KR101901025B1

KR101901025B1 - 당화혈색소 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101901025B1
Application number: KR1020160150557A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 김서경; 이상희; 안지영
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-09-20
Also published as: KR20180053146A

Abstract

본 발명은 당화혈색소 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 당화혈색소(HbA_1c)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 당화혈색소에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 이를 이용한 조성물 및 키트 등을 이용하여 당뇨 환자의 혈액 내 당화혈색소를 검출하여 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

당화혈색소 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to HbA1c protein and Uses Thereof}

본 발명은 당화혈색소 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

당뇨병은 최근 식생활이 서구화되고 생활 습관 변화를 배경으로 전 세계적으로 급증하고 있다. 당뇨병이란 체내에 흡수된 포도당이 제대로 이용되지 못하거나 인슐린 작용 부족에 의한 만성 고혈당 상태를 특징으로 하는 대사 질환으로, 만성일 경우 당뇨병 망막증, 신기능장애, 신경병증 등의 미세혈관 합병증을 일으킨다. 뿐만 아니라, 고혈압, 관상동맥 질환 등의 심혈관계 질환의 합병증을 동반하여 인간의 생명에 치명적인 위협을 줄 수 있는 만성 질환이다. 당뇨병의 위험인자로는 비만, 운동부족, 스트레스 등의 환경적 요인이 있으며, 가족적으로 발생하는 경우가 많기 때문에 특히 직계가족 중 당뇨병의 가족력의 유무를 확인하는 것이 중요하다. 당뇨병은 몸에서 인슐린이 발생되지 않아 발생하는 제 1형 당뇨병, 인슐린이 분비되기는 하지만 그 양이 충분하지 않거나 몸에서 이를 효과적으로 활용하지 못하여 발생하는 제 2형 당뇨병, 임신 중일 때 나타나는 임신성 당뇨 등으로 구분되지만, 종류와 상관없이 완치가 불가능한 진행성 질환이기 때문에 지속적인 치료와 관찰이 요구된다.

세계 인구 고령화 및 생활양식의 변화로 인하여 매년 당뇨병에 의한 당뇨병성 합병증 환자 및 사망자가 증가하는 추세이다. 세계보건기구 (World Health Organization, WHO)에 의하면 전 세계적으로 사망원인의 5%가 당뇨병에 의한 것이며 2030년 까지 당뇨병 환자가 두 배 이상 증가할 것으로 추측하고 있다. 특히 국내의 경우 당뇨병으로 인한 사망률이 국내 전체 사망원인 중 4위를 차지하고 있으며, 대한당뇨병학회의 연구 분석 자료에 의하면 국내 당뇨병 환자 규모는 2003년 286만 명에서 2030년 545만 명으로 급격히 증가할 것으로 예상하고 있다. 또한 2030년 국내 당뇨병 환자의 증가속도가 OECD 국가 중 최고 수준에 도달할 것으로 예측되어 당뇨병을 신속하게 진단할 수 있는 시스템 개발 구축이 필요하다.

당뇨병의 진단 당시 약 20%의 환자에서는 이미 당뇨병과 관련된 만성 합병증을 한 가지 이상 가진 경우가 많으며 특히 당뇨병의 초기 상태나 정도가 심하지 않은 경우에는 당뇨병과 관련된 임상증상들이 없을 수 있으며 따라서 자신이 당뇨병을 앓고 있는지 모르고 지내다 당뇨병의 합병증과 더불어 당뇨병이 처음 진단되는 경우가 있기 때문에 당뇨병의 조기 진단은 중요하다.

