CN107868786A - 多药耐药结肠癌细胞的单链dna适配体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，该适配体是针对多药耐药结肠癌细胞的且具有靶向药物递送功能的小分子单链DNA（ssDNA）序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该适配体具有与其它靶向分子如配受体等不同的特点，具有与靶细胞极高的亲和力和特异性，且适配体机体毒性小，筛选工艺简单，成本低廉，具有极大的应用价值，是一种有效的肿瘤靶向治疗的介质。

Description

多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体

技术领域

本发明属肿瘤临床治疗领域，具体涉及一种能用于多药耐药结肠癌靶向治疗及诊断的单链DNA适配子，还涉及该适配子在治疗多药耐药结肠癌中的应用。

背景技术

据世界肿瘤研究基金会（ World Cancer Research Fund）统计，结直肠癌（Colorectal cancer）已成为全球第三大恶性肿瘤，全球每年约 240 万新增病例。近年来，中国结直肠癌的发病率也明显提高，在部分发达地区已经上升为恶性肿瘤第二位。进展期结直肠癌根治效果差，手术切除率不足 50%。因此，关于结直肠癌的研究也越来越受到重视。化疗是结直肠癌综合治疗中重要的组成部分，也是防治转移的最重要手段，但与其它肿瘤一样，化疗过程中所产生的多药耐药（ Multidrug resistance, MDR）同样是结直肠癌化疗失败的最主要原因之一，因此，寻求一种能靶向多药耐药结肠癌细胞的药物系统是目前亟待解决的问题。随着纳米科技的不断进步，纳米材料在现代医学中的作用越来越受到重视。纳米药物载体通常是直径小于 100 纳米，具有携带和递送化疗药物至疾病部位的纳米颗粒。常见的包括纳米脂质体（ Liposome）， 聚合物纳米颗粒（Polymericnanoparticles）， 树枝状大分子（ Dendrimers）， 金属纳米颗粒等。研究证实，通过携带肿瘤表面特异性标记分子对应的配体可显著增加纳米载体被肿瘤细胞的摄取，从而进一步提高肿瘤细胞中化疗药物浓度，降低了化疗药物的系统毒性。常用的靶向配体有单克隆抗体如抗乳腺癌 Her-2 单抗（ Trastuzumab）、多肽、小分子如叶酸（ Folate）以及核酸适配子等。适配体（Apatmer）是通过SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment）以指数富集形式筛选获得的与靶分子具有高亲和力、高特异性的寡核苷酸配基，具有亲和力高、靶分子广、机体毒性小等特点，已经被广泛的应用到包括肿瘤的诊断及靶向治疗研究当中，是一种极具潜力的小分子生物制剂。本研究采用细胞SELEX技术筛选获得了针对人多药耐药结肠癌细胞LoVo/MDR的特异性单链DNA适配体，可特异识别多药耐药的结肠癌细胞，介导对耐药结肠癌细胞的靶向杀伤。

发明内容

本发明的目的在于：1、提供一种能与多药耐药结肠癌细胞特异性结合的单链DNA适配体LA1；2、提供单链DNA适配体在多药耐药结肠癌靶向治疗中的应用；3、提供制备上述DNA适配体的方法。

本发明的技术解决方案是该多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体的核苷酸序列为：

（1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

（2）以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为核心，向3’端或5’端延伸的序列；以SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，其中n30为SEQ ID No.1序列；

（3）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经插入、替换、缺失而形成的具有同等功能的序列。

其中，所述的核苷酸序列在多药耐药结肠癌诊断试剂制备中的应用。

其中，所述的核苷酸序列在多药耐药结肠癌靶向治疗药物体系制备中的应用。

其中，所述核酸适配体的制备方法包括以下步骤：

（1）不对称PCR法制备无标记、生物素或荧光素标记的适配体；

（2）人工合成。

本发明具有以下优点：

1、能特异性结合多药耐药结肠癌细胞LoVo的DNA适配体，其具有LA1所示的核苷酸序列；通过随机单链DNA文库以及引物的构建、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测定、体外不同肿瘤细胞及正常人外周血细胞的结合实验得到具有与多药耐药结肠癌细胞LoVo高亲和力、高特异性的DNA适配体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2、通过将其负载于一种纳米药物载体上证实，该适配体可有效的将化疗药物靶向至肿瘤部位，实现对多药耐药结肠癌更好的抑制作用。

