KR20170056126A - 스핑크１ 단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents
스핑크１ 단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 간암의 바이오마커인 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 SPINK1 단백질의 검출 용도로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 DNA 앱타머는 현재 간암 진단에 활용되고 있는 AFP의 면역학적 검출방법을 대체할 수 있는 안정성과 특이성을 갖고 있어서 기존 진단 검출 기법과 더불어 간암 조기 진단을 할 수 있으며, 앱타머 기반의 진단 시스템으로 신속하고 경제적인 간암 진단을 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 스핑크 1 (Serine protease inhibitor Kazal-type 1, SPINK1) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
간암은 전 세계적으로 암 사망 순위 4위이며, 우리나라에서 간암에 의한 사망률은 2위를 기록 중인 질병이다. 국가암정보센터 자료에 의하면 2013년 국내 간암 사망률은 남녀를 합쳐서 연 11,405건으로 전체 암 사망의 15.1%로 2위를 차지하고 있으며 남성 암 사망률 2위, 여성 암 사망률 4위, 간암 발생률이 남성 10.8%로 4위, 여성 3.7%로 6위를 보여 발생률보다 사망률이 더 높은 질환임을 보여주었다.
2012년 기준 국내 간 암 환자는 전체 224,177명의 암환자 중 16,254명을 차지하고 있을 정도로 발생률이 높으며, 연간 인구 10만 명당 22.6명이 간암으로 사망할 정도로 국민건강을 위협하고 있다. 현재 국내 국립암센터의 주요 암의 생존율 통계에 따르면 간암은 발병 후 5년 내 생존율이 30.1% 이지만, 발병 후 10년 내 생존율은 15.6%로 시간이 경과할수록 생존율이 급감하는 성향을 보여 조기 진단 및 예후 관리가 매우 절실한 질환으로 알려져 있다.
이와 같이 발생률에 비하여 사망률이 높은 이유는 간암은 발병 초기에 간암의 발병을 나타내는 특이 증상이 없기 때문이다. 간암은 병이 심각한 수준에 이를 때까지 아무런 증상이 없는 경우가 흔하다. 나타나는 증상으로는 피로, 더부룩한 느낌, 윗배 오른쪽 또는 등과 어깨의 통증, 메스꺼움, 식욕저하, 복부팽만감, 체중 감소, 무기력함, 열, 황달 (눈과 피부가 노란색으로 변하는 증세) 등과 같은 대부분 비특이적인 만성 간질환 증상이 발생되기 때문에 간암으로 확진될 당시에는 이미 간 절제술이나 이식술을 시행할 수 있는 병기가 지난 경우가 많아 생존확률이 낮아진다. 또한 간암 환자의 80% 정도는 간경변에서 시작하여 합병증으로 사망하는 경우가 많기 때문에 간암의 조기진단은 환자의 생존율을 크게 높일 수 있어 예후관리를 위한 진단물질의 개발이 주목받고 있다.
간암의 주요 원인으로는 B형 및 C형 간염 바이러스에 의한 감염, 곰팡이 독소인 Aflatoxin, 알코올 섭취, 흡연, 비만, 경구 피임약 복용, 음용수에 의한 비소 섭취 등의 환경적 인자 등에 의해서도 발병하는 것으로 알려져 있으며, 이중 특히 간염 바이러스에 의한 감염은 간암을 유발하는 직접적 원인인 것으로 보고되어 있다.
특히 간염 바이러스 중 주요 발병 원인은 HBV (Hepatitis B Virus : B형 간염 바이러스)와 HCV (Hepatitis C virus : C형 간염 바이러스)로 알려져 있으며 우리나라에서 발생하는 간암의 80~90%가 이 두 간염바이러스로 인해 발병한다. 간염 바이러스에 감염된 사람 중 일부는 급성간염에 걸리게 되고, 치료하지 않고 진행하여 만성 간염이 되면, 그 중 40%정도는 천천히 간경변으로 진행하게 된다. 간경변은 알코올, 지방간 등 여러 가지 원인에 의해 생길 수 있으며, 간 전체의 세포가 조금씩 괴사하는 질환으로 이때 간이 조금씩 굳어지는 이유는 괴사된 부분을 채우기 위해 단단한 섬유조직이 생기기 때문이며 이로 인해 간경변 환자의 약 20-25%가 간암에 걸려 생명의 위협을 받는다.