따라서 당뇨병의 조기 진단은 향후 당뇨병의 경과뿐만 아니라 만성 합병증의 예방과 진행과정에도 중요하므로 당뇨병의 위험요인들을 가진 경우 당뇨병 유무 확인 검사를 시행하여 조기 진단을 해야 한다. 현재 당뇨병의 조기 진단을 하기 위한 일반적인 검사법은 혈당검사, 경구 내당능장애 검사, 당화혈색소 (HbA_1c) 검사를 통하여 당뇨병을 진단하고 있다. 전 세계적으로 만성질환인 당뇨병의 위험성이 부각되면서 국가적 차원에서의 관리가 이루어지고 있으며, 혈당 검사는 적어도 8시간 공복 상태에서 채혈을 통해 혈중 혈당을 검사할 수 있지만, 나이, 성별 등의 개인차에 의한 혈당량 차이 때문에 진단 목적으로는 이용하지 않는다. 경구 내당능장애 검사의 경우 경구 당부하 검사를 시행하여 혈당을 측정하는 진단법이지만 시간이 많이 소요되며 검사 시 환자에게 고통이 수반된다는 단점이 있다. 당화혈색소 검사는 가장 널리 이용되는 당뇨병 진단법으로, 당화혈색소는 혈액 내 헤모글로빈이 혈당과의 비효소적 반응에 의해 일부 당화되는 것을 통칭한다. 당뇨병 환자에서 공복혈당과 식후혈당 측정은 수시로 변하는 혈당 상태를 제대로 반영하지 못하는 경우가 많기 때문에, 당화혈색소 검사의 경우 60~90일 동안의 평균 혈당에 비례하며 비교적 안정적인 결과를 보이며, 공복이 아닌 상태에서도 측정이 가능하여 최근 널리 이용되고 있다. 그러나 당화혈색소를 측정할 수 있는 바이오센서가 아직 정립되지 않은 상태이기 때문에 연구 개발에 많은 관심이 기울여 지고 있다.

더 상세하게는, 당화혈색소를 측정하기 위한 측정방법은 이온교환수지를 이용한 미니컬럼법 (minicolumn), 전기영동법(electrophoresis), 면역측정법, 고속액체크로마토그래피법 (high-performance liquid chromatography; HPLC) 등이 있다. 그러나 이러한 방법들은 기술적으로 복잡할 뿐만 아니라 분석 기기가 고가이며, 측정 속도가 느린 단점을 가지고 있으며, 당화혈색소 측정을 위해 소모되는 특수한 시약은 대부분 고가의 수입품을 이용하고 있어 당뇨의 진단을 위한 막대한 국가예산 지출이 불가피하다.

또한 현재 일반적으로 사용되고 있는 당화혈색소 측정 방법은 샘플 전처리 과정이 포함되어 있어 샘플 채취 및 확인까지 시간이 오래 걸리고 대량의 샘플은 분석하기 어렵다는 단점이 있다. 항원-항체를 기반으로 하는 측정 방법의 경우 항체 바이오프로브(bio-probe)의 크기가 커서 저분자에 대한 특이도가 떨어지며, 센서 표면에서의 활성을 유지하기 어려워 특정 센서에서만 응용이 가능하다는 한계가 있다.

따라서 효율적으로 당화혈색소 측정을 할 수 있는 고효율 검출 시스템 기술 개발이 요구되며, 특히 고효율 검출 시스템 개발을 위해서는 무엇보다 당화혈색소를 검출하기 위한 특이적인 물질에 대한 연구가 선행되어야 하는 실정이나 아직까지 그 연구가 미미하다.

대한민국 등록특허 제10-1340844호 대한민국 공개특허 제2013-0015414호

이에 본 발명자들은 상기와 같은 당화혈색소 검출 기법의 문제점들을 해결하고 보안하기 위하여 본 발명자들은 온도와 pH 등 환경에 안정적인 앱타머 소재를 사용하여 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 단백질을 빠르고 간편하게 검출할 수 있는 진단용 물질을 제조할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 단백질 특이적 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 검출용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 당뇨의 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 당뇨의 진단 또는 예후판단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료의 당화혈색소(HbA_1c) 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 HbA1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질, 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아민기, 바이오틴 및 는 티올기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5'말단 또는 3'말단에 표지될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 당뇨의 진단 또는 예후판단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 당뇨의 진단 또는 예후판단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료의 당화혈색소(HbA_1c) 존재 여부를 검출하는 방법으로서,(a) 당화혈색소(HbA_1c)를 포함하는 생물학적 시료와 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA_1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 당화혈색소(HbA_1c)를 확인하는 단계;를 포함하는 당화혈색소의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 또는 체액일 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) PCR 증폭을 통해 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 상기 증폭된 DNA 라이브러리를 대상으로 비대칭 PCR 기법 및 스트렙트아비딘을 이용하여 ssDNA를 제작하는 단계; (c) 상기 제작된 ssDNA과 HbA1c 단백질을 혼합시키는 단계; 및 (d) SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 HbA1c 단백질에 결합하는 DNA 앱타머를 분리하는 단계를 포함하는, HbA1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제조방법을 제공한다.