3、在SEQ ID No.1基础上，通过插入、替换、缺失同样可获得与本发明具有同等功能的适配体序列，如SEQ ID No.2所示序列，或以SEQ ID No.1为核心，向3’或5’端延伸产生的新序列。

4、本发明进一步提供了上述适配子LA1在肿瘤细胞特异性识别中的应用；以LA1为模板，PCR扩增FITC标记的适配子，然后通过流式细胞术测定与不同肿瘤细胞以及正常人外周血细胞的亲和力大小，结果显示，LA1与多药耐药结肠癌细胞LoVo/MDR具有最高亲和力，且与正常人外周血细胞几乎不结合；因此，可将本适配子作为介导纳米载体靶向多药耐药结肠癌细胞的一种策略。

5、本发明还提供了一种以该适配子LA1在纳米靶向载体中的应用；本发明研究发现LA1可以促进载药纳米载体进入靶细胞，同时促进纳米靶向载体向多药耐药结肠癌组织分布，因而，本发明适配子制备成具有多药耐药结肠癌靶向作用的纳米靶向载体，用于多药耐药结肠癌的靶向治疗，为耐药后结肠癌的治疗提供了一种新的治疗途径，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1是适配子筛选过程凝胶电泳结果图。

图2是SELEX技术筛选获得与靶细胞LoVo/MDR结合的相同序列占测序序列比例，共对50个单克隆进行测序，具有相同序列的占比分别为36%，14%，10%，8%，8%，6%，6%，6%，2%，2%，2%。

图3是三个与靶细胞LoVo/MDR结合比例最高的三个序列及对照序列适配子的二级结构预测。

图4是三个适配子及对照适配子与靶细胞及非耐药的对照细胞LoVo的亲和力测定结果；分别扩增FITC标记的三个适配子及对照适配子，然后通过流式细胞术分别检测其与LoVo及LoVo/MDR细胞的亲和力大小，将亲和力最高的适配子命名为LA1。

图5是与靶细胞LoVo/MDR具有最高亲和力的适配子（LA1）与靶细胞结合特异性分析；将FITC标记的LA1分别与肺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞等孵育，流式细胞术分析其结合能力大小；LA1与LoVo/MDR具有最高亲和力。

图6是适配子LA1与健康志愿者外周血细胞亲和力大小测定；收集外周血、裂解红细胞，与FITC标记的LA1孵育，分别分析其与不同细胞群细胞的亲和力大小；LA1与单核细胞、淋巴细胞、粒细胞均无特异性结合。

图7是纳米载体制备及鉴定；制备好的纳米载体行电镜分析其形态、粒径，并通过粒度分析仪检测其表面电势变化。

图8是纳米载体内化靶细胞能力分析；将Doxorubicin、 GNV-Dox-siRNA 及GNV-Dox-siRNA-LA1，与靶细胞孵育后通过共聚焦显微镜观察载体系统及单纯的 Doxorubicin内化LoVo/Dox 细胞的情况并比较其荧光强度；LA1可促进靶细胞中化疗药物的聚集。

图9是纳米载体肿瘤靶向性分析；LA1可有效促进纳米载体靶向至肿瘤组织，减少其在肝脏、脾脏等的分布。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案，但实施例不能理解为是对技术方案的限制，在此基础上的适应性改进皆属于本发明的保护范围。

实施例：通过随机单链DNA文库以及引物的构建、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测定、体外不同肿瘤细胞及正常人外周血细胞的结合实验得到具有与多药耐药结肠癌细胞LoVo高亲和力、高特异性的DNA适配体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；SEQ ID No.1 序列为：TACGGCGCGTCGCTGTTCCTTAGCCAGTCT；

