CN105861695A - 一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术工程及肿瘤医学领域，公开了一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法及检测试剂盒。该方法采用荧光原位杂交技术结合锁核酸探针(LNA‑ELF‑FISH方法)对乳腺癌细胞中的miR‑222进行定量检测，根据miR‑222检测结果判断乳腺癌细胞耐药性。该方法的优越性在于不破坏细胞的情况下，用可视的方法得出乳腺癌细胞的耐药性，具有较好的临床应用前景。

Description

一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法及检测试剂盒
发明领域
本发明属于分子生物学及肿瘤医学领域，涉及一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法及检测试剂盒。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已经成为危害女性健康的主要恶性肿瘤。目前影响乳腺癌临床治疗疗效最主要的障碍就是乳腺癌细胞耐药性的形成。近年的研究已经显示，成熟的微小非编码RNA(miRNA)在乳腺癌耐药中的作用越来越显著，并已成为乳腺癌研究领域的热点之一。
MiRNA的功能是通过与互补的信使RNA(mRNA)结合实现基因转录后修饰，引起RNA的降解或抑制翻译。MiRNA在真核生物细胞中广泛存在，可能影响超过所有人类基因的三分之一的调节过程，并在绝大多数细胞生理过程(包括分化、增殖、凋亡、代谢途径和信号转导)中具有重要的调节作用。随着miRNA的作用逐渐被人们认识，分析miRNA表达的技术也越来越多，包括Northern印迹、微阵列和聚合酶链式反应(PCR)等等。Northern印迹是将存在于凝胶中的RNA分子转移到固定化介质(硝基纤维素膜)上并加以检测分析的技术。微阵列技术是在固体表面上集成已知序列的基因探针，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测相应位置杂交探针，实现基因信息快速检测。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外放大扩增特定基因片段的技术，能将微量的基因片段大幅度增加，灵敏度极高。以上这些方法都能够对miRNA的表达水平进行分析，但不足之处在于必须要在裂解许多细胞的情况下才能够进行分析。因此，上述方法不能够评估出单个细胞的miRNA丰度。
荧光原位杂交技术(FISH)是近年来发展起来的检测miRNA的热点技术。该方法根据已知微生物不同分类级别上种群特异的基因序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中基因序列杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。基于FISH的miRNA的典型可视检测方法是使用锁核酸(Locked nucleicacid，LNA)探针。LNA是一类新型的寡核苷酸衍生物，其中核糖环通过亚甲桥连接2’-O原子核4’-C原子而被锁定并形成环，这种环形桥可锁定3’-内结构构象中的核糖，该构象通常在A型DNA或RNA中出现，能显著提高探针的融解温度和稳定性，使得LNA探针表现出对RNA靶标的高亲和性和特异性，可有效识别单个碱基的错配。因此，LNA对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，允许即使是单碱基错配的歧视存在。虽然LNA-FISH能够在不裂解细胞的情况下检测miRNA，但不能够提供精确的miRNA的定量表达信息，只能够提供miRNA定位类型和组织分布的定性信息。
目前尚没有文献报道采用LNA-ELF-FISH检测乳腺癌细胞耐药性的技术。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法。
本发明还有一个目的是提供适用该方法的检测试剂盒。
本发明再有一个目的是提供一种改变乳腺癌细胞耐药性的方法。