본 발명의 당화혈색소(HbA_1c)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 당화혈색소에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 이를 이용한 조성물 및 키트 등을 이용하여 당뇨 환자의 혈액 내 당화혈색소를 검출하여 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과와 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA를 비대칭 PCR 및 스트렙트아비딘 (streptavidin)을 이용하여 회수한 ssDNA을 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머로부터 PCR 기법을 통하여 증폭된 dsDNA 결과
레인 2: PCR 기법으로 확보한 dsDNA를 비대칭 PCR 기법과 스트렙트아비딘을 이용하여 제작한 ssDNA 결과
도 2는 네가티브 선별 이후인 7 라운드, 8 라운드, 9 라운드에서 용리된 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 21개의 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 중 네 종류의 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 HbA_1c 단백질과 DNA 앱타머의 결합력을 평가하기 위한 방법을 도식화한 것이다. Biacore 장비를 이용하고자 카르복실기를 가지고 있는 CM5 센서 칩 표면을 EDC/NHS 완충용액을 통해 활성화시키고 HbA_1c 단백질을 고정시켜 HbA_1c 특이 결합 DNA 앱타머와 결합시키는 각 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 HbA_1c 검출 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 당뇨가 의심되는 사람의 시료를 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머가 고정되어 있는 진단 키트에 처리하였을 때, 샘플 내 HbA_1c 단백질과 HbA_1c 특이 결합 앱타머의 결합에 의해 HbA_1c 단백질을 진단하는 시스템을 모식도로 나타낸 것이다.

본 발명자들은 기존의 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 단백질의 검출 방법보다 더욱 정확하고 신속하며 간단한 검출 방법을 개발하기 위하여, 당화혈색소 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 개발하였다. 본원에서 제공하는 DNA 앱타머는 타 단백질에는 결합하지 않고 당화혈색소 단백질에만 특이적으로 결합하므로, 당화혈색소 결합 유무를 통하여 당뇨병 진단 또는 예후 판단용으로 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 단백질에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 "DNA 앱타머"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 DNA 앱타머는 DNA 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)와 혼용하여 사용한다.

본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 "SELEX 방법"이란 임의적으로 합성된 DNA 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다 (Louis et al., 1992. Nature 355, 564-566). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열목록 제 1 서열 내지 제 21 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 한편, 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 21 서열의 DNA 앱타머는 본 명세서 도 4에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.

또한, 본 발명의 DNA 앱타머는 HbA_1c 단백질과 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 21 서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) Needleman and Wunsch, J.Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 기반으로 하는 HbA_1c 단백질 검출을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명의 HbA_1c 단백질 검출은 DNA 앱타머와 HbA_1c 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 형광물질, 예를 들어 플루오레세인 (fulorescein) Cy3 또는 Cy5, 방사성물질 또는 화학물질, 예를 들어 바이오틴 (biotin)으로 표지하거나 1차 아민 (primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 칩 또는 기판 상에 고정화할 수 있으며, 구체적으로 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 (microarray)형태일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "마이크로어레이"는 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이 (배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 마이크로어레이의 "기판"은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 가기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 막(membrane), 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다.

예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데하이드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민을 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 바이오티닐화 (biotinylated)될 수 있고, 이는 스트렙트아비딘이 코팅된 기판 상에 성공적으로 결합될 수 있다.

