CN105229166A

CN105229166A - 进行原位杂交的方法与试剂盒

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Publication number: CN105229166A
Application number: CN201380068639.7A
Authority: CN
Inventors: J·奥里驰-科斯塔; E·埃文; M·吉尔德亚
Original assignee: Cellay LLC
Current assignee: Cellay LLC
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2033-10-16
Also published as: EP2914737B1; US20150064701A1; JP2015536651A; US20140120535A1; US8877441B2; WO2014070460A8; EP2914737A1; CN105229166B; WO2014070460A1

Abstract

本发明涉及使用嵌入干燥的纤维基质中或吸附到其上的核酸探针在固体表面的生物样品上进行原位杂交的方法与试剂盒。例如，可以使用在滤纸或玻璃纤维圆片上以干燥形式提供的荧光标记寡核苷酸探针来进行荧光原位杂交(FISH)。

Description

进行原位杂交的方法与试剂盒

相关申请

本申请要求2012年10月31日提交的美国临时申请号为61/720,665的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文中。

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发明背景

原位杂交方法在医学病症(特别是癌症)患者的筛选和测试中广泛使用。成功的原位杂交程序部分取决于使用适当的、精确测量的浓度的杂交探针。当使用不适当的高或低浓度的杂交探针时，经常出现不准确的结果，包括患者误诊。

标准原位杂交程序通常包括制备具有期望浓度的探针的杂交溶液。为实现这个目的，使用微吸管从储备溶液中测量精确量的探针并加入到特定体积的杂交缓冲液中。微量移液的错误因此可以导致具有次优浓度的探针的杂交溶液，从而当探针浓度过高时导致高水平的背景信号，或当探针浓度过低时导致不足的可检测信号。

因此，需要开发不要求使用微吸管来测量精确量的探针以制备具有特定探针浓度的杂交溶液的简化和可靠的原位杂交程序。

发明内容

在一个实施方式中，本发明提供了测定目标核酸是否存在于固体表面上的生物样品中的方法。在这个实施方式中，所述方法包括以下步骤：a)将固体表面上的所述样品与干燥纤维基质接触，其中用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或多个不同核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；b)将所述基质水化以从所述基质释放所述探针；c)将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与所述样品中的所述目标核酸(如果存在)特异性杂交的严格条件下孵育；d)洗涤所述样品以除去未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和e)通过测定所述标记的核酸探针是否与所述样品杂交来确定所述目标核酸是否存在于所述样品中。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种计数固定在载片上的细胞样品中的染色体的方法。在这个实施方式中，所述方法包括以下步骤：a)将所述样品覆盖在具有干燥纤维基质的载片上，所述干燥纤维基质包含玻璃纤维，其中用于检测所述样品中的一个或多个靶染色体序列的荧光标记的合成DNA寡核苷酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述探针包含与所述一个或多个靶染色体序列中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；b)使用杂交缓冲液将所述基质水化以从所述基质释放所述探针；c)将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与所述样品中的所述靶染色体序列(如果存在)特异性杂交的严格条件下孵育；d)洗涤所述样品以除去未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和e)通过检测与所述样品中的所述靶染色体序列杂交的标记核酸探针来计数所述样品中具有所述靶染色体序列的染色体。

在进一步的实施方式中，本发明涉及用于检测样品中的目标核酸的试剂盒，其包含用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针的干燥纤维基质，其中所述标记的核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或多个核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。在特定实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于从所述基质释放所述探针的水化缓冲液。

本发明的原位杂交方法降低了微量吸液错误的可能性并确保使用适当的量和浓度的探针。

附图简要说明

图1A和1B为在室温下与嵌入滤纸圆片中的OligoFISH探针组杂交的人外周血细胞的图像，所述探针组用于染色体3(红色)、6(绿色)、7(浅绿色)和20(金色)。

图2为示出使用涉及升高温度的杂交步骤和盖玻片下的非嵌入探针的标准原位杂交程序(蓝色，对照)或者使用涉及室温杂交步骤和嵌入滤纸圆片的探针的原位杂交程序(绿色，圆片)对于染色体3(红色)、6(绿色)、7(浅绿色)和20(金色)的OligoFISH探针组获得的信噪比的柱状图。误差棒是平均值的标准误差。

发明详述

定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如本文中所使用，术语“室温”或“RT”是指约18摄氏度至约25摄氏度范围的温度。

术语“核苷酸”是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，以及非天然存在的其衍生物和类似物。因此，核苷酸可包括，例如，包含天然存在的碱基(例如，A、G、C或T)的核苷酸和包含修饰的碱基(例如，7-去氮杂鸟苷或肌苷)的核苷酸。

关于核酸的术语“序列”是指通过共价键(例如，磷酸二酯键)连接的连续的核苷酸系列。

术语“核酸”是指具有多个核苷酸单体的聚合物。核酸可以是单链或双链的，且可以是DNA(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA或杂化聚合物(例如，DNA/RNA)。核酸可以是化学地或生物化学地修饰的和/或可含非天然的或衍生的核苷酸碱基。核酸修饰包括，例如，甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰如不带电的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)、带电的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧悬部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的连接(例如，α异头核酸等)。核酸还包括在通过氢键键合和其他化学相互作用结合于指定序列的能力上模拟核酸的合成分子。通常，核苷酸单体通过磷酸二酯键连接，尽管核酸的合成形式可包含其他连接(例如，肽核酸(本文中也称为“PNA”)，如Nielsen等，Science254，1497-1500，1991中所描述的)。核酸还可以包括，例如，构象限制的核酸(例如，“锁核酸”或“LNA”，如Nielsen等，J.Biomol.Struct.Dyn.17:175-91，1999中所描述的)、吗啉代寡核苷酸(morpholinos)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。“核酸”不是指聚合物的任何特定长度，且因此可以基本上是任何长度，通常从约6个核苷酸至约10⁹个核苷酸或更长。在双链聚合物情况下，“核酸”可以指任一链或两条链。

术语“寡核苷酸”指通过共价连接如磷连接(例如，磷酸二酯、膦酸烷基和芳基酯、硫代磷酸酯、磷酸三酯)和/或非磷连接(例如，肽、氨基磺酸酯等)连接的长度通常为约6至约100个核苷酸碱基的短核酸。

术语“目标核酸”是指期望检测其在样品中的存在或不存在的核酸。

术语“目标序列”是指能够与寡核苷酸探针上的互补序列(例如，基本上互补的序列)形成氢键键合的双链体的目标核酸中的核苷酸序列。

如本文中所使用，“互补的”是指两个不同的核酸链之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性。如果当以反向平行方式排列两个区域时，核酸的第一区域中的至少一个核苷酸残基能够与第二区域中的残基碱基配对(即，氢键键合)而形成氢键键合的双链体，则核酸的第一区域与相同或不同的核酸的第二区域是互补的。

术语“基本上互补的”是指能够在严格杂交条件(包括本文中描述的等温杂交条件)下彼此碱基配对以形成稳定的氢键键合双链体的两条核酸链(例如，目标核酸的链和互补的单链寡核苷酸探针)。一般来说，“基本上互补的”是指具有至少70％，例如，约75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％互补性的两个核酸。

