JPS58126784A - リン病の診断テスト法、リン菌のテスト用株およびテストキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリン病の診断テスト法、ナイセリアゴ７　ｏ　
−工７　（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
ｅ　、リン菌）のテスト用株およびテストキットに関す
る。

リン病の標準的な診断はリン菌を分離し、ついで、コロ
ニーの形態、鏡検、生化学的テストまたは血清学的テス
ト番こよりリン菌を同定することに基（（ＫｅＨｏｇ、
Ｊｒ、ｅｔ　　ａｌｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｄｉａ
ｇｏ−ｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、　Ｃｕ
ｍ１ｔｅｃｈ、　Ａｍｅｒ、Ｓｏｃ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９７６　）。

ダラム染色試験がリン菌性尿道炎の診断テストに使用で
きるが、この技術は頚部、直腸部または口腔咽頭部の感
染の検出に対しては感度を欠く。

血清学的テストまたは直接螢光抗体染色法のような他の
診断法はその有効性がまた確立されていない。

リン菌は比較的速かに生育性を喪失するので、リン菌を
分離する最良の方法はできるだけ迅速に検体を培養する
ことである。これには、接種した培地を炭酸ガス雰囲気
中３５°〜３７°Ｃにてインキュベートすることが必要
で、そのため特別な装置を要する。適当な装置が入手し
えない場合には、検体をアミニス（Ａｍ１ｅｓ　）もし
くはスチュアート（５ｔｕａｒｔ　’）の輸送培地また
はトランスゲロウ（Ｔｒａｎｓｇｒｏｗ　）のような輸
送増殖培地に入れ研究所に送ることができる（　Ｍａｒ
ｔｉｍ、　Ｌｅｓｔｅｒ、　Ｈ５ＭＨＡＨｅａｌｔｈ　
ｒｅｐ、　８６　：３０．１９７１　）。しかし、これ
ら後者の方法は、リン菌の検出に約９０〜９５％の感度
を示す直接培養法に匹敵するにはほど遠いものである（
　Ｓｃｈｍａｌ　ｙ　、　Ｍａｒｔ　ｉｎ　、　Ｊ　、
Ａｍ、Ｍｅｄ。

Ａｓ５ｏｃ、　２１０　：　３１２　、１９６９　；　
Ｃａｌｄｗｅｌｌ、　Ｐｒ１ｃｅ。

Ｐａｚｉｎ、　Ｃｏｒｎｅｌ　ｉｕｓ　、　Ａｍ、　Ｊ
、　０ｂｓｔｅｒ、Ｇｙｎｅｃｏｌ　。

１０９　：　４６３，１９７１　）。

１９７６年に形質転換テストが報告され、それは臨床的
単離物をリン菌と同定するのに使用できることから、リ
ン病の診断に貢献した（　Ｊａｎｉｋ。

Ｊｕｎｉ　、　Ｈｅｙｍ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　４　：　７１　；米国特許第３，９３０
，９５０号）。形質転換テストはリン菌ＤＮＡの検出に
基くもので、コロニーの単離に基く培養法に匹敵する。

予備的な実験室的研究では、該技術は、リン菌のコロニ
ー同定法にとって代りうる基本的技術であることがわか
った（Ｂａｗｄｏｎ、　Ｊｕｎｉ　、　Ｂｒｉ＊ｔ　、
　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　、　５：　
１０８　、１９７７　；　５ａｒａｆｉａｎ、　Ｙｏｕ
ｎｇ、　Ｊ、Ｍｅｄ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３　：　２９１　、１９８０
　）。しかし、ザ・センター・フォー・デジーズ・コン
トロール（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａ
ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　）と協同して臨床患者から得た
検体を用いて行なった実地試験では、該テストはリン病
感染の診断には感度がわるく、特異的でないことが判明
した。

と（Ｄ　’）：Ｌ＝　（Ｊｕｎｉ　）の形質転換テスト
はコロニーまたは検体中のリン菌からのＤＮＡがリン菌
のテスト用菌株の栄養欠損性（すなわち、このテスト用
菌株はある種の栄養源を与えない限り、ある特定のテス
ト培地上では増殖できない）を矯正する遺伝子を含むこ
とに基く。この株はリン菌ＤＮＡ（遺伝子）をそのゲノ
ムに取り込むことができ、かかる遺伝子により形質転換
され、該特定の培地上で増殖できるようになる。しかし
、もし、コロニーまたは検体中のリン菌およびテスト用
菌株が同じ栄養欠損性を有していると、杉林は形質転換
できず、該特定の培地上で増殖できず、したがって、コ
ロニーまたは検体からのリン菌Ｄ　Ｎ　Ａ（７）検出が
妨げられる。ヒトに感染するリン菌の種々の栄養変異株
の存在、が知られているため（Ｃｒａｗｆｏｒｄ。

Ｓｅｘ、”ｒｒａｎｓ、Ｄｉｓ、５　：　１６５．１９
７８　）、明らかなごとく、あらゆるテスト事情におけ
る種々の可能性を保証するためには、このジュニのテス
トで、　　は異なった栄養欠損性を有する一連のテスト
用菌株が必要となる。

