JP2003502078A - 仔ウシ腸性ホスファターゼの２’−フルオロピリミジン核酸リガンド - Google Patents

仔ウシ腸性ホスファターゼの２’−フルオロピリミジン核酸リガンド

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JP2003502078A
JP2003502078A JP2001505347A JP2001505347A JP2003502078A JP 2003502078 A JP2003502078 A JP 2003502078A JP 2001505347 A JP2001505347 A JP 2001505347A JP 2001505347 A JP2001505347 A JP 2001505347A JP 2003502078 A JP2003502078 A JP 2003502078A
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ドロレット，ダニエル
ゴールド，ラリー
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ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 仔ウシ腸性ホスファターゼに対する核酸リガンドの同定および調製方法が述べられている。本発明にはまたＳＥＬＥＸ法により同定される仔ウシ腸性ホスファターゼに対する特定のＲＮＡリガンドが包含される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に対する高親和性核酸リガンドについて
述べる。さらにまたＣＩＰに対する高親和性核酸リガンドの同定方法と調製方法
についても記載する。かかる核酸リガンドを同定するためにここで使用する方法
はＳＥＬＥＸと呼ばれているものでＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎ
ｔ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）の頭文字をとったものである
。さらにＣＩＰに対するＲＮＡリガンドも開示している。またピリミジンの２’
-位が化学修飾されているヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドも
またここに包含される。さらに２’-Ｆ修飾を含有するＣＩＰに対するＲＮＡリ
ガンドもまた開示している。本発明はまたＣＩＰの高親和性核酸阻害剤も含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬として有用である。
【０００２】 背景技術 仔ウシ腸性アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）は研究、臨床分析で一般に使用
されているリポーター酵素である。これらの分析では通常ＣＩＰがリン酸基を除
去すると検出可能となる合成基質が使用されている。よく使用されている基質の
一つは例えば１，２ジオキセタンである。この基質はＣＩＰによりリン酸基が除
去されると化学発光する。もう一つ、よく使用される基質にクロマゲンｐ-ニト
ロフェニルホスフェートがある。ＣＩＰ接合抗体はＥＬＩＳＡにおいて幅広く使
用されており、ＣＩＰに結合した核酸プローブはさまざまな核酸検出スキームに
おいて使用可能である。さまざまな標的検出スキームにおけるＣＩＰの使用の広
がりを考えると、ＣＩＰが接合できる抗体とはっきり異なるリガンドを提供する
ことが望ましい。
【０００３】 長年にわたり定説となっていたのは、核酸は主として情報を与える役割を担っ
ているというものであった。ＳＥＬＥＸ法と名付けられている、指数関数的濃縮
によるリガンドの系統的進化として知られている方法により、核酸がタンパク質
のような三次元的な構造的多様性をもつことが明らかになってきた。このＳＥＬ
ＥＸ法は標的分子に対する極めて特異的な結合をもつ核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで進化させるための方法であり、１９９０年６月１１日に提出され現在放棄さ
れた、米国特許第０７／５３６，４２８号「指数関数的濃縮によるリガンドの系
統的進化」、米国特許第５，４７５，０９６号「核酸リガンド」および米国特許
第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３号も参照の事）「核酸リガンド
の同定法」に記載されており、これらはそれぞれここにその全体を参照として特
に援用する。これらの出願、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ、は所望の標的
分子に対する核酸リガンドを作成する根本的に新しい方法をそれぞれ記載してい
る。このＳＥＬＥＸ法はそれぞれ非反復配列を持ち、所望の標的化合物または分
子に特異的に結合する性質を持つ核酸リガンド（あるいはアプタマー）と呼ばれ
る１クラスの生成物を提供する。各ＳＥＬＥＸ同定核酸リガンドは、ある標的化
合物または分子に対する特異的リガンドである。このＳＥＬＥＸ法は、核酸は様
々な二次元および三次元構造を形成することができ、それ自身のモノマー中に、
モノマーであろうとポリマーであろうと、実質的にいかなる化学的化合物ともリ
ガンドとして作用する（特異的な結合ペアを形成する）に充分な化学的融通性を
持っているという独特の洞察に基づいている。このＳＥＬＥＸ法においてはいか
なる大きさ、いかなる組成の分子でも標的とすることができる。高親和性結合の
用途に用いるＳＥＬＥＸ法においては、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの
選択と、同じ一般的選択スキームを用いて、結合、分配、および増幅を段階的に
反復し、実質的にどのような基準の結合親和性と選択性を所望したとしても、そ
れを達成することができる。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム化したシーケ
ンスのセグメントを含有する、核酸混合物を原料にし、結合、標的分子に特異的
に結合した核酸から非結合核酸を分配し、核酸-標的複合体を解離し、この核酸-
標的複合体から解離した核酸を増幅してリガンドに富む核酸混合物を得るのに有
利な条件のもとでこの混合物を標的と接触するステップを含有し、それから結合
、分配、解離および増幅ステップを所望回数反復して標的分子に対し極めて特異
性の高い高親和性核酸リガンドを得るものである。
【０００４】 本発明者らは化学化合物としての核酸に広範囲にわたる一連の形状、大きさお
よび構造の形成能があり、生物学的システム中で核酸が示しているよりもはるか
に幅広い結合並びにその他の機能の能力があることをこのＳＥＬＥＸ法が示して
いるという認識を得た。
【０００５】 基本となるＳＥＬＥＸ法は多数の特定対象物を得るために修正されている。例
えば１９９２年１０月１４日に申請され、現在放棄された米国特許第０７／９６