（1）构建随机单链DNA文库及引物

构建长度约76个碱基的单链DNA文库：5’-GCGGAATTCCAGGCGTGGCCAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表ATCG四种碱基；上游引物为5’-GCG GAATTCCAGGCGTGGCCAGTCCGAGCC-3’，下游引物为：GCGGGATTC TATGACGCATTGACCC-3’，上下游引物中酶切位点分别为EcoRI及BamHI；随机单链DNA文库及引物均由专业公司合成；

（2）细胞SELEX筛选

取（20 nmol） ssDNA 文库于 1 mL 的结合缓冲液（ 1 L PBS 中加入 4.5 g葡萄糖，100 mg tRNA， 1 g BSA 及 5 mL 1M MgCL2）中， 95 ℃加热 5 min后迅速置于冰上；将培养于 100 ×20 mm 的培养皿中的 LoVo/Dox 细胞（靶细胞）用洗涤缓冲液（ 1 L PBS 中加4.5g 葡萄糖及 5 mL 1M MgCL2）清洗 2 次；将冷却后的 ssDNA 文库加至平皿中，与细胞37℃孵育 1 h；洗涤缓冲液洗 3次后加入 500 μL 不含 DNA 酶的水，用细胞刮刮取细胞并转至 1.5 mL EP管中；95 ℃加热 10 min 后 13000 g 离心 5 min， 收集上清，以上清中的ssDNA 文库为模板 PCR 扩增产生 dsDNA，然后再以此 dsDNA 为模板行不对称 PCR 扩增产生 ssDNA；从第三轮筛选开始，增加对照细胞的阴性筛选，第二轮阳性筛选获得的ssDNA 文库与对照细胞 LoVo 孵育 1 h 后收集未与对照细胞结合的 ssDNA 并将其与靶细胞 LoVo/Dox 孵育 1 h；最后以同上的方法收集与 LoVo/Dox 结合的 ssDNA 库，以此ssDNA 库为模板 PCR 扩增后进入下一轮筛选，如此反复15轮筛选；为了进一步减少 ssDNA适配子与血液中正常细胞的非特异性结合，在筛选的最后一轮， 通过将 ssDNA 库与正常人的外周血细胞结合去除与其非特异性结合的 ssDNA；

（3）双链DNA及单链DNA文库PCR扩增

ssDNA 为模板 PCR 产生 dsDNA 的体系及条件为： 10 μL 10× Taq DNA聚合酶缓冲液， 4 μL dNTP (10 mM)，上下游引物各 4 μL (25 mM), ssDNA 文库 2 μL， DNA 聚合酶2 μL 及无 DNA 酶的水 74 μL；PCR 扩增条件为： 95℃预变性 5 min，再进行 95℃， 36s， 60℃， 36 s， 72℃， 84 s，共 15 个循环，72℃延伸 5 min；以 dsDNA 为模板不对称PCR 扩增为 ssDNA 的条件为： 10μL 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液， 4 μL dNTP (10 mM)，下游引物 4 μL (25mM), ssDNA 文库 2 μL， DNA 聚合酶 2 μL 及无 DNA 酶的水 78 μL；PCR 扩增条件为： 95℃预变性 5 min, 再进行 95℃， 36 s， 60℃， 36 s， 72℃， 84 s，共20 个循环， 72℃延伸5min；

（4）ssDNA 文库与靶细胞亲和力测定

通过 FITC 标记的下游引物以不对称 PCR 扩增每一轮的 ssDNA 文库，分别取 500nM 的 FITC 标记的 ssDNA 文库与靶细胞 LoVo/Dox （ 1×10⁶/mL）于 37 ℃孵育 1 h，洗涤缓冲液三次后将细胞重悬于结合缓冲液中通过流式细胞术检测细胞表面结合 FITC 荧光强度；通过检测，第15轮具有与靶细胞LoVo/Dox最高的亲和力，然后将其行不对称PCR扩增后酶切构建至pUC19载体上，转化大肠杆菌后提取质粒并进行测序鉴定，得到上述核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示；

