CN102533955A - 一种肽核酸探针、含有该肽核酸探针的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种肽核酸探针、含有该肽核酸探针的组合物及其用途。具体而言，所述肽核酸探针带有可检测的标记，并且所述肽核酸探针的碱基序列为SEQ ID NO：1中或SEQ ID NO：2中连续的10-20个碱基。本发明还涉及含有该肽核酸探针的组合物、用于检测分枝杆菌的检测剂、用于检测分枝杆菌的试剂盒、一种原位杂交方法、一种检测分枝杆菌的方法、所述肽核酸探针在制备检测分枝杆菌的试剂中的用途、以及所述肽核酸探针在制备检测结核病的试剂中的用途。本发明的肽核酸探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测分枝杆菌和结核分枝杆菌复合菌群。

Description

一种肽核酸探针、含有该肽核酸探针的组合物及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种肽核酸探针，具体地，涉及一种用于检测分枝杆菌特别是结核分枝杆菌复合菌群的肽核酸探针。本发明还涉及含有该肽核酸探针的组合物、用于检测分枝杆菌的检测剂、用于检测分枝杆菌的试剂盒、一种原位杂交方法、一种检测分枝杆菌的方法、所述肽核酸探针在制备检测分枝杆菌的试剂中的用途、以及所述肽核酸探针在制备检测结核病的试剂中的用途。

背景技术

结核病是一种经呼吸道传播的慢性传染病，主要由结核分枝杆菌复合菌群(Mycobacterium tuberculosis Complex，MTC)引起，其中最主要的是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

目前临床上检测结核分枝杆菌最常用的方法是涂片染色镜检法，包括抗酸(Ziehl-Neelsen)染色法和荧光染色法。涂片染色镜检法优点是简单、快速、成本低，缺点是灵敏度低，例如当样本内含菌量少时，往往容易得出假阴性结果。

由于涂片染色镜检法灵敏度低，所以涂片阴性的样本还要继续使用分离培养法(罗氏培养法)进行进一步确定。分离培养法的结果相对可靠，特异性高，是目前结核病诊断的金标准。但是由于结核分枝杆菌的生长速度缓慢，大约需要4到8周才能得出结果，不利于对患者作出快速诊断和及时治疗。而如果使用结核菌快速培养仪，可以缩短一些培养时间，不过仪器价格昂贵，还需要专门进口专利的培养基，费用较高。

此外，PCR方法也被引入结核分枝杆菌的检测领域。这种方法可以在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加，在此基础上进行探针杂交，提高了检出的灵敏度和特异性。但是缺点是非常容易出现假阳性。并且由于样本中有可能有如血色素等抑制剂的存在导致出现假阴性的情况，所以限制了PCR方法的临床应用。

肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)是一类具有类多肽骨架的DNA类似物，由聚N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架，四种碱基通过亚甲基羰基与骨架相连。由于肽核酸是一种不带电荷的中性分子，它可以高度亲和并序列特异地与DNA或RNA结合形成稳定的复合体，形成的杂交复合物具有相当高的热稳定性以及独特的耐离子强度变化的性质，并且不易被核酸酶和蛋白酶所降解。

已经有文献报导了两种检测结核分枝杆菌的肽核酸探针(Stenderet al.，Fluorescence In situ hybridization assay using peptidenucleic acid probes for differentiation between tuberculous andnontuberculous mycobacterium species in smears ofmycobacterium cultures.J Clin Microbiol.，1999，37(9)：2760-2765；Lefmann et al.，Evaluation of peptide nucleicacid-fluorescence in situ hybridization for identification ofclinically relevant mycobacteria in clinical specimens andtissue sections.J Clin Microbiol.2006；44(10)：3760-3767.)，但是这两种探针杂交后的信号偏弱。部分可能的原因是探针序列的特异性不是很好，以及未使用连接器(linker)将荧光素基团与PNA链间隔开，造成PNA链与靶序列结合时存在空间位阻效应，影响杂交效率。