０，０９３号、および米国特許第５，７０７，７９６号は共に「構造に基づく核
酸選択法」という標題であるが、ベントＤＮＡなどの特定の構造的特徴を持つ核
酸分子を選択するためにゲル電気泳動と組みあわせたＳＥＬＥＸ法の使用が記載
されている。１９９３年９月１７日に申請され現在放棄された、米国特許第０８
／１２３，９３５号「核酸リガンドの光選択」、米国特許第５，７６３，１７７
号および米国特許第６，００１，５７７号は共に「指数関数的濃縮による核酸リ
ガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」においては標的
分子に対する結合、および／または光架橋、および／または標的分子の光不活性
化をおこなうことができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するＳＥＬ
ＥＸ法に基づいた方法が記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号「テ
オフィリンとカフェインとを識別する高親和性核酸リガンド」は密接に関連した
分子同士、これはペプチド性でなくてもよい、を見分けることのできる高特異性
核酸リガンドを同定する方法、カウンターＳＥＬＥＸ法と呼ばれている、が記載
されている。米国特許第５，５６７，５８８号「指数関数的濃縮によるリガンド
の系統的進化：溶液ＳＥＬＥＸ」は標的分子に高い親和性を持つオリゴヌクレオ
チドと低い親和性を持つオリゴヌクレオチドを効率的に分配するＳＥＬＥＸベー
スの方法を記載している。
【０００６】 ＳＥＬＥＸ法は、改善された生体内安定性、または改善されたデリバリ特性な
どの改善された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを持つ高親和性核酸リ
ガンドの同定を行う。このような修飾の例としてはリボース位置および／または
ホスフェート位置および／または塩基位置における化学的置換があげられる。修
飾ヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸ法同定核酸リガンドは米国特許第５，６６
０，９８５号「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」に記載され
ているが、ここにはピリミジンの５-および２’-位で化学修飾されたヌクレオチ
ド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許第５，
５８０，７３７号では２’-アミノ（２’-ＮＨ2）、２’-フルオロ（２’-Ｆ）
、および／または２’-Ｏ-メチル（２’-ＯＭｅ）で修飾された一つ以上のヌク
レオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。１９９４年
６月２２日に申請され現在放棄された、米国特許第０８／２６４，０２９号「分
子間求核置換による既知および新規の２’-修飾ヌクレオシドの新規調製法」で
は様々な２’-修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている
。
【０００７】 ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号「指数関数的濃縮によるリ
ガンドの系統的進化：キメラＳＥＬＥＸ」、米国特許第５，６８３，８６７号「
指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ブレンドＳＥＬＥＸ」にそれぞれ
記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴ
ヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位とを組みあわせることを包
含する。これらの応用例によりオリゴヌクレオチドの広範囲に渡る形およびその
他の性質、ならびに効率的な増幅や再現性とその他の分子の所望の性質とを組み
あわせることができる。
【０００８】 ＳＥＬＥＸ法はさらに米国特許第６，００１，０２０号「核酸リガンド複合体
」中に記載されているように、選択された核酸リガンドと親油性化合物または非
免疫原性高分子量化合物とを結合し、診断または治療用複合体とすることも包含
する。基本的ＳＥＬＥＸプロセスの修正例を記載している上記の特許および応用
例のそれぞれはここにその全体を参照として特に援用する。
【０００９】 本発明の目的は仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に対し高い特異性と親和
性を持って結合する核酸リガンドを同定するために使用することのできる方法を
提供することである。
【００１０】 さらに本発明の目的は結合したときにＣＩＰの活性を阻害するＣＩＰに対する
核酸リガンドを得ることである。
【００１１】 本発明の目的はまたＣＩＰと結合したときにホスファターゼ活性を阻害しない
ＣＩＰに対する核酸リガンドを得ることである。
【００１２】 さらにまた本発明の目的は、ロボット対応性微量定量プレートフォーマットに
おいてＳＥＬＥＸ法を行う方法を提供することである。
【００１３】 さらにまた本発明の目的は、疎水性相互作用のみにより、微量定量プレートを
始めとする固体担体表面へＳＥＬＥＸ法標的を吸着する方法を提供することであ
る。
【００１４】 発明の大要 本発明は仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に高い特異性をもって結合する
核酸リガンドを単離する方法を記載する。本発明の核酸リガンドは阻害性であっ
ても非阻害性であってもよい。ＣＩＰに対する高親和性核酸リガンドにはＣＩＰ
をリポーター酵素として使用する分析システムにおいて多くの潜在的用途がある
であろう。
【００１５】 本発明はまた疎水性相互作用のみによりＳＥＬＥＸ標的をロボット対応性微量
定量プレート上に固定化する方法を提供する。この方法によりＳＥＬＥＸプロセ
スの高速自動化が実現するであろう。
【００１６】 好ましい実施様態の詳細な説明 ここでＣＩＰに対する核酸リガンドを同定するために用いた中心となる方法は
ＳＥＬＥＸ法とよばれるもので、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ
（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）の頭文字を取ったものであり、
（ａ）核酸の候補混合物を仔ウシ腸性ホスファターゼまたは仔ウシ腸性ホスファ
ターゼに対応するペプチド類、あるいは発現領域と接触させ、（ｂ）前記候補混
合物のメンバーを仔ウシ腸性ホスファターゼに対する親和力に基づき分配し、そ
して（ｃ）選択された分子を増幅して仔ウシ腸性ホスファターゼに対する結合に
対し比較的高い親和力を持つ核酸配列に富む核酸混合物を得ることを包含する。
【００１７】 定義 本発明の態様を述べるためにここでは様々な用語が使用されている。本発明の
構成要素の記載をより明確にするために、下記の定義を設ける。