（5）单链DNA适配子与靶细胞亲和力鉴定

取 500 nM、 FITC 标记的单链 LA 适配子或初始 ssDNA 文库（未筛选对照） 与靶细胞 LoVo/Dox (1×10⁶/mL) 于 100 μL 结合缓冲液中 37 ℃孵育 1 h，洗涤缓冲液洗涤三次后，流式细胞术检测并通过 FlowJo7.6.1 分析细胞表面的FITC 荧光强度；

（6）适配子与靶细胞结合特异性分析

分别取 500 nM 与靶细胞具有最高亲和力的 FITC 标记的单适配子 LA1（ FITC-LA1）与靶细胞 LoVo/Dox，反向筛选细胞 LoVo， 人胃癌细胞SGC-7901，人食管癌细胞 EC109 及正常人外周血白细胞（ 1×10⁶/mL） 于结合缓冲液中 37℃孵育 1 h, 洗涤缓冲液洗三次后行流式细胞术检测并通过FlowJo 7.6.1 分析其平均荧光强度；

（7）适配子靶向的纳米载体的制备及鉴定

将含 1 µmol 磷脂的葡萄柚脂质于玻璃瓶中充分干燥， 加入 400 µL ddH₂O， 40 µgDoxorubicin 及 2 µg 合成的 siRNA，（ siMDR-1: 5´ -GGAAAAGAAACCAACUGUCdTdT-3´(sense)， 或者对照siRNA (siNegative): 5´ -AGUACUGCUUACGAUACGGdTdT-3´ (sense) ，350Mj/cm2 紫外照射后置于水浴超声器中超声 15-20 min，然后将其转移至 5 mL离心管中 36000 rpm 离心收集携带 Doxorubicin 及 siRNA 的 GNVs 载体（ GNV-Dox-siRNA）；将 GNV-Dox-siRNA 重悬于 200 µL ddH₂O 后加入聚乙烯亚胺（ Polyethylenimine， PEI），室温搅拌孵育 2 h 后形成 GNV-DoxsiRNA-PEI 复合体， 最后将其重悬于 500 µL ddH₂O后加入 2 µg 单适配子LA1， 4℃搅拌过夜， 36000 rpm 离心 45 min 获得 GNV-Dox-siRNA-LA1，4 度避光备用；电镜：将离心收集的 GNV-Dox-siMDR-1， GNV-Dox-siNegative，GNV-DoxsiMDR-1-LA1， GNV-Dox-siNegative-LA1 分别溶于含 3%戊二醛及 1%多聚甲醛的0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中， 然后用含 2% 四氧化锇的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液固定 1h， 2% 醋酸铀作用 30 min 后经 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100% 梯度乙醇分别脱水15 min；电势分析：取离心收集的 GNV-Dox-siMDR-1， GNV-Dox-siNegative，GNV-Dox-siMDR-1-LA1， GNV-Dox-siNegative-LA1 溶于 1 mL ddH₂O，然后将其分别置于比色杯中，通过 ZetaSizer 检测其表面电势；

（8）载体系统内化 LoVo/Dox细胞分析

将 5×10³ LoVo/Dox细胞于4孔培养室的载玻片培养24 h，然后分别加入Doxorubicin、 GNV-Dox-siRNA 及GNV-Dox-siRNA-LA1，37℃孵育 3 h， 6h， 24 h后通过共聚焦显微镜观察载体系统及单纯的 Doxorubicin 内化LoVo/Dox 细胞的情况并比较其荧光强度；

（9）载体肿瘤靶向性分析

取相同剂量新鲜制的DiR 荧光染料标记的 DiR-GNV-Dox及 DiR-GNV-Dox-siMDR-1-LA1， 尾静脉注射至SCID 小鼠体内， 注射后不同时间点（ 30 min，1 h，6 h，12 h 及24 h）将小鼠通过吸入麻醉后行活体扫描，较肿瘤内的 DiR 信号强度；载体系统的脏器分布： 24h 后将小鼠行CO₂处死小鼠，分离小鼠的脏器（肝脏，肺脏，脾脏，肾脏，心脏， 脑，胸腺），置于活体成像仪中扫描脏器中的 DiR 信号并通过相应软件分析其相对信号强度。