본 발명에서 HbA_1c 단백질 검출용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열목록 제 1 서열 내지 제 21 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열 또는 이 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 HbA_1c 단백질 검출에 사용하기 위한 설명서 또는 표지물질 (label)을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 사람의 생물학적 시료로부터 본 발명의 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 HbA_1c 단백질과의 결합반응을 통해 HbA_1c 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 용어 생물학적 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

DNA 앱타머 풀의 제작

<1-1> PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭

HbA_1c 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 양 말단에 앱타머 풀을 쉽게 증폭하기 위한 부위로서 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT 의 부위와 3'-AGATAGTAAGTGCAATCT를 구성하고, 중심에는 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100 bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATTGCACTTACTATCT-3'; 서열목록 제 22 서열)와 이를 100 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니아 (Bioneer, Korea)에 주문 제작하였다. [정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열목록 제 23 서열), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 24 서열), 비오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 25 서열)].

합성한 프라이머 및 40개의 연속 무작위 서열을 가지는 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였다. 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성으로는 증류수 35.7 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕와 Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)로 이루어져 있다.

PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 4분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 100 bp에서 밴드가 나타나는지 확인하였다. PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.

<1-2> 비대칭 PCR (asymmetric PCR ) 기법을 활용한 ssDNA 제작

PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 확보한 PCR 산물로부터 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR을 수행하였다. 비대칭 PCR 반응 조성은 획득한 주형 DNA 5 ~ 10 ㎕, 10X PCR 완충용액 10 ㎕, 10 mM dNTP 혼합물 8 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 10 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 1 ㎕, Ex Taq 중합효소 0.5 ㎕ (1 unit/㎕)와 55.5 ~ 65.5 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. 비대칭 PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 4분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15 cycle을 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 PCI 및 에탄올 침전법을 활용하여 증류수 50 ㎕에 DNA를 녹여 회수하였다.

<1-3> ssDNA 의 선별 및 회수

비대칭 PCR 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 바이오틴 (biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 잔여 primer를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 실시예<1-2>에서 획득한 50 ㎕의 반응액에 추가로 증류수 50 ㎕를 첨가한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액에서 순수한 ssDNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다.

상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 1 참고).

<1-4> ssDNA 앱타머의 구조 제작

상기 실시예 <1-3>을 통하여 확보한 ssDNA 앱타머 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X PBS buffer 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정하였다. 반응액을 85℃에서 5분간 끓여 변성시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.

< 실시예 2>

SELEX 기법을 이용한 HbA _1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별

<2-1> 카르복실 라텍스 (carboxyl latex)를 이용한 HbA _1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별

HbA_1c 단백질을 1 X PBS buffer로 전체 반응 부피를 조정한 후, 열처리하여 구조화된 ssDNA 앱타머 라이브러리와 1:10 비율로 혼합하여 4℃에서 1시간동안 반응시켰다.

카르복실 라텍스를 활성화시키기 위하여 우선 EDC (1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide) 25 ㎕와 NHS (N-hydroxysuccinimide) 25 를 상온에서 1분간 반응시킨 후 카르복실 라텍스 50 ㎕에 혼합하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 계속적인 활성화를 중단시키기 위하여 에탄올아민(Ethanolamine) 50 를 첨가하여 상온에서 10분간 추가로 반응시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다.

회수한 반응액에 1X PBS buffer 200 ㎕를 첨가하여 20분간 반응시켜준 후 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 활성화된 카르복실 라텍스에 HbA_1c 단백질과 DNA 앱타머 라이브러리를 혼합하여 반응시킨 용액을 첨가한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 카르복실 라텍스에 고정되지 못한 HbA_1c 단백질 및 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 0.5X PBS-T buffer (0.5% tween-20 in PBS buffer) 200 ㎕를 넣어 세척하는 과정을 3회 반복하였다. HbA_1c 단백질에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 (1X PBS buffer) 100 ㎕를 첨가하여 85℃에서 5분간 반응시켜 변성시킨 뒤, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 DNA 앱타머 용출용액으로부터 순수한 DNA 앱타머만을 확보하기 위하여 실시예 <1-3>과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 ㎕의 증류수에 회수하였다.

<2-2> 네가티브 선별 (Negative selection)을 통한 비특이적 ssDNA 제거

HbA_1c 단백질에 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 6회와 7회 사이에 HbA₀ 단백질을 이용한 네가티브 선별을 진행하였다.

