CN114438208A - 通过外泌体miRNA生物标志物进行肺癌诊断的检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了在受试者中进行肺癌状态诊断的检测试剂盒,其包括检测来自所述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的检测试剂,所述miRNA生物标志物选自miR‑126‑3p、miR‑140‑5p、miR‑17‑5p、miR‑181a‑5p、miR‑19b‑3p、miR‑22‑3p、miR‑221‑5p、miR‑30d‑3p、miR‑486‑5p和let‑7g‑5p及其任意组合。本文还提供了用于在受试者中进行肺癌状态诊断的方法。本文提供的检测试剂盒和方法可以有效用于肺癌状态诊断,具有较好的临床应用价值,为肺癌的筛查、诊断提供了新的思路和方法。
Description
技术领域
本文涉及用于人肺癌诊断的外泌体miRNA生物标志物和检测试剂盒。本文还涉及进行肺癌状态鉴定的方法。
背景技术
肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤,也是发病率、死亡率最高的恶性肿瘤,严重威胁了人类的生命健康。1987年,肺癌超过乳腺癌,成为与癌症相关女性死亡的主要原因。到2020年,肺癌占所有女性癌症死亡人数的22%和所有男性癌症死亡人数的23%,在所有常见癌症相关死亡中居首位。
造成肺癌死亡率高的主要原因是大多数患者被发现时已经是中晚期。如果能在早期发现并采用一定的治疗手段可大大降低肺癌的死亡率。对于所有分期的肺癌患者,其5年生存率仅为15-19%,但是,早期诊断出肺癌时,其5年生存率可提高至50-60%,特别是I期患者,其生存率可提高到81%到85%。因此,提高无症状患者中肺癌的早期诊断效率能有效的降低肺癌的死亡率,大大改善肺癌患者的预后。
目前,肺癌的诊断方法主要包括痰脱落细胞学、影像学及支气管镜活检等技术。研究证明,使用胸部X光片和痰脱落细胞学检查作为筛查技术并不会降低肺癌的死亡率。在高危吸烟者中,低剂量螺旋计算机断层扫描(CT)筛查已被证明比胸部X光线更灵敏,可用于早期肺癌诊断,并可以降低肺癌死亡率。但是,由于CT筛查的特异性较差,导致下游诊断成本高,其诊断准确性受到限制。因此,迫切需要其他非侵入性方法来进一步完善肺癌筛查,降低死亡率。
miRNA是一种内源性的,长度约为22~25个核苷酸的非编码小RNA,能够通过下调或抑制靶mRNAs来调节转录水平上癌基因或抑癌基因的表达和功能。大量研究表明,miRNA在不同肿瘤中特异性表达,并且可以区分正常和肿瘤组织。此外,也有研究证实,循环miRNA可以作为各种疾病的诊断标志物,包括癌症。但循环miRNA作为诊断标志物很容易受受损细胞释放的miRNA的影响,具有一定的局限性。
外泌体(exosome)是由各种细胞分泌的直径为30-120nm的微囊泡,广泛存在于人的体液中,包括唾液、血液、尿液和母乳等。其内部含有DNA、RNA和蛋白质等多种活性分子,能够调节细胞中的蛋白质和脂质的胞内稳态,在细胞信息交流、免疫应答、物质交换等多种生理反应中起着重要的作用。大量研究发现,外泌体能够保护循环系统中的miRNA避免被内源性RNA酶的降解,从而提高miRNA在循环系统中的稳定性。此外,外泌体也被认为是肿瘤细胞传递miRNA到循环系统中的方式,能间接反映肿瘤细胞中miRNA的变化。近年来的研究证实,外泌体中的miRNA与癌症的发生和转移有着密切的关系。外泌体miRNA通常具有肿瘤特异性,有潜力成为筛查、诊断和监测癌症的有效生物标志物。
目前的miRNA的定量检测,常用的方法包括定量real-time PCR、深度测序和微芯片。荧光定量PCR检测方法主要有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需调整引物浓度,提高引物扩增效率,尽量减少引物二聚体与非特异性扩增;探针法需设计荧光探针,探针设计位置可以有3种:完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉位置、完全在RT引物上。至于探针要设计在哪个位置,可根据自己的实验情况来定。芯片是一种较快的检测miRNA表达的方法。芯片分析也是基于杂交的原理,采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交,通过荧光扫描获得表达图谱,借助相应软件进行miRNA的表达分析。通过测定特定过程中miRNA的表达水平,来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。尽管如此,目前仍缺乏对癌症相关的miRNA进行有效检测并对检测结果进行处理的手段。
发明内容
在一方面,本文提供了用于在受试者中进行肺癌状态诊断的检测试剂盒,其包括检测来自所述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的检测试剂,所述miRNA生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p及其任意组合。
在一些实施方案中,所述生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p中的2种或2种以上。
在一些实施方案中,所述生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p中的5种或5种以上。
在一些实施方案中,所述miRNA生物标志物包括miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p。
在一些实施方案中,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态包括肺癌易感性和/或肺癌的存在、进展、亚型和/或分期。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为肺癌I期或II期,所述miRNA生物标志物为miR-140-5p、miR-19b-3p和/或miR-22-3p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为腺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为鳞癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-221-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为大细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为小细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-22-3p、miR-221-5p和/或miR-486-5p。
在一些实施方案中,所述检测miRNA生物标志物水平的检测试剂包括逆转录引物、PCR扩增引物对和/或Taqman探针。