发明内容

本发明人经过大量的实验和创造性的劳动，出乎意料地发现了一种信号强度高并且特异性好的肽核酸探针，其可以有效、快速地检测分枝杆菌特别是结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合菌群。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种肽核酸探针，其碱基序列为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2中连续的10-20个碱基；具体地，为连续的13-18个碱基，更具体地，为连续的14-17个碱基，进一步具体地，所述肽核酸探针的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：1-3的碱基序列如下所示：

5’-TGGCCTATCCTGGTGCCCTACGTACAGAACACCACCTTTCGCG-3’(SEQ IDNO：1)；

5’-GCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTGGTCCTATCCGGT-3’(SEQ IDNO：2)；

5’-TCCTGGTGCCCTACG-3’(SEQ ID NO：3)。

在本发明的一个实施方案中，所述肽核酸探针的碱基序列的5’端或3’端连接有一个或多个赖氨酸，具体地，为1个赖氨酸。所述赖氨酸可以通过连接器(linker)与肽核酸序列相连接，所述连接器可以是O-linker、E-linker、X-linker、或AEEEA-linker以及根据特殊用途(如提高或降低疏水性以及针对硫醇化PNA)而设计的linker。

O-linker结构式如下：

E-linker结构式如下：

X-linker结构式如下：

AEEEA-linker结构式如下：

在本发明的一个实施方案中，所述肽核酸探针带有可检测的标记，具体地，为荧光标记，包括但不限于，例如TAMRA(如6-TAMRA)、FITC、FAM或Cy3等等。所述可检测的标记或者荧光标记可以通过赖氨酸(Lys)和/或连接器与PNA链相连，标记或者荧光标记也可直接与PNA链相连。所述可检测的标记或荧光标记可以根据现有技术进行添加，例如参考文献

et al.，Multiplex FISH and three-dimensionalDNA imaging with near infrared femtosecond laser pulses.Histochem Cell Biol.2000；114(4)：337-345。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其含有本发明的肽核酸探针。

本发明的再一方面涉及一种分枝杆菌检测剂，其含有本发明的肽核酸探针。

本发明的再一方面涉及一种用于分枝杆菌检测的试剂盒，其含有本发明的肽核酸探针。

本发明的再一方面涉及一种原位杂交方法，包括使用本发明的肽核酸探针的步骤。

本发明的再一方面涉及一种检测分枝杆菌的方法，包括使用本发明的肽核酸探针的步骤。

本发明的再一方面涉及本发明的肽核酸探针用于检测分枝杆菌的用途。

本发明的肽核酸探针能够用于检测的样本范围广泛，包括但不限于，例如：痰、咽拭子、胃灌洗液、支气管灌洗液、活体组织、吸引物、咳出物、体液(脊髓、胸腹水、心包液等)、血液、脓液、骨髓、尿液、组织切片、食物样本、来自土壤、空气和水的样本、以及它们的培养物。这些样本经相应处理后，原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使用本发明的肽核酸探针检测。这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的，例如：

痰：痰液涂片法；

脓液：同痰液涂片法；

病灶组织或干酪快等：先用组织研磨器磨碎后再行涂片；

尿液：留全量夜尿，静置4-5h后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，离心30min，取沉渣涂片；

胸、腹水标本：参照尿液涂片法；

脑脊液：无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。

本发明的再一方面涉及本发明的肽核酸探针在制备检测分枝杆菌或者结核分枝杆菌复合菌群的试剂中的用途。结核分枝杆菌复合菌群包括人型、牛型、非洲、以及田鼠的分枝杆菌，其中人型和牛型占引起结核病的绝大部分。

本发明的再一方面涉及本发明的肽核酸探针在制备检测结核病的试剂中的用途。

本发明中所述的分枝杆菌，具体地，是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(M.bovis BCG ATCC 35734)，更具体地，所述结核分枝杆菌是M.tuberculosisH37Rv或M.tuberculosis H37Ra)。

