CN113249480B - 用于胃癌辅助诊断的联合检测fish探针试剂盒、应用及检测方法 - Google Patents

用于胃癌辅助诊断的联合检测fish探针试剂盒、应用及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒、应用及检测方法。该联合检测FISH探针试剂盒包括用于检测样本中miR‑7和miR‑153表达下调的试剂。该联合检测FISH探针试剂盒相比现有胃癌早期诊断方式，进行mir‑7和mir‑153表达的共同检测，极大提高了诊断的准确性和诊断效率。

Description

用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒、应用及检测 方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒、应用及检测方法。
背景技术
目前，消化道肿瘤的发病率在肿瘤疾病中位居高位，尤其以胃癌居首。据统计，早期胃癌的总体复发率为1.5％-13.7％，而进展期胃癌总体复发率为50％-70％，经手术综合治疗，5年生存率仅为16.6％。因此，早期胃癌的诊治与预后有关，对胃癌的早期诊断可以有效提高胃癌的检出率及患者的生存率。然而，现有检测技术的有限性，导致胃癌发病率和死亡率依旧居高不下，给患者和家庭带来了巨大的精神和经济负担。
针对胃癌早期诊断的方法包括临床诊断、影像学诊断、内镜诊断、分子生物学诊断及其他诊断方法等，分子生物学诊断作为目前较为先进的肿瘤诊断方法，越来越多的学者围绕肿瘤标记物、幽门螺杆菌、单克隆抗体及基因诊断等进行相关研究。
MicroRNAs(miRNAs)是一类由19-25个核苷酸组成的非编码单链小RNA，是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，在某种疾病状态下，可发生特异性上调或下调，在癌症的高位预警、早期诊断和预后判断发挥重要作用。研究发现，miR-7和miR-153的表达变化与某些癌症的发生密切相关，如miR-7可通过负调控抗凋亡蛋白BCL-2的表达抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖并增强细胞凋亡；miR-153可直接抑制BCL-2的表达诱导胶质瘤细胞凋亡。也有研究发现，miR-153在结直肠癌中高表达，使疾病进展。
现已有针对miR-7和miR-153分别在胃癌组织中表达的相关研究，证明miR-7和miR-153表达与胃癌存在一定的相关性。但目前仅有分别针对胃癌组织中的miR-7、miR-153的表达的研究，提供了的各自的潜在靶点在胃癌细胞系中的效应不明，在胃癌发生、发展过程中的作用机制也尚不明确，使得在胃癌早期诊断中的应用尚缺乏更为全面的理论基础。miRanda数据库显示miR-7和miR-153共有13个潜在靶基因，表明miR-7与miR-153可能在疾病进展中发挥协同作用，可作为潜在的肿瘤分子标志物。目前尚未有miR-7与miR-153共同检测在胃癌预测和诊断方面的研究报道。
综上所述，目前针对胃癌诊断和预测方面尚存在方法单一、操作麻烦、诊断周期长、检出率和准确性有待进一步提高的问题，亟需提供一种用于胃癌或癌前病变早期预测和诊断的操作简单、检测快速、检出率和准确性更高的产品和方法。
发明内容
本发明提供了一种用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒、应用及检测方法，相比现有胃癌早期诊断方式，进行mir-7和mir-153表达的共同检测，极大提高了诊断的准确性和诊断效率，解决了现有技术中存在的问题。
本发明所采用的技术方案是：
一种用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒,包括用于检测样本中miR-7和miR-153表达下调的试剂。
进一步地,所述试剂包括锁核酸修饰的联合检测FISH探针，所述FISH探针序列包括：
5’-AACAACAAAATCACTAGTCTTCCA-3’
和5’-GATCACTTTTGTGACTATGCAA-3’。
进一步地，FISH探针序列中横线标记碱基进行了锁核酸修饰。
进一步地，所述样本为患者的胃癌组织和/或癌旁组织。
进一步地，所述胃癌组织为胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞：HGC-27、MKN-45、SNU-1、AGS、MKN-28或NCL-87；所述癌旁组织为距离癌灶5cm以外的组织。
进一步地,所述试剂还包括二甲苯,去离子甲酰胺，2×SSC，蛋白酶K，杂交缓冲液，DAPI及DEPC水。
本发明还提供了所述的联合检测FISH探针试剂盒在制备预测和/或诊断胃癌和/或胃癌癌前病变的装置中的应用。
进一步地，上述应用所述装置包括结果检测用计算机软硬件。
采用如前所述的联合检测FISH探针试剂盒进行胃癌检测的方法，包括如下操作步骤：
(1)制备胃癌病理组织及相应癌旁组织的石蜡切片；
(2)蛋白酶处理：蛋白酶K稀释溶液预热；每张切片滴加蛋白酶K稀释溶液，37℃孵育20min；每张切片滴加2×SSC溶液，在室温下洗切片3次；梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，空气中干燥；
(3)变性：预热变性液；每张切片滴加预热变性液，孵育；梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，空气中干燥；
(4)杂交：将联合检测试剂盒的探针采用DEPC水稀释为100uM的储存液，并进行分装避光-20℃储存；配制探针混合液，73℃变性5min后，每张切片滴加100ul变性后的探针混合液，加盖玻片；盖上湿盒盖，37℃孵育12-16h；