ジュニのテストは２種類の培地を必要とするが、そのう
ちの１つは非常に特殊なものであって通常の診断テスト
実験室では入手できない。ＤＮＡ抽出技術には、テスト
用菌株に対して毒性限界となるような濃度の、ドデシル
硫酸ナトリウムのような界面活性剤の使用が必要である
。これは本質的に陽性であるべき結果を陰性にさせうる
。また、形質転換技術には該ＤＮＡとテスト用菌株をま
ず最初に所定時間インキュベートし、ついで該ＤＮＡ−
テスト用菌株混合物を特殊な培地上で副次培養する操作
が包含される。２４時間のインキュベーション後では、
このテスト結果は裸眼でわずかにみとめられる程度であ
る。陽性結果を示すコロニーの増殖を検出するのには顕
微鏡が必要となる（　Ｂａｗｄｏｎ　ｅｔａｌ、、　Ｊ
、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５　：１０８
゜１９７７）。

本発明者は、本発明の新規方法に従って使用することに
より、リン菌ＤＮＡの検出によってなされるリン病の診
断テストを正確に行なうことのできる新規なテスト用菌
株であるナイセリア・ゴノローエアＡＴＣＣ３１９５３
を見い出した。このテスト用菌株ＡＴｃｃａ　１９ｓ　
３はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）に寄託
されている。この新規なテスト用菌株は、リン菌にとっ
て至適と思われる条件でわずかに生育し、遺伝的組み換
えによって導入された抗生物質耐性遺伝子を有する。

本発明の方法は、（ａ）形質転換能のあるリン菌のテス
ト用菌株を調製し、（ｂ）患者の検体物質または純粋培
養、混合培養を問わずリン菌の疑のあるコロニーから、
リン菌を溶解させる塩基で処理してＤＮＡを抽出し、（
Ｃ）工程（ｂ）の抽出物のｐＨをテスト用菌株に対して
毒性のないｐｉ（に調整し、（ｄ）　ｐＨを調整した抽
出物をテスト用菌株に、リン菌の増殖に適した生物学的
培地に入れる前また後に作用させ、（ｅ）　ＩＪン菌の
増殖に至適な、かつ、テスト用菌株には抑制的な条件下
、リン菌の増殖に適した培地で該処理テスト用菌株を保
持し、ついで、（ｆ）該処理テスト用菌株の増殖を観察
する工程からなる。増殖が観察されることはリン菌ＤＮ
Ａの陽性検出を示す。

本発明はまた、本発明の方法を実行するためのテストキ
ットを提供するものである。このキットは生物学的培地
上または培地中、約３６℃でほとんど増殖しないリン菌
のテスト用菌株を包含し、また、所望により、該テスト
用菌株の増殖を支持することのできる生物学的培地、塩
基、酸、ｐＨ指示薬および必要な実験室装備ならびに材
料などのような該テストを行なうのに必要な他の要素を
含んでいてもよい。

本発明の新規方法はただ１つのテスト用菌株しか必要と
しない。この方法はヒト感染を引き起すすべてのリン菌
に共通な遺伝的特異性、すなわち約３６℃における増殖
能力に基く。本発明は通常のチョコレート培地のような
生物学的培地の使用を可能にする。塩基を用いてリン菌
ＤＮＡを抽出し、抽出物のｐｔ（をテスト用菌株に害の
なイＰ■シこ酸で調整することｌこより塩が形成される
が、これはテスト用菌株番こ対して毒性は示さない。こ
の方法は非常に簡単である。顕微鏡を使用せずに２７〜
４０時間で陽性結果がみとめられる。ザ　センター　フ
ォー・デジーズ・コントロールと協同シて行なった実地
試験では、本発明の新規な方法はリン病診断の培養法と
同様な感度と特異性を有することか判明した。

■、テスト用菌株ナイセリア・ゴノローエアＡＴＣＣ３
１９５３ 本発明の方法において使用する好ましいテスト用菌株で
あるナイセリア　ゴノローエアＡＴＣＣ３１９５３は約
３０Ｏ−約３７℃の温度範囲内Ｉこて炭酸ガス雰囲気中
チョコレート培地上でほとんど増殖しない。特に、この
テスト用菌株はリン菌にとって至適とみなされる条件、
すなわち通常のチョコレート培地上にて、炭酸ガス雰囲
気中３６℃前後の温度にてほとんど増殖しない。

また、このテスト用菌株は５〜１０μｙ／４４度のナリ
ジキシン酸に対して抵抗性があり、１０００μｙ　／　
Ｒ／　ａ度またはそれ以上のストレプトマイシンに対し
て抵抗性がある。ナイセリア・コリローエアＡＴＣＣ３
１９５３の分離のための変異操作および遺伝子組み換え
操作を以下に詳細に説明する。

化学変異誘発物質であるＮ−メチル−侵−二トローＮ−
二トロソグアニジンを最終濃度が２Ｓ１μ２／ｄとなる
ように、コロニータイプ１または２（Ｋｅｌｌｏｇ、　
Ｐｅａｃｏｃｋ、　Ｄｅａｃｏｎ、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｐ
ｉｒｋｌｅ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８５　＋　１２７４　、１９６
３　）から調製される通常の実験室で用いられるリン菌
株の約１０９細胞を含有すＣＣ緩衝液〔ディフコ社（Ｄ
ｉｒｃｏ。