“重复序列”或“重复的序列”是指人类基因组中非编码的串联重复的核苷酸序列，其包括，例如，来自α随体、随体1、随体2、随体3、β随体、γ随体和端粒的重复序列。重复序列是本领域中已知的，且例如在Allshire等，NucleicAcidsRes17(12):4611-27(1989)；Cho等，NucleicAcidsRes19(6):1179-82(1991)；Fowler等，NucleicAcidsRes15(9):3929(1987)；Haaf等，Cell70(4):681-96(1992)；Lee等，Chromosoma109(6):381-9(2000)；Maeda和Smithies，AnnuRevGenet20:81-108(1986)；Meyne和Goodwin，Chromosoma103(2):99-103(1994)；Miklos(1985).LocalizedhighlyrepetitiveDNAsequencesinvertebrategenomes.Molecularevolutionarygenetics.I.J.R.Macintyre.NY，PlenumPublishingCorp.:241-321(1985)；Tagarro等，HumGenet93(2):125-8(1994)；Waye和Willard，PNASUSA86(16):6250-4(1989)；和Willard和Waye，JMolEvol25(3):207-14(1987)中描述。重复序列位于例如染色体的着丝粒区域、近着丝粒(pericentromeric)区域、异染色质区域和端粒区域。共有重复序列在例如Willard和Waye，JMolEvol25(3):207-14(1987)；Tagarro等，HumGenet93(2):125-8(1994)；Vissel和Choo，NucleicAcidsRes.15(16):6751–6752(1987)；Cho等，NucleicAcidsRes19(6):1179-82(1991)中描述。

如本文中所使用，术语“染色体特异性核酸序列”或“染色体特异性核苷酸序列”是指对细胞基因组内的特定染色体具有特异性的核酸序列。

术语“探针”是指包括与目标核酸中的目标序列基本上互补的目标结合区域且因此能够与目标核酸形成氢键键合的双链体的寡核苷酸。通常，所述探针为单链探针，具有一个或多个可检测标记以允许在与其互补目标杂交后检测所述探针。

如本文中所使用，“目标结合区域”是指能够与互补目标核酸形成氢键键合的双链体的寡核苷酸探针的一部分。

如本文所用的，术语“可检测标记”是指表示其结合的相应分子(例如，探针)的存在的部分。

“间接标记”是指使用与所述间接标记特异性结合的标记的第二试剂或配体结合伴体来检测的部分或配体。

“直接标记”是指在不存在配体结合伴体相互作用的情况下可检测的部分。

术语“生物样品”是指生物来源的材料(例如，细胞、组织、器官、流体)。

在两个分子(无论是单体还是聚合分子)的连接的情况中“接头”表示插入在所连接的两个分子之间且与它们邻接的分子(无论是单体还是聚合分子)。“接头”可用于连接例如寡核苷酸探针序列与标记(例如，可检测标记)。所述接头可以是核苷酸接头(即在非邻接序列之间并与它们邻接的核酸序列)或非核苷酸接头。

术语“杂交体”是指通过互补的核苷酸之间的氢键键合形成的双链核酸分子。

术语“严格性”是指影响杂合体的稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。这些条件按经验优化以使探针与目标核酸的特异性结合最大化，并使探针与目标核酸的非特异性结合最小化。

术语“荧光团”是指具有荧光性的化学基团。

术语“任选”表示可包括或不包括所记载的步骤(例如，在本发明方法的情况下)或组分(例如，在本发明试剂盒的情况下)。

检测目标核酸的方法

生物样品在固体表面上并可以粘附或连接到所述表面上。适合的固体表面包括，但不限于，显微镜载片(例如，玻璃载片、塑料载片、石英载片)、盖玻片和多孔(multiwall)(例如，微量滴定)板。优选地，生物样品粘附或连接到玻璃载片上。对于本发明方法适合的生物样品包括，例如，染色体制剂(preparation)、细胞(例如，培养的细胞)、组织、器官、血液、脊髓液、淋巴液、眼泪、唾液、痰、尿液、精液、羊水、毛发、皮肤和肿瘤(例如，活组织检查)。优选地，所述生物样品包括含有染色体DNA的细胞。优选的细胞包括上皮细胞、精细胞、卵母细胞、极体、卵裂球和囊胚。在具体实施方式中，所述生物样品包括尿路上皮细胞(例如，人尿路上皮细胞)。优选地，所述生物样品从动物(例如，非人哺乳动物、人)获得。在特定实施方式中，所述生物样品从人获得。

在一个实施方式中，生物样品可包括单一目标核酸，或在替代的实施方式中，包括多种目标核酸(例如，两种或更多种不同的目标核酸)。目标核酸可以是DNA或RNA，并可包括基因内的、基因间的和/或转基因的核苷酸序列。因此，目标核酸可以是内源性基因组核苷酸序列或者人工或外源的(例如，转基因的)核苷酸序列。通常，目标核酸包含染色体特异性核苷酸序列。示例性的染色体特异性核苷酸序列示于表1中。

表1.示例性的染色体特异性核酸序列。

目标核酸可包括独特的或重复的核苷酸序列。优选地，所述目标核酸包括重复的基因组序列，例如，特定人染色体(即，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的重复序列。适合的重复序列包括，但不限于，着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列、端粒重复序列、α随体重复序列、β随体重复序列、γ随体重复序列和随体1、2或3重复序列。在一些实施方式中，所述目标核酸包括特异性序列(例如，特异性重复序列)内约20至约50个连续核苷酸的目标序列。

通常，本发明的方法中使用的生物样品为固定的样品(例如，固定的细胞样品、固定的组织样品、染色体涂片)。各种适合的固定剂是本领域已知的，且包括，例如，酸性丙酮溶液、各种醛溶液(例如，甲醛、多聚甲醛和戊二醛)和酸性醇溶液。用于染色体制剂的特定固定剂的实例例如在Trask等(Science230:1401-1402，1985)中描述。所述生物样品可在溶液中或在固体载体上制备(例如，固定)。

所述生物样品可以任选地预处理以使所述样品中的核酸更容易接近探针。这种预处理可包括，例如，用一种或多种蛋白酶(例如，蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胶原蛋白酶)和/或弱酸(例如，0.02-0.2NHCl、25％至75％乙酸)处理生物样品、用核糖核酸酶处理生物样品以除去残留RNA、样品的洗涤剂透化、样品热变性和样品熟化。其它预处理步骤包括样品化学变性。在一个实施方式中，生物样品在非碱变性缓冲液(例如，70％甲酰胺)中在升高的温度(例如，72°℃)下变性。在另一个实施方式中，生物样品在包含至少一种碱(例如，NaOH)和至少一种醇(例如，乙醇)的溶液中在室温下变性。优选地，所述碱/醇溶液包含约0.07N碱和约70％乙醇。

根据本发明，所述生物样品与含有核酸探针的干燥纤维基质接触。所述干燥纤维基质可以由天然存在的纤维或合成纤维构成。所述纤维可以是纺织纤维或非纺织纤维。示例性的纤维包括，但不限于，玻璃纤维、羊毛纤维和植物纤维。在优选实施方式中，所述纤维是玻璃纤维。在另一个实施方式中，所述纤维基质包含纤维素基材料(例如，纤维素纤维)。适合的纤维素基材料包括，但不限于，纤维素、硝基纤维素、羧甲基纤维素、人造丝(rayon)或粘胶纤维。

