CN104498500A

CN104498500A - 一种识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN104498500A
Application number: CN201410720055.XA
Authority: CN
Inventors: 上官棣华; 张楠; 邴涛; 刘祥军
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2014-12-01
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2034-12-01
Also published as: CN104498500B

Abstract

本发明公开了一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体。所述的核酸适体为如下(1)-(6)任一所示的单链DNA分子：(1)如SEQ ID No.1核苷酸分子所示的核酸适体1；(2)如SEQ ID No.2核苷酸分子所示的核酸适体2；(3)如SEQ ID No.3核苷酸分子所示的核酸适体3；(4)如SEQ ID No.4核苷酸分子所示的核酸适体4；(5)如SEQ ID No.5核苷酸分子所示的核酸适体5；(6)如SEQ ID No.6核苷酸分子所示的核酸适体6。利用本发明的核酸适体，可以在耐药机理未知的情况下，从分子响应信号上就能实时监测肿瘤的耐药性；从而有利于及时变更治疗方案，增加化疗成功率。

Description

一种识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体及其筛选方法和应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，主要包括导管癌和小叶癌。2012年，国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第一位，并呈逐年增长的趋势。阿霉素是常见的用于乳腺癌化疗一线药物之一；但在治疗过程中，肿瘤细胞逐渐对阿霉素耐受的同时对其它多种化疗药物产生耐药性，即多药耐药性。多药耐药性的产生是由于细胞解除药物活性的分子发生变异或过度表达引起的，分子水平上的机制从目前研究进展看可分为三种：第一种是细胞膜过度表达一些耐药蛋白如P-糖蛋白，多药耐药相关蛋白MRP，乳腺癌耐药蛋白BCRP等来增加细胞对药物的外排；第二种是癌基因介导的耐药；第三种是粘附蛋白相关。肿瘤细胞的耐药性是导致肿瘤化疗失败的重要原因之一。目前，检测肿瘤耐药性的主流方法是RT-PCR技术，即利用实时定量PCR相对定量检测相关耐药基因mRNA的表达水平，该方法虽然具有较高灵敏度，但步骤繁琐、耗时长、费用昂贵，且无法直观、原位地观察癌症耐药发生位置。因此构建一种简便、经济、直观和特异的肿瘤耐药性的实时监测系统在临床诊断方面具有应用前景。

配体指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment，SELEX)是一种在体外利用组合化学建立一个核酸文库并从文库中筛选出能与靶标物质特异性结合的核酸分子的技术。Cell-SELEX技术，即将细胞作为靶标物质，利用核酸文库，筛选能与该靶细胞结合的核酸适体的技术。目前，SELEX技术在基础研究、生物筛选等方面得到了很好的应用，并且在临床诊断方面也有广阔的应用前景。

核酸适体(aptamer)是一类能特异结合相应靶标物质的单链核酸序列，该单链核酸可以是DNA、RNA、肽核酸或化学修饰的核酸，通常由15到150个核苷酸组成。核酸适体与靶标物质高亲和力，高特异性地结合作用是通过范德华力、氢键、静电作用和疏水作用等分子间相互作用实现的。由于核酸能借助分子间作用力形成不同的特殊三维结构，如发卡、假结、G-四链体等结构，从而能特异性识别许多物质；因此SELEX技术所筛选的核酸适体的靶标物质范围广泛，包括无机金属离子、有机小分子、生物大分子、以及病毒、细菌、细胞和组织切片等，迄今已报道了数百个核酸适体。

利用Cell-SELEX技术能筛选出针对活细胞和组织等复杂靶标的核酸适体，与单克隆抗体相比，具有如下优点：(1)在体外筛选，无需免疫动物或细胞；(2)低毒性或免疫源性，水溶性好，可大剂量皮下静脉注射或病灶注射；(3)可进行大量化学合成制备，批间差异小；(4)易于结构改造、修饰、标记或固定化，增加血清中稳定性；(5)稳定性好，易保存和运输；(6)分子量小，一般在4-50KD；(7)核酸适体无需明确细胞表面靶标位点，即可开发用于疾病细胞。基于上述优点，核酸适体作为一种新型识别分子已经被广泛应用于分析化学、生物传感器、疾病诊断和治疗等诸多领域。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体。