B형 간염 바이러스는 성적 접촉, 출산 전 후기에 피부 점막을 통해 혈액, 타액 등으로 감염되어 전파 되며 C형 간염 바이러스 또한 혈액을 통해 전파되며 수혈이나 마약 남용 등으로 감염된다. 곰팡이 독소 중 하나인 Aflatoxin은 발암물질로서 종양 억제 유전자인 p53의 변이를 일으켜서 B형 간염 바이러스 감염 시 간암으로 발전할 가능성을 훨씬 높인다는 보고가 있다. 알코올 섭취에 의한 간암 발생은 알코올이 직접적인 간 손상을 일으키지는 않으나 지방간을 형성하고 지속적인 알코올 섭취로 인해 지방간은 간경화로 진행되며 간암을 야기하게 된다고 알려져 있다.
또한, 간암 환자의 약 73-85％는 간 경변 등의 합병증을 동반하고 있어 치료가 매우 어려우며, 수술 및 치료 후 재발률이 매우 높아 후가 매우 안 좋은 질환으로 알려져 있다. 특히, 간암은 발병 초기에는 특이적인 자각증상 없이 진행되어서 암 진단 시 평균 생존률은 30% 이하로 매우 낮아 조기 진단이 어렵고 예후가 좋지 않아 간암의 치료방법에 대한 많은 연구가 필요하다.
간암의 치료방법과 효과는 암의 범위와 간 기능 및 간경변증 정도에 의해 결정된다. 간암의 치료방법을 결정하기 위해서는 종양의 해부학적 평가와 더불어 간의 기능적 평가를 시행해야 하며 이를 바탕으로 최선의 치료법을 선택하게 된다. 간암의 치료방법에는 수술적 치료로 간 절제술, 간 이식이 포함되고, 비수술적치료로 경동맥 화학 색전술(TACE), 알코올 주입법(PEIT), 고주파 열 치료법(RFA)이 있다. 이와 더불어 실험적 치료법으로 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유자전 치료, 면역 치료법이 시도되고 있다. 간암 치료에 있어 가장 확실한 방법은 절제술이다. 그러나 절제술은 암의 크기나 위치상 절제가 가능해야 하며, 환자의 잔여 간 기능이 충분해야 한다. 또한, 간 이외의 장기에 암이 퍼져있지 말아야 한다. 따라서 절제술은 20% 이내의 간암 환자에게만 적용 가능한 매우 제한적인 기법이라는 단점을 가지고 있으며, 간 이식 방법 또한 생존율은 매우 높은 편이지만 공여자를 구하기 어렵다는 단점을 가지고 있다. 비수술적 방법인 알코올 주입법(PEIT), 고주파 열 치료법(RFA), 경동맥 화학 색전술(TACE) 및 방사선 치료 등은 초기 간암 환자 및 말기의 수술이 불가능한 간암 환자를 대상으로 하는 치료 기법으로써 초기 간암 환자에게는 매우 높은 치료 효과를 보이고 있지만 말기 환자들에게는 아직까지 적용 범위 방법 및 치료 적용 방법에 대한 적립이 명확히 확립되어 있지 않아 적극적 활용이 어려운 상황이다.
따라서 다른 암과는 달리 비가역적인 증상을 초래하는 간암에 대처하는 최선의 방법은 조기 발견을 통한 질병 예방이 가장 효과적인 것으로 알려져 있다. 이에 현재 우리나라에서는 간암을 조기 진단하기 위하여 영상 검사 방법으로는 초음파검사, 컴퓨터 단층촬영검사 (CT), 자기공명 단층촬영검사 (MRI), 간 혈관 조영술 등이 이루어지고 있다. 간에서 직접 조직을 확보하여 간암을 구분하는 생검 (biopsy) 진단법이나 상기 영상진단 방법들은 간암 종양을 정확하게 구별해내는 장점이 있으나 고가의 장비 및 샘플 처리 기술 등이 요구되며 특수 병원에서 가능하고 X선이나 방사선을 이용한 진단으로 장기간 인체 조사 시 부작용을 초래할 수 있는 단점이 있다. 이와 같은 영상 진단 방법 및 간조직 생검 기법은 일반 병원에서는 쉽게 활용되지 못하고 있어서, 종양표지자를 활용한 간단한 피 검사로 간암을 진단하는 기법이 손쉽게 활용되고 있다.