상기 실시예 <2-1>에서의 방법과 같이 HbA₀ 단백질을 상기 실시예 <1-4>를 통해 확보한 ssDNA 앱타머 100 ㎕에 반응시킨 후 반응액을 카르복실 라텍스에 4에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 HbA₀ 단백질에 결합하지 않은 앱타머 풀이 포함된 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액으로부터 순수한 DNA 앱타머를 회수하기 위하여 실시예 <1-3>과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 ㎕의 증류수에 회수하여 다음 SELEX 라운드의 주형 DNA로 사용하였다. 이후 SELEX를 총 8회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 HbA_1c 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.

< 실시예 3>

실시간 PCR (Real-time PCR ) 기법을 이용한 HbA _1c 단백질과 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 라운드 선정

SELEX를 8회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다.

우선 네가티브 선별 이후인 7 라운드, 8 라운드, 9 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 비대칭 PCR 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 7, 8, 9 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 HbA_1c 단백질과 4℃에서 1시간 이상 반응시켰다.

반응액은 활성화된 카르복실 라텍스와 1시간 동안 반응시킨 후 4에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이후, 세척 용액으로 3회 세척하여 HbA_1c 단백질과 결합하지 못한 ssDNA를 제거한 후 앱타머 용출 용액과 반응시켜 HbA_1c 단백질과 결합한 DNA 앱타머를 회수하였다.

회수한 DNA 앱타머 용출용액으로부터 순수한 DNA 앱타머만을 확보하기 위하여 실시예 <1-3>과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 의 증류수에 회수하였다. 이를 통하여 획득된 각 ssDNA들은 각각 10⁰와 10^-1,10^-2로 희석하여 실시간 PCR 기법의 주형 DNA로 사용하였다.

실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 95℃에서 5분 변성 이후, 95℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10^-1로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다.

8 라운드에서 획득한 ssDNA를 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR C(t)값이 5.15이고, 6 라운드, 7 라운드의 C(t)값이 각각 5.62, 7.16으로, 8 라운드의 C(t)값이 가장 낮아 8 라운드의 주형 ssDNA의 농도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다 (표 1 및 도 2 참고).

	7R (1 X 10 ^-1 )	8R (1 X 10 ^-1 )	9R (1 X 10 ^-1 )
C(t)	5.62	7.16	5.15
Efficiency(%)	71.3	66.5	76.2

< 실시예 4>

클로닝을 통한 HbA _1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 확보

실시간 PCR을 통하여 HbA_1c와 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단되는 8 round ssDNA 앱타머 용출액으로부터 PCR을 수행하여 dsDNA를 증폭하였다. 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트 (Biofact, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1 와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4 , 6X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다.

T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 200 ㎕의 DH5α와 섞어 42℃에서 30초 동안 열충격 (heat shock)을 가한 후 바로 얼음에서 안정화시켰다. 이후 여기에 900 ㎕의 SOC (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glucose) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal (50 ㎍/ml), IPTG (5 ㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시켰다. 배양 플레이트에서 흰색 콜로니만을 선별하여 플라스미드 DNA 정제 키트 (Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 확보한 각 콜로니의 플라스미드를 이용하여 앱타머의 염기서열을 결정하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 비정상적인 서열과 중복되는 서열을 제외하고 21개의 HbA_1c 특이 결합 DNA 앱타머를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 SELEX 기법을 활용하여 획득한 HbA_1c 특이 결합 DNA 앱타머 기능성 소재 21개에 대한 서열을 나타낸 것이다.