本发明提出一种新的并且超灵敏的FISH方法，该方法可以实现在单一细胞内对miRNA的拷贝数进行绝对定量。通过这种新的FISH方法杂交miR-222来定量检测乳腺癌细胞的耐药性变化。
发明人经过实验证明miR-222为乳腺癌耐药特异性miRNA，其数量变化可反映癌细胞耐药性。在乳腺癌细胞产生耐药的过程中，细胞可选择性将miR-222富集于其微泡(exosomes)中，然后通过微泡将miR-222传递给周围的乳腺癌敏感细胞，从而使后者获得耐药性；同时应用外源性导入的方式改变乳腺癌细胞内miR-222的数量也能导致细胞耐药性的相应变化。因此，通过乳腺癌细胞内miR-222的定量检测可反映细胞的耐药性。
LNA-FISH能够在不裂解细胞的情况下检测miRNA，但不能够提供精确的miRNA的定量表达信息，只能够提供miRNA定位类型和组织分布的定性信息。发明人通过将LNA探针对特异性miRNA的唯一识别性质(通过其对应的唯一核酸序列识别)与酶标记荧光(ELF)技术结合在一起，来获得方法学的高度特异性和超级敏感性。ELF信号放大系统是一种独特的免疫荧光放大技术，是酶促反应过程中在酶活性部位产生荧光沉积物。本发明中通过磷酸酶裂解产生荧光沉积物，这种磷酸酶产生的黄绿色荧光比单个荧光素的亮度要强40倍。发明人通过LNA-ELF-FISH来定量分析不同乳腺癌细胞内miR-222的数量，通过细胞凋亡检测和MTT试验验证乳腺癌细胞耐药性能够随miR-222数量的改变而变化。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的：
一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法，该方法采用荧光原位杂交技术结合锁核酸探针(LNA-ELF-FISH方法)对乳腺癌细胞中的miR-222进行定量检测，根据miR-222检测结果判断乳腺癌细胞耐药性，即细胞内miR-222如果上调，则乳腺癌细胞耐药性增高，细胞内miR-222如果下调，则乳腺癌细胞耐药性降低。
所述的方法，其中该方法还包括采用流式细胞分析技术检测乳腺癌细胞凋亡的方法和/或采用MTT试验检测乳腺癌细胞半数抑制浓度的方法来验证miR-222的数量与乳腺癌细胞耐药性的关系。
所述的方法，其中采用荧光原位杂交技术结合锁核酸探针对乳腺癌细胞中的miR-222进行定量检测包括下列步骤：
先用地高辛(DIG)标记的LNA探针与乳腺癌细胞中的miR-222杂交，随后用碱性磷酸酶结合抗DIG抗体标记LNA探针，再采用酶标记荧光使得LNA杂合的位置发出荧光信号，每个荧光信号代表一个miR-222，计数单个荧光信号的数量即得到miR-222的数量，或者根据荧光强度与miR-222数量关系的标准曲线计算出miR-222的数量。
所述的方法，其中LAN探针为针对miR-222的LAN探针，其核苷酸序列为5′-ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT-3′(SEQ ID NO：2)；酶标记荧光为ELF97。
所述的方法，其中乳腺癌细胞耐药性是针对阿霉素或多烯紫杉醇耐药。
所述的方法，其中根据荧光强度与miR-222数量关系的标准曲线计算出miR-222的数量是通过下列步骤实现的：
a.选择具有可数荧光信号的单一细胞荧光图像，测定荧光区域的强度，减去背景值，得到该图像的整体集成荧光，即确定该荧光图像中整体集成荧光与可数荧光信号数量的关系；
b.按步骤a分别确定若干个具有可数荧光信号的单一细胞荧光图像的整体集成荧光与可数荧光信号数量的关系，形成线性曲线，即标准曲线；
c.选择具有不可数荧光信号的单一细胞荧光图像，测定整体集成荧光，代入标准曲线，得出该图像中荧光信号的数量，即得出该图像中miR-222的数量。
所述的方法，其中：
通过流式细胞分析技术检测乳腺癌细胞对化疗药物诱导的凋亡率，验证miR-222的数量与乳腺癌细胞耐药性的关系的方法包括以下步骤：将乳腺癌细胞MCF-7敏感株和耐药株分别转染miR-222的模拟物和抑制物，得到miR-222数量被上调及下调的乳腺癌细胞敏感株和耐药株，然后加入不同梯度的化疗药物孵育，冲洗，荧光素标记，采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，从而证实miR-222数量与细胞耐药性的关系，其中化疗药物采用阿霉素或多烯紫杉醇；