현재 간암 진단을 위하여 널리 활용되고 있는 종양표지자는 AFP (Alpha-fetoprotein)가 대표적이다. AFP는 태아의 간 조직이나 소화기관에서 만들어지는 혈청 단백질로 출생 후 급격히 감소하여 혈액 내 10 ng/㎖ 정도의 농도로 존재한다. 하지만 간염, 간경변증, 간 종양, 간 내 전이된 암 등등 다양한 간 질환의 발생 시 혈액 내 AFP 수치가 급격히 증가하여 현재 간암 진단 표지자로 널리 활용되고 있다. 그러나 AFP는 급성 또는 만성 간염과 전격성 간염, 간경변증과 같은 질환에서도 비특이적으로 증가할 수 있고, 배아세포종이나 5~10%의 위장관암에서도 양성적 반응이 나올 수 있으며, 간암이 발병 되었음에도 불구하고 AFP 혈중 농도가 상승하지 않는 경우가 많다.
그러므로 현재의 간암 마커인 AFP 보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단 할 수 있는 새로운 마커의 발굴과 이를 이용한 간암 조기 진단 기술의 개발이 필요한 실정이다.
한편, SPINK1(Serine protease inhibitor Kazal-type 1) 단백질은 세린 프로테아제를 억제하거나 췌장에서의 트립신 분비를 억제하고 암과 관련된 트립신을 억제하는 기능이 있다고 보고된 바 있다.
이에 본 발명에서는 간암을 조기 진단할 수 있는 새로운 마커로써 SPINK1 단백질의 활용 가능성을 확인하였고, 특히 표적 물질 탐지 인자인 앱타머를 활용하여 SPINK1을 검출하는 진단기법을 개발하고자 하였다.
현재 혈액 및 샘플 내 표적 단백질 수치를 측정하는 방법으로는 효소결합 면역 흡착법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역크로마토그래피법 (immunochromatographic assay)등이 가장 널리 이용되고 있다. 하지만 이와 같은 기법들의 활용하기 위해서는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 개발이 반드시 요구된다. 그러나 항체 생산 및 개발은 동물 실험을 동반하고 자유로운 생산, 정제, 변형에 어려움이 있으며, 단백질로 주변 pH, 온도 등에 대한 안정성 확보에도 어려움이 있다. 뿐만 아니라, 항체 생산에는 많은 시간과 비용이 요구될 뿐만 아니라, 배치간 변이(batch to batch variation)가 존재하여 순수한 표적 항체만을 생산 확보하는 것이 매우 어렵다는 단점을 가지고 있다. 이에 효율적으로 표적 물질을 탐지에 활용할 수 있는 항체 대체 물질의 개발이 절실한 실정이다.
이와 같은 기존 항체를 기반으로 하는 표적물질 검출 기법의 문제점들을 해결, 보안하기 위하여 본 발명에서는 앱타머를 활용하고자 하였으며, 본 발명에서 사용하고자 하는 앱타머(aptamer)는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조를 형성하여 표적물질과 특이적인 결합력을 가지는 특징을 가지고 있다. 또한 앱타머는 DNA나 RNA인 핵산으로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 안정적이며, 다양한 표적 물질(단백질, 펩타이드, 금속, 화학물질 등)과 특이적으로 결합이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 화학적 합성 기법을 이용해 제작이 가능하기 때문에 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 이와 더불어 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
본 발명에서는 상기한 바와 같이 각종 환경 및 산업분야에서 높은 잠재성을 보이는 앱타머를 종래 항체를 활용한 간암을 진단하고자 하며, 기존 간암 바이오마커로서 사용되어오던 각종 종양표지자를 대체할 수 있는 새로운 SPINK1을 바이오마커로써 도입하여 앱타머 기술로 검출하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
현재 간암 조기 진단에는 혈액 및 샘플 내 종양 표지자인 AFP(Alpha-fetoprotein)의 농도 변화를 정량적, 정성적으로 측정하는 방법이 활용되고 있다. 하지만 AFP의 진단은 만성 간염, 간경변증과 같은 질환에서도 비특이적으로 양성진단을 내릴 수 있다는 문제와 배아세포종이나 5-10%의 위장관암에서도 위양성 반응이 나올 수 있다는 문제가 있다. 따라서 현재의 간암 마커인 AFP보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단 할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 간암을 조기 진단 할 수 있는 진단 기법 개발이 요구되고 있다. 뿐만 아니라, 기존 항체를 기반으로 하는 효소결합 면역 흡착법 및 면역크로마토그래피법 기법이 표적 물질과 특이적으로 결합하는 항체기반 기술로써 생산비용 및 변이와 같은 다양한 문제가 제기되어 새로운 형태의 진단 기법 개발이 필요하다.