在一些实施方案中,用于检测miR-126-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ IDNO:12所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:23和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:35所示序列的Taqman探针;用于检测miR-140-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:13所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:24和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:36所示序列的Taqman探针;用于检测miR-17-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:14所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:25和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:37所示序列的Taqman探针;用于检测miR-181a-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:15所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:26和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:38所示序列的Taqman探针;用于检测miR-19b-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:16所示序列的逆转录引物;包括SEQ IDNO:27和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:39所示序列的Taqman探针;用于检测miR-22-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:17所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:28和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:40所示序列的Taqman探针;用于检测miR-221-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:18所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:29和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:41所示序列的Taqman探针;用于检测miR-30d-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:19所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:30和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ IDNO:42所示序列的Taqman探针;用于检测miR-486-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ IDNO:20所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:31和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:43所示序列的Taqman探针;以及用于检测let-7g-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:21所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:32和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:44所示序列的Taqman探针。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括用于检测作为内参基因的miR-16-5p的水平的检测试剂;所述检测试剂包括:包括SEQ ID NO:22所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:33和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:45所示序列的Taqman探针。
在一些实施方案中,所述TaqMan探针5’端标记有报告荧光基团,如HEX、FAM等,优选为FAM,其3’端标记有淬灭荧光基团,如ECLIPSE、TAMRA、MGB等,优选为MGB。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括用于从所述生物样品中分离外泌体的试剂;任选地,还包括用于从所述外泌体提取miRNA的试剂。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括记载有根据所述miRNA生物标志物水平基于逻辑回归来判断所述受试者中肺癌状态的说明书。
在一些实施方案中,所述生物样品选自血液、血清、血浆、痰液、淋巴、脑脊液、胸水、支气管肺泡灌洗液和尿。优选地,所述生物样品为血浆。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括以下用于逆转录反应体系的试剂(可检测50次):250μL逆转录缓冲液(5×),120μL脱氧核苷酸(10mM),25μL RNA酶抑制剂(40U/μL),60μL逆转录酶(200U/μL)。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括以下用于实时荧光定量PCR反应体系的试剂(可检测50次):600μL PCR预混液(2×),30μL F端引物液(30μM),30μL R端引物液(30μM),30μLTaqman探针引物(10μM)和2mL无核酸酶水。
另一方面,本文提供了在受试者中鉴定肺癌状态的方法,其包括:1)从来自所述受试者的生物样品中分离外泌体;2)检测所述外泌体中miRNA生物标志物水平,所述miRNA生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p及其任意组合;以及3)将步骤2)中检测的miRNA生物标志物水平与群体中相应miRNA的水平进行比较,以确定所述受试者中的肺癌状态。
在一些实施方案中,所述miRNA生物标志物包括miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p。
在一些实施方案中,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p。
在一些实施方案中,所述生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p中的2种或2种以上。
在一些实施方案中,所述生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p中的5种或5种以上。
在一些实施方案中,所述肺癌状态包括肺癌易感性和/或肺癌的存在、进展、亚型和/或分期。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为肺癌I期或II期,所述miRNA生物标志物为miR-140-5p、miR-19b-3p和/或miR-22-3p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为腺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为鳞癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-221-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为大细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p。
在一些实施方案中,所述肺癌状态为小细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-22-3p、miR-221-5p和/或miR-486-5p。
在一些实施方案中,步骤2)中对所述miRNA生物标志物水平的检测包括使用miRNA生物标志物特异的检测试剂,所述检测试剂包括逆转录引物(例如RT茎环引物)、PCR扩增引物对和/或Taqman探针。