其中：图1是适配子筛选过程凝胶电泳结果图。图2是SELEX技术筛选获得与靶细胞LoVo/MDR结合的相同序列占测序序列比例，共对50个单克隆进行测序，具有相同序列的占比分别为36%，14%，10%，8%，8%，6%，6%，6%，2%，2%，2%。图3是三个与靶细胞LoVo/MDR结合比例最高的三个序列及对照序列适配子的二级结构预测。图4是三个适配子及对照适配子与靶细胞及非耐药的对照细胞LoVo的亲和力测定结果；分别扩增FITC标记的三个适配子及对照适配子，然后通过流式细胞术分别检测其与LoVo及LoVo/MDR细胞的亲和力大小，将亲和力最高的适配子命名为LA1。图5是与靶细胞LoVo/MDR具有最高亲和力的适配子（LA1）与靶细胞结合特异性分析；将FITC标记的LA1分别与肺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞等孵育，流式细胞术分析其结合能力大小；LA1与LoVo/MDR具有最高亲和力。图6是适配子LA1与健康志愿者外周血细胞亲和力大小测定；收集外周血、裂解红细胞，与FITC标记的LA1孵育，分别分析其与不同细胞群细胞的亲和力大小；LA1与单核细胞、淋巴细胞、粒细胞均无特异性结合。图7是纳米载体制备及鉴定；制备好的纳米载体行电镜分析其形态、粒径，并通过粒度分析仪检测其表面电势变化。图8是纳米载体内化靶细胞能力分析；将Doxorubicin、 GNV-Dox-siRNA 及GNV-Dox-siRNA-LA1，与靶细胞孵育后通过共聚焦显微镜观察载体系统及单纯的Doxorubicin 内化LoVo/Dox 细胞的情况并比较其荧光强度；LA1可促进靶细胞中化疗药物的聚集。图9是纳米载体肿瘤靶向性分析；LA1可有效促进纳米载体靶向至肿瘤组织，减少其在肝脏、脾脏等的分布。

序列表

<110> 淮安市第一人医院

<120> 多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体及其应用

<130> 无

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（适配体DNA ）

<400> 1

tacggcgcgt cgctgttcct tagccagtct

<210> 2

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列（蛋黄极性脂质纳米载体）

<400> 2

ggatcctatg acgcattgac ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggctcggactgttcccta tagtgagtcg tattag

序列表

<110> 淮安市第一人医院

<120> 多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体及其应用

<130> 无

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(适配体DNA)

<400> 1

tacggcgcgt cgctgttcct tagccagtct 30

<210> 2

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(蛋黄极性脂质纳米载体)

<400> 2

ggatcctatg acgcattgac ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggctcgga 60

ctgttcccta tagtgagtcg tattag 86

Claims (7)

1.多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：该适配体的核苷酸序列为

SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：该适配体的核苷酸序列是以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为核心向3’端或5’端延伸的序列，如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，其中n30为SEQ ID No.1序列。

3.权利要求1所述的多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：该适配体的核苷酸序列是以SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经插入、替换、缺失而形成的具有同等功能的序列。

4.权利要求1所述的多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：所述的核苷酸序列在多药耐药结肠癌诊断试剂制备中的应用。

5.权利要求1所述的多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：所述的核苷酸序列在多药耐药结肠癌靶向治疗药物体系制备中的应用。

6.权利要求1所述的多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：所述核酸适配体的制备方法包括以下步骤：

（1）不对称PCR法制备无标记、生物素或荧光素标记的适配体；

（2）人工合成。

7.权利要求4所述的多药耐药结肠癌细胞的单链DNA适配体，其特征是：通过随机单链DNA文库以及引物的构建、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测定、体外不同肿瘤细胞及正常人外周血细胞的结合实验得到具有与多药耐药结肠癌细胞LoVo高亲和力、高特异性的DNA适配体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1 序列为：TACGGCGCGTCGCTGTTCCTTAGCCAGTCT；其具体步骤是：