【００１８】 ここで用いる「核酸リガンド」とは標的に対し所望の作用を行う天然には産出
しない核酸である。核酸リガンドはしばしば「アプタマー」と呼ばれている。望
ましい作用としては、これに限るわけではないが、標的の結合、標的を触媒的に
変化させること、標的、または標的の官能性を修飾／変更するようなやり方で標
的と反応すること、自己不活性化阻害剤で行われるように、標的に共有結合的に
結合すること、標的とその他の分子の間の反応を促進することなどがある。好ま
しい態様において、この作用は標的分子に対する特異的結合親和力であり、この
ような標的分子は、ワトソン／クリックの塩基対合または三重らせん結合に支配
されている機構を通じて核酸リガンドへ結合するポリヌクレオチド以外の三次元
化学構造を持つものであり、ここで核酸リガンドは標的分子によって結合される
既知の生理学的機能を持つ核酸ではない。本発明において、標的は仔ウシ腸性ホ
スファターゼであり、またはその領域である。核酸リガンドは核酸の候補混合物
から同定される核酸を含むが、かかる核酸リガンドは、ａ）候補混合物に較べ標
的に対して高い親和力を持つ核酸を候補混合物の残りから分配できるように候補
混合物を標的と接触させ、ｂ）候補混合物の残りから親和力の高い核酸を分配し
、そしてｃ）親和力の高い核酸を増幅し、リガンドに富む核酸混合物を得る、こ
とを含有する方法によるある特定の標的のリガンドなのである。
【００１９】 ここで使用する「候補混合物」とは異なる配列を持つ核酸の混合物であり、そ
の中から所望のリガンドを選択するものである。候補混合物の原料は天然産出の
核酸であっても、またその断片であっても、あるいは化学的に合成された核酸で
あっても、酵素により合成された核酸であっても、また前述の技法を組みあわせ
て生産された核酸であってもよい。好ましい様態において、各核酸は増幅プロセ
スを容易にするためにランダム化した領域を取り囲む固定配列を持つ。
【００２０】 ここで使用する「核酸」とはＤＮＡでも、ＲＮＡでも、一本鎖でも、二本鎖で
あってもよく、またはその化学的修飾物であってもよい。修飾としては、これに
限るわけではないが、電荷、分極性、水素結合性、静電的相互作用、および流動
性を核酸リガンド塩基へまたは核酸リガンド全体に与える、別の化学基を提供す
るものがあげられる。このような修飾には、これに限るわけではないが、２’-
位糖修飾、５-位ピリミジン修飾、８-位プリン修飾、環外アミン修飾、４-チオ
ウリジンの置換、５-ブロモまたは５-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、メチ
ル化、イソシチジン、イソグアニジンなどのイソ塩基など珍しい塩基対合の組み
合わせなどが含まれる。修飾にはキャッピングなどの３’および５’修飾もまた
含まれる。
【００２１】 「ＳＥＬＥＸ」法には所望のやり方で標的と相互作用をする、例えばタンパク
に結合する、核酸リガンドの選択とこれらの選択した核酸の増幅とが組みあわさ
れて含有される。この選択／増幅ステップは反復サイクリングを行ってもよく、
きわめて多数の核酸を含有するプールから標的と最も強力に相互作用する一つま
たは小数の核酸を選択することができる。選択／増幅ステップの循環は選択され
たゴールが達成されるまで続けられる。本発明において、このＳＥＬＥＸ法は仔
ウシ腸性ホスファターゼに対する核酸リガンドを得るために用いられる。
【００２２】 ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願書類中に記載されている。
【００２３】 「ＳＥＬＥＸ標的」または「標的」とはそのためにリガンドが必要である、対
象化合物または分子を指す。標的はタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、
グリコプロテイン、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝
産物、遷移状態類似体、補助因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子など
であってよく、限定されない。本発明において、ＳＥＬＥＸ標的は仔ウシ腸性ホ
スファターゼである。特に本出願における、ＳＥＬＥＸ標的は精製された仔ウシ
腸性ホスファターゼおよびその断片、仔ウシ腸性ホスファターゼを含有する短い
ペプチド類あるいは発現タンパク領域を含む。
【００２４】 ここで使用する「固体担体」とは、分子が共有結合あるいは非共有結合を通じ
て結合できる表面として定義される。これには、これに限るわけではないが、膜
、微量定量プレート、磁気ビーズ、帯電紙、ナイロン、ラングミュアー・ブロジ
ェットフィルム、機能性ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチ
レン、砒化ガリウム、金および銀が含まれる。アミノ、カルボキシル、チオール
またはヒドロキシル基などの官能基をその表面に含有させることのできる、当該
分野で知られたその他の材料のいずれもこれに含めることができる。これは、こ
れに限るわけではないが、球形および溝付きの表面を始めとする、いかなるトポ
ロジーを持つ表面であってもよい。
【００２５】 Ａ．仔ウシ腸性ホスファターゼに対する核酸リガンドの調製 好ましい実施態様において本発明の核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法から得られる
。ＳＥＬＥＸ法は現在放棄された、米国特許第０７／５３６，４２８号「指数関
数的濃縮によるリガンドの系統的進化」、米国特許第５，４７５，０９６号「核
酸リガンド」、および米国特許第５，２７０，１６３号（Ｗ０９１／１９８１３
も参照のこと）「核酸リガンド同定法」に記載されている。これらの出願は、そ
れぞれここに参照として含めてあるが、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。
【００２６】 ＳＥＬＥＸ法はそれぞれ非反復配列を持ち、所望の標的化合物または分子に特
異的に結合する性質を持つ核酸分子である１クラスの生成物を提供する。標的分
子は好ましくはタンパク質であるが、その他にも炭水化物、ペプチドグリカン類
、およびさまざまな小分子であってもよい。ＳＥＬＥＸ法はまた細胞表面やウイ
ルスなどの標的となる生物学的構造体に対して、その生物学的構造体と一体とな
っている分子との特異的相互作用を通じて用いることもできる。
【００２７】 もっとも基本的な形のＳＥＬＥＸ不は下記の一連のステップにより定義すること
ができる。 １）さまざまな配列をもつ核酸の候補混合物を調製する。候補混合物には一般に
決まった配列（つまり候補混合物のメンバーそれぞれは同じ位置に同じ配列を含
有する）とランダム化した配列の領域が含まれる。きまった配列の領域は（ａ）
下記に記載の増幅ステップにおいて役立つ、（ｂ）標的に結合することがわかっ
ている配列を模倣する、あるいは（ｃ）候補混合物の核酸中のある構造配列の濃
度を高めるために、選択される。ランダム化配列は全面的にランダム化（例えば
ある塩基をある位置に見いだす確立は四分の一である）または部分的にランダム