在一些实施方案中,用于检测miR-126-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ IDNO:12所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:23和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:35所示序列的Taqman探针;用于检测miR-140-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:13所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:24和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:36所示序列的Taqman探针;用于检测miR-17-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:14所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:25和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:37所示序列的Taqman探针;用于检测miR-181a-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:15所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:26和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:38所示序列的Taqman探针;用于检测miR-19b-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:16所示序列的逆转录引物;包括SEQ IDNO:27和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:39所示序列的Taqman探针;用于检测miR-22-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:17所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:28和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:40所示序列的Taqman探针;用于检测miR-221-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:18所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:29和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:41所示序列的Taqman探针;用于检测miR-30d-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:19所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:30和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ IDNO:42所示序列的Taqman探针;用于检测miR-486-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ IDNO:20所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:31和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:43所示序列的Taqman探针;以及用于检测let-7g-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:21所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:32和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:44所示序列的Taqman探针。
在一些实施方案中,步骤2)还包括检测作为内参基因的miR-16-5p的水平;用于检测miR-16-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:22所示序列的逆转录引物;包括SEQID NO:33和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:45所示序列的Taqman探针。
在一些实施方案中,所述TaqMan探针5’端标记有报告荧光基团,如HEX、FAM等,优选为FAM,其3’端标记有淬灭荧光基团,如ECLIPSE、TAMRA、MGB等,优选为MGB。
在一些实施方案中,步骤3)包括根据所述miRNA生物标志物水平基于逻辑回归来判断所述受试者中肺癌状态。
在一些实施方案中,所述生物样品选自血液、血清、血浆、痰液、淋巴、脑脊液、胸水、支气管肺泡灌洗液和尿。优选地,所述生物样品为血浆
在一些实施方案中,所述方法还包括在所述受试者接受医疗处理后再次进行步骤1)和2),并且将两次获得的miRNA表达水平检测结果进行比较,以确定所述受试者中肺癌状态的变化。
本文提供了利用外泌体miRNA生物标志物来进行肺癌诊断的方法,其中可以采用10个与肺癌发生密切相关的外泌体miRNA,作为肺癌诊断标志物,具有较高的灵敏度和特异性。本文还开发了用于检测这10个外泌体miRNA水平的诊断试剂盒,所述试剂盒包括特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂。本文提供的方法和检测试剂盒对于肺癌早期诊断具有较好的临床应用价值,为提高肺癌早期诊断水平提供新的思路和方法。
附图说明
图1显示10种外泌体miRNA生物标志物的受试者工作特征(ROC)曲线。
图2显示10种外泌体miRNA生物标志物在不同肺癌分期中的水平分布,其中图2A显示了miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p的miRNA水平分布,图2B显示了miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p的miRNA水平分布。
图3显示10种外泌体miRNA生物标志物在不同肺癌亚型中的水平分布,其中图3A显示了miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p的miRNA水平分布,图3B显示了miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p的miRNA水平分布。
图4显示采用10种miRNA标志物构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线;
图5显示采用5种最有特征性miRNA标志物构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线。
具体实施方式
除非另有说明,本申请中使用的技术术语具有本发明所属领域技术人员所通常理解的含义。
本文在一方面涉及受试者中肺癌状态的诊断方法,其包括以下步骤:1)从所述受试者收集生物样品并从中分离外泌体;2)检测所述生物样品中外泌体miRNA生物标志物水平,其中所述生物标志物选自如下的一种或多种:miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p。以及3)将步骤2)检测的miRNA表达水平与群体中相应miRNA的水平进行比较,以确定所述受试者中的肺癌状态。上述miRNA生物标志物以及内参(miR-16-5p)的序列如下。
这里所用的术语“受试者”指患有或者怀疑患有某种疾病的个体(优选人),或者,在预测易感性时“受试者”也可包括健康个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