发明的有益效果

本发明的肽核酸探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合菌群。

附图说明

图1：本发明的肽核酸探针样品1检测结核病人痰标本的结果。

图2：对照探针1的肽核酸探针检测结核病人痰标本的结果。

图3：对照探针2的肽核酸探针检测结核病人痰标本的结果。

图4：本发明的肽核酸探针样品1检测结核分枝杆菌(M.tuberculosis H37Rv)的结果。

图5：本发明的肽核酸探针样品1检测结核分枝杆菌(M.tuberculosis H37Ra)的结果。

图6：本发明的肽核酸探针样品1检测牛分枝杆菌(M.bovis BCGATCC 35734)的结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：肽核酸探针样品1的制备

按照SEQ ID NO：3所示的碱基序列，委托上海科肽公司合成肽核酸探针样品1。其中，连接器为O-linker，连接在碱基序列的5’端，碱基序列与O-linker之间连接有一个赖氨酸(lys)。荧光标记是6-TAMRA，所述荧光标记连接在lys上。制得的肽核酸探针样品1的结构如下所示：

(6-TAMRA)-lys-(O-linker)-TCCTGGTGCCCTACG。

实施例2：对照探针1和对照探针2的制备

按照Stender et al.，1999中公开的技术方案，制得对照探针1。

按照Lefmann et al.，2006中公开的技术方案，制得对照探针2。

实施例3：三种方法检测痰样本的试验

结核病患者的痰样本中通常含有结核分枝杆菌复合菌群。下面是本实施例使用实施例1制备的肽核酸探针样品1，通过PNA FISH方法检测111份痰样本(获自不同的对象，包括结核病患者和正常人)的实验方法及结果。同时作为比较的有常规的抗酸染色方法以和罗氏培养法检测同样的111例痰样本的实验方法及结果。

一、PNA FISH检测

1.试剂准备

杂交液的配方如下：

10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％～60％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚蔗糖，5mM Na₂EDTA，0.1％(v/v)Triton X-100，50mM Tris/HCl(pH 7.5)，200-800nM肽核酸探针。

洗脱液的配方如下：

5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100(pH 10)。

2.实验方法

1)吸30μl痰液和30μl磷酸缓冲液(pH 7.0)，滴入镀Teflon载玻片的凹槽内混匀，80℃烤20min。

2)载玻片凹槽内滴入50μl杂交液，小心放上盖玻片避免出现气泡；

3)置于带湿盒的温箱内55℃杂交90min；

4)玻片浸泡在预热的55℃洗脱液中小心晃下盖玻片；

5)水浴中55℃洗脱30min，取出玻片于空气中晾干；

6)滴上一滴支持液，盖上盖玻片，荧光显微镜60-100倍油镜观察。

二、抗酸染色法检测

1.检测原理

结核分枝杆菌含脂质多，不易着色，先用石炭酸复红初染，染色时间要稍长，且需要加温。一旦细菌染上颜色，由于脂质的存在，即使强脱色剂也不能使之脱色，其它细菌均脱色，经碱性美兰复染，所以结核分枝杆菌呈红色，其它呈蓝色.

2.实验方法

取痰液→涂片(略厚)→干燥→固定→5％石炭酸复红染色30分钟(冷染)后→用3％的盐酸酒精脱色约1～2分钟，脱色时轻摇玻片，直到涂片颜色脱去为止→水洗后，用碱性美蓝复染1分钟→水洗，待干→镜检。抗酸杆菌呈红色(+)，其他细菌和背景物质为蓝色(-)。

三、罗氏培养法

1.实验方法

选用改良的Lowenstein-Jensen培养基，将处理过的痰液进行CO₂培养。具体为取痰标本1mL加2％氢氧化钠2～4mL，室温30min，其间振荡2～3次，促痰液化。取消化后痰液混匀，以灭菌刻度毛细吸管取0.1mL.缓缓均匀地接种每支培养基斜面上，每份痰标本接种二支培养基，接种毕，放37℃孵箱内培养。接种后应每周观察细菌生长情况，阳性生长经涂片染色验证后随时报告，培养至8周未见细菌生长，报告为培养阴性。

