でフォールディング後、ライブラリーとVEGFを混合し、室温で1時間インキュベートした。その後、10 %の未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行うことにより、VEGFと結合したssDNAと遊離のssDNAを分離した。電気泳動後、FITCを検出することによりDNAのバンドを確認し、複合体と思われる部分を切り出した。ここへ0.1% SDSを含むTE bufferを添加し凍結させた後、90℃で5分間加熱し、室温で一晩撹拌することにより、ゲルからDNAを溶出させた。遠心分離後、上清を回収し、フェノール、フェノールクロロホルム、およびクロロホルムを用いてssDNAを抽出した後に、得られたssDNAを上記と同様にPCRにより増幅し、次のラウンドのライブラリーを作製した。
スクリーニングにより得られたライブラリーを未修飾のプライマーを用いて上記と同様にPCR増幅し、MERmaid kit (QBio gene)を用いて精製した後、p-GEM-Tベクターを用いてクローニングを行った。得られたプラスミドをDH5αに形質転換し、プレート(0.5 mM IPTG、80μg/ml X-Gal)上で本培養した後に、得られたコロニーからプラスミドを抽出し、シーケンス解析を行った。
(1) アプタマーブロッティングによる評価
スクリーニング時と同様な方法により評価を行った。すなわち、ニトロセルロース膜の片面に、VEGF 0.2μg/2μl、PQQGDH 0.5μg/0.5μlを添加し(いずれも5pmol)した後に、10%の血清と室温で1時間インキュベートすることによりブロッキングを行った。スクリーニングにより得られたssDNAをフォールディング後、終濃度80nMになるように調整し、蛋白質を固定化した膜と室温で1時間インキュベートした。その後、化学発光により各ssDNAのターゲット蛋白質への結合を確認した。いずれのssDNAも、5'末端にbiotinが修飾されており、検出にはHRP修飾されたNeutrAvidin(商品名)を用いた。Bufferはスクリーニングの際と同様のものを用いた。
測定には、CM4(商品名)チップ、固定化Buffer、Running Bufferとしてスクリーニングで用いたBinding Buffer、再生Bufferとして250 mM NaCl、10 mM NaOH、0.5%SDSを用いた。50 μg/mlに溶かしたVEGFを、アミンカップリングによりチップに固定化し、100 nM、250 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2.5 μMに調製しフォールディングした各アプタマーおよびランダムライブラリーを流速5μl/minでインジェクトし、シグナルを観察した。
上記スクリーニングにより、アプタマーブロッティングにおいて結合が確認されたアプタマーが13種類得られ、これらのうち、特に濃いスポットを与えた2種のアプタマーが得られた。これらの2種のアプタマーが、配列番号1に示す塩基配列を有するアプタマーA(Clone 2)と、配列番号2に示す塩基配列を有するアプタマーB(Clone 1)である。なお、アプタマーAのスポットの方がアプタマーBのスポットよりもさらに濃く、従って、アプタマーAが最も高い結合能を示した。m-fold(商品名)により決定したアプタマーA及びアプタマーBの二次構造を図1及び図2にそれぞれ示す。これらの二次構造については上記したとおりである。
実施例1で得られたアプタマーA及びアプタマーBが、VEGFと結合するのに必要な領域がどの部分であるのかを解析した。アプタマーの標的物質との結合には、ステム−ループ構造が重要な役割を果たすことが知られているので、ステム−ループ構造を含む領域から成る各種欠失変異体をDNA合成機により化学合成した。作製したアプタマーAの欠失変異体は、del2-1(配列番号1の1nt〜50nt)、del2-2(配列番号1の4nt〜50nt)、del2-3(配列番号1の4nt〜38nt)及びshortdel(配列番号1の4nt〜20nt)の4種類であり、これらの二次構造は図1に示されている。作製したアプタマーBの欠失変異体は、del1-1(配列番号2の1nt〜55nt)及びdel1-2(配列番号2の4nt〜55nt)の2種類であり、これらの二次構造は図2に示されている。
Claims (1)
- 配列番号1又は配列番号2記載の塩基配列から成る一本鎖ポリヌクレオチド。
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