TWI550086B

TWI550086B - 對大腸結腸癌幹細胞具有專一性之適體及其應用

Info

Publication number: TWI550086B
Application number: TW104137260A
Authority: TW
Inventors: 李國賓; 洪廉育; 王志宏
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2016-09-21
Also published as: TW201614071A

Description

對大腸結腸癌幹細胞具有專一性之適體及其應用

本發明係有關於一種新穎的適體核苷酸序列及其應用，更特別的，係針對一種對於大腸結腸癌幹細胞具有結合專一性的適體核苷酸序列及其應用。

惡性腫瘤在近幾年來一直位於台灣十大死因排名的第一位，其中，又以大腸結腸癌為台灣發生率第一高的癌症。若在大腸結腸癌發生早期發現，則患者在治療之後多有大於90%的平均五年存活率。但是大腸結腸癌在早期並無明顯的症狀，所以大部份因腹痛就醫的病患，診斷出罹患大腸結腸癌時，通常都已擴散為第三期以上癌症，因此預後情況大多不佳。

有鑒於此，如何早期發現和早期診斷是治療大腸結腸癌最首要的課題，目前常見檢驗大腸直腸癌的方法包含肛門指診、內視鏡、鋇劑(鹽)灌腸-大腸造影術、及糞便潛血反應檢查等，然而，目前仍缺乏非侵入式、高專一性、快速方便且成本較低的大腸結腸癌偵測方法。

除此之外，在癌症治療的研究當中，已了解癌幹細胞在癌症轉移、復發、以及癌症藥物抗藥性的產生有極大的相關性，因此如何有效地分離癌幹細胞係為現今癌症的診斷與治療發展上的一大目標。然而，目前常見分離癌幹細胞的方法係利用幹細胞表面的特殊生物標誌(例如，CD133或CD44)，其係廣泛表現於各種癌症的癌幹細胞表面的特殊分子，目前並沒有專一辨識大腸結腸癌幹細胞的生物標誌。

本發明之目的為提供一種新穎的適體核苷酸序列，其對於大腸結腸癌幹細胞具有良好的結合專一性，可用於大腸結腸癌檢測，提供非侵入性且快速又方便的檢測方法。

依據本發明之一實施例，一種對大腸結腸癌幹細胞具有結合專一性的適體，其包含Seq ID: NO. 6之核苷酸序列或其互補的核酸序列，其中該互補的核酸序列為Seq ID: NO. 7。

依據本發明之另一實施例，一種檢測大腸結腸癌幹細胞的方法，包含：將對大腸結腸癌幹細胞具有結合專一性的適體連結磁珠後，與待測樣本接觸並進行結合反應；計算該適體與該待測樣本的結合率；以及在結合率大於閥值時，判斷待測樣本具有大腸結腸癌幹細胞之存在。

以下藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容易瞭解本發明之目的、技術內容、特點及其所達成之功效。

本發明將藉由下述之較佳實施例及其配合之圖式，做進一步之詳細說明。需注意的是，以下各實施例所揭示之實驗數據，係為便於解釋本案技術特徵，並非用以限制其可實施之態樣。

一般來說，適體(apatamer)指的是與特定的目標物，例如小分子化合物、蛋白質、核酸、細胞、組織或器官結合的寡聚核苷酸或肽鏈。而適體通常係從大量的隨機序列篩選出來，應用於大分子藥物的開發以及臨床診斷的研究中。

本發明提供一種對大腸結腸癌細胞具有結合專一性的適體核苷酸序列，其係利用下列步驟而篩選出來，請參閱圖1。首先，利用單股DNA庫以系統性配分子指數演繹程序(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)配合多表皮表面蛋白(epithelial-enrich)連結磁珠對大腸結腸癌細胞分別進行專一性腫瘤標誌篩選。在步驟S11中，先將單股DNA庫與多表皮表面蛋白連結磁珠/正向篩選細胞群混合。於此，在一實施例中，所使用的正向篩選細胞可為大腸結腸癌細胞株(colorectal cancer cell line, HCT-8)。或者，在另一實施例中，正向篩選細胞可為經流式細胞儀分離並懸浮式增生培養獲得之大腸結腸癌幹細胞(colorectal cancer stem cell, CR-CSC)。若與正向篩選細胞，亦即，上述大腸結腸癌細胞株HCT-8或大腸結腸癌幹細胞CR-CSC具有親和力的單股DNA則會與該些細胞結合。接著，如步驟S13，將未鍵結的單股DNA清洗排除，並以磁場收集單股DNA/正向篩選細胞/磁珠群，以完成初步篩選步驟。