通过MTT试验来检测各组乳腺癌细胞的化疗药物的半数抑制浓度(IC50)，验证miR-222的数量与乳腺癌细胞耐药性的关系的方法包括以下步骤：将乳腺癌细胞MCF-7敏感株和耐药株分别转染miR-222的模拟物和抑制物，得到miR-222数量被上调及下调的乳腺癌细胞敏感株和耐药株，然后加入不同梯度的化疗药物共培养，MTT试验测定乳腺癌细胞的IC50值，从而得出证实miR-222数量与细胞耐药性的关系，其中化疗药物采用阿霉素或多烯紫杉醇。
所述的方法在制备乳腺癌细胞耐药性检测试剂盒中的应用。
一种乳腺癌细胞耐药性检测试剂盒，该试剂盒包含下列试剂：
LAN-ELF-FISH方法所需要检测试剂：MCF-7乳腺癌细胞(购自中国科学院上海细胞生物所，为乳腺癌敏感细胞株，为便于对比研究，以下以MCF-7/S表示乳腺癌敏感细胞株)、对阿霉素和/或多烯紫杉醇耐药的MCF-7细胞亚株(本实验室构建并鉴定，具体流程见文献：Systematic expression analysis of genes related to multidrug-resistance inisogenic docetaxel- and adriamycin-resistant breast cancer cell lines.Mol Biol Rep2013；40:6143–6150，下同)，绿色荧光蛋白(GFP)、miR-222模拟物和抑制物(GenePharma公司)，针对miR-222的特异性LNA探针(上海辉睿生物科技有限公司)，脂质体2000和ELF97(Invitrogen公司)，PKH26红色荧光染料(Sigma-Aldrich公司)，ELF 97mRNAIn-Situ Hybridization Kit(原位杂交试剂盒，Molecular Probes公司)；
所述的检测试剂盒，该试剂盒中还包括：
流式细胞分析技术所需要检测试剂：Annexin-V-FITC apoptosis detection kit(BDBiosciences公司)；
和/或
MTT试验所需要检测试剂：四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO；Amresco公司)，阿霉素(深圳万乐药业有限公司)和/或多烯紫杉醇(江苏恒瑞医药股份有限公司)。
一种改变乳腺癌细胞耐药性的方法，该方法通过外源性导入的方式上调或下调乳腺癌细胞中miR-222的数量来改变乳腺癌细胞耐药性。
所述的方法，其中通过转染miR-222的模拟物或抑制物来上调或下调乳腺癌细胞miR-222的数量。
具体地说，本发明可通过以下三步技术方案实现：
第一步，LNA-ELF-FISH方法原位杂交乳腺癌细胞中的miR-222：
发明人先用地高辛(DIG)标记的LNA探针(序列为5′-ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT-3′，SEQ ID NO：2)与乳腺癌细胞中的miR-222(序列为5′-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3′，SEQ ID NO：1)杂交，随后用碱性磷酸酶-结合抗-DIG抗体标记LNA探针，最后应用ELF97使得LNA杂合的位置能够发出极强的荧光信号。乳腺癌细胞内单个明亮的荧光点就代表一个miR-222，这样就可以通过荧光显微镜成像确定单个细胞中miR-222的拷贝数。
第二步：单个乳腺癌细胞内miR-222的拷贝数定量：
当细胞内miR-222拷贝数低于1000的时候只存在很少的重叠信号，因此可以比较容易数出；当拷贝数超过1000的时候，单个荧光点就很难辨别，因此为了估算细胞内miR-222的数量，发明人建立了细胞中miR-222拷贝数与细胞的总荧光强度之间的线性关系，以此估算miR-222的数量，包括以下步骤：
①由于乳腺癌细胞耐药株的微泡高表达miR-222，因此将本实验室构建的耐药乳腺癌细胞的微泡导入乳腺癌敏感细胞株MCF-7/S(购自中科院上海细胞库)中，构建高表达miR-222的乳腺癌细胞株，随机挑取一定数量的细胞，作为实验组，利用第一步技术方案，通过LNA-ELF-FISH方法原位杂交细胞中的miR-222，从而获得miR-222的拷贝数分布及其平均值。