Ｄｅｔｒｏｉ　ｔ　、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ、　）のプロ
テオース　ペプトンのようなペプトン１．５％、０．０
２８Ｍ二塩基性リン酸カリウムおよび０．００７Ｍ−塩
基性リン酸カリウムの水溶液）に加える。この変異誘発
物質−細胞懸濁液を３７℃の水浴中で３０分間インキュ
ベーションした後、該懸濁液を遠心分離して細胞をペレ
ット状にする。上清液を除去して変異誘発物質をすてる
。ペレットにした細胞をＣＣ緩衝液に再び懸濁する。二
度目の遠心分離を行ない、該ペレットを再ひＣＣ緩衝液
に懸濁する。ついで該懸濁液をＧＣ寒天培地（ペトリ皿
中）（培地１００ｄ中、最終濃度クルコース０．４）、
クルクミン０．０１ｙ、コカルボキシラーゼｏ、ｏ　ｏ
　００．２　ｙ。

Ｆｅ（ＮＯ３）３・９■１２００．０００５ｙを補足し
たＧＣ培地ベース（ＣＣ緩衝液、０．５％ＮａＣｒ、　
　０．１％コーンスターチ、１．０％寒天）に塗布する
。該ペトリ皿を３０℃にて一夜インキユベートし、つい
で３７℃にてさらに一夜インキユベートする。

小さいコロニーを取り出し、ＧＣ寒天培地上で３７℃に
て盛んに増殖する能力のないことを試験する。

このようにして、本発明の方法に有用と判断されるリン
菌の増殖不良変異株を分離し、特定の抗生物質耐性を有
するテスト用菌株を得るのに用いる。

抗生物質耐性遺伝子を以下の方法によりこの変異株に導
入する。

ＤＮＡを、５〜１０μｙ／ｗｚ濃度のナリジキシン酸に
対する耐性を与えるＮａｚ遺伝子を含むリン菌のＲＷ−
２株から抽出する（　ｗｈａｒｔｏｎ、　Ｚｕｂｒｚｙ
ｃｋｉ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２７　：　１５７９　
、１９７６　）。該ＤＮＡ抽出操作は、ＧＣ緩衝液中Ｒ
Ｗ−２株懸濁液（約Ｉ　Ｘ　１０’細胞／Ｗｌｌ含有）
ニ最終濃度カ０．　Ｉ　Ｎ　トなるように水酸化ナトリ
ウムを加えることにより行なわれる。ついで抽出物を塩
酸で中和する。

ＲＷ　　２ＤＮＡを含有する上記中性抽出物の０．２ｄ
を約１０−”　Ｍの塩化カルシウムを含むＧＣ緩衝液中
の該変異株の懸濁液１．８．ｆ（約ｌＸｌ０　”細胞／
−）に加える。ＤＮＡ−細胞混合物を３０℃の水浴中で
３０分間インキュベーションした後、該混合液の０．１
ｄづつをＣＣ寒天培地を含む６枚のべ）　ＩＪ皿の表面
に一様に塗布する。キャンドル・エクスチンクション・
ジャー（ｃａｎｄｌｅ　ｅｘｔｉｎ−ｃｔｉｏｎ　ｊａ
ｒ　）中で４時間ペトリ皿をインキュベーションした後
、ＣＣ寒天培地をペトリ皿から取り出し、１０μｇ／−
のナリジキシン酸を含むもう１つのＣＣ寒天培地層の上
に置く。その頂部にＤＮＡ−細胞混合物を有する二層の
寒天培地を炭酸ガス雰囲気中３０℃にて約４０時間イン
キュベートする。出現した多くのコロニー中、ナリジキ
シン酸耐性と思われるもの２０個を適当に選び、副次増
殖を行なう。この中から最も好適であるものを１個選ん
で、本発明方法に使用する。

上記と実質的同様の方法を用い、リン菌株２４３９２　
（Ｍａｉｅｒ、　Ｚｗｂｒｚｙｃｋｉ　、　Ｃｏｙｌｅ
、　Ａｎｔｉｍｏｃｒｏｂ。

Ａｇ、　Ｃｈｅｍｏ、７　：　６７６　、１９７５　）
　カラ抽出シタＤＮＡを用い、Ｎａｌ変異株にＳｔｒ遺
伝子を導入する。

２種の抗生物質、ナリジキシン酸（５〜ｌＯμｙ／ｖｉ
濃度にて）およびストレプトマイシン（１０００μ２／
ｄまたはそれ以上の濃度にて）に対して耐性を示す１４
個の分離物から、本発明の方法に使用するテスト用菌株
として最も好適であるナイセリア・ゴノローエアＡＴＣ
Ｃ３１９５３を選択した。

このテスト用菌株であるナイセリア・ゴノローエアＡＴ
ＣＣ３１９５３は、一般に、リン菌（ナイセリア・ゴノ
ローエア）の通常の株と同様の形態学的および生化学的
特徴を有する。

■、テスト用菌株の増殖および調製 テスト用菌株は、リン菌に好適な炭酸ガス雰囲気中、例
えば、キャンドル・エクスチンクション・ジャー、炭酸
ガス・インキュベーター、ガス−パック・システム（Ｇ
ａ５−Ｐａｃ　ｓｙｓｔｅｍ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　
Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　Ｍａｙｙ−１ａｎｄ）の
ような炭酸ガス発生装置中で３０℃にてＧＣ培地の表面
上で増殖させ、本発明方法の使用のために調製される。

一夜インキユベーションした後、寒天平板上のほとんど
のコロニーがコロニータイプ１および／または２　（Ｋ
ｅｌｌｏｇｇ、　Ｐｅａｃｏｃｋ、　Ｄｅａｃｏｎ、　
Ｂｒｏｗｎ。