本发明提供的用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体，为如下(1)-(6)任一所示的单链DNA分子：

(1)如SEQ ID No.1中第18-65位核苷酸分子所示；

(2)如SEQ ID No.2中第12-53位核苷酸分子所示；

(3)如SEQ ID No.3中第12-51位核苷酸分子所示；

(4)如SEQ ID No.4中第12-51位核苷酸分子所示；

(5)如SEQ ID No.5中第5-46位核苷酸分子所示；

(6)如SEQ ID No.6中第1-40位核苷酸分子所示。

本发明的另一个目的是提供一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体。

(1)如SEQ ID No.1核苷酸分子所示的核酸适体1；

(2)如SEQ ID No.2核苷酸分子所示的核酸适体2；

(3)如SEQ ID No.3核苷酸分子所示的核酸适体3；

(4)如SEQ ID No.4核苷酸分子所示的核酸适体4；

(5)如SEQ ID No.5核苷酸分子所示的核酸适体5；

(6)如SEQ ID No.6核苷酸分子所示的核酸适体6。

本发明还有一个目的是提供一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体的衍生物。

本发明提供的用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体的衍生物，为如下(1)-(6)任意一种：

(1)将上述所述的核酸适体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(2)将上述所述的核酸适体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(3)将上述所述的核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(4)由上述所述的核酸适体编码的RNA分子，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；

(5)由上述所述的核酸适体编码的肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(6)将上述所述的核酸适体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

本发明还有一个目的是提供一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的试剂盒。

本发明提供的用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的试剂盒包括上述所述的核酸适体或上述所述的核酸适体的衍生物。

上述所述的核酸适体或上述所述的核酸适体的衍生物或上述所述的试剂盒在如下(1)-(5)中任一中的应用也是本发明的保护范围：

(1)制备识别或辅助识别耐阿霉素乳腺癌细胞的产品；

(2)制备诊断乳腺癌耐药性的产品；所述耐药为耐阿霉素；

(3)制备用于耐药性乳腺肿瘤组织切片成像或活体成像的产品；所述耐药为耐阿霉素；

(4)乳腺癌耐药性相关的肿瘤标志物的制备；所述耐药为耐阿霉素；

(5)制备用于耐药性乳腺癌肿瘤细胞的靶向治疗的产品；所述耐药为耐阿霉素。

本发明的最后一个目的是提供一种检测乳腺癌细胞对阿霉素是否有耐药性的方法。

本发明提供的检测乳腺癌细胞对阿霉素是否有耐药性的方法包括如下步骤：将上述所述的核酸适体和对照序列分别与乳腺癌细胞混合得到混合液，孵育，通过流式细胞仪分别检测乳腺癌细胞与核酸适体和乳腺癌细胞与对照序列结合后的荧光强度，并设置阈值；

如所述乳腺癌细胞与所述核酸适体结合后的荧光强度大于阈值，则乳腺癌细胞为耐阿霉素乳腺癌细胞。

上述方法中，所述阈值为95％的所述乳腺癌细胞与所述对照序列结合后的荧光强度。

上述方法中，所述核酸适体和对照序列在与乳腺癌细胞混合前还需在5’端标记荧光素分子的步骤。

上述方法中，所述核酸适体和对照序列在混合液中的浓度为200nmol/L。

上述方法中，所述对照序列为任一不与乳腺癌细胞特异性结合的序列；具体如SEQ ID No.7所示。

在乳腺癌临床治疗中，通常采用化疗等手段，随着肿瘤细胞对化学药物的耐药性增加，化疗的效果降低。本发明的核酸适体具有高特异性、高亲和力；利用本发明的核酸适体，可以在耐药机理未知的情况下，从分子响应信号上就能实时监测肿瘤的耐药性；从而有利于及时变更治疗方案，增加化疗成功率。在医学监测、肿瘤标志物的发现和肿瘤靶向治疗方面将有重要的潜在应用价值。