②由于乳腺癌细胞敏感株的微泡中含有少量miR-222，因此将乳腺癌敏感株细胞的微泡导入上述同样来源的乳腺癌敏感株细胞中，构建低表达miR-222的乳腺癌细胞株，随机挑取一定数量的细胞，作为对照组，利用第一步技术方案，通过LNA-ELF-FISH方法原位杂交细胞中的miR-222，从而获得非耐药的情况下细胞内miR-222的拷贝数分布及其平均值，作为阈值。
③随机挑取一定数量的乳腺癌敏感株细胞，不额外加微泡，作为空白组，利用第一步技术方案，通过LNA-ELF-FISH方法原位杂交细胞中的miR-222，从而获得非耐药的情况下细胞内miR-222的拷贝数分布及其平均值，作为空白值。
第三步：流式细胞检测技术和MTT试验来验证miR-222拷贝数与乳腺癌细胞耐药性之间的对应关系：
①将上述实验组、对照组和空白组细胞暴露在同一浓度阿霉素下一定时间后，利用流式细胞检测技术分析各组细胞的凋亡率，利用MTT试验检测各组细胞的半数抑制浓度(IC50)，通过各组之间在相关参数上的差异(即，实验组细胞的凋亡率远低于对照组和空白组，但IC50远高于低于对照组和空白组)，从而得出乳腺癌细胞的耐药性与细胞内miR-222的表达量有关。
②为了进一步验证耐药性的改变是miR-222在起作用：首先，将miR-222模拟物转染到乳腺癌敏感细胞中，与①同样的步骤用阿霉素处理细胞，并用流式细胞技术和MTT试验检测相关参数，显示随着miR-222数量的上调，细胞的凋亡率降低，IC50升高，因此耐药性增高；其次，将miR-222抑制物转染到乳腺癌耐药细胞中，与①同样的步骤用阿霉素处理细胞，并用流式细胞技术和MTT试验检测相关参数，显示随着miR-222的下调，细胞的凋亡率升高，IC50降低，因此耐药性降低。从而乳腺癌细胞的耐药性是通过细胞内miR-222的上调或下调实现的。
本发明解决问题的技术流程包括：1.LNA-ELF-FISH；2.图像获取和数据统计；3.流式细胞检测；4.MTT试验。
进一步，具体的技术流程主要包括以下几个部分：
1.LNA-ELF-FISH
(1)乳腺癌细胞(敏感株和耐药株等分别进行实验)在多房腔室盖玻片在培养，直至它们达到50-70％。
(2)用500μL的浓度1×PBS清洗细胞3次，每次5min。用新鲜配制的500μL的4％多聚甲醛固定细胞，室温下30min。
(3)用500μL的浓度1×DEPC处理过的PBS清洗腔室玻片3次，每次5min。
(4)在500μL 70％的酒精中4℃渗透至少1夜。
(5)去除70％的酒精，用500μL浓度为1×DEPC处理过的PBS清洗腔室玻片1次，5min。
(6)细胞在250μL的杂交缓冲液(ELF 97试剂盒提供)中预杂交，在55℃的潮湿腔室中孵育2-4h。
(7)预杂交后，用250μL地高辛(DI)标记的LNA探针(终浓度10nM)，55℃下杂交1-3h完成与mir-222的原位杂交。
(8)在37℃条件下严格完成4次清洗：4×SSC简单清洗，2×SSC洗30min，1×SSC洗30min，最后0.1×SSC洗20min。
(9)室温下用500μL浓度1×洗涤缓冲液(ELF 97试剂盒提供)清洗细胞3次，每次5min。
(10)室温下在潮湿的腔室中用200μL封闭缓冲液(ELF 97试剂盒提供)中孵育细胞1h。
(11)在封闭液(ELF 97试剂盒提供)中(稀释1-250)加入2μg/mL的羊抗DIG-AP抗体，在室温下孵育1h。每个孔加250μL。
(12)再用1×洗涤缓冲液清洗细胞三次，每次5min后，在200μL ELF97磷酸酶培养基工作液(ELF 97试剂盒提供)中孵育细胞10-15min(10倍稀释ELF97磷酸酶培养基于显色缓冲液中即可配成工作液，所用试剂均由ELF 97试剂盒提供)。用0.2μM孔径大小的过滤器把剩下的溶液过滤到无菌玻璃瓶中。过滤后，在工作液中按照1:500比例稀释培养基添加剂1和添加剂2(ELF 97试剂盒提供)，涡旋搅拌，立即使用或者在无菌容器中4℃保存最多48h。
(13)为了长时间原位信号保存，用1×洗涤缓冲液快速清洗样品2次。将腔室玻片室温下放在后固定溶液(含2％甲醛和20mg/mL的BSA的1×PBS溶液，BSA购自北京赛为思生物技术开发中心)中30min，再次固定样品。