而後，如步驟S15，加熱所收集到的單股DNA/正向篩選細胞/磁珠群，使鍵結的單股DNA釋出。接著，如步驟S17，將釋出的單股DNA與已連結負向篩選細胞的磁珠混合以共同培養，於此，負向篩選細胞只要為與上述正向篩選細胞相異的細胞即可。最後，利用磁場收集已鍵結的單股DNA/負向篩選細胞/磁珠群，並收集上清液中未與負向篩選細胞鍵結的單股DNA，如步驟S19。藉此，可獲得對於正向篩選細胞，亦即，上述大腸結腸癌細胞株HCT-8或大腸結腸癌幹細胞CR-CSC具有結合專一性與親和力的單股DNA，以完成第二步的篩選。

接著，藉由聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)增幅利用上述方法所篩選出之單股DNA，並經過多次循環篩選，較佳地，經過6次循環篩選後，收集所篩選出之單股DNA，並進行選殖與基因定序。

根據本發明之上述實施例，分別篩選出對大腸結腸癌細胞株HCT-8或大腸結腸癌幹細胞CR-CSC具有結合專一性及親和力的核苷酸序列，如Seq ID: NO. 1至Seq ID: NO.7所列。

在本發明之另一實施例中，上述篩選出之對大腸結腸癌細胞株HCT-8或大腸結腸癌幹細胞CR-CSC具有結合專一性及親和力的核苷酸序列可於5’端及3’端加入引子序列，以便於後續實驗的進行，其可為如Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO.14所列之核苷酸序列。在後文中，係例示性地以Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO.14所列之核苷酸序列進行實驗，然而本發明並不以此為限制，其可包含如Seq ID: NO. 1至Seq ID: NO. 7所列之核苷酸序列。

細胞定性影像分析

在一實施例中，為確認Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO. 14所列之核苷酸序列對於大腸結腸癌細胞的結合專一性，進行下列細胞定性影像分析。首先，利用癌幹細胞表面分子CD44及CD133以確認培養細胞(大腸結腸癌細胞株HCT-8或大腸結腸癌幹細胞CR-CSC的幹細胞特性。其中，利用帶有紅色螢光的CD44及CD133抗體分別辨識大腸結腸癌細胞株HCT-8及大腸結腸癌幹細胞CR-CSC，其結果如圖2所示。其中，僅有在大腸結腸癌幹細胞CR-CSC中可發現帶有紅色螢光的CD44及CD133抗體之結合，顯示本發明中所使用的大腸結腸癌幹細胞CR-CSC確實具有癌幹細胞之特性。

接著，將Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO. 14所列之核苷酸序列的5’端分別標記綠色螢光基團(FAM fluorescence)，並分別地與大腸結腸癌細胞株HCT-8及大腸結腸癌幹細胞CR-CSC共同混合，以確認該些核苷酸序列對於上述細胞株的專一性辨識性，其結果如圖3所示。其中，在大腸結腸癌細胞株HCT-8中可發現帶有綠色螢光基團的Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO. 10，顯示Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO. 10對於大腸結腸癌細胞株HCT-8具有專一性的辨識能力；而在大腸結腸癌幹細胞CR-CSC中可發現帶有綠色螢光基團的Seq ID: NO. 11至Seq ID: NO. 14，顯示Seq ID: NO. 11至Seq ID: NO. 14對於大腸結腸癌幹細胞CR-CSC具有專一性的辨識能力。

抓取能力分析

在一實施例中，將Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO. 14所列之核苷酸序列分別接合於磁珠上，並與各種不同的細胞株進行混合，包含大腸結腸癌細胞(HCT-8)、大腸結腸癌幹細胞(CR-CSC)、人類肺腺癌細胞(A549)、人類乳癌細胞(MCF7)、人類原位胰腺癌細胞(BxPC-3)、人類肝癌細胞(HepG2)、人類子宮頸癌細胞(Hela)、及小鼠纖維母細胞(NIH-3T3)。其中，帶有上述核苷酸序列之磁珠與各細胞係於室溫下以25 rpm混合30分鐘，且各細胞株的數量皆為2x10⁵ 。在清洗數次後，計算被帶有上述核苷酸序列之磁珠抓取的細胞數目。其結果如圖4所示。

Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO. 10對於大腸結腸癌細胞株HCT-8的抓取率分別為47.8%、50.1%、以及42.5%；而Seq ID: NO. 11至Seq ID: NO. 14對於大腸結腸癌幹細胞CR-CSC的抓取率分別為51.7%、45.6%、52.9%、以及54.9%，由此可知，相較於其他的腫瘤細胞，本發明所提供之核苷酸序列分別對於大腸結腸癌及大腸結腸癌幹細胞具有較高的抓取辨識率。

綜合上述，本發明之適體核苷酸序列Seq ID: NO. 8至Seq ID: NO.14分別對於大腸結腸癌及大腸結腸癌幹細胞分別具有高專一性與親和力，可有利於大腸結腸癌的早期篩檢以及提供更方便快速的癌症檢測方法。

以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。

S11~S19‧‧‧步驟

圖1為根據本發明實施例之篩選對大腸結腸癌細胞具有結合專一性的適體之流程圖。圖2為實驗數據顯示本發明所使用之細胞株的細胞特性。圖3為實驗數據顯示本發明之適體核苷酸序列對於大腸結腸癌細胞及大腸結腸癌幹細胞的專一性辨識。圖4為實驗數據顯示本發明之適體核苷酸序列對於大腸結腸癌細胞及大腸結腸癌幹細胞的抓取能力。

＜110＞ National Tsing Hua University ＜120＞ apatamer sequence listing ＜130＞ Human ＜160＞ 14 ＜170＞ BiSSAP 1.3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 1 atggttgtgt ttttttttgt gtggcttcgt atgttgttgc g 41 ＜210＞ 2 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 2 ccaaaaaaac accaaaaaca aaaccact 28 ＜210＞ 3 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 3 agtggttttg tttttggtgt ttttttgg 28 ＜210＞ 4 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 4 gcggtctgac tgggtagcag tagaaggcgt cggtcccggg t 41 ＜210＞ 5 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 5 acccgggacc gacgccttct actgctaccc agtcagaccg c 41 ＜210＞ 6 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 6 cacagccgca cacacagaac tccaggatct taccgcctca t 41 ＜210＞ 7 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 7 atgaggcggt aagatcctgg agttctgtgt gtgcggctgt g 41 ＜210＞ 8 ＜211＞ 73 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 8 tacagcacca cagaccatgg ttgtgttttt ttttgtgtgg cttcgtatgt tgttgcgtgt 60 ttgtcttcct gcc 73 ＜210＞ 9 ＜211＞ 60 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 9 ggcaggaaga caaacaccaa aaaaacacca aaaacaaaac cactggtctg tggtgctgta 60 ＜210＞ 10 ＜211＞ 60 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 10 tacagcacca cagaccagtg gttttgtttt tggtgttttt ttggtgtttg tcttcctgcc 60 ＜210＞ 11 ＜211＞ 73 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 11 ggcaggaaga caaacagcgg tctgactggg tagcagtaga aggcgtcggt cccgggtggt 60 ctgtggtgct gta 73 ＜210＞ 12 ＜211＞ 73 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 12 tacagcacca cagaccaccc gggaccgacg ccttctactg ctacccagtc agaccgctgt 60 ttgtcttcct gcc 73 ＜210＞ 13 ＜211＞ 73 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 13 ggcaggaaga caaacacaca gccgcacaca cagaactcca ggatcttacc gcctcatggt 60 ctgtggtgct gta 73 ＜210＞ 14 ＜211＞ 73 ＜212＞ DNA ＜213＞ National Tsing Hua University ＜400＞ 14 tacagcacca cagaccatga ggcggtaaga tcctggagtt ctgtgtgtgc ggctgtgtgt 60 ttgtcttcct gcc 73

S11~S19‧‧‧步驟

Claims

一種對大腸結腸癌幹細胞具有結合專一性的適體，其包含Seq ID: NO. 6之核苷酸序列或其互補的核酸序列，其中該互補的核酸序列為Seq ID: NO. 7。
如請求項1之對大腸結腸癌細胞具有結合專一性的適體，其中該核苷酸序列更包含選自由Seq ID: NO. 13及Seq ID: NO. 14所組成的群組之其中之一的核苷酸序列。
一種檢測大腸結腸癌幹細胞的方法，其包含：將請求項1至請求項2任一項之對大腸結腸癌幹細胞具有結合專一性的適體與一待測樣本接觸並進行結合反應；計算該適體與該待測樣本的結合率；以及在結合率大於一閥值時，判斷該待測樣本具有大腸結腸癌幹細胞之存在。
如請求項3之檢測大腸結腸癌幹細胞的方法，其中該待測樣本包含細胞、組織。