附图说明

图1为随筛选轮数增加核酸适体的富集过程。

图2为实施例2中核酸适体2、核酸适体3、核酸适体4、核酸适体5和核酸适体6以及对照序列对耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr的结合曲线。

图3为空白对照的流式细胞仪检测结果。图3中三个散点图从左至右分别代表单独培养的A549T细胞、共培养的A549T细胞和MCF-7/Adr细胞、单独培养的MCF-7/Adr细胞的流式细胞仪检测结果。纵坐标代表流式细胞仪第一通道收集的荧光强度，横坐标代表流式细胞仪第四通道收集的荧光强度。

图4为待测细胞与核酸适体2结合的流式细胞仪检测结果。图4中三个散点图从左至右分别代表单独培养的A549T细胞、共培养的A549T细胞和MCF-7/Adr细胞、单独培养的MCF-7/Adr细胞与核酸适体2结合的流式细胞仪检测结果。纵坐标代表流式细胞仪第一通道收集的荧光强度，横坐标代表流式细胞仪第四通道收集的荧光强度。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

结合缓冲溶液(pH＝7.4)：含137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM KCl、2mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、25mM葡萄糖、1μg/ml BSA、0.1μg/ml鲱鱼精DNA和0.01％(v/v)吐温-80。

洗脱缓冲液(pH＝8.0)：含137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM KCl、2mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄和25mM葡萄糖。

实施例1、核酸适体的筛选和制备

一、耐阿霉素乳腺癌细胞和敏感型乳腺癌细胞的培养

耐阿霉素乳腺癌细胞(MCF-7/Adr)(购自上海艾研生物科技有限公司)用添加1μg/mL阿霉素的RPMI 1640(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)培养，使用前接种到无阿霉素培养基中培养一代；

敏感型乳腺癌细胞(MCF-7)(购自中科院上海细胞库)用DMEM(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)培养。所有细胞均在培养箱中进行常规培养(37℃，5％CO₂)，每两天传代一次。

二、随机核酸文库的设计

设计两端包括20个固定核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机核酸文库：5'-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N₄₅-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'；N₄₅代表45个A、T、C或G的随机核苷酸序列。

三、核酸适体的筛选

1、文库预处理

将上述18nmol的随机核酸文库溶于结合缓冲液，95℃变性5min，冰上冷却10min，室温复性放置30min。

2、反筛

在第2-11轮与耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr孵育前，取一皿敏感型乳腺癌细胞MCF-7，将预处理后的ssDNA库(随着筛选压力增加而降低DNA量)加入细胞中，在4℃振荡孵育1h(随筛选轮数增加而逐渐增加孵育时间)。

3、正筛

将反筛过程得到上清液与一皿耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr在4℃振荡孵育一段时间(随筛选轮数增加而逐渐减少孵育时间)。再用结合缓冲液清洗细胞几次之后，用细胞刮刀将细胞刮下来，加200μL水于95℃加热5min，洗脱结合在耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr上的ssDNA。而后将洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增。PCR扩增的引物为：

5'-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3'；

5'-Biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3'。

PCR扩增程序：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃，5min。

用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA(ssDNA)序列。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团，瑞典)脱盐，真空干燥，用于下一轮的筛选。

为了提高核酸适体的亲和力和特异性，在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛细胞MCF-7/Adr和增加反筛细胞MCF-7的细胞数量，以增加筛选的压力。17轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3'和5'-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3')进行PCR扩增，将第8轮和第17轮PCR产物进行测序。最终选择的核酸适体1如下：5'-AAGGAGCAGCGTGGAGGATAGTTGGGGTTTTTACGTTCGGTTGGCAAGTA TTGTGTGCGCTGTTCTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'(SEQ ID No.1)；其中加粗下划线标记的为核心序列。