(14)用1μg/mL的Hoechst33342溶液(ELF 97试剂盒提供)复染，用mounting溶液(ELF 97试剂盒提供)封片。
(15)荧光成像：在封片1h后玻片就能快速观察杂交性能及背光水平。然而需要整晚的时间才能达到最佳观察效果。若4℃保存，玻片能数月不丢失荧光信号。
2.图像获取和数据统计
(1)在原位杂交后，获得细胞荧光图像。视野中随机选择细胞，按照Z轴增幅在单个细胞内获取3D图像，然后融合成一个2D图像。
(2)用以下命令在ImageJ(1.42u)软件中处理图像：(I)Process->Sharpen,(II)Image->type->8-bit and(III)Process->binary->make binary。
(3)在ImageJ中利用粒子分析计数程序(Analyze->analyze particles)计数单个细胞中所有的孤立信号。
(4)细胞中miRNA拷贝数超过1000时，分辨单独的荧光点逐渐困难。拷贝数超过2000时，整个细胞将会呈现几乎均一的荧光信号。这些细胞需要构建标准曲线来评估miRNA拷贝数，步骤如下：
①尽可能多的确定“可数”细胞，即只有少量miRNA-222的细胞。
②在ImageJ中，按照上述的步骤，在选择的细胞中计数miRNA-222拷贝数。
③测量这些“可数”细胞的整体集成荧光。围绕某一细胞画出想要测量的区域，并在ImageJ中运行下列步骤：Analyze->measure。记录在“IntDen”下列出的值。移动ROI到图像中没有细胞的另一位置来获得“IntDen”的背景测量。确定这两种测量方法的不同，这个值就是细胞整体集成荧光。
④画一个关于整体集成荧光和“可数”细胞内miRNA拷贝数的线性关系，拟合数据做一趋势线。
⑤同样的方法测量“不可数”细胞中整体集成荧光，参照步骤III。把整体荧光代入步骤IV的趋势图，算出“不可数”细胞中miRNA-222的拷贝数。
(5)分别统计不同组别中miRNA-222的数量，画出柱状统计图。
3.流式细胞检测
(1)阿霉素敏感的乳腺癌细胞株(例如MCF-7/S)通过技术方案第二步①②③分别构建实验组、对照组和空白组细胞，分别铺到六孔板中，然后用0.5μM的阿霉素孵育细胞48小时，PBS冲洗细胞两次，然后细胞与荧光素和碘化丙啶避光孵育30分钟，收集细胞，并用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。
(2)将乳腺癌细胞敏感株MCF-7/S及其阿霉素耐药株MCF-7/Adr分别铺到六孔板中，MCF-7/S转染miR-222的模拟物，MCF-7/Adr转染miR-222的抑制物，然后用0.5μM和200μM阿霉素分别孵育MCF-7/S和MCF-7/Adr细胞48小时，采用同样的步骤清洗、染色和收集细胞后，流式细胞仪分别检测细胞的凋亡率。
4.MTT试验
(1)上述实验组、对照组以及空白组的细胞分别种植到96孔板中，用0.5μM的阿霉素孵育细胞24小时，然后每个孔加入20μL的四甲基偶氮唑盐(MTT)孵育4小时，去掉培养基后每个孔中加入150μL的二甲基亚砜。最后测量每个孔在550nm的吸光度值，用SPSS软件计算各组细胞的IC50值。
(2)MCF-7/S与MCF-7/Adr分别铺到96孔板中，分别转染miR-222的模拟物和抑制物，与上述前处理流程类似，分别用0.5μM和200μM阿霉素处理24小时，采用同样的流程实施MTT试验，用SPSS软件分别计算细胞的IC50值。
以下是本发明进一步的说明：
发明人使用的乳腺癌细胞株MCF-7/S购自中科院上海细胞库(Cell Bank of ChineseAcademy of Sciences，细胞目录号TCH74)，MCF-7/Adr(阿霉素耐药株)由本实验室按照阿霉素梯度递增刺激的方法构建(具体流程见文献：Systematic expression analysis ofgenes related to multidrug-resistance in isogenic docetaxel-and adriamycin-resistant breastcancer cell lines.Mol Biol Rep 2013；40:6143–6150)，锁核酸探针由上海辉睿生物科技有限公司合成，酶联荧光97荧光试剂盒购自美国分子探针有限公司((Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR,USA)，抗地高辛购自美国杰克逊公司(Jackson ImmunoResearch)，miR-222的模拟物和抑制物及其对应的阴性对照物均由上海吉玛制药技术有限公司合成(商品货号分别为B02001和B03001)。