Ｐｉｒｋｌｅ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８５　：
１２７４．１９６３）であるコロニー増殖域を滅菌綿棒
で取り出し、マクファーランド・スタンダード（Ｍａｃ
Ｆａｒｌａｎｄ　５ｔａｎ−ｄａｒｄ　）　４番または
５番（Ｌｅｎｎｅｔｔｅ、　Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ。

Ｔｉｕａｎｔ、　Ｍａｎｎｗａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１Ａｍｅｒ、ＳｏｃｏＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、、　９３３　、１９７４　）　ニ等し
い懸濁液を調製するために、１０〜２０％のグリセリン
を含むｌＯ〜２０ｄの容量のＧＣ緩衝液中ニ挿入スる。

コロニータイプ１また２の選択は、調製物中におけるテ
スト用菌株がその能力の至適状態、すなわち、形質転換
にとって必要なりＮＡの至適取り込み状態にあることを
確実にするために必要である。

本懸濁液を５ｄ＠づつ試験管に取り、順次−７０℃のフ
リーザー中に入れて必要な時まで保管する。

本発明方法にとって必要な時に、試験管を３７℃。

の水浴中に入れ該懸濁液を解かす。

新たに調製したテスト用菌株の懸濁液を用いてもよい。

この場合、懸濁液の濁度はマクファーランド１番の１／
４から４番までのいずれでもよい。

該懸濁溶媒は、グリセリンを含む必要はない。冷凍−解
凍したものおよび新たに調製したものが、本発明の方法
に使用するテスト用菌株の好ましい調製物である。

第３の別法としては、テスト用菌株の凍結乾燥調製物か
ら調製された懸濁液を使用することである。マクファー
ランド５番または６番の濁度の懸濁液を、大体、１．５
％ペプトン、０．０４％Ｌ−グルタミン酸、５％アルブ
ミン、５％血清、５％グリセリン、０，２％澱粉、０．
４％グルコース、ｌ。

％シヨ糖を含有する溶媒中で調製し、これを水酸化カリ
ウムでｐＨ約７．２に調製する。ついで該懸濁液を凍結
乾燥する。

凍結乾燥調製物をＧＣ緩衝液中で復元して、直ちに使用
するか、または、１００ｄ当り、グルコース０．４ノ、
グルタミン０．ｏｔｙ、コカルボキシラーゼ０．０００
０２ｇ１．Ｆｅ（ＮＯ３）３９Ｈ２０ｏ、ｏｏｏｓｙの
増殖補足物を含有するＧＣＣ緩衝液 中で復元する。後者の方法においては、復元された懸濁
液は使用前に、炭酸ガス雰囲気中、３０”Ｃにて４〜６
時間インキュベートする。凍結乾燥したテスト用菌株を
インキュベーションした後に用いると、より好ましい結
果が得られる。すなわち、陽性テストにおいて凍結乾燥
した調製物を直接使用するよりもコロニーが多くなる。

以上、寒天含有培地、ことに、ＣＣ寒天培地上でのテス
ト用菌株の増殖について述べたが、これはテスト用菌株
のその他の培地上または培地中での増殖を排除するもの
ではない。例えばフラスコまたは醗酵槽中の液体培地を
用いてもよい。また、グリセリンの有無にかかわらずＧ
Ｃ緩衝液を用いることは述べたが、生またば凍結乾燥し
たテスト用菌株の生育性を保つのに好適なその他の適当
な溶媒を排除するものでもない。さらに、テスト用菌株
の凍結乾燥において特定の溶媒に言及したが、他の好適
な溶媒を排除するものでもない。テスト用菌株か抗生物
質に対して耐性を示す場合、テスト用菌株を調製する際
に用いられるいずれの液体または固体の培地にその抗性
物質を添加することができる。例えば、ＡＴＣＣ３１９
５３株の凍結ロットに、ナリジキシン酸５μｙ／ｌｔお
よびストレプトマイシン１０００μｙ／ｄを加えておき
、該ロットを順次使用する際の汚染を防ぐことかできる
。

用心のために、通常、これらの抗生物質をＡ　Ｔ　ＣＣ
３１９５３株の懸濁液を調製するのに用いられるＧＣ緩
衝液にグリセロールの有無にかかわらず添加し、また該
テスト用菌株を凍結乾燥する溶媒にも加える。

■、油抽出よび中和 １）　Ｎ　Ａ抽出物の調製は患者の検体材料または疑い
のあるコロニーを、リン菌を分解する塩基中に入れ、つ
いで抽出時のＰＩＩを酸を用いてテスト用菌株に毒性を
示さないｐＨに調整することを包含する。変法として、
検体材料またはコロニーのＧＣ緩衝液中懸濁液を調製し
、ついて塩基および酸をその懸濁液に加えてもよい。い
ずれの場合でも、一般に、調製された抽出物は加熱され
る。好ましい塩基および酸は水酸化す）　ＩＪウムおよ
び塩酸である。