化（例えばある塩基をある位置に見いだす確立は０パーセントから１００パーセ
ントまでの間のいずれかである）することができる。 ２）候補混合物は標的と候補混合物のメンバー間の結合に好ましい条件の下で選
択された標的と接触させる。これらの状況のもとでは標的と候補混合物の核酸の
間の相互作用により、標的に対して最も親和力の強い核酸と標的との間に核酸-
標的ペアが形成されると考えられる。 ３）標的に対して最も親和力の高い核酸と標的に対する親和力がより低い核酸と
を分配する。この候補混合物中に存在するうちで最も親和力の高い核酸に相当す
るのはきわめて少数の配列のみ（そしておそらく核酸一分子のみ）であるので、
分配を通じて維持される、候補混合物中の核酸量がかなりの量（約５-５０％）
となるように、分配基準を設定することが一般的に望ましい。 ４）標的に対する親和力が比較的高いとして分配中に選択された核酸をついで増
幅し、標的に対する親和力が相対的により高められた核酸に富む新しい候補混合
物を作り出す。 ５）上記の分配および増幅ステップを繰り返すことにより、新しく形成された候
補混合物は、より少ない非反復配列を含有し、標的に対する核酸の平均親和度は
一般に増加する。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は当初の候補混合物から標的分子に
対し最も高い親和力を持つ核酸を表す、一つまたは小数の非反復配列を含有する
候補混合物を作り出すであろう。
【００２８】 この基本的ＳＥＬＥＸ法は多数の特定の目的物を作り出すために修正されてきた
。例えば１９９２年、１０月１４日に出願され、現在放棄された米国特許第０７
／９６０，０９３号、米国特許第５，７０７，７９６号、これらは共に「構造に
基づき核酸を選択する方法」と言う標題を持つが、においてはベントＤＮＡなど
、特定の構造的特徴を持つ核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動法を組みあ
わせたＳＥＬＥＸ法の使用について記載している。１９９３年９月１７日に出願
され、現在放棄された米国特許第０８／１２３，９３５号「核酸リガンドの光選
択」、米国特許第５，７６３，１７７号および米国特許第６，００１，５５７号
、共に「指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選
択と溶液ＳＥＬＥＸ」という標題であるが、これらは標的分子に結合および／ま
たは光架橋および／または光不活性化する能力のある光反応性基を含有する核酸
リガンド選択のためのＳＥＬＥＸに基づく方法を記載している。米国特許第５，
５８０，７３７号「テオリフィンおよびカフェインを見分ける高親和性核酸リガ
ンド」は密接に関連している分子間を見分けることのできる高度に特異的な核酸
リガンドを同定するための方法、カウンターＳＥＬＥＸと呼ばれる、を記載して
いる。米国特許第５，５６７，５８８号「指数関数的濃縮によるリガンドの系統
的進化：溶液ＳＥＬＥＸ」は、標的分子に対し親和性の高いオリゴヌクレオチド
と親和性の低いオリゴヌクレオチドとを効率的に分配することができるＳＥＬＥ
Ｘ法に基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号「ＨＩＶ-
ＲＴおよびＨＩＶ-１ ｒｅｖに対する核酸リガンド」はＳＥＬＥＸ法を行った
後で改良核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３
７号「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：Ｃｈｅｍｉ-ＳＥＬＥＸ」
はリガンドをその標的へ共有結合で結びつける方法を記載している。
【００２９】 ＳＥＬＥＸ法はリガンドに、改善された生体内安定性、または改善されたデ
リバリ特性などの改善された特性を与える修飾ヌクレオチドを持つ高親和性核酸
リガンドの同定を行う。このような修飾の例としてはリボースおよび／またはリ
ン酸基および／または塩基における化学的置換があげられる。修飾ヌクレオチド
を含有するＳＥＬＥＸ法同定核酸リガンドは米国特許第５，６６０，９８５号「
修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」に記載されているが、ここ
にはピリミジンの５-および２’-位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有
するオリゴヌクレオチドが記載されている。上記米国特許第５，６３７，４５９
号では２’-アミノ（２’-ＮＨ2）、２’-フルオロ（２’-Ｆ）、および／また
は２’-Ｏ-メチル（２’-ＯＭｅ）で修飾された一つ以上のヌクレオチドを含有
する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。１９９４年６月２２日に出
願され、現在放棄された米国特許第０８／２６４，０２９号「分子間求核置換に
よる既知および新規の２’修飾ヌクレオシドの新規調製法」では様々な２’-修
飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００３０】 ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号「指数関数的濃縮によるリ
ガンドの系統的進化：キメラＳＥＬＥＸ」、米国特許第５，６８３，８６７号「
指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ブレンドＳＥＬＥＸ」にそれぞれ
記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドと他の選択されたオリゴ
ヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位とを組みあわせることを含
有する。これら応用例によりオリゴヌクレオチドの広範囲に渡る形およびその他
の性質、ならびに効率的な増幅および再現性とその他の分子の持つ所望の性質と
を組みあわせることができる。
【００３１】 米国特許第５，４９６，９３８号はＳＥＬＥＸ方を行った後に改良核酸リガンド
を得る方法を記載している。この「ＨＩＶ-ＲＴおよびＨＩＶ-１ ｒｅｖに対す
る核酸リガンド」という標題の特許は、ここに参照として特に含めてある。
【００３２】 核酸を診断に使用する上で直面する潜在的な問題として、所望の効果が発現す
るまえに、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオチドが体液中ではエンドヌクレ
アーゼやエキソヌクレアーゼなどの細胞内、細胞外の酵素により、速やかに分解
されてしまう恐れのあることである。この核酸リガンドの生体内安定性を増加す
るため、あるいは核酸リガンドのデリバリを強化、または媒介するために核酸リ
ガンドのある種の化学修飾を行うことができる。例えば１９９３年９月９日に申
請され、現在放棄された米国特許第０８／１１７，９９１号、および米国特許第
５，６６０，９８５号、標題はともに「修飾されたヌクレオチドを含有する高親