本发明的有益效果
本发明提供的通过原位杂交miR-222检测乳腺癌细胞耐药性的方法的优越性在于：本方法能够在不破坏细胞的情况下，用可视的方法得出单个细胞内miRNA-222的数目，并且通过miRNA-222的数目可以获知乳腺癌细胞的耐药性，具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1：LNA-ELF-FISH法原位杂交细胞内mir-222的荧光显微镜图。(a)未加LNA探针的细胞；(b)空白组细胞加入LNA探针的荧光图；(c)对照组细胞加入LNA探针的荧光图；(d)实验组细胞加入LNA探针的荧光图。
图2：ImageJ软件处理单个细胞中不同数量miRNA-222的荧光信号图。图中一个小亮点就一个miRNA-222，相应miRNA-222的总拷贝数已分别标注在每张图的右下角。
图3：(A)空白组、(B)对照组和(C)实验组细胞中miR-222的分布图，可以看出耐药细胞中miR-222拷贝数的峰值右移，表明其数量增加；(D)不同miR-222拷贝数与荧光强度的线性拟合图，利用该图可通过荧光强度估算miR-222的拷贝数。
图4：流式细胞检测和MTT试验验证miR-222拷贝数与乳腺癌细胞耐药性之间的对应关系，具体说明如下：
(A)MCF-7/S(对阿霉素敏感的MCF-7细胞)与(B)MCF-7/Adr(耐阿霉素的MCF-7细胞)经阿霉素处理后的流式细胞检测细胞凋亡率。其中1为未转染的MCF-7/S，2为导入了低表达miR-222微泡的MCF-7/S，3为导入了高表达miR-222微泡的MCF-7/S，4为转染了miR-222阴性对照物的MCF-7/S，5为转染了miR-222模拟物的MCF-7/S，6为未转染的MCF-7/Adr，7为转染了miR-222阴性对照物的MCF-7/Adr，8为转染了miR-222抑制物的MCF-7/Adr)。可以看出：(A)3和(A)5分别比(A)2和(A)4的凋亡率低，表明乳腺癌细胞的耐药性与细胞内miR-222的表达量有关；(B)8的凋亡率高于(B)6和(B)7，表明耐药性的改变是通过细胞内miR-222的上调或下调实现的。
(C)MCF-7/S与(D)MCF-7/Adr细胞并经阿霉素处理后的MTT试验检测阿霉素半数抑制浓度(IC50)。其中1-8的含义同上。可以看出：(C)3和(C)5分别比(C)2和(C)4的IC50高，表明乳腺癌细胞的耐药性与细胞内miR-222的表达量有关；(D)8的IC50低于(D)6和(D)7，表明耐药性的改变是通过细胞内miR-222的上调或下调实现的。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：LNA-ELF-FISH方法原位杂交乳腺癌细胞中的miR-222以评估耐药性的变化。
发明人的实验证明在乳腺癌细胞产生耐药的过程中，miR-222能被选择性富集到乳腺癌细胞分泌的微泡(exosomes)中，然后微泡将miR-222传递给周围的乳腺癌敏感细胞，从而使后者获得耐药性。因此，miR-222为乳腺癌耐药特异性miRNA。发明人基于LNA-ELF-FISH方法，通过原位杂交乳腺癌细胞中的miR-222，利用其拷贝数来确定细胞的耐药性，并结合流式细胞检测技术和MTT试验这两个普遍使用的经典方法验证了该方法的有效性。实施过程包括：
1.构建高表达miR-222的乳腺癌细胞株：
(1)由于乳腺癌细胞可以通过微泡传递miR-222产生耐药性，因此发明人首先提取了细胞分泌的微泡，具体步骤为：按照通常使用的方法，通过超速离心分别收集乳腺癌细胞敏感株MCF-7/S及其阿霉素耐药株MCF-7/Adr的微泡，其中前者低表达miR-222，后者高表达miR-222。具体步骤为：取培养过细胞的上清溶液，300g离心10分钟，去除沉淀，上清溶液在2000g离心15分钟，去除沉淀后，继续在12000g下离心30分钟，去掉沉淀，最后在100000g下离心2小时，得到的沉淀即为微泡。所有操作均在4℃下进行。