이에 본 발명에서는 간암 조기진단을 위하여 간암의 진단 및 예후 확인에 활용될 수 있는 SPINK1 단백질을 바이오마커로 활용하였으며 항체 기반 진단방법이 아닌 DNA 앱타머를 활용한 SPINK1 단백질의 탐지방법으로 새로운 진단 기법을 제시하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 검출용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 검출용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 발현의 증가를 나타내는 암의 진단 또는 예후 판단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 DNA 앱타머와의 결합반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 SPINK1단백질의 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 SPINK1 단백질 발현의 증가를 나타내는 암의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명의 다른 목적은 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SPINK1 단백질은 서열번호 11로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 검출용 마이크로어레이를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 발현의 증가를 나타내는 암의 진단 또는 예후 판단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 간암일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 DNA 앱타머와의 결합반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 SPINK1단백질의 검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 피험자로부터 얻은 생물학적 시료를 대상으로 제1항의 DNA 앱타머와의 결합반응을 수행하는 단계를 포함하는, SPINK1 단백질 발현의 증가를 나타내는 암의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 간암일 수 있다.
나아가, 본 발명은, (a) 임의의 염기서열을 갖는 주형 DNA로부터 PCR 반응을 이용하여 DNA 앱타머 풀(pool)을 제작하는 단계; (b) 가열-냉각 기법을 이용하여 상기 DNA 앱타머 풀(pool)의 이중가닥(double-stranded) DNA를 단일가닥(single-stranded) DNA로 만드는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 제조된 단일가닥 DNA 앱타머들을 GST 융합 SPINK1 단백질과 반응시킨 후 반응액을 기활성화된 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터에 투과시켜, GST 융합 SPINK1 단백질과 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 선별된 DNA 앱타머에 대해 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 이용한 네가티브(negative) SELEX를 수행하여 SPINK1 단백질에 대해 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하는 단계; 및 (e) 선별된 단일가닥 DNA 앱타머의 SPINK1 단백질에 대한 친화성을 측정하여 SPINK1 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적의 DNA 앱타머를 결정하는 단계를 포함하는, SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 간암의 새로운 바이오마커인 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 간암 환자 샘플에서 SPINK1 단백질을 검출함으로써, 간암의 조기 진단 및 예후 판단 용도로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 각종 암 진단에 사용되는 기존 항체를 대체할 수 있으며, 나아가 각종 암뿐만 아니라 다양한 난치성 질환을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과와 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA를 열-냉각기법 및 스트랩타비딘 (streptavidin)을 이용하여 회수한 ssDNA을 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머로부터 PCR 기법을 통하여 증폭된 dsDNA 결과
레인 2: PCR 기법으로 확보한 dsDNA를 열-냉각기법과 스트랩타비딘을 이용하여 제작한 ssDNA 결과
도 2는 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 GST 융합 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 ssDNA 농도를 Nanodrop spectrophotometer를 이용하여 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 3A, 3B는 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 6개의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 SPINK1-1 내지 SPINK1-6의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 카르복실기를 가지고 있는 CM5 센서 칩 표면에 SPINK1을 고정하는 단계를 나타낸 도면이다.
도 5는 SPINK1 결합 DNA 앱타머를 이용하여 ELISA 기법을 기반으로 SPINK1을 탐지하는 방법에 대한 모식도로서, 패널 [1]은 SPINK1 탐지를 위해 SPINK1 결합 DNA 앱타머를 이용한 ELISA 법의 모식도를 나타내며, 패널 [2]는 기존 항체를 이용하여 SPINK1을 탐지하는 ELISA 법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 간암 표적인자인 SPINK1 검출 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 간암으로 의심되는 환자의 시료를 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머가 고정되어 있는 진단 키트에 처리하였을 때, 샘플 내 SPINK1 단백질과 SPINK1 단백질 결합 앱타머의 결합에 의해 SPINK1을 진단하는 시스템을 모식도로 나타낸 도이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머로부터 PCR 기법을 통하여 증폭된 dsDNA 결과
레인 2: PCR 기법으로 확보한 dsDNA를 열-냉각기법과 스트랩타비딘을 이용하여 제작한 ssDNA 결과
도 2는 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 GST 융합 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 ssDNA 농도를 Nanodrop spectrophotometer를 이용하여 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 3A, 3B는 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 6개의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 SPINK1-1 내지 SPINK1-6의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 카르복실기를 가지고 있는 CM5 센서 칩 표면에 SPINK1을 고정하는 단계를 나타낸 도면이다.