4、核酸适体的优化

步骤3得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，优化后的序列长度只有41-62个核苷酸。最终得到的截短核酸适体序列(下划线代表核心序列)如下：

核酸适体2(将核酸适体1从5’端剪切掉3个核苷酸，从3’端剪切掉20个核苷酸)：5’-GAGCAGCGTGGAGGATAGTTGGGGTTTTTACGTTCGGTTGGCAAGTATTGTGTGCGCTGTTC-3’(SEQ ID No.2)；

核酸适体3(将核酸适体2的第11位的G突变为C，第13位的G突变为C得到的，加粗的2个核苷酸为突变核苷酸)：5’-GAGCAGCGTGCACGATAGTTGGGGTTTTTACGTTCGGTTGGCAAGTATTGTGTGCGCTGTTC-3’(SEQ ID No.3)；

核酸适体4(将核酸适体2的第50位的G突变为C，第52位的G突变为C得到的，加粗的2个核苷酸为突变核苷酸)：5’-GAGCAGCGTGGAGGATAGTTGGGGTTTTTACGTTCGGTTGGCAAGTATTCTCTGCGCTGTTC-3’(SEQ ID No.4)；

核酸适体5(将核酸适体2的5’端和3’端分别各自剪切掉7个核苷酸)：5’-GTGGAGGATAGTTGGGGTTTTTACGTTCGGTTGGCAAGTATTGTGTGC-3’(SEQ ID No.5)；

核酸适体6(将核酸适体2的5’端和3’端分别各自剪切掉11个核苷酸，并将核酸适体2的第45位的G突变为C，第50位的G突变为C，加粗的2个核苷酸为突变核苷酸)：5’-AGGATAGTTGGGGTTTTTACGTTCGGTTGGCAACTATTCT-3’(SEQ IDNo.6)；。

核酸适体随筛选轮数的富集过程如图1所示，峰形曲线表示耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr的细胞荧光分布情况；空白细胞作为对照。从图中可以看出：与乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/Adr结合的核苷酸序列在第1轮时就得到了明显富集，经过逐步加压后，结合序列在第6轮和第12轮进一步得到富集，筛选到第17轮时结合量略有降低。

实施例2、流式分析法检测核酸适体与耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr的结合能力

将获得的核酸适体2至核酸适体6及对照序列(SEQ ID No.7)在5’端标记荧光素(FAM)分子。用结合缓冲液溶解各单链DNA，依据紫外吸收标定浓度后，95℃加热5min，冰上放置10min，室温放置30min。变性-再复性后的DNA用结合缓冲液稀释成1nmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L和200nmol/L浓度梯度的DNA溶液。取一皿对数生长期的耐阿霉素乳腺癌细胞，用0.2％EDTA消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份，与上述DNA溶液在冰上孵育30min后，用洗涤缓冲液洗涤两遍，用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。以细胞表面平均荧光强度和分子探针浓度作图，利用公式Y＝BmaxX(Kd+X)计算探针对应的核酸适体的平衡解离常数。

结果如图2所示，横坐标为单链DNA浓度(nmol/L)，纵坐标为扣去细胞自发荧光值后的平均荧光强度，从图2的数据得出，核酸适体2的平衡解离常数为3.25±0.84nmol/L，核酸适体3的平衡解离常数为57.3±30.1nmol/L，核酸适体4的平衡解离常数为13.6±4.53nmol/L，核酸适体5的平衡解离常数为20.8±7.38nmol/L，核酸适体6的平衡解离常数为2.06±0.28nmol/L。结果表明：核酸适体的平衡解离常数均在纳摩尔级，亲和力较高。

实施例3、流式分析法检测核酸适体的特异性

1、核酸适体探针预处理

将已合成的荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2、核酸适体3、核酸适体4、核酸适体5和核酸适体6和对照序列(SEQ ID No.7)分别溶于结合缓冲液中得到20μM的DNA溶液，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。