（1）构建随机单链DNA文库及引物

构建长度约76个碱基的单链DNA文库：5’-GCGGAATTCCAGGCGTGGCCAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表ATCG四种碱基；上游引物为5’-GCG GAATTCCAGGCGTGGCCAGTCCGAGCC-3’，下游引物为：GCGGGATTC TATGACGCATTGACCC-3’，上下游引物中酶切位点分别为EcoRI及BamHI；随机单链DNA文库及引物均由专业公司合成；

（2）细胞SELEX筛选

取（20 nmol） ssDNA 文库于 1 mL 的结合缓冲液（ 1 L PBS 中加入 4.5 g葡萄糖，100 mg tRNA， 1 g BSA 及 5 mL 1M MgCL2）中， 95 ℃加热 5 min后迅速置于冰上；将培养于 100 ×20 mm 的培养皿中的 LoVo/Dox 细胞（靶细胞）用洗涤缓冲液（ 1 L PBS 中加4.5g 葡萄糖及 5 mL 1M MgCL2）清洗 2 次；将冷却后的 ssDNA 文库加至平皿中，与细胞37℃孵育 1 h；洗涤缓冲液洗 3次后加入 500 μL 不含 DNA 酶的水，用细胞刮刮取细胞并转至 1.5 mL EP管中；95 ℃加热 10 min 后 13000 g 离心 5 min， 收集上清，以上清中的ssDNA 文库为模板 PCR 扩增产生 dsDNA，然后再以此 dsDNA 为模板行不对称 PCR 扩增产生 ssDNA；从第三轮筛选开始，增加对照细胞的阴性筛选，第二轮阳性筛选获得的ssDNA 文库与对照细胞 LoVo 孵育 1 h 后收集未与对照细胞结合的 ssDNA 并将其与靶细胞 LoVo/Dox 孵育 1 h；最后以同上的方法收集与 LoVo/Dox 结合的 ssDNA 库，以此ssDNA 库为模板 PCR 扩增后进入下一轮筛选，如此反复15轮筛选；为了进一步减少 ssDNA适配子与血液中正常细胞的非特异性结合，在筛选的最后一轮， 通过将 ssDNA 库与正常人的外周血细胞结合去除与其非特异性结合的 ssDNA；

（3）双链DNA及单链DNA文库PCR扩增

ssDNA 为模板 PCR 产生 dsDNA 的体系及条件为： 10 μL 10× Taq DNA聚合酶缓冲液， 4 μL dNTP (10 mM)，上下游引物各 4 μL (25 mM), ssDNA 文库 2 μL， DNA 聚合酶2 μL 及无 DNA 酶的水 74 μL；PCR 扩增条件为： 95℃预变性 5 min，再进行 95℃， 36s， 60℃， 36 s， 72℃， 84 s，共 15 个循环，72℃延伸 5 min；以 dsDNA 为模板不对称PCR 扩增为 ssDNA 的条件为： 10μL 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液， 4 μL dNTP (10 mM)，下游引物 4 μL (25mM), ssDNA 文库 2 μL， DNA 聚合酶 2 μL 及无 DNA 酶的水 78 μL；PCR 扩增条件为： 95℃预变性 5 min, 再进行 95℃， 36 s， 60℃， 36 s， 72℃， 84 s，共20 个循环， 72℃延伸5min；

（4）ssDNA 文库与靶细胞亲和力测定

通过 FITC 标记的下游引物以不对称 PCR 扩增每一轮的 ssDNA 文库，分别取 500nM 的 FITC 标记的 ssDNA 文库与靶细胞 LoVo/Dox （ 1×10⁶/mL）于 37 ℃孵育 1 h，洗涤缓冲液三次后将细胞重悬于结合缓冲液中通过流式细胞术检测细胞表面结合 FITC 荧光强度；通过检测，第15轮具有与靶细胞LoVo/Dox最高的亲和力，然后将其行不对称PCR扩增后酶切构建至pUC19载体上，转化大肠杆菌后提取质粒并进行测序鉴定，得到上述核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示；