도 5는 SPINK1 결합 DNA 앱타머를 이용하여 ELISA 기법을 기반으로 SPINK1을 탐지하는 방법에 대한 모식도로서, 패널 [1]은 SPINK1 탐지를 위해 SPINK1 결합 DNA 앱타머를 이용한 ELISA 법의 모식도를 나타내며, 패널 [2]는 기존 항체를 이용하여 SPINK1을 탐지하는 ELISA 법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 간암 표적인자인 SPINK1 검출 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 간암으로 의심되는 환자의 시료를 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머가 고정되어 있는 진단 키트에 처리하였을 때, 샘플 내 SPINK1 단백질과 SPINK1 단백질 결합 앱타머의 결합에 의해 SPINK1을 진단하는 시스템을 모식도로 나타낸 도이다.
본 발명은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 SPINK1 단백질은 간암 진단에 널리 활용되고 있는 AFP 단백질의 단점을 보완할 수 있는 새로운 바이오 마커로 활용될 수 있으며, 본 발명의 DNA 앱타머 기술은 기존 항체 기반의 진단 기법의 문제점을 해결, 보완 및 대체할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 새로운 간암 마커 단백질인 SPINK1에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(올리고뉴클레오타이드)에 관한 것이다. 본 명세서에서 용어 “DNA 앱타머(aptamer)”는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200bp 미만인 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머(aptamer)는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열목록 1의 서열 내지 서열목록 6 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 한편, 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 6 서열의 DNA 앱타머는 본 명세서 도 3A, 3B에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.
또한, 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 SPINK1 단백질과 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 6 서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) Needleman and Wunsch, J.Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
또한, 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 SPINK1 단백질을 직접 검출하는데 사용되거나 환자의 생물학적 시료에서 SPINK1 단백질을 검출하는데 사용될 수 있으며, 이를 활용하여 간암을 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 SPINK1 단백질 검출은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 SPINK1 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 형광물질(예를 들어, 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5), 방사성물질, 또는 비오틴(biotin)과 같은 화학물질로 표지되거나 1차 아민으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 예를 들어, DNA 앱타머가 고정화된 기판(Substrate)을 포함하는 마이크로어레이(microarray)를 사용하여 SPINK1을 검출할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “마이크로 어레이”는 기판의 특정의 영역에 유전 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 마이크로어레이의 “기판”은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 가기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 막(membrane), 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데하이드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민을 통해 기판에 결합될 수 있다.
본 발명에서 SPINK1 단백질 검출용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열목록 제 1 서열 내지 제 6 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열 또는 이 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 SPINK1 단백질 검출 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.
한편, SPINK1 단백질은 일반적으로 세린 프로테아제를 억제하거나 췌장에서의 트립신 분비를 억제하고 암과 관련된 트립신을 억제하는 기능이 있다고 보고되었다. 본 발명에서는 SPINK1 단백질이 간암 조기진단의 새로운 바이오마커로써 사용될 수 있음을 확인 하였으며 이에 본 발명에서는 SPINK1 단백질을 활용하여 간암을 진단할 수 있다는 것을 확인하였고, 본 발명의 상기 SPINK1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 11에 기재하였다.
또한, 본 발명은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 기반으로 하는 간암의 진단 및 SPINK1 단백질의 검출을 위한 조성물 및 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 SPINK1 단백질 검출은 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 SPINK1 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 형광물질, 예를 들어 플루오레세인 (fulorescein) Cy3 또는 Cy5, 방사성물질 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴 (biotin)으로 표지되거나 1차 아민 (primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
시료내 사람 SPINK1 단백질의 검출 및 분석은 간암 가능성을 제시할 수 있으며 추후 간암 모니터링을 위한 검출에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, SPINK1은 자가분비생장인자 (Autocrine growth factor)로써 암세포를 증식시키는 역할을 한다는 보고가 있다. 이에 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 환자의 시료로부터 SPINK1 단백질의 유무 및 정량 확인함으로써, 간암 진단 또는 예후 SPINK1 검출에 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 간암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 본 발명의 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 SPINK1 단백질과의 결합반응을 통해 SPINK1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 용어 “생물학적 시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1:
SPINK1 유전자 선정 및 GST 융합 재조합 SPINK1 단백질 준비
1-1. SPINK1 유전자의 선정
사람에게 발현되는 SPINK1 단백질에 대한 앱타머를 제작하기 위하여 Abnova 사의 GST 융합된 재조합 사람 SPINK1 단백질 (SPINK1 (Human) Recombinant Protein (P01))을 구매하여 SPINK1에 특이적인 앱타머를 제작하였다.
실시예 2: DNA 앱타머의 제작
2-1. PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 76 bp의 주형 DNA (5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3'; 서열목록 제 7 서열)와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니어로부터 주문하여 제작하였다 [정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열목록 제 8 서열), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 9 서열), 비오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 10 서열)]. 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 25 μM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 μM 비오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 76bp에서 밴드가 나타나는지 증폭 산물을 확인하였다. PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.