2、细胞株的预处理

人耐阿霉素乳腺癌细胞(MCF-7/Adr)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人乳腺癌细胞(SK-BR-3)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人耐长春新碱口腔癌细胞(KB/VCR)、人耐紫杉醇肺癌细胞(A549T)、人耐紫杉醇结肠癌细胞(HCT-8T)、人胚肾细胞(HEK293)、人口腔癌细胞(KB)、人肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT-8)、人结肠癌细胞(Lovo)、人前列腺癌细胞(22-RV1)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人宫颈癌细胞(HeLa)，以上15株细胞各取生长对数期的细胞一皿，用0.2％EDTA消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍，分为若干份，每份细胞数为5×10⁴个；悬浮生长的人白血病细胞(Jurkat)直接吹散后用洗涤缓冲液洗涤2遍，平均分为若干份，每份细胞数为5×10⁴个。

3、核酸适体的特异性的检测

上述处理后的16株细胞分别进行如下五组处理，每个处理设置三个重复，结果取平均值：

处理一、16株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入核酸适体2(终浓度为200nmol/L)。

处理二、16株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入核酸适体3(终浓度为200nmol/L)。

处理三、16株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入核酸适体4(终浓度为200nmol/L)。

处理四、16株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入核酸适体5(终浓度为200nmol/L)。

处理五、16株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入核酸适体6(终浓度为200nmol/L)。

处理六、16株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入对照序列(终浓度为200nmol/L)。

六个处理的混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪。

用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第一通道的荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。每个样品的仪器测得荧光强度扣除细胞自发荧光，得到每个样品结合在细胞表面的核酸适体的荧光强度。设定一个阈值，使得细胞百分数有大于95％的处理六细胞荧光强度值低于该阈值。细胞荧光强度值大于该阈值的视为核酸适体与细胞能特异性结合。以细胞与核酸适体结合后荧光强度超过这一阈值的细胞百分数作为衡量核酸适体与细胞结合能力强弱。核酸适体特异性结果如表1所示。

表1、核酸适体与不同细胞孵育结合的流式细胞仪检测结果

(-：<15％；﹢：15-30％；﹢﹢：30-65％；﹢﹢﹢：65-85％；﹢﹢﹢﹢：>85％)

4、检测结果

核酸适体2、核酸适体4和核酸适体6与靶标细胞MCF-7/Adr结合的荧光强度高于阈值的细胞百分数大于85％，核酸适体3和核酸适体5与靶标细胞耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/Adr结合的荧光强度高于阈值的细胞百分数占65-85％，而与其它三种敏感型的乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231的荧光强度与很少，说明相对于敏感型乳腺癌细胞，该核酸适体对耐阿霉素的乳腺癌细胞有强特异性。

同时还考察了其它三株耐药型肿瘤细胞，分别是耐紫杉醇肺癌细胞(A549T)、耐长春新碱口腔癌细胞(KB/VCR)和耐紫杉醇结肠癌细胞(HCT-8T)，其中，A549T和KB/VCR与核酸适体2、3、4、5、6这5个核酸适体结合的荧光强度高于阈值的细胞百分数小于15％；HCT-8T与核酸适体2、核酸适体4和核酸适体6结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数在15-30％，而与核酸适体3和核酸适体5结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数小于15％；说明相对于其它耐药型肿瘤细胞，核酸适体2、3、4、5、6这5个核酸适体特异性识别耐阿霉素的乳腺癌细胞。

还考察了核酸适体与正常永生化的人胚肾细胞(HEK293)的结合情况，结果表明核酸适体2、3、4、5、6这5个核酸适体与正常永生化的人胚肾细胞结合高于阈值的细胞百分数小于15％，说明核酸适体与正常永生化的人胚肾细胞不结合。

还考察了其它8株肿瘤细胞：人口腔癌细胞(KB)、人肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT-8)、人结肠癌细胞(Lovo)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人前列腺癌细胞(22-RV1)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人白血病细胞(Jurkat)，除了HeLa与核酸适体2、核酸适体4和核酸适体6结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数在15-30％，而与核酸适体3和核酸适体5结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数小于15％；其它7株细胞与核酸适体结合的荧光强度高于阈值的细胞百分数均小于15％。