和性核酸リガンド」であり、ここに参照として特に含めてある、を参照されたい
。本発明において考えられている核酸リガンドの修飾は、これに限るわけではな
いが、核酸リガンド塩基あるいは核酸リガンド全体にさらに電荷、分極性、疎水
性、水素結合、静電的相互作用、および流動性を与える他の化学基を提供するも
のが含まれる。このような修飾には、これに限るわけではないが、２’-位糖修
飾、５-位ピリミジン修飾、８-位プリン修飾、環外アミン修飾、４-チオウリジ
ンの置換、５-ブロモまたは５-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、ホスホロチ
オエートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、イソシチジン、イソグア
ニジンなどのイソ塩基など珍しい塩基対合の組み合わせなどが含まれる。修飾に
はキャッピングなどの３’および５’修飾もまた含まれる。本発明の好ましい実
施様態において、核酸リガンドはピリミジン残基の糖部分における２’-フルオ
ロ（２’-Ｆ）修飾されたＲＮＡ分子である。
【００３３】 修飾はＳＥＬＥＸプロセス前の修飾であってもＳＥＬＥＸプロセス後の修飾で
あってもよい。ＳＥＬＥＸプロセス前の修飾はＳＥＬＥＸ標的に対する特異性と
生体内安定性の改善の両方を核酸リガンドに対して行う。２’-ＯＨ核酸リガン
ドに対してＳＥＬＥＸプロセス後の修飾を行うと核酸リガンドの結合能力に悪影
響を及ぼすことなく生体内安定性が向上する。
【００３４】 その他の修飾は当業者に公知である。このような修飾はＳＥＬＥＸプロセス後
に行ってもよく（予め同定された未修飾リガンドの修飾）あるいはＳＥＬＥＸ法
中に含めて行っても良い。
【００３５】 本発明の核酸リガンドは先にその概略を示し、その全体を参照としてここに含
めてあるＳＥＬＥＸ出願書類において詳細にその手段が記載されているＳＥＬＥ
Ｘ法を通じて調製される。このＳＥＬＥＸ法は精製した仔ウシ腸性ホスファター
ゼ、またはその断片を標的として用いて行うことができる。別法として、全長仔
ウシ腸性ホスファターゼ、あるいは仔ウシ腸性ホスファターゼの個々の領域を適
当な発現系中で生成することができる。別法として、ＳＥＬＥＸ法は仔ウシ腸性
ホスファターゼ中に見いだされる配列を含有する合成ペプチドを標的として用い
て行うこともできる。最適核酸リガンドに厳密にいくつのアミノ酸が必要である
かは当業者にとって日常的な実験で決定される。
【００３６】 幾つかの実施様態において、核酸リガンドを選択された波長を持つ光で照射す
ると核酸リガンドはその標的に共有結合で結合する。このような核酸リガンドを
得る方法は、１９９３年９月１７日に申請され、現在放棄された米国特許第０８
／１２３，９３５号「核酸リガンドの光選択」、および米国特許第５，７６３，
１７７号および米国特許第６，００１，５５７号、共に「指数関数的濃縮による
リガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」という標題で
あるが、に記載されており、これらはそれぞれここにその全体を参照として特に
含めてある。
【００３７】 好ましい実施様態において、ＳＥＬＥＸ法はプラスチックの微量定量プレート
のウエル表面にコートした全長仔ウシ腸性ホスファターゼを用いて行われる。そ
れから一本鎖ＲＮＡ分子の候補混合物をプレートのウエル中で結合仔ウシ腸性ホ
スファターゼに接触させる。所定の時間、選択された温度でインキュベートした
後、プレートのウエルを洗浄して結合していない候補核酸リガンドを除去する。
仔ウシ腸性ホスファターゼに結合した核酸リガンドは溶液中に放出され、ポリメ
ラーゼ連鎖反応を用いて増幅される。増幅した候補混合物を用いてＳＥＬＥＸ法
の次の回を始める。
【００３８】 仔ウシ腸性ホスファターゼに対する所望の親和力を持つ核酸リガンドを単離し
た後、アッセイを行ってこれらが酵素活性を阻害するかどうか決定することがで
きる。これらは仔ウシ腸性ホスファターゼ活性を決定するために当該分野で公知
の数多くの方法のどれを用いて行ってもよい。例えば、いくつかの実施例におい
てはアッセイとしてクロマゲンｐ-ニトロフェニルホスフェートアッセイを用い
ることができる。
【００３９】 本発明の方法によって単離された核酸リガンドは仔ウシ腸性ホスファターゼを
用いるアッセイ系中で極めて多くの用途を持つ。例えば、いくつかの実施様態に
おいて、仔ウシ腸性ホスファターゼが非阻害的核酸リガンドのアフィニティー部
位に結合しないようにして、この非阻害的核酸リガンドを仔ウシ腸性ホスファタ
ーゼと接合することができる。核酸リガンドが接合した仔ウシ腸性ホスファター
ゼ分子それ自身は標的分析物特異性試薬に接合できる。分析物特異性試薬がその
標的分析物に結合すると、仔ウシ腸性ホスファターゼを溶液に加えたときに、仔
ウシ腸性ホスファターゼのオリジナル分子に接合した核酸リガンドへと結合する
。この標的分析物特異性試薬にさらに仔ウシ腸性ホスファターゼが結合すること
により、検出可能な基質を加えると、非常に強化された信号が得られる。このよ
うにして仔ウシ腸性ホスファターゼ接合抗体などの仔ウシ腸性ホスファターゼに
接合する分析物特異性試薬を用いる数多くのアッセイ系の感度を劇的に向上する
ことができる。
【００４０】 その他の実施様態において、仔ウシ腸性ホスファターゼ核酸リガンド配列が別
の標的分子用の核酸リガンド配列と隣接している核酸を合成することができる。
得られた核酸リガンドはその標的分子に結合し、仔ウシ腸性ホスファターゼと適
当な基質を加えることにより、この結合を検出することができる。このようにし
て、存在する標的分析物の量は基質に対するＣＩＰ活性により生じる信号の量に
直接比例することになる。
【００４１】 その他の実施様態において、非阻害ＣＩＰ核酸リガンドは特定の分析物に結合
することのできる他の試薬に接合することができる。例えば核酸リガンドは抗体
、タンパク質、糖またはペプチドと接合することができる。このような試薬は実
際の酵素がリガンド接合検出試薬とは別に加えられているため、従来の抗体接合
仔ウシ腸性ホスファターゼよりも貯蔵寿命が長い。
【００４２】 仔ウシ腸性ホスファターゼの阻害的核酸リガンドはまた大いに有用である。阻
害性仔ウシ腸性ホスファターゼ核酸リガンドはタンパク質検出のための均一アッ
セイ系中で使用できる。この実施態様において、阻害性ＣＩＰ核酸リガンドはＣ
ＩＰと標的分析物との結合が両立しないように、独立した標的分析物に特異的な
核酸リガンドと隣接して合成される。この系はＣＩＰ、ＣＩＰ基質およびＣＩＰ
活性をほぼ完全に阻害する濃度で存在する核酸リガンドにより設計される。特定
の分析物を含有するテスト溶液を加えると、核酸リガンドからＣＩＰが放出され
る。従って分析物濃度の増加は得られたＣＩＰ信号に直接比例する。阻害性核酸
リガンドは修飾することなく使用できるが、必要に応じて、小分子のＣＩＰ阻害
剤をアプタマーに接合する、あるいはポリエチレングリコール、デキストランな
ど高分子量を持つ部分を添加して立体障害により阻害性能を助けるなどを行い、