四、三种检测方法的结果及分析

1.结果

将111份痰样本的检测结果分成5种情形，如下面的表1所示。

表1：三种方法检测的结果

检测结果情形分类	PNA FISH	抗酸染色	罗氏培养	样本数
					1	+	+	+	26
2				53
					3	+		+	25
4	+	+		5
					5			+	2
合计			53	111

2.结果分析

以罗氏培养为金标准，抗酸染色和PNA FISH的阳性检出率分别为49％(26/(26+25+2))和96％((26+25)/(26+25+2))。

可见，本发明的肽核酸探针检测的结果是罗氏培养法的96％，较为准确，并且检测的时间显著缩短，提高了检测效率。

本发明的肽核酸探针的检测信号强度高，特异性好，图1示出了其中一个结核病人痰样本的检测结果。

注：经过病例追溯，第5种情形的5例是服药一段时间后复诊留的痰样，染色阳性培养阴性的结果可能是体内菌已无活力，但细菌形态和核酸仍未被破坏，故PNA FISH杂交结果仍为阳性。

实施例4：使用对照探针1进行痰样本检测的实验

按照与实施例3中的PNA FISH检测部分类似的方法进行，所用痰样本源自同一结核病人，不同之处在于所用探针为对照探针1。

结果如图2所示。从图2可见，与本发明的肽核酸探针的检测结果(图1)相比，对照探针1的信号强度偏弱，信号的特异性也不好。

实施例5：使用对照探针2进行痰样本检测的实验

按照与实施例3中的PNA FISH检测部分类似的方法进行，所用痰样本源自同一结核病人，不同之处在于所用探针为对照探针2。

结果如图3所示。从图3可见，与本发明的肽核酸探针的检测结果(图1)相比，对照探针2的信号强度偏弱，信号的特异性也不好。

实施例6：使用肽核酸探针样品1检测分枝杆菌标准菌株

用接种环挑取在改良罗氏培养基上生长的分枝杆菌标准株(购自ATCC)，分别于200μl磷酸缓冲液(pH7.2)中稀释后，吸取40μl滴入凹槽制备玻片。除了被检测的样本不同，具体操作方法参见实施例3中的PNA FISH检测部分。检测结果如下面的表2所示。

表2：肽核酸探针样品1检测分枝杆菌标准菌株的结果

注：+，阳性结果，指杂交后在荧光显微镜下能观察到分枝杆菌；-，阴性结果。

表2中三种阳性检测结果如图4-6所示。结果显示本发明的肽核酸探针能够检测结核分枝杆菌(M.tuberculosisH37Rv和M.tuberculosisH37Ra)和牛分枝杆菌(M.bovis BCG ATCC 35734)，并且检测的信号强度高，特异性好。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种肽核酸探针，其带有可检测的标记，其特征在于，所述肽核酸探针的碱基序列为SEQ ID NO：1中或SEQ ID NO：2中连续的10-20个碱基；具体地，为连续的13-18个碱基，更具体地，为连续的14-17个碱基，进一步具体地，所述肽核酸探针的碱基序列如SEQID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的肽核酸探针，其碱基序列的5’端或3’端连接有一个或多个赖氨酸。

3.根据权利要求2所述的肽核酸探针，其中，所述赖氨酸通过连接器与肽核酸序列相连接，所述连接器选自O-linker、E-linker、X-linker、以及AEEEA-linker；所述可检测的标记为荧光标记。

4.一种组合物，其含有权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针。

5.一种分枝杆菌检测剂，其含有权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针。

6.一种用于分枝杆菌检测的试剂盒，其含有权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针。

7.一种检测分枝杆菌的方法，包括使用权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针的步骤。

8.一种原位杂交方法，包括使用权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针的步骤。

9.权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针在制备检测分枝杆菌的试剂中的用途。

10.权利要求1至3中任一项所述的肽核酸探针在制备检测结核病的试剂中的用途。

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