水酸化す）　ＩＪウムおよび塩酸溶液は市販の１゜Ｎｔ
たはＩＮ水酸化ナトリウム溶液および３７〜３８％また
はＩＮ塩酸溶液をＧＣ緩衝液で希釈して調製する。この
緩衝液中で水酸化す）　ＩＪウムおよび塩酸を希釈する
ことは重要な工程である。緩衝作用の効果は、ｐＨを６
．０以下または８．０以上に変化させずに水酸化ナトＩ
Ｊウムおよび塩酸の必装置より多少多くまたは少なく使
用できることである。このｐＨ範囲は形質転換テストに
おいてテスト用菌株にとって許容できるものである。水
酸化カリウムまたは水酸化アンモニウムでも水酸化ナト
リウムの代りに用いることができる。どのような塩基、
例えば、弱有機塩基でも水酸化す）　ＩＪウムの代りに
使用しつる。いずれの酸でも、弱有機酸でさえも塩基を
相殺するのに使用することができる。いずれの場合でも
原理は同じであって、すなわち、塩基はリン菌を分解し
てＤＮＡを遊離させるのに使用され、酸は抽出時のｐＨ
をテスト用菌株に対して毒性を示さないｐＨに調整する
のに用いられる。

ＧＣ緩衝液、水酸化す）　ＩＪウムおよび塩酸の置は種
々変化しうる。有用な組み合わせは次のとおりである。

０．ＩＮ水酸化ナトリウム０．２〜０．３１および０．
０５Ｎ塩酸０．３〜０．４　ｄ　；　０．Ｉ　Ｎ水酸化
ナトリウム０．５ＴｎＩ！および０．０５Ｎ塩酸０．６
〜０．８−；ＧＣ緩衝液０．５１１ｅ、　０．５　Ｎ水
酸化ナトリウム０、１〜０．２−および０．２〜０．４
　Ｎ塩酸０．２ｍｃ’；ＧＣ緩衝液０．５ｄ、０．４Ｎ
水酸化ナトリウムＱ、　ｌ　ｆＩｅおよび０．２Ｎ塩酸
Ｏ−１〜０．２　ｍｅ０原則はＣＣ緩衝液、水酸化ナト
ＩＪウムおよび塩酸の量をＤＮＡの希釈を最小限にする
のに充分少量であり、かつ、日常の実験室で都合よく用
いられるに充分な量に保持することである。また、ＣＣ
緩衝液は、後述する頚部のスワブ検体のサンプル抽出操
作に使用されるけれども、懸濁液溶媒としては必要とさ
れないことに注目すべきである。

調製されたＤＮＡがほぼ中性のｐＨであることを調べる
手段としては、フェノールレッドをその最終濃度ｏ、ｏ
ｏｓ％で塩基、酸、ＣＣ緩衝液またはそれらすべて中で
用いることである。これは、フェノールレッドをその他
の有効な濃度で使用することを排除するものではない。

また、この目的のためにその他の酸−塩基ｐＨ指示薬を
用いることを排除するものでもない。

酸−塩基抽出操作を行なった後、該抽出物を６０〜７０
℃に１０〜１５分間加熱する。７５℃程度の温度詔よび
３０分程度の時間は、結果に何ら明白な影響も及ぼさず
に使用される。リン菌の純粋培養では、リン菌が塩基処
理に対して非常に敏感なので、加熱操作は必要とされな
い。このことは、混合培養物や臨床検体中に見られるい
くつかの他の微生物には該当しない。加熱は塩基処理か
ら逃れた微生物を不活性化する。

検体またはコロニーの抽出時もしくは抽出後における汚
染をさらに防止するため、テスト用菌株にとって許容で
きる抗生物質をＧＣ緩衝液中ｊこ加える。抗生物質は同
様に塩基および酸に加えることもできる。同様に、本発
明の方法による有用な培地、溶媒のいずれのものにも、
抗生物質を加えることができる。テスト用菌株、ナイセ
リア・ゴノローエアＡＴＣＣ３１９５３を用いる場合は
、抗生物質はナリジキシン酸およびストレプトマイシン
を各々５μｙ　／　ｍｅおよび１０００μｙ　／　ｔｔ
ｔの濃度で用いる。該抗生物質の濃度はテスト用菌株に
とって許容できるならこれらの抗生物質をさらに高濃度
で使用することを排除するものではない。

エチルアルコールをｐＨ調整したＤＮＡ抽出物に加熱の
有無にかかわらず、最終濃度が約７０％となるように加
えることかできる。アルコールの使用前に抽出物に約０
．０１％アルブミンを加えてもよい。このアルブミンは
生じうる沈澱物の不活性担体の役割をする。該懸濁液を
低速で遠心分離してＤＮＡ含有沈澱物をペレット状にす
るか、あるいは沖過してフィルター上に集めることかで
きる。該沈澱物を少量のＣＣ緩衝液中に溶解するが、こ
のＣＣ緩衝液はテスト用菌株にとって許容できる抗生物
質を含んでいてもよい。添加するＣＣ緩衝液の量はもと
の量の１／１０〜２／１０であり、その結果濃縮抽出物
が得られる。室温にて約１０分聞直いた後、該濃縮抽出
物は形質転換操作に使用できる。濃縮抽出物の使用は、
陽性テストでは濃縮していない抽出物よりもより多くの
コロニーを生ずる。

エチルアルコールはまた塩基によって抽出される間のＤ
ＮＡの濃縮に用いることができる。この場合、アルコー
ル−塩基溶液はＤＮＡを抽出すると同時に沈澱させる。

この場合も、所望により、アルブミンを添加してもよい
。該沈澱物は遠心分離またはｔ過により取り出すことが
できる。いずれの場合でも濃縮ＤＮＡ溶液の最終濃度か
ｐＨ８，Ｑ以上とならないように残った塩基を相殺する
ために懸濁溶媒、ＣＣ緩衝液のｐＨを６．０前後とすべ
きである。