(5)杂交后水洗：预热杂交后水洗溶液；吸弃探针混合液，每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液洗切片，每张切片滴加2×SSC(预热至37℃)洗2次；PBS洗切片1次；
(6)细胞核染色：每张切片加稀释后的DAPI工作液，在室温下避光孵育；吸弃DAPI工作液，PBS洗切片2次；滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。
本发明的有益效果：
本发明联合检测FISH试剂盒根据miR-7和miR-153序列进行了针对性设计，并对获得的反向互补探针进行锁核酸修饰，相较传统荧光探针，本发明联合检测试剂盒的探针可更快与互补核苷酸链配对，并提高了所得双链体的稳定性，在胃癌早期发现和治疗方面提供了重要的参考依据。
本发明联合检测FISH试剂盒通过联合检测miR-7和miR-153表达下调，相较现有技术中对胃癌组织中miR-7和miR-153的分别研究，提升了胃癌诊断的检出率和准确性，应用价值显著。
附图说明
图1(A)为胃癌细胞系和胃粘膜上皮细胞中miR-7的表达差异；图1(B)为胃癌细胞系和胃粘膜上皮细胞中miR-153的表达差异；
图2(A)为胃癌组织及其癌旁组织中miR-7的表达差异；图2(B)为胃癌组织及其癌旁组织中miR-153的表达差异；
图3为胃癌病理组织及其癌旁组织中本发明FISH探针的检测结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。
本发明实施例提供的一种用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒，包括：探针5’-AACAACAAAATCACTAGTCTTCCA-3’
和5’-GATCACTTTTGTGACTATGCAA-3’，其中横线表示该碱基进行了LNA修饰。
试剂盒还包括以下试剂：二甲苯,去离子甲酰胺，2×SSC、蛋白酶K、杂交缓冲液、DAPI及DEPC水。
一、实验对象：
细胞水平检测选择胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞系KATO III、HGC-27、MKN-45、SNU-1、AGS、MKN-28、Ncl-87为研究对象；组织标本共包括20例胃癌患者(GC)及其对应癌旁组织。
所有胃癌患者均来自威海市立医院普通外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，各例标本均由病理科检查确认。取材后，将组织标本冻存于-80℃冰箱，用于提取总miRNA。所有样本均在取得受试者同意的情况下进行。
二、胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞系中miR-7及miR-153的RT-PCR实验检测
采用实时荧光定量PCR技术发现：与胃粘膜上皮细胞GES-1相比，miR-7和miR-153在胃癌细胞系中普遍下调。
具体操作为：
(1)收集胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞系细胞；
(2)按RNAisoforSmal lRNA(Takara)操作说明提取各细胞总miRNA；
(3)通过Hairpin-itTMmiRNA定量RT-PCR试剂盒(苏州吉玛)进行逆转录反应；逆转录体系包括：5×RT buffer 4μL、dNTP(2.5uM)4μL、miR-7/U6PrimerMix 1.2μL、DTT 1μL、RNase Inhibitor 1μL、HiFiScript(200U/ul，碧云天)1μL、RNA模板1-3ug，补充RNase-FreeWater至总体积20μL；逆转录反应条件为：25℃孵育30分钟，42℃反应30分钟，85℃孵育5分钟；
(4)使用上步所得逆转录产物，进行实时荧光定量PCR；反应体系包括：2×FastSYBR Mixture 10μL、U6/miR-7Primer Set(10uM)0.4μL、逆转录产物2μL、50×Low ROX0.4μL、ddH2O 7.2μL；反应步骤为：Holding Stage95℃反应10分钟，Cycling Stage 95℃15s、60℃1min共40个循环，Melt Curve Stage(Continuous)95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s；
(5)根据所得循环数Ct值，采用2-^^Ct法计算miR-7和miR-153在胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞系中的表达差异；具体实验结果见附图1。
三、胃癌组织及其癌旁组织中miR-7和miR-153的RT-PCR实验检测
采用实时荧光定量PCR技术发现：与对应癌旁组织相比，miR-7在18例胃癌组织中下调；miR-153在17例胃癌组织中下调；其中miR-7与miR-153在16例胃癌组织中均下调。
具体步骤为：
(1)收集胃癌组织及其相应癌旁组织，各称取30μg用于miRNA的提取；
(2)按照RNAisoforSmallRNA(Takara)操作说明提取组织总miRNA；
(3)通过Hairpin-itTMmiRNA定量RT-PCR试剂盒进行逆转录反应；
(4)使用上步所得逆转录产物，进行实时荧光定量PCR(U6为内参)；
(5)根据所得循环数Ct值，采用2-^^Ct法计算miR-7和miR-153在胃癌组织及其癌旁组织中的表达差异；具体实验结果见附图2。图2为20例胃癌组织及其相应癌旁组织中miR-7和miR-153的表达水平，在胃癌组织中普遍下调，具有统计学意义(P<0.05)；miR-7与miR-153共同下调与胃癌病理结果符合率为80％。与图1细胞水平的结果相吻合，表明miR-7和miR-153可成为胃癌早期诊断与预后判断的新型标志物，为治疗胃癌提供了新的作用靶点。
