CN109628455B - 一种检测人结肠癌的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用 - Google Patents

一种检测人结肠癌的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可靶向检测结肠癌细胞的核酸适体及其应用，该核酸适体的核苷酸序列为5’‑ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATG CGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG‑3’。本发明的核酸适体的稳定性好，能特异性识别靶标分子，在体内的免疫原性小，易于被排除。该适体分子量小，制备成本低，可通过体外化学合成得到，易于贮存和运输。采用本发明的核酸适体可以对多种结肠癌细胞进行检测，且操作简单、迅速，有助于结肠癌的早期诊断、靶向治疗及预后等。

Description

一种检测人结肠癌的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于人结肠癌细胞及临床样本组织检测的核酸适体及其制备检测试剂的应用方法。
背景技术
结直肠癌是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤，其全球死亡率位于第三位。结直肠癌的发生与体外环境和体内因素有很大的关联。体外环境中的饮食习惯（如长期高热量、高脂肪饮食）和生活方式（如缺乏运动）都是导致结直肠癌发生的诱因。体内因素主要是与家庭遗传史有关，如家族性腺瘤性息肉病家系（FAP）、遗传性非息肉性结直肠癌家系（HNPCC）。随着经济飞速发展，人们的生活水平日渐提高，饮食习惯和生活方式随之发生改变，结直肠癌的发病率和死亡率也在逐年提升，每年约新增病例120万，且有60%发生于发达国家，发展中国家占新增病例的40%。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率将比于上世纪90年代都有明显的提升。结直肠癌已成为威胁我国人民健康的重要肿瘤之一。
手术切除是目前结直肠癌治疗的首选方式，但是结直肠癌的肝转移会导致手术切除失败。约15%-20%的结直肠癌在进行第一次手术时已经发生肝转移，术后结直肠癌复发产生肝转移的概率约达50%。化疗是应对术后复发及产生转移性结直肠癌患者的主要治疗方法，但化疗缺乏靶向性，会对正常组织和细胞产生毒副作用。目前用于结直肠癌靶向治疗的药物主要包括伊立替康、卡培他滨、奥沙利铂、西妥昔单抗、帕尼单抗等，但某些基因突变的结直肠癌患者的靶向药物治疗效果不显著。
结直肠癌的疾病分期是最重要的预后因素。在美国，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的结直肠癌患者5年生存率分别为90.1%、69.2%、69.2%、11.7%。Ⅰ期和Ⅳ期的结直肠癌患者术后生存率分别为90%和10%。因此，结直肠癌的早期筛查和治疗是治疗结直肠癌患者的重要方法之一。美国在2018年公布的癌症统计数据表明，美国结直肠癌死亡率在25年内下降了52%，主要得益于美国在这20年间进行的筛查。筛查在临床上主要是指在早期通过各类化学、影像等医学手段对将要发生或已经发生的疾病进行早期检查，进而在早期就对疾病进行治疗和控制，减少晚期病例，降低死亡率。但我国的肠镜筛查非常欠缺。一方面是由于大部分国民对于肠镜检查的意义并不重视和了解。另一方面，内镜检查是一种侵入性的检查方式，有一定的不适和并发症，让人产生畏惧心理，导致一些结直肠的疾病无法得到早期发现和确诊，错过了最佳治疗时期。综上，研发一种能靶向识别结直肠癌且能对结直肠癌进行早期识别的分子药物对于结直肠癌的筛查和治疗都具有重大的意义。
发明内容
本发明人利用实验室中的Swan Library（plos one,2014, 9(1): e87002-e87002）中的所有适体对人结肠癌细胞进行流式结合验证，最终得到可以与多种人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo 、Caco2、SW620、HCA7、DLD1）结合且不与人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）结合的适体。因而，本发明的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于人结肠癌检测的适体及其在制备检测试剂中的应用方法。
本发明提供一种检测人结肠癌的核酸适体，其核苷酸序列如下所示：
5’-AGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGG-3’，或者在其两端分别增加1至20个碱基，或进行标记修饰。
优选地，其核苷酸序列如下所示：
5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’、
5’-CCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG -3’、
5’-CTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCAC-3’、或者
5’-CGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGT-3’。
更优选地，其核苷酸序列如下所示：
5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’。
进一步地，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记，更进一步地，所述标记修饰是指Cy5标记。
本发明还提供上述的检测人结肠癌的核酸适体在制备检测人结肠癌的制剂中的用途。
进一步地，本发明还提供检测人结肠癌的制剂中的试剂盒，其含有如上述的检测人结肠癌的核酸适体。
本发明具有以下有益效果：
目前结肠癌细胞缺乏能早期识别的分子探针，本发明筛选得到的核酸适体能靶向识别结直肠癌，特别是结直肠癌早期组织。该适体具有免疫源性低、稳定性好、分子量小、易于修饰和标记的特点，且可以在体外通过化学合成得到，制备成本低，易于保存。本发明的适体可特异性识别人结肠癌细胞，为结肠癌的准确诊断、快速定位、靶向治疗和预后提供了有力的手段。
附图说明
图1为swan library中的ssDNA与人结肠癌细胞（HCT116）的结合情况；
图2为DML7与人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo 、Caco2、SW620、HCA7、DLD1）、人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）的结合情况；
图3 DML7序列经过一系列的删减后与人结肠癌细胞（HCT116）的结合情况；
图4为DML7与人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo等）的亲和性；
图5核酸适体DML7与线粒体荧光探针在HT29、LoVo活细胞共定位情况；
图6核酸适体DML7对临床结肠癌组织切片的靶向识别能力。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为购自常规生化试剂商店。
细胞来源：
本实验所用到的细胞系人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo 、Caco2、SW620、HCA7、DLD1），人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）均购自于中科院上海细胞库。
实施例1：确定与结肠癌细胞系结合能力最高的序列