（5）单链DNA适配子与靶细胞亲和力鉴定

取 500 nM、 FITC 标记的单链 LA 适配子或初始 ssDNA 文库（未筛选对照） 与靶细胞 LoVo/Dox (1×10⁶/mL) 于 100 μL 结合缓冲液中 37 ℃孵育 1 h，洗涤缓冲液洗涤三次后，流式细胞术检测并通过 FlowJo7.6.1 分析细胞表面的FITC 荧光强度；

（6）适配子与靶细胞结合特异性分析

分别取 500 nM 与靶细胞具有最高亲和力的 FITC 标记的单适配子 LA1（ FITC-LA1）与靶细胞 LoVo/Dox，反向筛选细胞 LoVo， 人胃癌细胞SGC-7901，人食管癌细胞 EC109 及正常人外周血白细胞（ 1×10⁶/mL） 于结合缓冲液中 37℃孵育 1 h, 洗涤缓冲液洗三次后行流式细胞术检测并通过FlowJo 7.6.1 分析其平均荧光强度；

（7）适配子靶向的纳米载体的制备及鉴定

将含 1 µmol 磷脂的葡萄柚脂质于玻璃瓶中充分干燥， 加入 400 µL ddH₂O， 40 µgDoxorubicin 及 2 µg 合成的 siRNA，（ siMDR-1: 5´ -GGAAAAGAAACCAACUGUCdTdT-3´(sense)， 或者对照siRNA (siNegative): 5´ -AGUACUGCUUACGAUACGGdTdT-3´ (sense) ，350Mj/cm2 紫外照射后置于水浴超声器中超声 15-20 min，然后将其转移至 5 mL离心管中 36000 rpm 离心收集携带 Doxorubicin 及 siRNA 的 GNVs 载体（ GNV-Dox-siRNA）；将 GNV-Dox-siRNA 重悬于 200 µL ddH₂O 后加入聚乙烯亚胺（ Polyethylenimine， PEI），室温搅拌孵育 2 h 后形成 GNV-DoxsiRNA-PEI 复合体， 最后将其重悬于 500 µL ddH₂O后加入 2 µg 单适配子LA1， 4℃搅拌过夜， 36000 rpm 离心 45 min 获得 GNV-Dox-siRNA-LA1，4 度避光备用；电镜：将离心收集的 GNV-Dox-siMDR-1， GNV-Dox-siNegative，GNV-DoxsiMDR-1-LA1， GNV-Dox-siNegative-LA1 分别溶于含 3%戊二醛及 1%多聚甲醛的0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中， 然后用含 2% 四氧化锇的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液固定 1h， 2% 醋酸铀作用 30 min 后经 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100% 梯度乙醇分别脱水15 min；电势分析：取离心收集的 GNV-Dox-siMDR-1， GNV-Dox-siNegative，GNV-Dox-siMDR-1-LA1， GNV-Dox-siNegative-LA1 溶于 1 mL ddH₂O，然后将其分别置于比色杯中，通过 ZetaSizer 检测其表面电势；

（8）载体系统内化 LoVo/Dox细胞分析

将 5×10³ LoVo/Dox细胞于4孔培养室的载玻片培养24 h，然后分别加入Doxorubicin、GNV-Dox-siRNA 及GNV-Dox-siRNA-LA1，37℃孵育 3 h， 6h， 24 h后通过共聚焦显微镜观察载体系统及单纯的 Doxorubicin 内化LoVo/Dox 细胞的情况并比较其荧光强度；

（9）载体肿瘤靶向性分析

取相同剂量新鲜制的DiR 荧光染料标记的 DiR-GNV-Dox及 DiR-GNV-Dox-siMDR-1-LA1， 尾静脉注射至SCID 小鼠体内， 注射后不同时间点（ 30 min，1 h，6 h，12 h 及24 h）将小鼠通过吸入麻醉后行活体扫描，较肿瘤内的 DiR 信号强度；载体系统的脏器分布： 24h 后将小鼠行CO₂处死小鼠，分离小鼠的脏器（肝脏，肺脏，脾脏，肾脏，心脏， 脑，胸腺），置于活体成像仪中扫描脏器中的 DiR 信号并通过相应软件分析其相对信号强度。