在特定实施方式中，所述干燥纤维基质是滤纸(例如，纤维素基滤纸、玻璃纤维滤纸)。适合的滤纸是可商购的，其包括，例如，Whatman^TM纤维素和玻璃微纤维滤纸(GEHealthcare)。

干燥纤维基质含有用于检测目标核酸的标记核酸探针。优选地，所述探针是染色体特异性的探针。所述探针可以在基质上、连接于基质、粘附于基质、沉积到基质上、嵌入基质中或吸附到基质上。制备含有核酸的纤维基质的方法是本领域已知的。

在一个实施方式中，在所述基质置于样品上之前，所述核酸探针在嵌入基质中或吸附到基质上后变性。例如，在所述探针已经沉积到所述基质上后，可以加热所述纤维基质到适合的温度(例如，100℃)以使探针变性。同时，干燥(如脱水)所述基质以防止探针复性。一旦基质已经干燥，变性的探针直到所述基质再水化才可以复性。

可用于本发明方法中的探针包含与样品中的目标核酸的核苷酸序列(例如，目标序列)基本上互补的核苷酸序列，也称目标结合区域。虽然通常是期望的，但是探针中的目标结合区域不要求具有与目标核酸100％的互补性。例如，在一些实施方式中，可用于本发明方法中的探针可包含与目标核酸中的核苷酸序列至少约70％、约80％、约90％、约95％或约99％互补的核苷酸序列。

在特定实施方式中，本发明方法中所使用的探针是寡核苷酸探针(例如，单链DNA寡核苷酸探针)。典型的寡核苷酸探针是线性的，且大小范围为约20至约100个核苷酸，优选地，约30至约50个核苷酸。在特定实施方式中，寡核苷酸探针长度为约30个核苷酸。

用于本发明方法中的合适的探针包括，但不限于，DNA探针、RNA探针、肽核酸(PNA)探针、锁核酸(LNA)探针、吗啉代探针、二醇核酸(GNA)探针和苏糖核酸(TNA)探针。这种探针可以是化学地或生物化学地修饰的和/或可含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。例如，探针可含有具有修饰的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)和/或修饰的糖基(例如，2’O-甲基核糖基、2’O-甲氧基乙基核糖基、2’-氟核糖基、2’-氨基核糖基)的修饰核苷酸。虽然优选的是线性探针，但可用的探针可以是环状的或分支的和/或包括能够形成稳定的二级结构(例如，茎-和-环和环-茎-环发夹结构)的结构域。

制备可用于本发明方法中的探针的方法是本领域所公知的，且其包括，例如，生物化学方法、重组方法、合成方法(例如，化学合成)和半合成方法。在一个实施方式中，本发明方法中使用的寡核苷酸探针是通过化学合成制备的。合成的寡核苷酸探针可使用用于核酸合成的已知方法(参见，例如，Glick和Pasternak，MolecularBiotechnology:Principles和ApplicationsofRecombinantDNA(ASMPress1998))来制备。例如，可使用溶液相或固相技术。合成程序通常是自动的，且可包括，例如，亚磷酰胺法、亚磷酸三酯法、H-磷酸酯法或磷酸三酯法。

可用于本发明方法中的探针可进一步包含一种或多种可检测标记。根据本发明适合使用的标记是本领域中已知的，且通常包括按照其化学性质提供(无论是以直接方式还是间接方式)允许探针检测的可识别信号的任何分子。因此，例如，可通过常规方式，例如使用特定的报告分子、荧光团、放射性物质或酶(例如，过氧化物酶、磷酸酶)来标记探针。在特定实施方式中，本发明方法中使用的探针包括一个或多个荧光团作为可检测标记。

适合于连接于探针的可检测标记可以是间接标记或直接标记。示例性的间接标记包括，例如，半抗原、生物素或其他可特异性结合的配体。对于间接标记，配体结合伴体通常具有直接标记，或者，也可以间接地标记。作为半抗原的间接标记的实例包括二硝基苯酚(DNP)、洋地黄毒苷、生物素和各种荧光团或染料(例如，荧光素、DY490、DY590、Alexa405/Cascade蓝、Alexa488、BodibyFL、丹酰、俄勒冈绿、荧光黄、四甲基罗丹明/罗丹明红和得克萨斯红)。作为间接标记，通常使用抗半抗原抗体作为配体结合伴体来检测半抗原。然而，也可以使用可选择的配体结合伴体(例如，在生物素的情况下，可使用例如抗生物素抗体或抗生物素蛋白链菌素作为配体结合伴体)来检测半抗原。此外，在某些实施方式中，还可以直接检测半抗原(例如，在荧光素的情况中，可使用抗荧光素抗体或直接荧光检测)。

示例性的“直接标记”包括，但不限于，荧光团(例如，荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、Cy3、Cy5、DY荧光体(fluor)(DyomicsGmbH，Jena，德国)、Alexa532、Alexa546、Alexa568或Alexa594)。其它直接标记可包括，例如，放射性核素(例如，3H、35S、32P、125I和14C)，酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶、生色团(例如，藻胆蛋白)、发光剂(例如，化学发光剂和生物发光剂)和镧系元素螯合物(例如，Eu3+或Tb3+的络合物)。在荧光标记的情况下，荧光团不限定于单一种类的有机分子，但包括无机分子、有机和/或无机分子的多分子混合物、晶体、杂聚合物等。例如，包封在二氧化硅壳内的CdSe-CdS核-壳纳米晶体可容易地衍生化以用于与生物分子偶联(Bruchez等，Science，281:2013-2016，1998)。类似地，高荧光的量子点(硫化锌覆盖的硒化镉)与生物分子共价偶联以用于超灵敏的生物检测中(Warren和Nie，Science，281:2016-2018，1998)。

探针标记可例如在合成过程中或者在合成后例如使用5’-端标记来进行，其包括使用末端转移酶将标记的核苷酸酶促添加至探针的5’-端。可通过使用“链终止”核苷酸来添加单一的标记核苷酸。或者，可使用非终止的核苷酸而导致添加多个核苷酸以形成“尾”。对于合成标记，可在化学合成过程中将标记的核苷酸(例如，亚磷酰胺核苷酸)并入所述探针中。标记可添加至探针的5’-端、3’-端或两端(参见，例如，美国专利号5,082,830)，或者在ODN内部的碱基位置处。

标记核酸的其它方法利用基于铂的标记。这类方法包括通用连接系统(ULS，KreatechBiotechnologyB.V，阿姆斯特丹，荷兰)。基于铂的标记法以及应用描述在下述文献中，例如，美国专利号5,580,990、5,714,327和6,825,330；国际专利公开号WO92/01699、WO96/35696和WO98/15546；Hernandez-Santoset等，Anal.Chem.77:2868-2874，2005；Raap等，BioTechniques37:1-6，2004；Heetebrij等，ChemBioChem4:573-583，2003；VandeRijke等，AnalyticalBiochemistry321:71-78，2003；Gupta等，NucleicAcidsResearch31:e13，2003；VanGijlswijk等，ClinicalChemistry48:1352-1359，2002；Alers等，Genes，Chromosomes&Cancer25:301-305，1999；Wiegant等，Cytogenetics和CellGenetics87:7-52，1999；Jelsma等，JournalofNIHResearch5:82，1994；VanBelkum等，BioTechniques16:148-153，1994和VanBelkum等，JournalofVirologicalMethods45:189-200，1993。