2-2. 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작
PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성 (Denaturation)하였다. 실험 방법을 구체적으로 표현하자면 PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 획득한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각 시켜 ssDNA를 확보하였다.
2-3. ssDNA의 선별 및 회수
가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴 (Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 primer를 제거하고 정방향의 ssDNA만을 순수하게 확보하기 위하여, 상기 실시 예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙트아비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 1 참고).
실시예 3: SELEX 기법을 이용한 재조합 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
3-1. SELEX에 이용되는 각 용액의 조성
SELEX에 이용한 각 용액은 Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare, USA)를 이용하였으며, 조성은 다음과 같았다. 즉, 1 X 앱타머 선별 용액 (pH 7.3): 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 2 X 앱타머 선별 용액 (pH 7.3): 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4 세척 용액 (pH 7.3): 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, DNA 앱타머 용출 용액 (pH 8.0): 50mM Tris-HCl, 10mM reduced glutathione.
3-2. SELEX에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작
상기 실시예 2-3을 통하여 제작 확보한 ssDNA 50 ㎕에 2X DNA 앱타머 선별 용액 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성 시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.
3-3.
Glutathione
Sepharose
4B 정제
키트를
이용한
SPINK1
단백질과 특이적으로 결합하는
DNA
앱타머의
선별
상기 실시예 1에서 구매한 GST 융합 SPINK1 단백질 15 ㎕ (38.68 pmol)를 1 X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 상기 실시예 3-2에서 획득한 ssDNA 앱타머 풀 (386.8 pmol)과 1:10 비율로 혼합하여 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. Glutathione Sepharose 4B 정제 키트를 사용하기 위하여 Glutathione Sepharose 4B 100 ㎕를 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 1 X 앱타머 선별 용액 500 ㎕을 넣고 4℃에서 5분 동안 교반하며 반응시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 상기 과정을 2회 반복한 후 GST 융합 SPINK1 단백질과 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반응액을 Glutathione Sepharose 4B와 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 세척용액 500 ㎕를 넣어 세척하는 과정을 3회 반복하여 GST 융합 SPINK1 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 앱타머를 제거하였다. Glutathione Sepharose 4B로부터 GST 융합 SPINK1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 100 ㎕를 넣어 4℃에서 10분 동안 교반하며 반응시켰으며, 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층의 용출 용액을 얻었다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층의 용출 용액을 획득하였다. GST 융합 SPINK1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합물에서 GST 융합 SPINK1 단백질을 제거하기 위하여, 용출 용액에 동일 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, GST 융합 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 만을 회수하기 위하여 PCI 법을 통하여 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA와 3배부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰고, 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 이를 통하여 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수할 수 있었으며, 회수된 DNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다.
3-4. 비특이적
DNA
앱타머
제거를 위한
네가티브
선별 (
Negative
selection
)
SPINK1 단백질이 아닌 GST 잔기에 결합하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 5회와 6회 사이에 SPINK1 단백질 대신 GST 단백질을 결합하는 네가티브 선별 (negative selection)을 진행하였다. 이후 3-3과 같은 방법으로 SELEX를 총 9회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 SPINK1 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.
실시예
4:
GST
융합
SPINK1
단백질과 특이적으로 결합하는 최적
DNA
앱타머
선별을 위한
SELEX
라운드 선별
4-1. 나노 드롭 (
Nano
Drop
)을 이용한 각 라운드의 친화성 확인
SELEX를 9회 까지 마친 후 SELEX 계속 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노 드롭 (Nano drop (Micro spectrophotometer))을 이용하여 측정하였다. 나노 드롭을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 8 라운드의 농도가 170.1 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드의 농도는 131.8 ng/㎕로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후, GST 융합 SPINK1 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 8 라운드 풀임을 확인할 수 있었다 (도 2 참고).
4-2. 실시간(
Real
time
)
PCR
기법을 이용한 최적 라운드 확인
SELEX를 9회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다.