클론 명칭	서열번호	선별된 서열	서열크기 (bp)
HbA_1c_1	서열번호 1	AGTAGCCGGCATATGGAAAGGCTCATGCGTATTTTGGGGG	40
HbA_1c_3	서열번호 2	CTCTTTCTATACAGAGTCACTAGAAGTGTGCAGGTGTTGG	40
HbA_1c_4	서열번호 3	CTTCTCGGGGGAGGTCTGCGAAAGGTTATTCGTTACTGGG	40
HbA_1c_5	서열번호 4	TTCTGTTACTTGCCTGTGGTGTCGGTACCGGGCTACTGTG	40
HbA_1c_7	서열번호 5	TCTCTGTCGTATGTTTAGAGAGTCATATCTATGTGATGCG	40
HbA_1c_8	서열번호 6	TCGTCGTGGAGACGTACGTCCACTTTGGTGCATGGTCG	38
HbA_1c_10	서열번호 7	AAGTCCTTAACACGCTATCTGTGAATAAGAGTCGTGTTG	39
HbA_1c_11	서열번호 8	TAGTGAGATGTAGGTCCATGCTGACGGGTTGCGTACTGTG	40
HbA_1c_12	서열번호 9	AATTGAGTCACCACGCCGATTCATATGTGGGTTTTGCTCG	40
HbA_1c_15	서열번호 10	TGTGTTTGAGGGATCAGTGCCATCGAAGTTGTGTCCTCG	39
HbA_1c_17	서열번호 11	TTAACATAATCAGTGTCCTGCACGGATCCCATTTGTATG	39
HbA_1c_20	서열번호 12	CGTTCGGTTCGACGTTCAAGCGAATTGTTGATAGGTCGTG	40
HbA_1c_21	서열번호 13	GTGTCATGCGCAATTGTGTGTTGTGGTCGCGTTTTGGTCG	40
HbA_1c_27	서열번호 14	GGCGTAGCCAAAGCGGCGTACTGGAATTGTTGCATTCCCG	40
HbA_1c_33	서열번호 15	CCAAAGGCATAGCTGTCGTATTCCTGCTGTTTAAGACGCG	40
HbA_1c_37	서열번호 16	GTGGTTCCCGCTGCTCCATTCTTATGAAGTTATCCCGGCG	40
HbA_1c_42	서열번호 17	GCAAGGTTCGAACCACGCATCCACTATTTAACGGGTGTCG	40
HbA_1c_46	서열번호 18	CGTCGGCTAGACGACTTGGGCCATCCTTTCAGTGCCGTTG	40
HbA_1c_47	서열번호 19	GGGCGCTGTAGCTGCGCACCTGGTGACCTTAGCTGTTACG	40
HbA_1c_48	서열번호 20	CAGAAGCTGAATCTCGCTGTGTACGTCATCATTGTTAGCG	40
HbA_1c_52	서열번호 21	GTACCAGCTACATCGATGTGGGTTGTATTTGTGGTGTTG	39

< 실시예 5>

HbA _1c 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정

HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 4 참고).

< 실시예 6>

SPR 을 이용한 HbA _1c 단백질과 HbA _1c 결합 앱타머 후보군 간의 친화도 테스트

<6-1> HbA _1c 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 각 친화도를 정량하기 위한 HbA _1c 단백질 코팅 센서 칩 제작

HbA_1c 단백질과 상기 실시예 4에서 획득한 앱타머 후보군들 간의 친화도를 정량하기 위하여 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. HbA_1c 단백질과 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare, UK)을 이용하였다.

먼저 센서 칩 CM5에 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropy l) carbodiimide (EDC) 혼합액을 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려 센서 칩 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy- succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시켰다.

NHS-에스테르로 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에 HbA_1c 단백질을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.0) 완충액에 60 ㎍/㎖의 농도로 녹아 있는 HbA_1c 단백질 용액을 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 칩 표면을 HbA_1c 단백질로 코팅하였다. 이후 HbA_1c 단백질이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성화시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서 칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득, 정량하였다.

<6-2> HbA _1c 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

HbA_1c 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 HbA_1c 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700nM의 농도로 준비하였다.

기 제작 준비된 HbA_1c 결합 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1)과 HbA_1c 단백질이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700nM)의 HbA_1c 결합 DNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 HbA_1c 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 HbA_1c 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K _d , dissociation) 수득 결과 HbA_1c 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 중 HbA_1c_46 앱타머의 해리상수 (K _d )가 2.84 X 10^-14 nM으로 표적하는 HbA_1c 단백질에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (표 3 참고).