这里所用的术语“群体”一般指健康人群。在提及特定疾病(如肺癌)时,“群体”可以包括不患有该特定疾病但可能患有其它疾病的人体。另外,还可以根据年龄、性别、健康状况、是否吸烟等特征仅选择部分个体来作为“群体”。“群体中miRNA水平”可以通过对足够多的个体进行检测而得到,或者可以在已有的临床文献中找到。
这里所用的术语“肺癌状态”包括受试者对肺癌的易感性以及肺癌的存在、进展、亚型和/或分期。在一些实施方案中,可以根据受试者中所述miRNA生物标志物水平来预测该受试者对肺癌的易感性。在另一些实施方案中,可以根据受试者中所述生物标志物miRNA水平来鉴定该受试者中是否存在肺癌;并且如果存在肺癌的话,鉴定其亚型和/或分期。肺癌亚型可包括腺癌、鳞癌、大细胞肺癌和小细胞肺癌。肺癌分期可以包括I期、II期、III期和IV期。在一些实施方案中,所述肺癌是I期肺癌。在一些实施方案中,所述肺癌是II期肺癌。在一些实施方案中,所述肺癌是III期肺癌。在另一些实施方案中,所述肺癌是IV期肺癌。
在本文提供的方法中,还包括在受试者经治疗后,再次测量受试者中所述生物标志物水平,并且使所述测量结果与肺癌状态相关联,以鉴定所述治疗是否导致受试者中肺癌状态的改变。
本文提供的方法中对所述生物标志物miRNA水平的检测包括检测所述生物标志物中存在miRNA多少、以及对该miRNA进行定量和定性检测。
所述生物样品选自受试者的体液,包括血液、血清、血浆、痰液、淋巴、脑脊液、胸水、支气管肺泡灌洗液和尿等。
在本文提供的方法中,还可以考虑受试者的年龄和吸烟指数SI,用来预测所述受试者中的肺癌状态。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括提供肺癌预测的书面报告或电子报告的步骤,并且任选地,所述报告包括关于受试者中肺癌存在与否或其可能性或者关于受试者肺癌的等级化风险的预测。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括为医师建立生物标志物相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中,通过互联网传输包含生物标志物水平的报告的数据流。
在一些实施方案中,采用统计方法构建基于生物标志物水平的诊断模型,所述统计方法选自如下方法:多元线性回归,查找表、决策树、支持向量机、Probit回归、逻辑回归、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯、主成分分析和非贝叶斯方法等。
在另一些实施方案中,提供了基于生物标志物水平的预测或诊断模型。所述模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式,用于评价生物标志物的相对水平。
利用本文提供的方法可得到新的且重要的额外信息,其协助医师对患者患肺癌的风险进行分级并计划接下来将采取的诊断步骤。本文提供的方法类似地还可用于评估无症状高风险患者中的肺癌风险,以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本文提供的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指标的全面评估的一部分。
本文提供的方法可用于评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其它类型癌症治疗手段的治疗效力。例如,可以在受试者治疗前后或者在治疗期间从所述受试者取得生物样品,并且按前文所述进行生物标志物水平的检测,通过检测结果诊断所述受试者中肺癌状态的变化,从而确定所述治疗效力。
本文提供的方法还可用于鉴定受试者是否潜在地正在发生癌症。在随时间取自受试者的生物样品中检测生物标志物miRNA相对水平,从而将指向癌症特征的生物标志物水平改变解释为朝癌症方向进展。
所述生物标志物的组合提供了用于在肺癌进展不同分期中预测肺癌存在或检测肺癌的敏感、特异且准确的手段。对所述生物样品中生物标志物水平的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此,所公开的方法可用于预测或检测样品中肺结节的良恶性、肺癌的存在、肺癌的阶段、肺癌的亚型、肺癌的转移可能性、与肺癌有关的赘生物的组织学类型、癌症的无痛性或攻击性,以及与预防、诊断、表征和治疗患者肺癌有关的其它肺癌特征。
本文提供的方法还可用于评估候选药物抑制肺癌的效力,评估肺癌疗法的效力,监测肺癌的进展,选择抑制肺癌的药剂或疗法,监测肺癌患者的治疗,监测患者中肺癌的抑制状况,以及通过检测测试化合物暴露后测试动物内miRNA生物标志物的表达水平,来评估测试化合物的致癌潜力。
本文还提供了用于肺癌外泌体miRNA检测的试剂盒。其可以包括:1)用于逆转录反应的引物和试剂;2)用于实时荧光定量PCR反应的引物、TaqMan探针和试剂。优选地,所用TaqMan探针5’端报告荧光基团可以为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox、或Cy5;3’端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL或MGB。
在某些实施方案中,所述试剂盒还可包括使用试剂盒内试剂检测受试者中生物标志物水平的说明书。在一些实施方案中,所述试剂盒包含使用该试剂盒以确定受试者中肺癌状态的说明书。
所述miRNA生物标志物检测方法可包括但不限于以下方法:基于阵列的方法、实时荧光PCR、数字PCR、测序、下一代测序、基因芯片技术、荧光原位杂交技术和质谱分析技术。
以下通过实施例来进一步描述本发明。
实施例1:血浆外泌体分离及miRNA提取
含有EDTA抗凝剂采血管收集的外周血在采血4小时内,4℃条件下以3000×g离心10分钟,然后小心吸取浅黄色上清,再在4℃条件下以3000×g离心10分钟,将上层血浆收集至1.5mL无酶的EP管中,储存于-80℃备用。
使用SBI公司的外泌体提取试剂(EXOQ5TM-1)分离血浆中外泌体,具体操作方法:取500μL血浆,加入120μL ExoQuick溶液,并用震荡器震荡混匀,4℃放置30分钟,室温条件下,以1500×g离心30分钟,外泌体沉淀复合体沉淀至EP管管底,用枪头小心吸取上清弃掉。用500μL无菌PBS小心清洗管壁及外泌体沉淀,吸取废液弃掉。将EP管于1500×g离心5分钟,吸弃剩余的少量残留液体。
使用Qiagen公司的miRNeasy Micro Kit提取外泌体中的miRNA。具体操作按照试剂盒说明书进行。通过Qubit 2.0荧光计检测miRNA的浓度。
实施例2:将miRNA逆转录成cDNA
cDNA逆转录反应体系
用于配制反转录反应体系的试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司,包括M-MuLV逆转录酶(Cat:B600005),RNase抑制剂(Cat:B600008),dNTP Mix 10mM(Cat:B500056),逆转录反应体系如下:
表1逆转录反应体系
组分 | 体积 |
5×Reaction Buffer | 2ul |
RNase inhibitor | 0.2ul |
dNTP Mix,10mM | 1ul |
M-MuLV逆转录酶 | 0.5ul |
逆转录引物(1uM) | 0.3ul |
RNA模板 | 6ul |
逆转录程序:16℃30min,42℃30min,85℃5min。所得cDNA置于4℃保存。
实施例3:基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平
以cDNA为模板,在:miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p、let-7g-5p和miR-16(内参)的特异性引物和TaqMan探针的使用下,用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测待测样品中目的miRNA的表达量2-ΔCt(Cttarget miRNAs-CtmiRNA-16):Ct值代表一种目的miRNA达到实验设计阈值(15-40)所需要的PCR循环的次数,当Ct值>40时,认为样本中不含有该目的miRNA,在目标miRNA与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的miRNA相对于内参miRNA的定量(ΔCt=Ct目的miRNA-Ct内参miRNA)。