より強いＣＩＰ阻害剤を生成することができる。当然のことながら、これらの実
施様態はいずれもリポーター酵素としてのＣＩＰだけでなく、これに限るわけで
はないが、ペルオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、グルコース-６-ホス
フェートデヒドロゲナーゼおよびグルコースオキシダーゼなどの酵素を含めたそ
の他のリポーター酵素にも等しく用いられる。
【００４３】 本発明のＳＥＬＥＸ標的、ＣＩＰ、は疎水性相互作用のみによりＳＥＬＥＸプ
ロセス中に微量定量プレートの表面に固定化することができる。この固体支持体
に対する固定化により微量定量プレート中で洗浄および溶出ステップを行うこと
ができる。ＳＥＬＥＸ法のこれまでの実施様態では標的を何らかの方法で修飾す
ることにより固体支持体へ標的を固定していた。このような修飾には標的の処置
が必要となり、時間がかかるものとなることが多い。それに較べて、本発明によ
り提供される疎水性固定化法は極めて簡単で、標的の処置は全く必要ない。さら
にロボット対応性微量定量プレートフォーマットを用いることによりこのＳＥＬ
ＥＸ法は自動化することができる。
【００４４】 実施例 下記の実施例は説明のためだけに掲げるものである。これらは本発明の範疇を
何ら制限するものではない。
【００４５】 実施例１ 仔ウシ腸性ホスファターゼに対する核酸リガンドを得るためにＳＥＬＥＸ法を使
用する 仔ウシ腸性アルカリホスファターゼ（１０ｍｇ／ｍｌ、分子量５２，４６５ダ
ルトン）をベーリンガーマンハイム社（インディアナ州、インディアナポリス）
から購入した。一本鎖ＤＮＡ-プライマーとテンプレートはオペロンテクノロジ
ーズ社（カリフォルニア州、アラミダ）により合成された。
【００４６】 ＳＥＬＥＸ法は詳しくＦｉｔｚｗａｔｅｒおよびＰｏｌｉｓｋｙ（１９９６）
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２７５-３０１に記載されている。
手短に述べると、二本鎖転写テンプレートを４０Ｎ８ｓｓＤＮＡのＫｌｅｎｏｗ
断片延長により調製した。 配列番号：４４
【化１】 ５Ｎ８プライマー使用： 配列番号：４５
【化２】 これはＴ７ポリメラーゼプロモータ（下線）を含有している。ＲＮＡを、ここに
その全体を参照として含めてあるＦｉｔｚｗａｔｅｒおよびＰｏｌｉｓｋｙ（１
９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２７５-３０１にすでに記
載されている、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより調製した。すべての転写反応を糖
部分が２’-フルオロ（２’-Ｆ）修飾されているピリミジンヌクレオチドの存在
下で行った。この置換によりホスホジエステル結合の分割に２’-ヒドロキシル
部分を使用するリボヌクレアーゼに対する耐性が強化される。さらに詳しくは、
各転写混合物には３．３ｍＭ２’-Ｆ ＵＴＰおよび３．３ｍＭ２’-Ｆ ＣＴＰ
が１ｍＭ ＧＴＰおよびＡＴＰと共に含まれていた。このようにして生成した最
初のランダム化ＲＮＡライブラリには３ｘ１０14個の分子（５３５ピコモル）が
含まれた。
【００４７】 このランダム化ＲＮＡライブラリを用いてＳＥＬＥＸプロセスを８回行った。
各回とも２時間にわたり、表１に示す濃度のＣＩＰを含有するダルベッコ社のＰ
ＢＳ２００μｌでＬｕｍｉｎｏプレート（ラブシステムス社、マサチューセッツ
州、ニーダムハイツ）を室温で塗布した。塗布後、第１回から第３回まではＴＢ
Ｓに溶かしたスーパーブロックブロッキングバッファー（イリノイ州、ロックフ
ォードのピアースケミカル社）で、第５回から第８回まではＳＨＭＣＫにバッフ
ァー［２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．３５，１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2および１ｇ／ｌカゼイン（Ｉ-ブ
ロック；トロピックス社）］を加えたものによりウエルをブロックした。結合お
よび洗浄バッファーはＳＨＭＣＫに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有したバッフ
ァーを加えたものであった。ＳＥＬＥＸプロセスの各回でＲＮＡを２００μｌの
結合バッファーにより希釈し、タンパクでコートし、結合バッファーで予め洗浄
したウエル中で２時間３７℃でインキュベートした。各回で投入したＲＮＡを表
１に示す。結合の後それぞれ２００μｌの洗浄液で６回洗浄した。洗浄ステップ
の後、乾燥ウエルを９５℃のヒートブロックの上に５分間置いた。標準ＡＭＶ逆
転写酵素反応（５０μｌ）を４８℃で直接ウエル中で行い、反応生成物を標準Ｐ
ＣＲおよび転写反応に使用した。このテンプレート増幅と逆転写ステップに対し
ては二つの合成プライマー５Ｎ８（上記参照）と３Ｎ８：
【化３】 を用いた。第６回から第８回まではＲＮＡプールの５’-末端をビオチニル化す
るため、転写はビオチン-ＧＡＰの存在下で行った。
【００４８】 増幅した親和性リッチの８回目のプールを８％ポリアクリルアミドゲル上で精
製し、ｓｓＤＮＡに逆転写し、このＤＮＡをＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩ制
限エンドヌクレアーゼ部位を含有するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
により増幅した。ＰＣＲ断片をクローン化し、プラスミドを調製し、標準技法に
従い配列分析を行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．
３ｖｏｌｓ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ）。４３個の個別のク
ローンの配列を図１に示す。これらのクローンの大半（３９個）はグループＡお
よびグループＢと名付けた二つのはっきり異なる配列のうちの一つを示していた
（図１）。１２個のクローンから得られる配列がグループＡのメンバーであり、
２７個のクローンから得られる配列がグループＢのメンバーであった。グループ
Ａの１２個のクローン中の可変領域を調べると、９つの極めて似ているが反復し
ていない配列がわかった。グループＢの２７個のクローンの可変領域を調べると
、非反復配列は７つしか見あたらず、しかもこれらはほんの２，３のヌクレオチ
ドが異なっているにすぎなかった（図１）。実際、配列のうち２１は全く同一で
あり、図１のグループＢ部分の一番上に示す、クローンＤＤ-１７２-２-２０配
列番号：１３で表すことができる。最終的に４個の配列を得て、任意にグループ
Ｃに入れた（図１）。全体としてこのデータは極めてリッチな配列プールを表し
ている。
【００４９】 実施例２ 核酸リガンドの親和性に富むプールの親和性および個々の仔ウシ腸性ホスファタ
ーゼ核酸リガンドの親和性の定量 実施例１の第一回目のランダムライブラリおよび８回目の親和性に富むプール
の親和性を５‘-末端上をビオチニル化したＲＮＡ-転写物を用いてプレートベー