アルコール操作の使用には、アルコールか８ｍ剤として
作用して生存する微生物を不活性化するという効用があ
る。多くの場合、この効用により前記抽出操作における
加熱を必要としない。

■、サンプル抽出 ここではサンプルの抽出方法を示す。頚部のスワブを０
．５ｉＧＣ緩衝液を含む試験管に入れる。

該頚部スワブを緩衝液と混合し、後の抽出操作のために
そのままにしておくか、管壁に押しっけてしぼり、捨て
る。得られた粘液および細胞の懸濁液に０．３Ｎ水酸化
ナトリウム（０，００５％フェノールレッドを含有）　
０−２　ｔｈｅを加える。しばらくして（約３０秒程度
）、０６２Ｎ塩酸０．２＋ｎｌ〜０．３４を該抽出物に
加える。ついで該試験管を６８℃の水浴中で１０分間加
熱する。室温まで冷却したのち、該抽出物を本発明の形
質転換操作に付す。この例は直腸部、尿道部またはその
他“の検体を排除するものではない。ＧＣ緩衝液または
塩基溶液≦こリン菌を導入するのに用いることのできる
塗布棒、接種用白金耳、白金線または木製、プラスチッ
ク製、金属製または紙製のいずれもの道具により、純粋
または混合培養から取り出したリン菌の疑いのあるコロ
ニー１こついても同様な抽出操作を使用することができ
る。

■、形質転換 本発明のテスト方法の形質転換操作は、テスト用菌株が
許容しうる濃度の抗生物質を含むことのできる生物学的
培地上またはその中で約３６℃でほとんど増殖しないテ
スト用菌株に、調製したＤＮＡ抽出物を作用させること
をこよって行なわれる。

テスト用菌株に該抽出物を作用させる好ましい方法は、
通常のチョコレート寒天平板上に準備されたテスト用菌
株の密生上飯こ抽出物をスポットするものである。この
密生を調製するには好ましくは署 ２本の滅菌綿棒並べ、テスト用菌株の懸濁液中にへ 浸すことである。ついでこれらの綿棒を、抗生物質ディ
スク感受性テスト（ＬｅｎｎｅＬｔｅ、　Ｓｐａｕｌｄ
ｉｎｇ。

Ｔｒａｕｎｔ　　　　Ｍａｎｕａｌ　　　ｏｆ　　　Ｃ
１１ｎｉｃａｌ　　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ鳳ｏｇｙ。

Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４２
３　、１９７４　）と同様の方法で、チョコレート寒天
平板の表面上に一様に塗布する。

テスト用菌株の密生を有するチョコレート寒天平板に接
種する番こは、単一のスワブまたはいくつかのスワブを
用いることができるか、その他の装置または方法を用い
てもよい。

本明細書においては市販のチョコレート寒天平板培地（
Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌｏｂｏ
ｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）を
使用しているが、その他の有用な栄養寒天培地またはチ
ョコレート寒天培地を排除するものではなく、また、ペ
トリ皿に限らず、その他のタイプの容器中または表面を
使用してもよい。さらに、栄養寒天培地またはチョコレ
ート寒天培地、あるいはテスト用菌株が許容しうる濃度
の抗生物質を含有し、その培地上でテスト用菌株が炭酸
ガス雰囲気中３６℃前後の温度にてほとんど増殖しない
ような他の増殖培地を排除するものでもない。炭酸水素
ナトリウムのようなＣＯ２に代わることのできる成分を
含む培地を含んでもよい。

テスト用菌株の密生に該抽出物をスポットした後、該チ
ョコレート寒天平板培地をリン菌の増殖に適する炭酸ガ
ス雰囲気中３６℃前後の温度にてインキュベートする。

２７〜４０時間インキュベーションした後、陽性のテス
トでは該抽出物をスポットした場所でコロニーの増殖が
みられる。陰性のテストでは、スポットした部分には何
らコロニーの増殖が認められない。

テスト用菌株は密生の形で用いることが好ましいか、抑
制的条件下、例えば、テスト用菌株が増殖しえないよう
な温度でリン菌ＤＮＡがテスト用菌株の検知しうる増殖
を刺激するのに使用できるようないずれもの状態でテス
ト用菌株を用いることも本発明範囲のものである。この
ことは、リン菌ＤＮＡなしには起りえないテスト用菌株
の増殖に該ＤＮＡの存在が寄、与する限り、テスト用菌
株とリン菌ＤＮＡを含有する液体環境中、テスト用菌株
が許容しうる抗生物質の存在下または非存在下でもテス
トを行なうことかできることを意味する。

■、データ 本発明方法によるテストの効果は、す・センター・フォ
ー・デジーズ　コントロールと協同して盲検法で証明さ
れており、その結果は臨床的培養分析法に匹敵した。女
性から採取した頚部および直腸部検体および男性から採
取した尿道部検体をジョーシア州、デカルプ・カランテ
ィ（ＤｅＫａｌｂＣｏｕｎｔｙ　、　Ｇｅｏｒｇｉａ　
）　（７）病院に集めた。各身体部位から２種のスワブ
を採取し、１つを直ちに選択培地導入れ該病院で処理し
、他方をペンシルベニア州、フイラデル７　イア　（Ｐ
ｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌ−ｖａｎｉ
ａ　）へ郵送して本発明の方法に従ってテストした。そ
の結果、以下の陽性（＋）および陰性（−）結果が得ら
れた。