所设计的相应引物、探针序列如下:
miR-126-3p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCATTAT(SEQID NO:12)
F端引物(正向引物):GCGCGTCGTACCGTGAGTAATA(SEQ ID NO:23)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACCGCATT(SEQ ID NO:35)
miR-140-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCATA(SEQID NO:13)
F端引物(正向引物):CGACCAGTGGTTTTACCCTAT(SEQ ID NO:24)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACCTACCA(SEQ ID NO:36)
miR-17-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCTGC(SEQID NO:14)
F端引物(正向引物):CCGCCAAAGTGCTTACAGTG(SEQ ID NO:25)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACCTACCTGC(SEQ ID NO:37)
miR-181a-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTCACCG(SEQID NO:15)
F端引物(正向引物):CATAACATTCAACGCTGTCG(SEQ ID NO:26)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CACTGGATACGACACTCAC(SEQ ID NO:38)
miR-19b-3p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTTTTG(SEQID NO:16)
F端引物(正向引物):CCGCGTGTGCAAATCCATGCA(SEQ ID NO:27)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CACTGGATACGACTCAGTTTTG(SEQ ID NO:39)
miR-22-3p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTTC(SEQ IDNO:17)
F端引物(正向引物):CGGGAAGCTGCCAGTTGAAG(SEQ ID NO:28)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACACAGTTC(SEQ ID NO:40)
miR-221-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAATCTAC(SEQID NO:18)
F端引物(正向引物):AGCCGACCTGGCATACAAT(SEQ ID NO:29)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACAAATCTACA(SEQ ID NO:41)
miR-30d-3p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCAGCAAA(SEQID NO:19)
F端引物(正向引物):CCGCGCTTTCAGTCAGATG(SEQ ID NO:30)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACGCAGCAAA(SEQ ID NO:42)
miR-486-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCGGGGC(SEQID NO:20)
F端引物(正向引物):CCGCGTCCTGTACTGAGCTGC(SEQ ID NO:31)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACCTCGGG(SEQ ID NO:43)
let-7g-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTGT(SEQ IDNO:21)
F端引物(正向引物):GCCCGCTGAGGTAGTAGTTTGTAC(SEQ ID NO:32)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACAACTGT(SEQ ID NO:44)
miRNA检测内参基因miR-16-5p引物组
逆转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAATA(SEQID NO:22)
F端引物(正向引物):CGCGCGTAGCAGCACGTAAA(SEQ ID NO:33)
R端引物(反向通用引物):GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:34)
TaqMan探针:CTGGATACGACCGCCAATA(SEQ ID NO:45)
检测miRNA表达水平,每个样本进行3次重复PCR反应,每个反应体系总体积20μL,其中包括10μL PCR反应液和5μL引物混合液和5μL的PCR模板。实时荧光定量PCR反应条件如下(表2):
表2检测miRNA表达水平反应程序
实施例4:试剂盒检测肺癌状态的准确性
本研究共纳入1056例临床样本作为研究对象,其中确诊为肺癌样本432例,非肺癌样本624例。于术前采集患者样本,每个入组的患者于术后根据影像学及病理检查结果给出准确的诊断。肺癌样本涵盖了肺癌的不同分期和常见亚型,非肺癌样本包含良性结节,炎症,囊肿等。样本分期基于国际TNM分期标准,样本亚型依据组织活检及免疫组化方法确定。表3展示了样本的临床信息。
表3.采集样品对象的临床信息特征
采用上述实施例所述的实时荧光PCR法对432例肺癌样本和624例非肺癌样本中10种miRNA的表达水平进行检测。利用实施例1的方法从生物样品(血浆)中分离外泌体并提取外泌体miRNA,再参照实施例2和实施例3方法进行cDNA的逆转录和PCR检测,最后得到待测样本中各个miRNA的Ct值,再通过2-ΔCt(Cttarget miRNAs-CtmiRNA-16))来反应miRNA的表达水平。
对于每种生物标志物的miRNA水平检测数据,使用MedCalc11.4.2.0软件,选择95%置信区间,产生ROC曲线及其曲线下面积(AUC)值。相对于良性样本,肺癌样品中10种生物标志物miRNA水平的AUC均大于0.8(P值>0.05),在0.81-0.90之间(见图1和表4)。
表4 10种标志物受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)
为了确定某些生物标志物是否对肺癌的不同分期(特别是早期)具有更大的区分度,比较10种miRNA标志物在良性样本以及不同分期的肺癌样本中的检测水平(图2)。对于早期(I或II期)肺癌样品,miR-140-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p具有很高的区分度(P值<0.001)。对于miR-221-5p和miR-486-5p,在早期肺癌与良性病症之间没有显著性差异(P值>0.05)。