우선 초기 DNA 라이브러리와 네가티브 선별 이후인 6 라운드, 7 라운드, 8 라운드, 9 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 가열- 냉각 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 6, 7, 8, 9 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 GST 융합 SPINK1 단백질과 4℃에서 24시간 이상 반응시켰다. 반응액은 Glutathione Sepharose 4B와 1시간 동안 반응시킨 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 이후, 세척 용액으로 3회 세척하여 GST 융합 SPINK1 단백질과 결합하지 못한 ssDNA를 제거한 후 앱타머 용출 용액과 반응시켜 GST 융합 SPINK1 단백질과 결합한 DNA 앱타머를 회수하였다. 회수한 GST 융합 SPINK1 단백질과 결합한 DNA 앱타머에 동일 부피의 PCI를 처리하여 GST 융합 SPINK1 단백질을 제거한 후, 회수 용액의 1/100 부피의 tRNA와 3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 회수된 DNA는 85℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 이를 통하여 획득된 각 ssDNA들은 각각 100와 10- 1 로 희석하여 실시간 PCR 기법의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 95℃에서 5분 변성 이후, 95℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10-1로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR Ct값은 6, 7, 8, 9 라운드에서 각각 10.48, 7.01, 6.86, 11.05로 8 라운드 Ct값이 가장 낮게 나왔다. 8 라운드의 ssDNA 앱타머들이 7 라운드와 9라운드와 비교하여 높은 앱타머 농도의 풀임을 확인할 수 있었으며 더 이상 SELEX를 진행이 필요 없음을 확인하였다 (표 1 참고). 이는 나노 드롭을 이용하여 확인한 각 라운드에서 회수된 앱타머 농도 측정 결과와도 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 나노 드롭 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 8 라운드의 앱타머 풀이 GST 융합 SPINK1 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
| 6R (1 X 10 -1 ) | 7R (1 X 10 -1 ) | 8R (1 X 10 -1 ) | 9R (1 X 10 -1 ) | |
| C(t) | 10.48 | 7.01 | 6.86 | 11.05 |
| Efficiency (%) | 68.4 | 71.8 | 74.9 | 61.2 |
실시예
5 :
SPINK1
단백질과 특이적으로 결합하는
DNA
앱타머
후보군 확보
나노 드롭과 실시간 PCR을 통하여 GST 융합 SPINK1 단백질과 친화력이 가장 높은 것으로 판단된 8 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열목록 제 8 서열)와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 9 서열)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트 (SolGent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1 ㎕와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4 ㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격 (heat shock)을 가한 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 여기에 900 ㎕의 SOC (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 50분 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal (50 ㎍/ml), IPTG (5 ㎍/ml)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고, 37℃에서 20시간 동안 배양시킨 후, 50개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 결정하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 중복되지 않고 SPINK1 단백질과 친화력이 높은 SPINK1 단백질 결합 DNA 앱타머 6개를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 Glutathione Sepharose 4B를 활용한 SPINK1 단백질 결합 DNA 앱타머 선별 SELEX 기법을 이용하여 획득한 SPINK1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 6개에 대한 서열을 구체적으로 나타낸 것이다.
| 클론명칭 | 서열번호 | 선별된 서열 |
서열크기
( bp ) |
| SPINK1-1 | 서열번호 1 | GCACGGAACTTGCCAATAGCGTGTATTGTGCTTACCCCCG | 40 |
| SPINK1-2 | 서열번호 2 | CGTGGAATAGTGGCTGAAGGAGGGAACTGACGCTGCTTGC | 40 |
| SPINK1-3 | 서열번호 3 | CCCGCGCGTACCTGGACCGAGATTCGGCTAGTGTGCCTGTG | 41 |
| SPINK1-4 | 서열번호 4 | GCCAACGTATTCTCTAGAGCGTGGTTCAATTAGCCGCGTG | 40 |
| SPINK1-5 | 서열번호 5 | GCCTTTCTTAGCCCGTGGATCACGTTAGGTAGCCCTCCGG | 40 |
| SPINK1-6 | 서열번호 6 | CGGGGGTGGGCATATACCGCTTGTTTGCCACATTCCACTG | 40 |
실시예
6 :
SPINK1
단백질 결합
DNA
앱타머
후보군들의 구조 결정
SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 3A, 3B 참고).
실시예
7 :
SPR
을 이용한
SPINK1
단백질과
SPINK1
결합
앱타머
후보군 간의 친화도 테스트
7-1.
SPINK1
단백질과 이에 특이적으로 결합하는
DNA
앱타머
후보군들 간의 각
친화도를
정량하기 위한
SPINK1
단백질 코팅 센서 칩 제작 실험
SPINK1 단백질과 상기 실시예 5에서 획득한 앱타머 후보군들간의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. SPINK1 단백질과 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare, UK)을 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5에 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려 센서칩 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy- succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시켰다. NHS-에스테르로 활성화된 센서칩 CM5의 표면에 SPINK1 단백질을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 60 ㎍/㎖의 농도로 녹아 있는 SPINK1 단백질 용액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 칩 표면을 SPINK1 단백질로 코팅하였다. 이후 GST 융합 사람 SPINK1 단백질이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득, 정량하였다.