综合核酸适体与包括靶标细胞在内的16株肿瘤细胞的结合情况表明：核酸适体与乳腺癌耐阿霉素细胞可以特异性结合，与其它细胞基本不结合；说明核酸适体能高特异性地识别耐阿霉素乳腺癌细胞。

实施例4、流式分析法检测核酸适体靶标在共培养的不同肿瘤细胞间的转移或迁移

一、检测方法

1、耐紫杉醇肺癌细胞(A549T)用CDFA SE染料预先标记，取大约1×10⁶个细胞，种于培养皿中，培养24h；

2、取耐阿霉素乳腺癌细胞(MCF-7/Adr)大约5×10⁵个细胞和取用CDFA SE染料预先标记的耐阿紫杉醇肺癌细胞(A549T)大约5×10⁵个细胞，将两者混合均匀，以1:1比例种于一个培养皿中，共培养24h；

3、耐阿霉素乳腺癌细胞(MCF-7/Adr)大约1×10⁶个细胞，种于培养皿中，培养24h；

上述所述三皿细胞在培养24h后，去除培养基，用洗涤缓冲液洗三遍后，用0.2％EDTA作用细胞20min，轻轻吹打，使细胞分散成单细胞。细胞用洗涤缓冲液洗涤三遍后，重悬于200ul结合缓冲液中。分别做如下处理：

处理一：不加任何DNA的细胞悬液(作为空白对照)，冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤一遍后，用流式细胞仪分析；

处理二：0.2nmol用Cy5染料标记的核酸适体2(终浓度为100nmol/L)加入细胞悬液中，冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤一遍后，用流式细胞仪分析。上述实验设置三个独立重复实验。

上述步骤2中的CDFA SE染料是从凯基生物公司购买的绿色荧光分子；这种荧光分子稳定存在于细胞质中，随着细胞分裂而均分至子代细胞，因此用于细胞示踪。用CDFASE染料使A549T细胞预先染色，按照凯基生物公司提供的染色方法进行染色；使得所有A549T细胞带有较强的绿色荧光，从而可区分共培养的A549T和MCF-7/Adr两株细胞。

二、检测结果

图3和图4是细胞的流式细胞仪检测结果。在流式细胞散点图中，横坐标表示流式细胞仪第四通道的荧光强度，即染料分子Cy5的荧光强度；纵坐标表示流式细胞仪第一通道的荧光强度，即染料分子CDFA SE的荧光强度。在散点图中设置十字象限门，将坐标区域划分为四个区域：左上角即第一通道荧光强度大而第四通道荧光强度小，即CDFA SE阳性、Cy5阴性，记为Q1区；右上角即第一通道荧光强度大同时第四通道荧光强度大，即CDFA SE阳性、Cy5阳性，记为Q2区；右下角即第一通道荧光强度小而第四通道荧光强度大，即CDFA SE阴性、Cy5阳性，记为Q3区；左下角即第一通道荧光强度小同时第四通道荧光强度小，即CDFA SE阴性、Cy5阴性，记为Q4区。以十字象限门右边两个区域为第四通道荧光强度高于阈值。

图3是细胞进行处理一的流式细胞仪检测结果，作为空白对照。结果表明：CDFA SE标记的A549T细胞在Q1区，MCF-7/Adr细胞在Q4区，共培养的细胞分为两群细胞，一群细胞在Q1区，表示A549T细胞占总细胞百分数为38.6％；另一群细胞在Q4区，表示MCF-7/Adr细胞，占总细胞百分数为61.4％。说明用CDFA SE染料预先标记A549T细胞的方法可以很好的区分共培养细胞中的A549T细胞和MCF-7/Adr细胞。