四、用于诊断胃癌的miR-7和miR-153联合FISH探针试剂盒应用
采用前述联合检测FISH探针试剂盒，对组织样品联合检测miR-7和miR-153的变化趋势。
将胃癌病理组织及其相应癌旁组织制成石蜡切片，通过本发明LNA-miR-7FISH探针和LNA-miR-153 FISH探针联合检测试剂盒进行检测。
实验步骤如下：
1)脱蜡：石蜡切片在60℃烤箱中预热30min；将切片浸入二甲苯I、II中各放置10min；在梯度酒精(100％、95％、90％、80％、70％)中室温孵育各10min；PBS洗切片两次，每次2min；
2)蛋白酶处理：蛋白酶K稀释溶液预热至37℃；每张切片滴加蛋白酶K稀释溶液100ul，37℃孵育20min；每张切片滴加2×SSC溶液100ul在室温下洗切片3次，每次1min；梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，每次2min，空气中干燥；
3)变性：78℃预热变性液；每张切片滴加预热变性液100ul，78℃孵育8min；梯度酒精70％、80％、90％、100％脱水，每次2min，空气中干燥；
4)杂交：首先，将探针采用DEPC水稀释为100uM的储存液，并进行分装避光-20℃储存；其次，配制探针混合液，73℃变性5min后，每张切片滴加100ul变性后的探针混合液，加盖玻片；盖上湿盒盖，37℃孵育12-16h；
5)杂交后水洗：43℃预热杂交后水洗溶液；吸弃探针混合液，每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液100ul洗切片15min，每张切片滴加2×SSC(预热至37℃)100ul洗2次，每次10min；PBS洗切片1次，10min；
6)细胞核染色：每张切片加100ul稀释后的DAPI工作液，在室温下避光孵育20min；吸弃DAPI工作液，PBS洗切片2次，每次2min；滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。
具体实验结果见附图3。图3是以胃癌病理组织及其癌旁组织为研究对象，制作石蜡切片并采用本发明的联合检测试剂盒检测miR-7与miR-153在胃癌组织中的差异表达水平。由图3可以看出，miR-7和miR-153在胃癌组织中及癌旁组织中表达下调。另外，对20例已确诊胃癌病理组织采用本试剂盒检测发现，miR-7与miR-153荧光表达均下降的为18例，阳性符合率高达90％，用于胃癌早期诊断，阳性检出率和准确性显著高于前述荧光定量PCR检测结果。
五、未经LNA修饰的FISH探针用于上述胃癌比你组织及癌旁组织进行检测的检测灵敏度对比：
FISH探针序列：5’-AACAACAAAATCACTAGTCTTCCA-3’
和5’-GATCACTTTTGTGACTATGCAA-3’
其他试剂同本发明联合检测FISH探针试剂盒的试剂。
检测方法同四的操作步骤，具体试验结果见图3。通过对20例已确诊胃癌病理组织采用本试剂盒检测发现，miR-7与miR-153荧光表达均下降的为8例，阳性符合率40％，显著低于本发明联合检测FISH探针试剂盒的检测结果。
由此可见，本发明联合检测FISH试剂盒采用mir-7和mir-153联合检测，以互补的方式提高了胃癌早期诊断的检出率，联合检测FISH试剂盒的灵敏度显著，可用于胃癌诊断的早期干预。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
Figure BDA0003083412060000091
序列表
<110> 威海市立医院
<120> 用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒、应用及检测方法
<141> 2021-05-25
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aacaacaaaa tcactagtct tcca 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gatcactttt gtgactatgc aa 22

Claims (6)

1.一种用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒,其特征在于,包括用于检测样本中miR-7和miR-153表达下调的试剂；
所述试剂包括锁核酸修饰的联合检测FISH探针，所述FISH探针序列包括：
5’-AACAACAAAATCACTAGTCTTCCA-3’
和5’-GATCACTTTTGTGACTATGCAA-3’。
2.根据权利要求1所述的用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒,其特征在于,所述样本为患者的胃癌组织和/或癌旁组织。
3.根据权利要求2所述的用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒，其特征在于，所述胃癌组织为胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞：HGC-27、MKN-45、SNU-1、AGS、MKN-28或NCL-87；所述癌旁组织为距离癌灶5cm以外的组织。
4.根据权利要求1所述的用于胃癌辅助诊断的联合检测FISH探针试剂盒,其特征在于,所述试剂还包括二甲苯,去离子甲酰胺，2×SSC，蛋白酶K，杂交缓冲液，DAPI及DEPC水。
5.根据权利要求1-4任一所述的联合检测FISH探针试剂盒在制备预测和/或诊断胃癌和/或胃癌癌前病变的装置中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述装置包括结果检测用计算机软硬件。
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