标记的核苷酸也可使用交联剂或间隔物(spacer)连接至探针。交联剂可以是同型双官能的或异型双官能的。适合的同型双官能交联剂包括，例如，在每端具有NHS酯的胺反应性交联剂(包括，例如，二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)；3,3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)；二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)；双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)；乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)；乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基EGS))；在两端具有酰亚胺酯的胺反应性交联剂(包括，例如己二亚胺酸二甲酯(DMA)；庚二亚胺酸二甲酯(DMP)；辛二亚胺酸二甲酯(DMS)；3,3’-二硫代双丙二亚胺酸二甲酯(DTBP))；在每端具有二硫吡啶基的巯基反应性交联剂(包括，例如，1,4-二-[3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰氨基]丁烷(DPDPB))；在每端具有马来酰亚胺基的巯基反应性交联剂(包括，例如，双马来酰亚胺基己烷(BMH))；在每端具有酰肼基的羧基反应性交联剂(包括，例如，己二酸二酰肼和碳酰肼)；在每端具有环氧基的多基团反应性交联剂(包括，例如，1,2:3,4-二环氧丁烷；1,2:5,6-二环氧己烷；双(2,3-环氧丙基)醚；1,4-(丁二醇)二缩水甘油醚)。适合的异型双官能交联剂包括具有胺反应性末端和巯基反应性末端的交联剂(包括，例如，3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)；长链SPDP(SPDP)；磺基-LC-SPDP；琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)；磺基-LC-SMPT；琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷(SMCC)；磺基-SMCC；6-((碘代乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯(SIAX)；6-(6-(((4-碘代乙酰基)氨基)己酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯(SIAXX))；具有羰基反应性末端和巯基反应性末端的交联剂(包括，例如，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)；4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼盐酸盐(M2C2H)；3-(2-吡啶基二硫代)丙炔基酰肼(PDPH))；具有胺反应性末端和光反应性末端的交联剂(包括，例如，磺基琥珀酰亚胺基-2-(对-叠氮基水杨酸基氨基)乙基-1,3’-二硫代丙酸酯(SASD)；2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3’-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺基酯(SAED))；具有巯基反应性末端和光反应性末端的交联剂(包括，例如，N-[4-对-叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP))；具有羰基反应性末端和光反应性末端的交联剂(包括，例如，4-(对-叠氮基水杨酰胺基)丁胺(ASBA))。适合的间隔物包括，5’ODN修饰如dNTP’s；和胺反应性的间隔物如氨基-或磺基-亚磷酰胺，其包括，例如，丁基亚磷酰胺、戊基亚磷酰胺、己基亚磷酰胺、庚基亚磷酰胺、辛基亚磷酰胺、壬基亚磷酰胺、癸基亚磷酰胺、十一烷基亚磷酰胺、十二烷基亚磷酰胺、十五烷基亚磷酰胺、十八烷基亚磷酰胺。其它适合的胺反应性间隔物包括例如，活化的聚乙二醇(PEG)如(单甲氧基)_n二醇，其中n＝3-18个单元重复。另外的适合的交联剂和间隔物在Herman."BioconjugateChemistry".AcademicPress.NewYork,NY.1996中描述。

在一些实施方式中，纤维基质载有多种具有对于不同目标核酸的特异性的标记探针。在这样的实施方式中，每种探针至少与样品中的特定目标核酸基本上互补，并包含可检测标记(其区别于具有对于所述样品中的其他目标核酸的特异性的其他探针上存在的可检测标记)。例如，每种探针可以包含具有可光谱区分的发射波长的荧光团。适用于具有多种不同标记探针的本发明试剂盒的荧光团包括，例如，Alexa488(在492nm处具有最大激发和在520nm处具有最大发射)和Alexa546(在555nm处具有最大激发和在570nm处具有最大发射))。

在其他实施方式中，干燥纤维基质包括嵌入所述基质中或吸附到其上的一种或多种附加试剂。这样的附加试剂包括，例如，鲑鱼精DNA、封闭试剂(例如，乳(例如，脱脂乳)、白蛋白、酪蛋白)和抗微生物剂(例如，叠氮化钠、硫柳汞)或其组合。

根据本发明，将纤维基质水化以在探针与样品中可能存在的目标核酸杂交之前从所述基质释放所述探针。所述纤维基质可以紧接在所述基质与生物样品接触之前或之后水化。在一个实施方式中，通过向所述基质施用一滴或多滴水化缓冲液来水化所述纤维基质。在特定实施方式中，所述水化缓冲液包含变性剂(例如，甲酰胺、NaOH)。

在特定实施方式中，所述水化缓冲液包含甲酰胺、硫酸葡聚糖和盐(例如，柠檬酸钠盐水(SSC))。当杂交在升高的温度下(例如，37-45℃)进行时，包含甲酰胺或其它去稳定化(desestabilizing)分子(例如，碳酸亚乙酯，DMSO)的水化缓冲液是特别有用的。所述水化缓冲液中甲酰胺的适合浓度包括，例如，按体积计约20％至约90％范围内的浓度，例如，按体积计约60％、约70％或约80％。所述水化缓冲液中硫酸葡聚糖的适合浓度包括，例如，按体积计约3％至约20％。所述水化缓冲液中总盐浓度优选在约0.03M至约0.09M的范围内。例如，所述水化缓冲液中SSC的浓度可以是，例如，在约0.1X至约4.0X的范围内。优选地，所述水化缓冲液包含约30％甲酰胺、约10％至约20％的硫酸葡聚糖和约2×SSC。

在另一个实施方式中，所述水化缓冲液包含碱(例如，NaOH)，并且具有在约10至约13范围内的pH值。当杂交在室温下进行时，这样的碱性水化缓冲剂是特别有用的。在所述水化缓冲液中使用的适合的碱包括，但不限于，氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化铯、氢氧化钠、氢氧化锶、氢氧化钙、氢氧化锂、氢氧化铷、氢氧化镁、丁基锂、二异丙基氨基锂、二乙基氨基锂、氨基钠、氢化钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂、碳酸钠和氨水或其组合。优选地，所述碱是碱金属碱(alkalibase)。更优选地，所述碱是氢氧化钠。所述水化缓冲液的碱的适合浓度通常在约0.03当量浓度(N)至约0.17N的范围内，例如，约0.05N、约0.06N、约0.07N、约0.08N、约0.09N或约0.1N。在特定实施方式中，所述溶液包含约0.07N的NaOH，其等同于0.07MNaOH。