スのアッセイによって行った。手短にいうと、不透明な白色９６穴Ｌｕｍｉｎｏ
プレートをストレプトアビジン（１０から２０μｇ／ウエル）でコートした。９
６穴微量定量プレート（一ウエル当たりおよそ３０ｆＭｏｌのＲＮＡ）のそれぞ
れのウエルに８回目のプールまたはランダムライブラリのいずれかから得たビオ
チニル化ＲＮＡを別々に加えた。１時間室温でインキュベートした後、ウェルを
２００ｍｌのＳＨＭＣＫにバッファーを加えたもので３回洗浄した。ＣＩＰの濃
度をさまざまに変えてＳＨＭＣＫとバッファーの中に加え、これをウエルに入れ
、３７℃で１時間インキュベートした。ウエルを２００μｌのＳＨＭＣＫにバッ
ファーを加えたもので４回洗浄し、０．１ＭのジエタノールアミンｐＨ１０，１
０ｖｏｌ％のサファイア強化液（マサチューセッツ州、ベッドフォードのトロピ
ックス社）、１７ｍｌ／ｍｌのＣＳＰＤ（トロピックス社）、１ｍＭ ＭｇＣｌ 2 および０．０２％アジドナトリウムからなる、１００μｌの溶液を加えた。３
０分間インキュベートしたのち、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（ニューハンプシャー州、ナ
シュア）ＬＢ ９６Ｐ照度計を用いて化学発光を測定した。発光レベルを１秒に
渡り積分し、このデータをグラフパッドプリズムのバージョン２．０１（カリフ
ォルニア州、サンディエゴのグラフパッドソフトウエア社）を用いて、Ｓ字状の
用量-応答曲線（可変勾配）Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋［（Ｔｏｐ-Ｂｏｔｔｏｍ）／１
＋１０(Log EC50-X)(勾配)］に当てはめた。重複測定をそれぞれ独立して考慮し
、続けて行った二つの反復が０．０１％未満の偏差平方和（曲線から点までの相
対距離、１／Ｙ2）で変動するとき、収斂とした。
【００５０】 この手順を用いると親和力を高めた第８回目のプールは、３７℃でのＣＩＰの
平衡解離定数（Ｋｄ）が２５０ｘ１０-12Ｍ（図２；ＲＬＵは相対発光単位）を
示した。グループＢの代表二つ、ＤＤ-１７２-２-２０とＤＤ-１７２-２-４をテ
ストしたところサブナノモルの解離定数（それぞれ２６０ｐＭと１３０ｐＭ）を
示した。グループＡの各メンバー（ＤＤ-１７２-２-９、ＤＤ-１７２-２-１７）
とグループＣの一メンバー（ＤＤ-１７２-２-６）もまた試験したが、低ナノモ
ル解離定数を示した（表２および図３）。
【００５１】 実施例３ 仔ウシ腸性ホスファターゼ核酸リガンドの阻害活性の測定 ＣＩＰをＳＨＭＣＫとバッファー（洗剤抜き）をあわせたもので希釈し１ｎＭ
とした。この溶液を２５０μｌのアリコートに分け実施例２で得た、またはラン
ダムＲＮＡ-ライブラリからの別の核酸リガンドを最終アプタマー濃度が１００
ｎＭとなるようにそれぞれのアリコートへ加えた。核酸リガンド添加量は１．３
から３．６μｌの間であり、したがってＣＩＰの濃度は大きくは変化しなかった
。対照として、一つのアリコートには２．５μｌの水を加えた。溶液を１０分間
室温でインキュベートし、当初の２５０μｌのアリコートからそれぞれ１００μ
ｌの２つのアリコートを移して微量定量プレートのウエルを２つづつ作成した。
さらに５分間インキュベートを行い４３．６ｍＭｐ-ニトロフェニルホスフェー
トクロマゲン基質（ｐＮＰＰ；ミズーリ州、セントルイスのシグマ社）をＳＨＭ
ＣＫバッファー（洗剤およびタンパク質抜き）に溶解した液１００μｌを加えた
。４５分後、４０５ｎｍでの吸収をマイクロプレートリーダーを用いて定量した
。最終的な吸光度をＣＩＰを含有しない他は全く同一の溶液２００μｌを入れた
もう一つのウエルから測定したバックグラウンド吸光度を差し引くことによって
計算した。
【００５２】 図４に示すように、本アッセイの条件下では、２’-ＦピリミジンランダムＲ
ＮＡ-ライブラリ（Ｒ）もグループ２のクローンＤＤ-１７２-２-４（４）および
クローンＤＤ-１７２-２-２０（２０）もＣＩＰの活性を阻害することができな
かった。しかし、グループ１から得たクローン、すなわちＤＤ-１７２-２-９（
９）、ＤＤ-１７２-２-１７（１７）およびＤＤ-１７２-２-２９（２９）は、基
質濃度（２１．８ｍＭ）がアプタマー濃度（５０ｎＭ）の４００，０００倍以上
であるという事実にも関わらず、測定されたＣＩＰ活性を４０％減少させた。も
ちろんＣＩＰのｐＮＰＰに対するＫｍはここで使用したバッファー条件では定量
していない。
【００５３】
【表１】 ＳＥＬＥＸ ＲＮＡおよびタンパク質投入量
【００５４】
【表２】 ３７℃での各２’-ＦピリミジンＲＮＡ-アプタマーに対する平衡解離定数
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は第８回目のＳＥＬＥＸプールから得た核酸リガンド配列を示す。
【図２】図２はランダム２’-Ｆ ＲＮＡ（黒い四角）と第８回目のＳＥＬＥＸ
プール（黒丸）に対する３７℃での平衡解離定数を求めるためのＣＩＰ結合等温
線を示す。データは各点における２回の測定の平均（＋／-）ＳＥＭ（標準誤差
マージン）として示す。
【図３】図３は第８回目のＳＥＬＥＸプールからの各クローンに対する３７℃で
の平衡解離定数を求めるためのＣＩＰ結合等温線を示す。データは各点における
２回の測定の平均（＋／-）ＳＥＭとして示す。
【図４】図４はＣＩＰ阻害実験の結果を示す。核酸リガンド配列ＤＤ-１７２-２
-４（４）（配列番号：３５）、ＤＤ-１７２-２-９（９）（配列番号：８）、Ｄ
Ｄ-１７２-２-１７（１７）（配列番号：２）、ＤＤ-１７２-２-２０（２０）（
配列番号：１３）およびＤＤ-１７２-２-２９（２９）（配列番号：３）に加え
ランダム２’-Ｆ ＲＮＡ（Ｒ）をテストし、そのＣＩＰ活性阻害能を求めた。
測定を２回行い、データは平均＋／-標準偏差で示した。各グループのデータは
核酸を加えなかった場合（０）のＣＩＰ活性と比較した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR13 QR24 QR32 QR35 QR55 QR58 QR82 QS34 QX01 QX02

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）核酸の候補混合物を調製するステップと、 ｂ）核酸の候補混合物を仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）と接触させるステ
    ップであって、ここで候補混合物と比較し、ＣＩＰに対する親和力が高い核酸を
    残りの候補混合物から分配することができ、 ｃ）親和力の高い核酸を残りの候補混合物から分配するステップ、および ｄ）親和力の高い核酸を増幅し、ＣＩＰに対する親和力が比較的高く、またＣＩ
    Ｐに対する結合特異性を持つ核酸に富む核酸混合物を得、それによりＣＩＰの核
    酸リガンドを同定するステップ、 を含む方法にしたがい同定された、仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に対
    する核酸リガンド。