頚部検体に関しては、両方のテストで６９検体が が陽性であり、１３２検す性である。本発明方法では陽
性であるが培養法では陰性な２つの頚部検体については
次の事情がある。すなわち、患者の頚部から再度検体を
採取し、再テストしたところ、培養法でも陽性で、また
、本発明方法でもやはり陽性であることが判明した。こ
の患者はリン菌に感染しているが、再テストに際し、チ
ョコレート寒天およびバンコマイシン含有タイヤーーマ
ーチ７　（Ｔｈａｙｅｒ−Ｍａｒｔｉｎ　）培地からリ
ン菌を分離したので、このリン菌はバンコマイシン感受
性であることが明らかとなった。本発明方法によるテス
トは、炭酸ガス雰囲気中チョコレート寒天培地上の約３
６℃における増殖能力以外は、ヒト感染リン菌のどんな
特徴にも影響を受けないため、−回目のテストと同様に
二度目のテストでも陽性の結果が得られる。この点て、
リン菌のバンコマイシン感受性株が一般的である分野（
Ｗｉｎｄａｌｌ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　ｌｎｆ、Ｄｉｓ
、　１４２．７７５．１９８０　）の１」ン病診断テス
トに本発明方法が非常に価値あるテスト法である。第２
の頚部検体はリン菌患者と接触した人のもので、直腸部
の培養では陽性であった。

このことはその患者がリン病であることを意味する。こ
の場合、頚部と同様に直腸部も、本発明方法では陽性で
あった。

この情報に基き、妥当な結論は本発明方法には偽陽性結
果がないことである。このテストは培養法と同様にリン
病診断に特異的である。本発明テストの頚部に対する感
受性、つまり陽性として検出される数は培養法の感受性
９７．３％（７１／７３）と同じで°ある。

直腸検体に関して、両テストにおいて２６検体が陽性で
あり、１２８検体が陰性である。本発明方法では陽性で
あるが、培養法では陰性である４つの直腸部検体につい
て、それらに対応する頚部検体はいずれも本発明テスト
法においても培養法においても陽性である。したがって
、これらの検体はリン病患者のものである。これらの４
つの直腸部検体はおそらく偽陰性培養であると思われる
。

この情報に基いて、本発明方法の直腸検体に対する感受
性は培養法の感受性８７．１％（２７／３１）に比較し
て９６，８％（３０／３１）である。

尿道検体に関しては、両テストでは７４検体が陽性であ
り６６検体が陰性である。本発明テスト法では陽性であ
るが、培養法では陰性である２つの尿道部検体について
は、いずれの検体もダラム染色法ではリン菌に対して強
い陽性である。したかって、該検体はリン病患者からの
ものである。

これらの２つの尿道部検体はおそらく偽陰性培養である
と思われる。この情報に基くと、本発明方法の尿道部検
体に対する感受性は、培養法感受性９７．４％（７６／
７８　）と同じである。

上記のデータに加えて、６８名の患者を、リン病の治療
後１４日以内にその治癒をテストした。

両テストともその結果は同様、つまり、患者から採取し
た検体は陰性であった。

本発明方法は好ましくはテストキットを用いて行なう。

該キットは基本的には生物学的培地上または中で約３６
℃にてほとんど増殖しないリン菌のテスト用菌株の分包
からなる。また該キットハ、（ａ）テスト用菌株の増殖
を支持する固体または液体培地、（ｂ）エタノールを含
有するまたはしない塩基供給物、（Ｃ）酸供給物、（ｄ
）　ｐＨ指示薬および（ｅｊ室験器具または材料を含ん
でよい。テスト用菌株は生の培養物または懸濁液として
、凍結懸濁液として、また凍結乾燥または乾燥調製物と
して供給してもよい。好ましい生物学的培地はチョコレ
ート寒天培地またはその他の栄養培地であり、その形ま
たは形状は、テスト用菌株がリン菌？ことって好適な炭
酸ガス雰囲気中３６℃前後の温度にてほとんど増殖しな
いいずれのものでもよい。

特許出願人　テンプル・ユニバーシティ・オプ・ザ・コ
モンウエルス・システム・オプ・バイアー・エデュケイ
ション 代　理　人　弁理士　青　山　　　葆　ほか２名第１頁
の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号（Ｃ
１２Ｑ　　１１０４　　　　　　　　　　　　　−Ｃ１
２Ｒ１／３６　）　　　　　　　　　　　６７６０−４
Ｂ手続補正書（自発） 昭和５８年１月１２日 昭和５７年特許願第　１８９９４９　　　号２、発明の
名称 リン病の診断テスト法、リン菌のテスト用株およびテス
トキット ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ７、補正の内容 （１）明細側１０頁１１行、「寄託」のＴ）１１に「、
プダベスト条約の規定により」を加える。