图4是细胞进行处理二的流式细胞仪检测结果。结果表明：单独培养的A549T细胞与核酸适体2结合后第四通道荧光强度高于阈值的细胞百分数为15％；单独培养的MCF-7/Adr细胞与核酸适体2结合后第四通道荧光强度高于阈值的细胞百分数为96.1％；共培养的A549T细胞与核酸适体2结合后，A549T细胞在第四通道荧光强度高于阈值的占A549T细胞群的百分数为60.9％；共培养的MCF-7/Adr细胞与核酸适体2结合后，MCF-7/Adr细胞在第四通道荧光强度高于阈值的占MCF-7/Adr细胞群的百分数为82.2％。单独培养的A549T细胞不与核酸适体2结合，而与MCF-7/Adr细胞共培养后，A549T细胞与核酸适体2结合增强。

综合处理一和处理二的检测结果表明：单独培养的MCF-7/Adr细胞与核酸适体2结合后第四通道荧光强度高于阈值的细胞百分数为96.1％，共培养的A549T细胞和MCF-7/Adr细胞与核酸适体2结合后，第四通道荧光强度高于阈值两种细胞数的占细胞总数百分数为73.2％。共培养后与核酸适体结合的MCF-7/Adr细胞数略有降低，说明核酸适体2的在细胞表面的靶标物质总数目没有增加，但是有一部分靶标物质从MCF-7/Adr细胞表面转移或迁移至A549T细胞表面。

Claims

1.一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体，为如下(1)-(6)任一所示的单链DNA分子：

(1)如SEQ ID No.1中第18-65位核苷酸分子所示；

(2)如SEQ ID No.2中第12-53位核苷酸分子所示；

(3)如SEQ ID No.3中第12-51位核苷酸分子所示；

(4)如SEQ ID No.4中第12-51位核苷酸分子所示；

(5)如SEQ ID No.5中第5-46位核苷酸分子所示；

(6)如SEQ ID No.6中第1-40位核苷酸分子所示。

2.一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体，为如下(1)-(6)任一所示的单链DNA分子：

(1)如SEQ ID No.1核苷酸分子所示的核酸适体1；

(2)如SEQ ID No.2核苷酸分子所示的核酸适体2；

(3)如SEQ ID No.3核苷酸分子所示的核酸适体3；

(4)如SEQ ID No.4核苷酸分子所示的核酸适体4；

(5)如SEQ ID No.5核苷酸分子所示的核酸适体5；

(6)如SEQ ID No.6核苷酸分子所示的核酸适体6。

3.一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的核酸适体的衍生物，为如下(1)-(6)任意一种：

(1)将权利要求2所述的核酸适体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(2)将权利要求2所述的核酸适体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(3)将权利要求2所述的核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(4)由权利要求2所述的核酸适体编码的RNA分子，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；

(5)由权利要求2所述的核酸适体编码的肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(6)将权利要求2所述的核酸适体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

4.一种用于识别耐阿霉素乳腺癌细胞的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1或2所示的核酸适体或权利要求3所述的核酸适体的衍生物。

5.权利要求1或2所述的核酸适体或权利要求3所述的核酸适体的衍生物或权利要求4所述的试剂盒在如下(1)-(5)中任一中的应用：

(1)制备识别或辅助识别耐阿霉素乳腺癌细胞的产品；

(2)制备诊断乳腺癌耐药性的产品；所述耐药为耐阿霉素；

6.一种检测乳腺癌细胞对阿霉素是否有耐药性的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述的核酸适体和对照序列分别与乳腺癌细胞混合得到混合液，孵育，通过流式细胞仪分别检测乳腺癌细胞与核酸适体和乳腺癌细胞与对照序列结合后的荧光强度，并设置阈值；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述阈值为95％的所述乳腺癌细胞与所述对照序列结合后的荧光强度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述核酸适体和对照序列在与乳腺癌细胞混合前还需在5’端标记荧光素分子的步骤。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述核酸适体和对照序列在混合液中的浓度为200nmol/L。

10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述对照序列为任一不与乳腺癌细胞特异性结合的序列；具体如SEQ ID No.7所示。