(2)将高表达miR-222的MCF-7/Adr微泡加入到MCF-7/S的培养基(含10％胎牛血清的高糖DMEM细胞培养液)中，过夜后所有微泡将能被细胞吸收，从而使得MCF-7/S细胞高表达miR-222，并以此作为实验组。与此同时，将低表达miR-222的MCF-7/S微泡加入到MCF-7/S的培养基中，过夜后的细胞(低表达miR-222)作为对照组，不加微泡的MCF-7/S作为空白组。
2.按照技术流程1中的步骤(2)～(15)，LNA-ELF-FISH方法原位杂交上述构建的实验组、对照组和空白组细胞中的miR-222并荧光成像，各组细胞在荧光显微镜下得到2D的荧光图见图1。可见，高表达miR-222的微泡能被MCF-7/S完全吸收，从而使得MCF-7/S细胞内的miR-222数量上升。
3.按照技术流程2中的步骤进行图像获取和数据统计，miR-222数量的荧光图片见图2，每个细胞内miR-222数量的统计结果见图3。统计结果见表1。可见，实验组细胞的miR-222数量明显高于对照组及空白组。
表1.不同细胞内miR-222的数量统计结果
4.为了确定构建的表达miR-222的MCF-7/S是否耐药，按照技术流程3中的步骤(1)用阿霉素处理上述三组(实验组、对照组和空白组)细胞48小时，然后使用流式细胞仪检测三组细胞的凋亡率(见图4A)。结果显示，(A)3比(A)1和(A)2的凋亡率低，这表明乳腺癌细胞产生阿霉素耐药与细胞内miR-222的上调有关。
5.为了确定高表达miR-222的MCF-7/S耐药是由miR-222上调造成的，按照技术流程3中的步骤(2)，转染miR-222模拟物到MCF-7/S以上调细胞内的miR-222表达水平，转染miR-222抑制物到MCF-7/Adr以下调细胞内的miR-222表达水平，并用阿霉素处理细胞48小时，然后使用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率(见图4A、图4B)。结果显示，(A)5的凋亡率低于(A)4，(B)8的凋亡率高于(B)6和(B)7，这表明阿霉素耐药性的改变是通过细胞内miR-222的上调或下调实现的。
6.为了提供进一步证据确定构建的高表达miR-222的MCF-7/S是否耐药，按照技术流程4中的步骤(1)用阿霉素处理上述三组(实验组、对照组和空白组)细胞48小时，然后使用MTT试验检测三组细胞的IC50值(见图4C)。结果显示，(C)3的IC50高于(C)1和(C)2，这提供了进一步证据证明乳腺癌细胞产生阿霉素耐药与细胞内miR-222的上调有关。
7.为了提供进一步证据确定高表达miR-222的MCF-7/S耐药是由miR-222上调造成的，按照技术流程4中的步骤(2)，对上调了miR-222的MCF-7/S和下调了miR-222的MCF-7/Adr细胞分别用青霉素处理48小时，然后使用MTT试验两组细胞的IC50值(见图4C、图4D)。结果显示，(C)5的IC50值高于(C)4，(D)8的IC50值低于(D)6和(D)7，IC50越高，细胞越耐药，因此上述结果表明阿霉素耐药性的改变是通过细胞内miR-222的上调或下调实现的。

Claims (12)

1.一种检测乳腺癌细胞耐药性的方法，其特征在于：该方法采用荧光原位杂交技术结合锁核酸探针(LNA-ELF-FISH方法)对乳腺癌细胞中的miR-222进行定量检测，根据miR-222检测结果判断乳腺癌细胞耐药性，即细胞内miR-222如果上调，则乳腺癌细胞耐药性增高，细胞内miR-222如果下调，则乳腺癌细胞耐药性降低。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法还包括采用流式细胞分析技术检测乳腺癌细胞凋亡的方法和/或采用MTT试验检测乳腺癌细胞半数抑制浓度的方法来验证miR-222的数量与乳腺癌细胞耐药性的关系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用荧光原位杂交技术结合锁核酸探针对乳腺癌细胞中的miR-222进行定量检测包括下列步骤：