此外,比较了上述10种miRNA水平在良性病症与各种亚型肺癌的样品之间是否具有统计显著性差异(图3)。对于腺癌,miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和miR-486-5p均具有很高的区分度(P值<0.001),而miR-221-5p、miR-30d-3p对腺癌的区分度较低。对于鳞癌,miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和miR-221-5p具有很高的区分度(P值<0.001),而miR-17-5p、miR-486-5p对鳞癌的区分度较低。对于大细胞肺癌,miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和miR-486-5p具有很高的区分度(P值<0.001),而miR-221-5p对大细胞肺癌的区分度较低。对于小细胞肺癌,miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-22-3p、miR-221-5p和miR-486-5p具有很高的区分度(P值<0.001),而miR-30d-3p、let-7g对小细胞肺癌的区分度较低。
就简单操作和降低成本而言,检测单个miRNA水平优于检测多种miRNA标志物水平。然而,单个miRNA水平可能无法提供复杂疾病的固有多样性信息,因此经常需要构建多种标志物的诊断模型。多种标志物诊断模型需要使用统计分析方法进行,以下以逻辑回归模型为例构建多个miRNA标志物诊断模型。
逻辑回归模型的构建方式为:将样本分成病例组和对照组,然后使用IBM SPSSStatistics 24软件来优化回归系数。对于每种标志物都有一个回归系数,加上一个偏差参数,使得逻辑回归模型用于训练数据的似然性最大化。训练后,回归系数集合就限定了逻辑回归模型。通过将miRNA标志物的表达水平代入逻辑回归方程中,本领域技术人员可容易地使用该诊断模型预测任何新样品为病例或对照的可能性。
上述10种miRNA标志物得到的AUC均大于0.80,我们使用逻辑回归组合了10种miRNA标志物,产生的AUC为0.985(标准误差:0.00285;95%CI:0.976-0.992;P值:<0.0001)(图4)。为了让监测分析方法更简单,再将AUC值较大的5种标志物(miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p)进行组合并建立逻辑回归模型。得到的AUC值为0.968(标准误差:0.00557;95%CI:0.955-0.977;P值:<0.0001)(图5),一般来说,10种标志物比5种标志物的逻辑回归模型的灵敏度和特异性稍好些,但基于操作分析程序和成本考虑,5种标志物组合也是比较好的选择。
本文提供的技术方案,通过联合检测外泌体中miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p生物标志物的一种或多种miRNA表达水平,使得肺癌检测的灵敏度和特异性得到了提高,从而保证了检测结果的正确性和可靠性。此外,开发了用于检测miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p这10个miRNA的诊断试剂盒及检测方法,能方便地实现针对这10个miRNA水平的检测,利用逻辑回归方程分析,能够快速、便捷地判断样本是否呈阳性及风险值,为提高肺癌早期诊断提供了一种快速检测试剂盒。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;本领域的普通技术人员应当理解:可以对前述各实施例记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案范围,其均应涵盖在本发明说明书的范围中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京艾克伦医疗科技有限公司
<120> 通过外泌体miRNA生物标志物进行肺癌诊断的检测试剂盒和方法
<130> 21799CI
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
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ucguaccgug aguaauaaug cg 22
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ugagguagua guuuguacag uu 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 28
cgggaagctg ccagttgaag 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 29
agccgacctg gcatacaat 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 30
ccgcgctttc agtcagatg 19
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 31
ccgcgtcctg tactgagctg c 21
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 32
gcccgctgag gtagtagttt gtac 24
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 33
cgcgcgtagc agcacgtaaa 20
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 34
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 35
ctggatacga ccgcatt 17
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 36
ctggatacga cctacca 17
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 37
ctggatacga cctacctgc 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 38
cactggatac gacactcac 19
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 39
cactggatac gactcagttt tg 22
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 40
ctggatacga cacagttc 18
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 41
ctggatacga caaatctaca 20
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 42
ctggatacga cgcagcaaa 19
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 43
ctggatacga cctcggg 17
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 44
ctggatacga caactgt 17
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 探针
<400> 45
ctggatacga ccgccaata 19
Claims (21)
1.用于在受试者中进行肺癌状态诊断的检测试剂盒,包括检测来自所述受试者的生物样品中miRNA生物标志物水平的检测试剂,所述miRNA生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p及其任意组合。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒,其中所述miRNA生物标志物包括miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p。