首先，将Swan library中的所有序列用DPBS稀释到终浓度为250nM，并在95℃变性5min，在冰上复性10min，然后放置于常温。其次，将贴壁的结肠癌细胞用0.2%的EDTA从培养皿上消化下来并收集到离心管中，用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）洗涤离心多次。然后往细胞中分别加入准备好的适体序列和结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）。将整个混合体系置于4℃摇床孵育1h，然后用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）洗涤离心2次，最后用流式细胞仪检测荧光（结果见图1）。检测结果如图1所示，DML7与结肠癌细胞HCT116细胞的结合能力最强。
实施例2 ：DML7特异性识别结肠癌细胞
该实验与实施例1的实验相似。首先将DML7和对照序列分别用DPBS稀释成终浓度为250nM后变性复性。然后，将贴壁于培养皿上的结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo 、Caco2、SW620、HCA7、DLD1）和人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）分别用0.2%的EDTA消化下来并收集到离心管中，用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心洗涤几次。将准备好的DML7和对照序列分别加入到结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo）和人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）中，并加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）。将混合体系放于4℃摇床孵育1h，孵育完后用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）洗涤离心2次，之后用流式细胞仪检测荧光（结果见图2）。结果显示DML7与结肠癌细胞具有高亲和力的结合，但与人正常肠上皮细胞几乎不结合。
实施例3：DML7序列进行截短的方法
对DML7按以下方法进行删减优化（下划线部分为DML7的保守核苷酸序列）：
DML7序列全长为：
5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’。
：(左边引物区删减11个碱基)
CCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG
DML7-b：(左边引物区删减3个碱基，右边引物区删减9个碱基)
CTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCAC
DML7-c：(左边引物区删减13个碱基，右边引物区删减19个碱基)
AGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGG
DML7-d：(左边引物区删减5个碱基，右边引物区删减7个碱基)
CGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGT
我们将上述4条删减后的序列和全长序列与HCT116孵育后用流式细胞仪进行荧光检测，计算删减后的序列的相对结合情况（结果见图3），结果显示DML7与HCT116细胞的结合能力最强。
实施例4: DML7与人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo）的亲和性
该实验与实施例1的实验相似。将DML7用DPBS按照一定的浓度梯度稀释，95℃变性5min，冰上复性10min。然后，将贴壁于培养皿上的结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo）分别用0.2%的EDTA消化下来并收集到离心管中，用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心洗涤几次。将准备好的浓度梯度的DML7分别加入到结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo）中，并加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）。将混合体系放于4℃摇床孵育1h，孵育完后用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）洗涤离心2次，之后用流式细胞仪检测荧光。扣掉非特异性吸附的平均细胞荧光强度，用公式Y = BmaxX / (Kd + X)作图，横坐标为梯度浓度，纵坐标为平均荧光强度。DML7与结肠癌（HCT116、HT29、LoVo）均具有高亲和力，Kd值在nmol级别（结果见图4）。
实施例5: 核酸适体DML7与线粒体荧光探针在结肠癌活细胞中共定位
将DML7和对照序列用DPBS稀释，并在95℃变性5min，冰上复性10min，然后加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）使其终浓度为250nM，离心后放置于常温。用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）轻柔洗涤光学皿中HT29、LoVo细胞，然后往两个皿中加入线粒体荧光探针，在37℃孵育半小时后用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）再次轻柔洗涤2次，然后往两个皿中分别加入准备好的适体和对照序列，在4℃孵育1h，孵育完后用洗涤缓冲液（Washing Buffer：DPBS，0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）洗涤多次，最后用激光共聚焦荧光显微镜拍照（结果见图5）。结果显示DML7在HT29、LoVo细胞中定位于线粒体。
实施例6: DML7对临床结肠癌组织切片的识别能力
将购买的临床病理石蜡组织切片放入60℃烘箱中烤片，然后立刻在二甲苯中进行脱蜡，并切片依次放入无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、DPBS中进行水化处理。用抗原修复液（柠檬酸钠溶液（PH=6.0））对切片进行抗原修复，修复完成后用DPBS洗涤，并用封闭液（binding buffer + 20%FBS + 0.5mg/mL的鲑鱼精）室温封闭切片1h。往切片上滴加已经准备好的Cy5标记的DML7，4℃孵育2h。孵育完成后，DPBS洗涤切片，并吸干切片表面水分。在切片上滴加中性树脂，盖上盖玻片。最后使用全景扫描（3DHISTECH）检测荧光信号。同时，计算每个案例的荧光强度并评价为阴性（ - ，<30000），弱（+，30000-60000），中等（++，60000-100000）或强（+++，> 100000）。表1是对玻片荧光强度进行分析后的结果，Cy5标记的DML7对结肠癌临床切片具有靶向识别能力，尤其是对结肠癌早期组织切片的的靶向能力更强（结果见图6）。
表1
荧光强度 正常组织 相邻组织 癌组织Ⅰ期 癌组织Ⅱ期 癌组织Ⅲ期 癌组织Ⅳ期
- 8 8 14 42 15 3
+ 2 0 18 16 19 4
++ 0 2 12 25 7 4
+++ 0 0 1 4 0 0
“-”: 没有荧光
“+”: 弱荧光强度
“++”: 中等荧光强度
“+++”: 强荧光强度。

Claims (3)

1.一种人结肠癌的核酸适体在制备检测或诊断人结肠癌的制剂中的用途，其中所述核酸适体的核苷酸序列如下所示：
5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG- 3’；所述制剂用于检测人结肠组织切片。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，对所述核酸适体进行标记修饰，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述标记修饰是指Cy5标记。
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