先用地高辛(DIG)标记的LNA探针与乳腺癌细胞中的miR-222杂交，随后用碱性磷酸酶结合抗DIG抗体标记LNA探针，再采用酶标记荧光使得LNA杂合的位置发出荧光信号，每个荧光信号代表一个miR-222，计数单个荧光信号的数量即得到miR-222的数量，或者根据荧光强度与miR-222数量关系的标准曲线计算出miR-222的数量。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于LAN探针为针对miR-222的LAN探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2；酶标记荧光为ELF97。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于乳腺癌细胞耐药性是针对阿霉素或多烯紫杉醇耐药。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于根据荧光强度与miR-222数量关系的标准曲线计算出miR-222的数量是通过下列步骤实现的：
a.选择具有可数荧光信号的单一细胞荧光图像，测定荧光区域的强度，减去背景值，得到该图像的整体集成荧光，即确定该荧光图像中整体集成荧光与可数荧光信号数量的关系；
b.按步骤a分别确定若干个具有可数荧光信号的单一细胞荧光图像的整体集成荧光与可数荧光信号数量的关系，形成线性曲线，即标准曲线；
c.选择具有不可数荧光信号的单一细胞荧光图像，测定整体集成荧光，代入标准曲线，得出该图像中荧光信号的数量，即得出该图像中miR-222的数量。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
通过流式细胞分析技术检测乳腺癌细胞对化疗药物诱导的凋亡率，验证miR-222的数量与乳腺癌细胞耐药性的关系的方法包括以下步骤：将乳腺癌细胞MCF-7敏感株和耐药株分别转染miR-222的模拟物和抑制物，得到miR-222数量被上调及下调的乳腺癌细胞敏感株和耐药株，然后加入不同梯度的化疗药物孵育，冲洗，荧光素标记，采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，从而证实miR-222数量与细胞耐药性的关系，其中化疗药物采用阿霉素或多烯紫杉醇；
通过MTT试验来检测各组乳腺癌细胞的化疗药物的半数抑制浓度(IC50)，验证miR-222的数量与乳腺癌细胞耐药性的关系的方法包括以下步骤：将乳腺癌细胞MCF-7敏感株和耐药株分别转染miR-222的模拟物和抑制物，得到miR-222数量被上调及下调的乳腺癌细胞敏感株和耐药株，然后加入不同梯度的化疗药物共培养，MTT试验测定乳腺癌细胞的IC50值，从而得出证实miR-222数量与细胞耐药性的关系，其中化疗药物采用阿霉素或多烯紫杉醇。
8.权利要求1所述的方法在制备乳腺癌细胞耐药性检测试剂盒中的应用。
9.一种乳腺癌细胞耐药性检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含下列试剂：
LAN-ELF-FISH方法所需要检测试剂：MCF-7乳腺癌细胞，对阿霉素和/或多烯紫杉醇耐药的MCF-7细胞亚株，绿色荧光蛋白，miR-222模拟物和抑制物，LNA探针，脂质体2000，ELF97，PKH26红色荧光染料，原位杂交试剂盒。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中还包括：
流式细胞分析技术所需要检测试剂：Annexin-V-FITC apoptosis detection kit；
和/或
MTT试验所需要检测试剂：四甲基偶氮唑盐，二甲基亚砜，阿霉素和/或多烯紫杉醇。
11.一种改变乳腺癌细胞耐药性的方法，其特征在于该方法通过外源性导入的方式上调或下调乳腺癌细胞中miR-222的数量来改变乳腺癌细胞耐药性。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于通过转染miR-222的模拟物或抑制物来上调或下调乳腺癌细胞miR-222的数量。
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