클론 명칭	K _d (M)	클론 명칭	K _d (M)
HbA_1c_1	5.23 x 10^-12	HbA_1c_20	1.99 x 10^-13
HbA_1c_3	5.78 x 10^-14	HbA_1c_21	8.72 x 10^-14
HbA_1c_4	2.99 x 10^-13	HbA_1c_27	1.78 x 10^-13
HbA_1c_5	3.33 x 10^-13	HbA_1c_33	1.02 x 10^-12
HbA_1c_7	1.50 x 10^-13	HbA_1c_37	3.41 x 10^-13
HbA_1c_8	4.53 x 10^-13	HbA_1c_42	3.35 x 10^-14
HbA_1c_10	1.31 x 10^-13	HbA_1c_46	2.84 x 10^-14
HbA_1c_11	5.30 x 10^-13	HbA_1c_47	5.17 x 10^-13
HbA_1c_12	4.33 x 10^-12	HbA_1c_48	2.51 x 10^-13
HbA_1c_15	3.05 x 10^-13	HbA_1c_52	3.54 x 10^-13
HbA_1c_17	5.84 x 10^-13

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to HbA1c protein and Uses Thereof <130> PN1610-368 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 1 agtagccggc atatggaaag gctcatgcgt attttggggg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 2 ctctttctat acagagtcac tagaagtgtg caggtgttgg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 3 cttctcgggg gaggtctgcg aaaggttatt cgttactggg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 4 ttctgttact tgcctgtggt gtcggtaccg ggctactgtg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 5 tctctgtcgt atgtttagag agtcatatct atgtgatgcg 40 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 6 tcgtcgtgga gacgtacgtc cactttggtg catggtcg 38 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 7 aagtccttaa cacgctatct gtgaataaga gtcgtgttg 39 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 8 tagtgagatg taggtccatg ctgacgggtt gcgtactgtg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 9 aattgagtca ccacgccgat tcatatgtgg gttttgctcg 40 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 10 tgtgtttgag ggatcagtgc catcgaagtt gtgtcctcg 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 11 ttaacataat cagtgtcctg cacggatccc atttgtatg 39 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 12 cgttcggttc gacgttcaag cgaattgttg ataggtcgtg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 13 gtgtcatgcg caattgtgtg ttgtggtcgc gttttggtcg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 14 ggcgtagcca aagcggcgta ctggaattgt tgcattcccg 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 15 ccaaaggcat agctgtcgta ttcctgctgt ttaagacgcg 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 16 gtggttcccg ctgctccatt cttatgaagt tatcccggcg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 17 gcaaggttcg aaccacgcat ccactattta acgggtgtcg 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 18 cgtcggctag acgacttggg ccatcctttc agtgccgttg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 19 gggcgctgta gctgcgcacc tggtgacctt agctgttacg 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 20 cagaagctga atctcgctgt gtacgtcatc attgttagcg 40 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 21 gtaccagcta catcgatgtg ggttgtattt gtggtgttg 39 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA <400> 22 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 23 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 24 agattgcact tactatct 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer_biotin <400> 25 agattgcact tactatct 18

Claims

서열번호 18의 염기서열로 이루어지며, 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 단백질에 특이적으로 결합하는 당뇨의 진단 및 예후 판단용 DNA 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
제2항에 있어서,
상기 표지물질은 형광물질, 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아민기 및 티올기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5'말단 또는 3'말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
제 1항에 있어서,
상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 당화혈색소(Hemoglobin A_1c, HbA_1c) 검출용 키트.
제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 당뇨의 진단 또는 예후판단용 조성물.
제1항의 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 당뇨의 진단 또는 예후판단용 마이크로어레이.
당뇨의 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 인체로부터 분리된 생물학적 시료로서, 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 또는 체액 내의 당화혈색소(HbA_1c) 존재 여부를 검출하는 방법으로서,
(a) 당화혈색소(HbA_1c)를 포함하는 생물학적 시료와 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA_1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 당화혈색소(HbA_1c)를 확인하는 단계;를 포함하는 당화혈색소의 검출방법.
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