在特定实施方式中，探针在基质被放置到样品上并水化(例如，通过将探针、基质和样品加热到约75℃的温度下5分钟)后变性。

本发明所述方法还包括在足以允许所述探针与所述样品中的目标核酸(如果存在)特异性杂交的严格条件下孵育样品与探针的步骤。一般来说，杂交在足以使所述探针与生物样品中的互补目标核酸杂交的条件(例如，温度、孵育时间、盐浓度等)下进行。适用于原位杂交技术的杂交缓冲液和条件是本领域所公知的。(参见，例如，Sambrook和Russell，同上；Ausubel等，同上。还参见Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistry和MolecularBiology，Vol.24:HybridizationwithNucleicAcidProbes(Elsevier，NY1993))。例如，在本发明所述方法中可以使用包含甲酰胺、硫酸葡聚糖和柠檬酸钠盐水(SSC)的杂交缓冲液。所述杂交缓冲液中甲酰胺的适合浓度包括，例如，按体积计约20％至约90％的范围内的浓度，例如，按体积计约60％、约70％或约80％。所述杂交缓冲液中硫酸葡聚糖的适合浓度包括，例如，约3％至约20％。所述杂交缓冲液中SSC的适合浓度包括，例如，约0.1X至约4.0X。所述杂交缓冲液中总盐浓度优选在约0.03M至约0.09M的范围内。在特定实施方式中，用于水化纤维基质的水化缓冲液也用作杂交缓冲液。如本领域技术人员所理解的，给定目标序列及其互补探针的最佳杂交条件取决于若干因素，例如盐浓度、孵育时间和探针浓度、组成和长度。基于这些和其他已知因素，本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的结合条件，以及如果必要，对于根据本发明方法的应用进行优化。通常，在允许基本上互补的核苷酸序列特异性结合的严格条件下进行杂交。可以提高或降低严格性以特别地检测具有100％互补性的目标核酸或检测具有小于100％互补性(例如，约70％互补性、约80％互补性、约90％互补性)的相关核苷酸序列。可以改变杂交缓冲液/溶液中的因素例如探针序列的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)、目标核苷酸序列的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定)及杂交缓冲液中的盐和其他组分的浓度(例如，甲酰胺浓度、硫酸葡聚糖浓度、聚乙二醇浓度和/或盐浓度)以形成低、中或高严格性的条件。可以基于核苷酸碱基组成和长度以及使用环境根据经验或基于用于确定这种变化的公式(参见，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)来改变这些条件。

优选的杂交条件包括在包含2×SSC、30％甲酰胺、10％-20％硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中在37℃下杂交5至10分钟。其他的优选杂交条件包括在包含6mMNaOH、30％甲酰胺、20％硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中在室温下杂交5至10分钟。

在一个实施方式中，在升高的温度(例如，37℃)下进行杂交。在替代的实施方式中，在室温下进行杂交。

根据本发明，在杂交步骤后洗涤样品以除去未杂交的探针或非特异性杂交的探针。在具有适当严格性的溶液中进行洗涤以除去未结合和/或非特异性结合的探针。可以通过在连续升高严格性的溶液中洗涤所述样品并读取各次洗涤之间的信号强度来确定适当的严格性。以这种方式分析数据集可以揭示一种洗涤严格性，在高于该洗涤严格性时杂交模式不会明显改变，并且该洗涤严格性为特定的目标探针提供了足够的信号。

适用于原位杂交方法的洗涤缓冲液是本领域所公知的(参见，例如，Sambrook和Russell，同上；Ausubel等，同上。还参见Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistry和MolecularBiology，Vol.24:HybridizationwithNucleicAcidProbes(Elsevier，NY1993))。洗涤缓冲液通常包括，例如，一种或多种盐(例如，钠盐、锂盐、钾盐)和一种或多种洗涤剂(例如，离子洗涤剂、非离子洗涤剂)。适用于洗涤缓冲液的洗涤剂包括，但不限于，十二烷基硫酸钠(SDS)、X-100、20、NP-40或IgepalCA-630。优选地，所述洗涤缓冲液包含具有约0.03M至约0.09M的总浓度的一种或多种盐(例如，柠檬酸钠)和约0.1％的SDS。在特定实施方式中，所述洗涤缓冲液包含1.864mMNaOH和2×SSC。

本领域技术人员可以容易地确定洗涤次数和每次洗涤的持续时间。用于本发明的等温方法的示例性洗涤条件包括，例如，在2×SSC中在室温(例如，约21℃)下初始杂交后洗涤5分钟，接着在0.03M-0.09M单价盐(例如，SSC)和0.1％SDS中在室温下一次或多次附加洗涤，每次洗涤至少约2分钟，优选地，每次洗涤在约2分钟至约5分钟的范围内。

在样品已经经受杂交后洗涤后，所述样品中的染色体DNA优选地使用光谱可区分的DNA特异性染色剂，例如，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶(PI)或Hoechst试剂/染料来进行复染，并使用抗褪色剂封片(mount)。所述DNA染色剂可以直接加入到抗褪色剂，或者可以与样品一起孵育，并在加入抗褪色剂之前排干和漂洗。用于对样品复染和封片的试剂和技术是本领域中所公知的。

本发明的原位杂交方法进一步包括检测样品中的一种或多种目标核酸。通过检测与所述目标核酸杂交的标记探针来检测所述目标核酸。探针标记的检测可使用可由本领域技术人员容易地确定的适合于特定标记的方法来完成。例如，可通过检测所使用的特定荧光团的发射波长来检测荧光团标记。检测荧光信号的典型方法包括，例如，荧光光度法、落射式荧光显微镜法、共焦显微镜法和流式细胞术分析。荧光标记通常优选用于检测低水平的目标，因为它们提供具有低背景的非常强的信号。此外，荧光标记通过快速扫描程序可以高分辨率和灵敏度光学检测，并且具有不同发射波长的荧光团(例如，荧光素和罗丹明)的不同杂交探针可用于单一样品以检测多个目标核酸。

在利用荧光探针的荧光原位杂交(FISH)程序的特定情况下，可利用各种不同的光学分析检测杂交复合物。光谱检测方法在例如美国专利号5,719,024；Schroeck等(Science273:494-497，1996)；和Speicher等(NatureGenetics12:368-375，1996)中讨论。关于一般FISH程序的进一步指导在例如Gall和Pardue(MethodsinEnzymology21:470-480，1981)；Henderson(InternationalReviewofCytology76:1-46，1982)；和Angerer等，GeneticEngineering：PrinciplesandMethods(Setlow和Hollaender编，PlenumPress，NewYork，1985)中讨论。

间接标记的检测通常包括结合伴体或第二试剂的检测。例如，间接标记如生物素和其它半抗原(例如，洋地黄毒苷(DIG)、DNP或荧光素)可通过与作为第二试剂的抗生物素蛋白链菌素(即，在生物素的情况下)或抗体的相互作用来检测。在探针与目标结合后，可通过使用例如直接标记的抗生物素蛋白链菌素或抗体来检测目标-探针复合物。或者，未标记的第二试剂可与特异性地结合第二试剂的直接标记的"第三"试剂一起使用(例如，可使用未标记的抗DIG抗体，其可以用对第一抗体的种类和类别特异性的标记的第二抗体来检测)。用于第二试剂的标记通常为非同位素标记，尽管可使用放射性同位素标记。典型的非同位素标记包括，例如，可与第二或第三试剂偶联的酶和荧光团。通常用于DNA诊断的酶包括，例如，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