８添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ナイセｌＪ７−ゴ７　ｏ　−ｘ　ｙ　（Ｎｅ
   ｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　、リン菌）Ａ
   ＴＣＣ３１９５３の培養調製物。 （２）該微生物がリン閑の増殖に適した炭酸ガス雰囲気
   中、約３０〜３７℃の温度で、チョコレート寒天上でほ
   とんど増殖しない特性を有し、該培養物がナリジキシン
   酸５〜１０μｆ／ｒＭおよびストレプトマイシン１００
   ０μｙ　／　ｍｅ以上の濃度に特異的耐性を有する前記
   第（１）項の調製物。 （３）該微生物がリン菌の至適増殖条件でリン菌の増殖
   に適した培地上または中で正常に増殖する能力を与える
   リン菌ＤＮＡを受は入れる能力のあるものである前記第
   （２）項の調製物。 ＋４１　　（ａ）検体またはコロニーから、リン菌を溶
   解させる塩基でＤＮＡを抽出し、（ｂ）工程（ａ）の抽
   出物のｐＨを、リン菌の増殖至適条件でほとんと増殖せ
   ず、形質転換能を有するリン菌のテスト用菌株に毒性を
   示さない値に調整し、（ｃ）　ｐＨを調整した抽出物を
   テスト用菌株に、リン菌の増殖に適した生物学的培地に
   入れる前または後に作用させ、（ｄ）　ＩＪン菌の増殖
   に至適な、かつ、テスト用菌株には抑制的な条件下、リ
   ン菌の増殖に適した培地で該処理したテスト用菌株を保
   持し、ついで、（ｆ）該処理テスト用菌株の増殖を観察
   する工程からなることを特徴とする患者の検体または純
   粋培養、混合培養を問わず、リン菌の疑のあるコロニー
   中におけるリン菌ＤＮＡの存在検出方法。 （５）　　工程（Ｃ）の前に、工程（ｂ）にてｐＨを調
   整した抽出物を約６０〜７５℃で約１０〜３０分間加熱
   して残存微生物を不活性化する前記第（４）項の方法。 （６）工程（Ｃ）の前に、ｐＨを調整した抽出物をエタ
   ノールで処理してｌ）　Ｎ　Ａを沈澱させ、沈澱物を採
   取し、少社のペプトンを含有する緩衝液で復元してＤＮ
   Ａの濃縮溶液を得る前記第（４）項の方法。 （７）該塩基がｌ）　Ｎ　Ａの抽出および沈澱を同時に
   行なうエタノール−塩基混合物で、ついで、沈澱を集め
   、少量のペプトンを含有する緩衝液で復元し、ｐＨを調
   整したＤＮＡの濃縮溶液を得た後、工程（０を行なう前
   記第（４）項の方法。 （８）塩基か無機または有機塩基で、ＤＮＡを含有する
   抽出物のｐＨ調整を無機または有機酸で行なう前記第（
   ４）項の方法。 ｉ９）　　ｐＨの調整をｐＨ指示薬の存在下に行なう前
   記第（８）項の方法。 ００　　塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよ
   び水酸化アンモニウムからなる群から選はれるもので、
   酸が塩酸である前記第（８）項の方法。 αＤ　塩基および酸をペプトン含有緩衝液中で行なう前
   記第（８）項の方法。 ａｚ　　工程（ｃ）の前に、リン菌に至適な条件下でほ
   とんど増殖せず、形質転換能を有するリン菌のテスト用
   菌株を調製する工程を有する前記第（４）項の方法。 （］３　リン菌の増殖に至適て、かつ、テスト用菌株に
   対して抑制的な条件下、リン菌の増殖に適しく４）項の
   方法。 （１４１１Ｊン菌の至適増殖条件か、適当な炭酸ガス雰
   囲気中、約３６℃の温度で約２７〜４０時間の培養期間
   である前記第（４）項の方法。 （１５培地が普通チョコレート寒天培地である前記第（
   １３１項の方法。 （１Ｇ＋　　チョコレート寒天培地が、テスト用菌株の
   耐えつる濃度の抗生物質を含有する前記第１５］項の方
   法。 （１７１チョコレート寒天培地がナリジキシン酸および
   ストレプトマイシンからなる群から選ばれる抗生物質を
   含有する前記第（］印項の方法。 止　テスト用菌株が培養増殖、固体培地からの生の懸濁
   液、凍結乾燥または乾燥品および凍結保存物の解凍懸濁
   液からなる群から選ばれる前記第（４）項の方法。 ａα　テスト用菌株がナイセリア・ゴノローエアＡＴＣ
   Ｃ３１９５３である前記第（４）項の方法。 ■　テスト用菌株の形が杉林の耐えうる抗生物質を含有
   するものである前記第（ト）項の方法。 １２１）該塩基および酸がテスト用菌株の耐えつるよう
   な濃度の抗生物質を含有する前記第（４）項ｄ方法。 ■　生物学的培地上もしくは中、約３６℃でほとんど増
   殖しないナイセリア・ゴノローエアのテスト用菌株の分
   包を必須要素としてなるリン菌ＤＮＡ検出用テストキッ
   ト。 ■　テスト用菌株がナイセリア　ゴノローエアＡＴＣＣ
   ３１９５３である前記第■項のテストキラ　ト。 ｃ！４１（ａ）テスト用菌株の増殖を支持するための固
   体または液体培地、（ｂ）エタノールを含有するまたは
   含有しない塩基供給物、（ｃ）酸供給物、（ｄ）　ｐ）
   （指示薬および（ｅ）実験器具または材料からなる群か
   ら選ばれる１種以上の要素を包含する前記第ｎ項のキッ
   ト。 磯　ナイセリア・ゴノローエアＡＴＣＣ３１９５３゜