7-2.
SPINK1
단백질 결합
DNA
앱타머
후보군의 친화력 측정
SPINK1 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 SPINK1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1,000nM의 농도로 녹여 준비하였다. 기 제작 준비된 SPINK1 결합 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1)과 SPINK1 단백질이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1,000nM)의 SPINK1 결합 DNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 SPINK1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 SPINK1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K D , dissociation) 수득 결과 GST 융합 SPINK1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 중 SPINK1_3 앱타머의 해리상수 (K D )가 2.53 X 10-13 M으로 표적하는 SPINK1 단백질에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다 (표 3 참고).
| 클론 명칭 | K D (M) | 클론 명칭 | K D (M) |
| SPINK1-1 | 1.36 x 10-12 | SPINK1-2 | 1.92 x 10-12 |
| SPINK1-3 | 2.53 x 10-13 | SPINK1-4 | 1.22 x 10-11 |
| SPINK1-5 | 4.90 x 10-11 | SPINK1-6 | 6.59 x 10-12 |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> DNA aptamer specifically binding to SPINK1 protein and Use
thereof
<130> pn1511-322
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 1
gcacggaact tgccaatagc gtgtattgtg cttacccccg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 2
cgtggaatag tggctgaagg agggaactga cgctgcttgc 40
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 3
cccgcgcgta cctggaccga gattcggcta gtgtgcctgt g 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 4
gccaacgtat tctctagagc gtggttcaat tagccgcgtg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 5
gcctttctta gcccgtggat cacgttaggt agccctccgg 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 6
cgggggtggg catataccgc ttgtttgcca cattccactg 40
<210> 7
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA aptamer
<400> 7
ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> template DNA
<400> 8
ataccagctt attcaatt 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 9
agattgcact tactatct 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 10
agattgcact tactatct 18
<210> 11
<211> 101
<212> PRT
<213> SPINK1 aminoacid sequence
<400> 11
Met Lys Val Thr Gly Ile Phe Leu Leu Ser Ala Leu Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ala Asp Ser Leu Gly Arg Glu Ala Lys Cys
20 25 30
Tyr Asn Glu Leu Asn Gly Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly
35 40 45
Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Pro Asn Glu Cys Val Leu Cys Phe Glu Asn
50 55 60
Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile Gln Lys Ser Gly Pro Cys Leu
65 70 75 80
Glu Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
85 90 95
Asn Met His Thr Gly
100
Claims (10)
- 서열번호 1 내지 서열번호 6 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
- 제 1항에 있어서,
상기 SPINK1 단백질은 서열번호 11로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머. - 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 검출용 키트.
- 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 검출용 마이크로어레이.
- 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 SPINK1 단백질 발현의 증가를 나타내는 암의 진단 또는 예후 판단용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항의 DNA 앱타머와의 결합반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 SPINK1단백질의 검출 방법.
- 피험자로부터 얻은 생물학적 시료를 대상으로 제1항의 DNA 앱타머와의 결합반응을 수행하는 단계를 포함하는, SPINK1 단백질 발현의 증가를 나타내는 암의 진단 또는 예후 판단을 위한 정보 제공 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 방법. - (a) 임의의 염기서열을 갖는 주형 DNA로부터 PCR 반응을 이용하여 DNA 앱타머 풀(pool)을 제작하는 단계;
(b) 가열-냉각 기법을 이용하여 상기 DNA 앱타머 풀(pool)의 이중가닥(double-stranded) DNA를 단일가닥(single-stranded) DNA로 만드는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 제조된 단일가닥 DNA 앱타머들을 GST 융합 SPINK1 단백질과 반응시킨 후 반응액을 기활성화된 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터에 투과시켜, GST 융합 SPINK1 단백질과 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 선별된 DNA 앱타머에 대해 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 이용한 네가티브(negative) SELEX를 수행하여 SPINK1 단백질에 대해 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하는 단계; 및
(e) 선별된 단일가닥 DNA 앱타머의 SPINK1 단백질에 대한 친화성을 측정하여 SPINK1 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적의 DNA 앱타머를 결정하는 단계를 포함하는, SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020150159309A KR101759401B1 (ko) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 스핑크１ 단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 |
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| WO2022231191A1 (ko) * | 2021-04-29 | 2022-11-03 | 연세대학교 산학협력단 | 암의 진단용 조성물 |
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-
2015
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