取决于所使用的酶学标记的类型，酶标记的检测可例如通过检测颜色或染料沉积(例如，用于碱性磷酸酶的对硝基苯基磷酸酯或5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/氮蓝四唑，和用于辣根过氧化物酶的3,3’-二氨基联苯胺-NiCI2)、荧光(例如，用于碱性磷酸酶的4-甲基伞花基磷酸酯)或化学发光(例如，来自LumigenInc.,DetroitMich.的碱性磷酸酶二氧杂环丁烷(dioxetane)底物LumiPhos530或来自Tropix,Inc.的AMPPD和CSPD)来实现。可用X射线或Polaroid膜或通过使用单光子计数光度计(例如，用于碱性磷酸酶标记的探针)进行化学发光检测。

在某些实施方式中，使用数字增强或积分来检测来自探针上标记的信号。例如，标记的检测可包括使用显微成像，其采用安装在显微镜(例如，双目、单目或立体显微镜)的目镜管上的CCD相机。在一些实施方式中，使用图像扫描显微术完成标记的检测。例如，计算机化图像扫描显微术的最新进展已显著提高了使用荧光显微术检测稀有细胞的能力，从而允许在～6×10⁵个阴性细胞的环境中检测1个阳性细胞(参见，例如，Mehes等，Cytometry42:357-362，2000)。已开发了先进的图像扫描软件，其不仅可以检测多种颜色，而且可以检测可用于检测例如DNA水平上的易位的融合的或共定位的信号(MetaSystemsGroup,Inc.)。扫描速度通常取决于用于可靠地检测单个阳性细胞的参数的数量。图像扫描还允许人工检查评分为阳性的细胞的图像以进行确认。已开发了用于自动化的、基于载片的分析的先进图像扫描软件，其不仅可以检测多种颜色，而且可以检测可用于检测例如DNA水平上易位的融合或共定位信号(MetaSystemsGroup,Inc.)。扫描速度通常取决于用于单一阳性细胞的可靠检测的参数的数量。自动化的基于载片的扫描系统特别适合高通量测定。

在一个实施方式中，使用扫描载片显微镜，例如，使用MetaCyte自动化生物成像系统(MetaSystemGroup,Inc.)。该系统由下述组件组成：1)CarlZeissAxioPlan2MOT荧光显微镜，2)扫描8-位置平台，3)PC奔腾III处理器，4)Jai照相机，5)照相机接口，6)平台控制，7)轨迹球和鼠标，和8)打印机。焦点分析从装载于显微镜上的载片装置开始。随平台移动扫描载片，并捕获图像。在扫描整个载片后创建图库。基于对于阳性或阴性设置的标准，图像分析产生阳性信号或阴性信号。如果为阴性，则重扫描载片进行稀有事件分析。如果为阳性，对适当的荧光信号更换滤镜，并捕捉和分析5-7个平面。对于8个载片，存在离开(walkaway)/过夜操作(标准或具有任选的托盘变换器的100个载片)。适应性检测算法和自动曝光控制功能补偿不均匀的染色条件。可同时检测几种标志物。标准光源覆盖从紫外到红外的广泛光谱。如果细胞荧光强度允许在1/1,000秒内检测，则高达每秒1,000个细胞的扫描速度可用于检测稀有细胞。对于强信号，可使用较低的放大倍数以增加扫描速度。

或者，探针的检测可在不存在数字增强或积分的情况下进行。

计数染色体的方法

在特定实施方式中，本发明涉及计数固定在载片上的细胞样品中的染色体的方法。优选地，细胞是上皮细胞(例如，尿路上皮细胞、外周血细胞)、精细胞、卵母细胞、极体、卵裂球、囊胚或其组合。在一个实施方式中，所述细胞粘附到玻璃显微镜载片上。

所述方法包括将所述样品覆盖在具有纤维基质的载片上，所述纤维基质包含玻璃纤维，其中用于检测所述样品中的一种或多种靶染色体序列的荧光标记的合成DNA寡核苷酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上。所述寡核苷酸探针包含与所述一种或多种靶染色体序列中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。优选地，所述寡核苷酸探针是染色体特异性的探针。在一个实施方式中，所述寡核苷酸探针具有约20至约50个核苷酸的长度，更优选具有约30个核苷酸的长度。

所述方法还包括使用水化缓冲液将所述基质水化以从所述基质释放所述探针。在特定实施方式中，所述水化缓冲液包含甲酰胺、硫酸葡聚糖和盐(例如，柠檬酸钠盐水(SSC))。优选地，所述水化缓冲液包含约30％甲酰胺、约10％至约20％硫酸葡聚糖和约2×SSC。在另一个实施方式中，所述水化缓冲液包含碱(例如，NaOH)并具有在约10至约13范围内的pH值。

所述方法还包括将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与所述样品中的所述靶染色体序列(如果存在)特异性杂交的严格条件下孵育。所述探针与所述靶染色体序列特异性杂交的适合条件可以由本领域技术人员确定，并包括，例如，在包含2×SSC、30％甲酰胺和10-20％硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中在37℃下杂交5-10分钟。其他优选的杂交条件包括在包含6mMNaOH、30％甲酰胺和20％硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中在室温下杂交5-10分钟。优选地，用于水化纤维基质的水化缓冲液也用作杂交缓冲液。在一个实施方式中，杂交在升高的温度(例如，37℃)下进行。在替代的实施方式中，杂交在室温下进行。

计数染色体的方法还包括洗涤所述样品以除去未杂交的探针和非特异性杂交的探针，和通过检测与所述样品中的靶染色体序列杂交的标记核酸探针来计数所述样品中具有靶染色体序列的染色体的步骤。可以如本文所述的对于用于确定目标核酸是否存在于生物样品中的方法中进行洗涤和检测。

用于检测目标核酸的试剂盒

在另一个实施方式中，本发明涉及用于检测样品中的目标核酸的试剂盒。所述试剂盒包括包含用于检测目标核酸的标记核酸探针的干燥纤维基质，和用于从所述基质释放所述探针的水化缓冲液。所述标记核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，并且包含与所述目标核酸中的一个或多个核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。

所述干燥纤维基质可以由天然存在的纤维或合成纤维组成。所述纤维可以是纺织纤维或非纺织纤维。示例性的纤维包括，但不限于，玻璃纤维、羊毛纤维和植物纤维。在优选实施方式中，所述纤维是玻璃纤维。在另一个实施方式中，所述纤维基质包含纤维素基材料(例如，纤维素纤维)。适合的纤维素基材料包括，但不限于，纤维素、硝基纤维素、羧甲基纤维素、人造丝和粘胶纤维。

所述干燥纤维基质包括包含与目标核酸中的目标序列基本上互补的目标结合区域的核酸(例如，DNA、RNA)探针。所述核酸探针嵌入所述干燥纤维基质中或吸附到其上。优选地，所述探针是染色体特异性的探针。