3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒,其中所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p。
4.如权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒,其中所述肺癌状态包括肺癌易感性和/或肺癌的存在、进展、亚型和/或分期。
5.如权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒,其中所述肺癌状态为肺癌I期或II期,所述miRNA生物标志物为miR-140-5p、miR-19b-3p和/或miR-22-3p;所述肺癌状态为腺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p;所述肺癌状态为鳞癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-221-5p;所述肺癌状态为大细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p;或者所述肺癌状态为小细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-22-3p、miR-221-5p和/或miR-486-5p。
6.如权利要求1-5任一项所述的检测试剂盒,其中所述检测miRNA生物标志物水平的检测试剂包括逆转录引物、PCR扩增引物对和/或Taqman探针。
7.如权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒,其中:
用于检测miR-126-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:12所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:23和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:35所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-140-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:13所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:24和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:36所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-17-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:14所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:25和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:37所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-181a-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:15所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:26和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:38所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-19b-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:16所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:27和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:39所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-22-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:17所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:28和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:40所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-221-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:18所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:29和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:41所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-30d-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:19所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:30和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:42所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-486-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:20所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:31和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:43所示序列的Taqman探针;以及
用于检测let-7g-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:21所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:32和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:44所示序列的Taqman探针。
8.如权利要求1-7任一项所述的检测试剂盒,还包括用于检测作为内参基因的miR-16-5p的水平的检测试剂;所述检测试剂包括:包括SEQ ID NO:22所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:33和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:45所示序列的Taqman探针。
9.如权利要求1-8任一项所述的检测试剂盒,还包括用于从所述生物样品中分离外泌体的试剂;任选地,还包括用于从所述外泌体提取miRNA的试剂。
10.如权利要求1-9任一项所述的检测试剂盒,还包括记载有根据所述miRNA生物标志物水平基于逻辑回归来判断所述受试者中肺癌状态的说明书。
11.如权利要求1-10任一项所述的检测试剂盒,其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、痰液、淋巴、脑脊液、胸水、支气管肺泡灌洗液和尿。
12.在受试者中鉴定肺癌状态的方法,包括:
1)从来自所述受试者的生物样品中分离外泌体;