  2. 【請求項２】 図１に示す配列番号１〜４３からなる群から選択される、Ｃ
    ＩＰに対する、精製された非天然ＲＮＡリガンド。
  3. 【請求項３】 仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に対する精製され単離
    された非天然核酸リガンド。
  4. 【請求項４】 前記ＣＩＰが疎水性相互作用により固体担体に結合されてお
    り、ステップｂ）-ｃ）が該固体担体の表面上で行われる請求項１の核酸リガン
    ド。
  5. 【請求項５】 前記固体担体が微量定量プレートである請求項４の核酸リガ
    ンド。
  6. 【請求項６】 前記微量定量プレートがポリスチレンからなる請求項５の核
    酸リガンド。
  7. 【請求項７】 前記核酸の候補混合物が一本鎖の核酸からなる、請求項１の
    核酸リガンド。
  8. 【請求項８】 前記一本鎖の核酸がリボ核酸である請求項７の核酸リガンド
    。
  9. 【請求項９】 前記一本鎖の核酸がデオキシリボ核酸である請求項７の核酸
    リガンド。
  10. 【請求項１０】 前記核酸の候補混合物が２’-Ｆ（２’-フルオロ）修飾リ
    ボ核酸である請求項８の核酸リガンド。
  11. 【請求項１１】 前記核酸リガンドが一本鎖である、請求項３の精製され単
    離された非天然核酸リガンド。
  12. 【請求項１２】 前記核酸リガンドがＲＮＡである、請求項１１の精製され
    単離された非天然核酸リガンド。
  13. 【請求項１３】 前記リガンドが２’-フルオロ（２’-Ｆ）修飾ヌクレオチ
    ドからなる、請求項１２の精製され単離された非天然ＲＮＡリガンド。
  14. 【請求項１４】 ａ）核酸の候補混合物を調製するステップと、 ｂ）核酸の候補混合物を仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）と接触させるステ
    ップであって、ここで候補混合物と比較しＣＩＰに対する親和力が高い核酸を、
    残りの候補混合物から分配することができ、 ｃ）親和力の高い核酸を、残りの候補混合物から分配するステップと、および ｄ）親和力の高い核酸を増幅し、ＣＩＰに対する親和力が比較的高く、またＣＩ
    Ｐに対する結合特異性を持つ核酸に富む核酸混合物を得、それによりＣＩＰの核
    酸リガンドを同定するステップと を含む、仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に対する核酸リガンドを同定す
    る方法。
  15. 【請求項１５】 さらに ｅ）ステップｂ）、ｃ）およびｄ）を繰り返すステップを含有する請求項１４の
    方法。
  16. 【請求項１６】 前記核酸の候補混合物が一本鎖の核酸からなる、請求項１
    ４の方法。
  17. 【請求項１７】 前記一本鎖の核酸がリボ核酸である請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 前記一本鎖の核酸がデオキシリボ核酸である請求項１６の
    方法。
  19. 【請求項１９】 前記核酸が２’- Ｆ（２’- フルオロ）修飾リボ核酸であ
    る、請求項１７の方法。
  20. 【請求項２０】 ａ）仔ウシ腸性ホスファターゼ（ＣＩＰ）に対する非阻害
    性核酸リガンドを提供するステップと、 ｂ）前記核酸リガンドがＣＩＰの別の分子に特異的に結合できる状態を保ちつつ
    、前記核酸リガンドをＣＩＰの各分子へ接合するステップと、 ｃ）前記核酸リガンドへ接合したＣＩＰを標的分析物特異性試薬と結合し、修飾
    した標的分析物特異性試薬を形成するステップと、 ｄ）前記修飾した標的分析物特異性試薬を、前記標的分析物を含有すると思われ
    るテスト混合物と接触させるステップと、 ｅ）前記標的分析物に結合している修飾した標的分析物特異性試薬を前記標的分
    析物に結合していない修飾した標的分析物特異性試薬から分配するステップと、 ｆ）前記標的分析物に結合している修飾した標的分析物特異性試薬を外来性ＣＩ
    Ｐと接触させることにより、前記外来性ＣＩＰが前記修飾された標的分析物特異
    性試薬と接合した前記核酸リガンドと結合するステップと、および ｇ）前記標的分析物特異性試薬と結合したＣＩＰの活性を検出するステップ を含み、ここでＣＩＰ活性レベルは前記テスト混合物中に存在する前記標的分析
    物の量に比例しているものである、テスト混合物中の標的分子の検出方法。
  21. 【請求項２１】 ａ）ＣＩＰに対する非阻害親和性部位と標的分析物に対す
    る親和性部位を持ち、ＣＩＰと前記標的分析物に同時に結合することができる核
    酸リガンドを提供するステップと、 ｂ）前記テスト混合物を前記核酸リガンドと接触させるステップと、 ｃ）前記標的に結合した核酸リガンドと前記標的分析物に結合していない核酸リ
    ガンドとを分配するステップと、 ｄ）前記標的に結合した核酸リガンドをＣＩＰと接触させるステップと、および ｅ）前記ＣＩＰの活性を検出するステップ を含み、ここでＣＩＰの活性レベルは前記テスト混合物中に存在する前記標的分
    析物の量に比例するものである、テスト混合物中の標的分析物の検出方法。
  22. 【請求項２２】 ａ）標的分析物に結合することのできる部分、および ｂ）ＣＩＰに対する核酸リガンド、 を含有する標的分析物の検出用試薬。
  23. 【請求項２３】 前記部分が抗体、核酸リガンド、タンパク質、ペプチドお
    よび糖からなる群から選択される、請求項２２の試薬。
  24. 【請求項２４】 ＣＩＰに対する前記核酸リガンドがＣＩＰの活性を阻害す
    る、請求項２２の試薬。
  25. 【請求項２５】 ａ）阻害性ＣＩＰ核酸リガンドを提供するステップと、 ｂ）前記核酸を標的分析物特異性試薬と接合し、修飾した標的分析物特異性試薬
    を形成するステップ、ここで、前記標的分析物と前記ＣＩＰの前記修飾した標的
    分析物特異性試薬への結合は互いに両立しないものであり、 ｃ）前記修飾した標的分析物特異性試薬と所定量のＣＩＰとを接触させるステッ
    プと、ここで前記ＣＩＰは前記阻害性核酸リガンドと結合して活性が阻害されて
    おり、 ｄ）前記テスト混合物を前記ＣＩＰに結合している前記修飾した標的分析物特異
    性試薬と接触させるステップと、および ｅ）前記テスト混合物中のＣＩＰ活性を検出するステップ を含み、ここで標的分析物を前記修飾した標的分析物特異性試薬と結合すること
    により、ＣＩＰの前記阻害性核酸リガンドからの置換が生じ、該放出されたＣＩ
    Ｐの活性が前記テスト混合物中に存在する標的分析物の量に比例するものである
    、テスト混合物中の標的分析物の検出方法。
  26. 【請求項２６】 前記標的分析物特異性試薬が抗体、核酸リガンド、タンパ
    ク質、ペプチドおよび糖からなる群から選択される、請求項２５の方法。
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