在本发明所述方法中使用的适合的探针包括，但不限于，DNA探针、RNA探针、肽核酸(PNA)探针、锁核酸(LNA)探针、吗啉代探针、二醇核酸(GNA)探针和苏糖核酸(TNA)探针。这些探针可以是化学或生物化学修饰的和/或可含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。例如，探针可含具有经修饰的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)和/或经修饰的糖基(例如，2’O-甲基核糖基、2’O-甲氧基乙基核糖基、2’-氟核糖基、2’-氨基核糖基)的修饰核苷酸。虽然优选的是线性探针，但是可用的探针可以是环状的或是支化的和/或包括能够形成稳定二级结构(例如，茎-和-环和环-茎-环发夹结构)的结构域。

优选地，所述探针是寡核苷酸探针。适合的寡核苷酸探针通常具有约20到约100个核苷酸的长度，优选约20至约50个核苷酸的长度，并且更优选约30个核苷酸的长度。优选地，本发明试剂盒中的寡核苷酸探针是单链DNA探针。

在某些实施方式中，本发明试剂盒中的探针是被标记的(例如，包含一种或多种可检测标记)。用于探针的示例性的可检测标记在本文中描述。优选地，本发明试剂盒中的寡核苷酸探针包含一种或多种荧光团(例如，荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、Cy3、Cy5、Alex532、Alexa546、Alexa568或Alexa594)。

在一些实施方式中，所述纤维基质载有多种不同的标记探针。在这样的实施方式中，每个探针对特定目标核酸是特异性的，并且包含区别于其他探针上存在的对于其他目标核酸具有特异性的可检测标记。例如，每种探针可包含具有可光谱区分的发射波长的荧光团。适用于具有多种不同标记探针的本发明试剂盒的荧光团包括，例如，Alexa488(在492nm处具有最大激发和在520nm处具有最大发射)和Alexa546(在555nm处具有最大激发和在570nm处具有最大发射))。

在一些实施方式中，所述干燥纤维基质包括嵌入所述基质中或吸附到其上的一种或多种附加试剂。这样的附加试剂包括，例如，鲑鱼精DNA、封闭试剂(例如，乳(例如，脱脂乳)、白蛋白、酪蛋白)和抗微生物剂(例如，叠氮化钠、硫柳汞)或其组合。

本发明所述试剂盒还包括水化缓冲液。在一些实施方式中，所述水化缓冲液也作为杂交缓冲液起作用。在特定实施方式中，所述水化缓冲液包含甲酰胺、硫酸葡聚糖和盐(例如，柠檬酸钠盐水(SSC))。所述水化缓冲液中甲酰胺的适合浓度包括，例如，在按体积计约20％至约90％范围内的浓度，例如，按体积计约60％、约70％或约80％。所述水化缓冲液中硫酸葡聚糖的适合浓度包括，例如，约3％至约20％。所述水化缓冲液中总盐浓度优选在约0.03M至约0.09M的范围内。例如，所述水化缓冲液中SSC的浓度可以是，例如，在约0.1X至约4.0X的范围内。优选地，所述水化缓冲液包含约30％甲酰胺、约10％至约20％的硫酸葡聚糖和2×SSC。

在另一个实施方式中，所述水化缓冲液包含碱(例如，NaOH)，并且具有在约10至约13范围内的pH值。当杂交在室温下进行时，包含碱的水化缓冲剂是特别有利的。在所述水化缓冲液中使用的适合的碱包括，但不限于，氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化铯、氢氧化钠、氢氧化锶、氢氧化钙、氢氧化锂、氢氧化铷、氢氧化镁、丁基锂、二异丙基氨基锂、二乙基氨基锂、氨基钠、氢化钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂、碳酸钠和氨水或其组合。优选地，所述碱是强碱。更优选地，所述碱是氢氧化钠。所述水化缓冲液的碱的适合浓度通常在约0.03当量浓度(N)至约0.17N的范围内，例如，约0.05N、约0.06N、约0.07N、约0.08N、约0.09N或约0.1N。在特定实施方式中，所述溶液包含约0.07N的NaOH，其等同于0.07MNaOH。

在一些实施方式中，试剂盒可包括附加的、任选的组分，例如，变性缓冲液(例如，包含NaOH和醇的缓冲液)、洗涤缓冲液、第二检测试剂、染色体DNA的染色剂、抗褪色剂、说明书、实验方案或其组合。通常，所述试剂盒是区室化的以便于使用，并且可包括一个或多个装有试剂的容器。在一个实施方式中，所有试剂盒组分包装在一起。或者，所述试剂盒的一种或多种单独组分可以在与其他试剂盒组分分开的独立包装中提供(例如，水化缓冲液可以与纤维基质分开包装)。

在一些实施方式中，本发明的试剂盒包括变性缓冲液，其包含碱(例如，NaOH)和醇。所述变性缓冲优选包括约0.03N至约0.17N的碱，例如，约0.05N、约0.06N、约0.07N、约0.08N、约0.09N或约0.1N的碱。优选地，所述变性缓冲液包含约0.07N的NaOH(即，0.07M的NaOH)。在变性缓冲液中使用的示例性的碱包括，例如，氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化铯、氢氧化钠、氢氧化锶、氢氧化钙、氢氧化锂、氢氧化铷、氢氧化镁、丁基锂、二异丙基氨基锂、二乙基氨基锂、氨基钠、氢化钠、双(三甲基硅烷基)氨基锂、碳酸钠和氨或其组合。优选地，所述碱是碱金属碱。更优选地，所述碱是氢氧化钠。所述变性缓冲液还包括至少一种醇，其浓度为按体积计约50％至约90％，例如，按体积计约60％、约70％或约80％。优选地，所述醇以按体积计约70％的浓度存在。在所述变性缓冲液中使用的示例性的醇特别地包括，例如，乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇和异戊醇，或其混合物。在特定实施方案中，所述变性缓冲液包含约70％的乙醇。

本发明的试剂盒可任选地包括一种或多种洗涤缓冲液。通常，所述一种或多种洗涤缓冲液各自包含最终浓度为约0.03M至约0.09M的一种或多种盐(例如，钠盐、锂盐或钾盐)。在特定实施方式中，所述洗涤缓冲液包括柠檬酸钠和氯化钠。所述洗涤缓冲液还可以包含洗涤剂，其包括，但不限于，十二烷基硫酸钠(SDS)。所述洗涤缓冲液中SDS的适合浓度通常在约0.01％至约1.0％SDS的范围内，优选约0.1％SDS。另外，本发明试剂盒中的洗涤缓冲液可任选地包括甲酰胺。在一个实施方式中，所述试剂盒包括包含1.864mMNaOH和2×SSC的洗涤缓冲液。

任选地，本发明的试剂盒中可包括用于检测标记探针的一种或多种试剂。这样的试剂或其他本领域技术人员公认用于检测分析中的成分对应于探针上标记的类型。在一个实施方式中，所述试剂盒包括用于检测探针上的间接标记的第二试剂(例如，标记有荧光团的抗生物素蛋白链菌素)。