2)检测所述外泌体中miRNA生物标志物水平,所述miRNA生物标志物选自miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p及其任意组合;以及
3)将步骤2)中检测的miRNA生物标志物水平与群体中相应miRNA的水平进行比较,以确定所述受试者中的肺癌状态。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述miRNA生物标志物包括miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-19b-3p和miR-22-3p。
14.如权利要求12或13所述的方法,其中所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p、miR-221-5p、miR-30d-3p、miR-486-5p和let-7g-5p。
15.如权利要求12-14任一项所述的方法,其中所述肺癌状态包括肺癌易感性和/或肺癌的存在、进展、亚型和/或分期。
16.如权利要求12-15任一项所述的方法,其中所述肺癌状态为肺癌I期或II期,所述miRNA生物标志物为miR-140-5p、miR-19b-3p和/或miR-22-3p;所述肺癌状态为腺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p;所述肺癌状态为鳞癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-221-5p;所述肺癌状态为大细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-19b-3p、miR-22-3p和/或miR-486-5p;或者所述肺癌状态为小细胞肺癌,所述miRNA生物标志物为miR-126-3p、miR-140-5p、miR-17-5p、miR-22-3p、miR-221-5p和/或miR-486-5p。
17.如权利要求12-16任一项所述的方法,其中步骤2)中对所述miRNA生物标志物水平的检测包括使用miRNA生物标志物特异的检测试剂,所述检测试剂包括逆转录引物、PCR扩增引物对和/或Taqman探针。
18.如权利要求12-17任一项所述的方法,其中:
用于检测miR-126-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:12所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:23和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:35所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-140-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:13所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:24和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:36所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-17-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:14所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:25和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:37所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-181a-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:15所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:26和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:38所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-19b-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:16所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:27和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:39所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-22-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:17所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:28和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:40所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-221-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:18所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:29和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:41所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-30d-3p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:19所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:30和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:42所示序列的Taqman探针;
用于检测miR-486-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:20所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:31和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:43所示序列的Taqman探针;以及
用于检测let-7g-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:21所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:32和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:44所示序列的Taqman探针。
19.如权利要求12-18任一项所述的方法,其中步骤2)还包括检测作为内参基因的miR-16-5p的水平;用于检测miR-16-5p的水平的检测试剂包括:包括SEQ ID NO:22所示序列的逆转录引物;包括SEQ ID NO:33和34所示序列的PCR扩增引物对;和/或包括SEQ ID NO:45所示序列的Taqman探针。
20.如权利要求12-19任一项所述的方法,其中步骤3)包括根据所述miRNA生物标志物水平基于逻辑回归来判断所述受试者中肺癌状态。
21.如权利要求12-20任一项所述的方法,其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、痰液、淋巴、脑脊液、胸水、支气管肺泡灌洗液和尿。
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