本发明的示例实施方式描述如下

实施例：使用纤维基质上的核酸探针进行的原位杂交法

材料和方法：

制备包含在纤维基质上的探针的组合物

使用1/2”打孔器切割Qualitative1(纤维素)和GF/A(玻璃纤维)Whatman过滤圆片。对于染色体3、6、7和20特异性的未稀释的寡核苷酸探针的混合物以6-9μL体积沉积在每种类型圆片的中央。在烘箱中在60℃下加热圆片30分钟。在室温下避光储存圆片。

在原位杂交之后检测包含上皮细胞的生物样品中的目标核酸

来自外周血细胞的细胞遗传学载片在室温下使用等温变性溶液(Cellay，Inc，Cambridge，MA)变性10分钟，然后在85％和100％的醇中各脱水1分种，并晾干。如上所述制备具有嵌入的探针的纸圆片并放置在各个载片的期望杂交区域中的细胞上。在盖玻片下在杂交溶液(10％葡聚糖、30％甲酰胺、2×SSC)中在37℃下使用非嵌入探针进行杂交，或者在室温下使用嵌入滤纸圆片的探针进行杂交，所述滤纸圆片在包含20％葡聚糖、30％甲酰胺、6.0mMNaOH的杂交缓冲液中水化。对于室温方法，使用巴氏移液管在每个纸圆盘的顶部加入适当体积的在水中稀释的杂交缓冲液。然后在37℃加热载片10分钟，或者在室温下放置载片10分钟。在杂交之后，在2×SSC中在室温下伴随搅拌洗涤载片5分钟以除去圆片，然后在等温洗涤溶液(Cellay，Inc，Cambridge，MA)中在室温杂交下洗涤5分钟以除去未杂交的和非特异性杂交的探针。载片在2×SSC中简单冲洗并在用抗褪色剂、DAPI和盖玻片封片之前干燥。封片的载片在被分析之前在载片支架上放置至少10分钟。

统计

在测量各荧光体的信噪比后，将信噪比平均，并如下计算在95％置信水平的平均值的标准误差：

其中，对于95％置信水平，z＝1.96，SD＝标准偏差，n＝细胞数(200)。

结果

使用上文所述的程序，嵌入滤纸圆片的染色体特异性探针组被成功地用于原位杂交程序以检测人外周血细胞中的染色体特异性目标核酸(图1A和1B)。当分别在升高的温度(37℃)下使用非嵌入探针进行杂交或者在室温下使用嵌入滤纸圆片的探针进行杂交时，这些方法产生了类似的结果(图2；将升高的温度(蓝色，对照)与室温(绿色，圆片)比较)。

本文中引用的所有专利、公布的申请和参考文献的相关教导通过引用以它们的整体引入。

虽然已参考其示例性实施方式具体地示出并描述本发明，但本领域技术人员将理解，在不背离所附权利要求所涵盖的本发明范围的情况下，可在其中进行形式和细节上的各种改变。

Claims

1.确定目标核酸是否存在于固体表面上的生物样品中的方法，其包括以下步骤：

a)将所述固体表面上的样品与干燥的纤维基质接触，其中用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或多个不同核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；

b)将所述基质水化以从所述基质释放所述探针；

c)将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与如果存在于所述样品中的所述目标核酸特异性杂交的严格条件下孵育；

d)洗涤所述样品以去除未杂交的和非特异性杂交的探针；和

e)通过测定所述标记的核酸探针是否与所述样品杂交来确定所述目标核酸是否存在于所述样品中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维基质包含玻璃纤维、羊毛纤维、合成纤维或植物纤维。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述纤维基质包含纤维素基材料。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述纤维素基材料选自纤维素、硝基纤维素、羧甲基纤维素、人造丝或粘胶纤维。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中选自鲑鱼精DNA、封闭试剂和抗微生物剂或其组合的一种或多种附加试剂嵌入所述基质中或吸附到其上。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤b)中将包含约30％甲酰胺、约10％至约20％硫酸葡聚糖和2×SSC的水性杂交缓冲液加入到所述基质中以水化所述基质。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述标记的核酸探针是DNA寡核苷酸探针。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约20至约50个核苷酸的长度。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约30个核苷酸的长度。

10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针是合成产生的。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述标记的核酸探针包含至少一个直接标记。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述直接标记是荧光体。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生物样品结合或粘附到所述固体载体。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含上皮细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述上皮细胞选自尿路上皮细胞和外周血细胞或其组合。

16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含选自精细胞、卵母细胞、极体、卵裂球和囊胚或其组合的细胞。

17.根据权利要求1-5和7-16中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤c)在约19摄氏度至约25摄氏度范围内的温度下进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤b)中将包含约1.0-5.0mMNaOH并具有在约10至约13范围内的pH值的杂交缓冲液加入到所述基质中以水化所述基质。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述生物样品被固定在玻璃载片上。

20.一种计数固定在载片上的细胞样品中的染色体的方法，其包括以下步骤：

a)将所述样品覆盖在具有纤维基质的载片上，所述纤维基质包含玻璃纤维，其中用于检测所述样品中的一个或多个靶染色体序列的荧光标记的合成DNA寡核苷酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述探针包含与所述一个或多个靶染色体序列中的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；

b)使用杂交缓冲液将所述基质水化以从所述基质释放所述探针；

c)将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与如果存在于所述样品中的所述靶染色体序列特异性杂交的严格条件下孵育；

d)洗涤所述样品以去除未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和

e)通过检测与所述样品中的所述靶染色体序列杂交的标记核酸探针来计数所述样品中具有所述靶染色体序列的染色体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述严格条件包括将所述样品与所述探针在约19摄氏度至约25摄氏度范围内的温度下孵育。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中选自鲑鱼精DNA、封闭试剂和抗微生物剂或其组合的一种或多种附加试剂嵌入所述基质中或吸附到其上。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约30个核苷酸的长度。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述细胞是上皮细胞、精细胞、卵母细胞、极体、卵裂球或囊泡或其组合。

25.用于检测样品中的目标核酸的试剂盒，其包含：

a)包含用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针的干燥纤维基质，其中所述标记的核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或多个核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；

b)用于从所述基质释放所述探针的水化缓冲液。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述纤维基质包含玻璃纤维、羊毛纤维、合成纤维或植物纤维。

27.根据权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述纤维基质包含纤维素基材料。

28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述纤维素基材料选自纤维素、硝基纤维素、羧甲基纤维素、人造丝或粘胶纤维。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的试剂盒，其中选自鲑鱼精DNA、封闭试剂和抗微生物剂或其组合的一种或多种附加试剂嵌入所述基质中或吸附到其上。

30.根据权利要求25-29中任一项所述的试剂盒，其中所述水化缓冲液包含约30％甲酰胺、约10％至约20％硫酸葡聚糖和2XSSC。

31.根据权利要求25-29中任一项所述的试剂盒，其中所述水化缓冲液包含约1.0-5.0mMNaOH并具有在约10至约13范围内的pH值。

32.根据权利要求25-31中任一项所述的试剂盒，其中所述标记的核酸探针是合成DNA寡核苷酸探针。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约20至约50个核苷酸的长度。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约30个核苷酸的长度。

35.根据权利要求25-34中任一项所述的试剂盒，其中所述标记的核酸探针包含至少一个荧光标记。