CN112538515A - 一种测定食品中生孢梭菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定食品中生孢梭菌的方法，主要包含了接种和培养菌落，分离典型菌落，进行分子生物学检测和根据生孢梭菌(J‑201)为阳性对照，产气荚膜梭菌(ATCC‑13124)为阴性对照，判定检测结果四个主要步骤。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测方法领域，特别涉及测定食品中检测生孢梭菌菌群的方法。
背景技术
生孢梭菌与肉毒梭菌极其相似，两者主要的区别在于生孢梭菌不会产生肉毒毒素。有报道称生孢梭菌也可以产生不同于肉毒毒素的其他有毒代谢产物。有人从肠出血腹泻兔的粪便中分离出该菌，其毒素直接作用在兔肠道血管壁的内皮细胞造成兔的出血性腹泻，但对小鼠、大鼠和豚鼠则不显示毒性作用；也有报道从浓缩乳清蛋白粉中分离出生孢梭菌，其代谢产物显示出对ICR小鼠致死的毒性作用。然而目前并未进一步研究生孢梭菌对人、尤其是婴幼儿的健康是否存在危害。但在实际应用中，无论来源、无论毒性，都需要首先从样品中分离检测出目标菌的存在。本非标在检测大量的样品经验上，建立了从样品中分离检测并鉴定生孢梭菌的方法，可为样品实际检测应用以及进一步评估食品中污染生孢梭菌的风险提供技术支持。
在实际检测中，生孢梭菌与肉毒梭菌生理生化特征极其相似，2013年新西兰恒天然肉毒事件爆发一个月后，新西兰初级产业部对外发表声明称，肉毒梭菌污染是虚惊一场，浓缩乳清粉中发现的是与肉毒梭菌极其相似的但没有毒性的生孢梭菌，虽然没有毒性，但因为没有食品中生孢梭菌的检测方法，不能快速的断定污染源，从而造成的损失巨大。
经查文献，目前没有针对食品中生孢梭菌的检测方法。但有针对肉毒梭菌的检测标准(GB 4789.12)。与标准不同之处在于优化了样品处理方法、增加了血平板并利用传统生化、结合分子生物学等手段将可疑菌圈定在生孢梭菌和肉毒梭菌的范围内，最终通过小鼠毒素试验将生孢梭菌和肉毒梭菌分离。
本方法建立在大量实际检测经验基础之上，针对实际样品检测有很强的可操作性。目前也有很多市售肉毒梭菌的快速检测试剂盒，但均是建立在从样品中分离出可疑目标菌落的基础之上的，所以建立检测方法就显得至关重要。
有报道称根据生孢梭菌培养特性，当此菌与肉毒梭菌混合培养时，其生长占优势。将培养时间缩短在18h，卵黄琼脂平板分离培养时间缩短在20h，就可使肉毒梭菌较易分离出来，故可根据目的，通过调节培养基的培养时间来分离出所需要的菌落。
发明内容
本发明提出了一种测定食品中生孢梭菌的方法，具体方案如下：
一种测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，测定方法包含如下步骤：
S1：接种和培养菌落，培养周期为5天；
S2：分离典型菌落；
S3：进行分子生物学检测和毒素检测试验；
S4：以生孢梭菌(J-201)为阳性对照，以产气荚膜梭菌(ATCC-13124)为阴性对照，进行结果判定。
进一步的，步骤S1中所述的接种和培养菌落步骤优选为：煮沸两只疱肉培养基后，分别进行如下处理：第一支迅速冷却，第二支冷却至60℃后接种检样，继续保温10min后，急速冷却。
进一步的，步骤S1中还包括培养物的检查和判断步骤：
S11：用显微镜检查经革兰氏染色的培养物涂片，观察菌体形态，判定是否有典型的梭状菌，是否形成芽孢和芽孢形成的程度以及芽孢在菌体内部的部位；
S12：若已培养5天的增菌液内没有细菌生长，应继续培养10天以检出可能迟缓出芽的生孢梭菌芽孢。
进一步的，步骤S2中所述的分离典型菌落步骤包括：
S21：用接种环挑取1环具有典型现象的培养物，分别划线卵黄琼脂及血琼脂平板各一块，在厌氧条件下36±1℃培养48小时，若两个支管均有典型现象时，则只挑取第二支管上的培养物；
S22：将步骤S21中确定的可疑菌落转移两块卵黄琼脂，分别置于需氧、厌氧条件下36±1℃培养48小时，若可疑菌在需氧平板上生长，则排除待测样品中包含生孢梭菌可能性；
S23：将步骤S22中筛选出的可疑菌落再次接种血琼脂平板，于厌氧条件下36±1℃培养24小时，挑取纯培养物进行API 20A检测并进行结果判读；
S24：选取判读结果良好的培养物同时接种疱肉培养基和TPGY液体培养基，其中，疱肉培养基于厌氧条件下30±1℃培养5天，TPGY液体培养基于厌氧条件下36±1℃培养24小时，所得培养物待用。
进一步的，步骤S3中还包括制备模板DNA和、PCR扩增、电泳检测和测序的步骤。
进一步的，所述制备模板DNA的步骤包括：
S311：取1.4ml TPGY培养物置于1.5ml离心管中，在14000g条件下离心2分钟，丢弃上清液后，加入1.0ml LPBS悬浮菌体沉淀，在14000g条件下离心2分钟，丢弃上清液；
S312：对步骤S311中所得物用400μl LPBS重悬沉淀后，加入10mg/ml溶菌酶溶液100μl后，30±1℃环境水浴15分钟，期间每5-7分钟颠倒混匀一次；
S313：对步骤312中所得物沸水浴10分钟后，在14000g条件下离心2分钟后，将上清液移至新的灭菌小管中；
S314：在盛放步骤313所得物的灭菌小管中加入3mol/L NaAcμl和95％乙醇1.0ml，颠倒混匀，在-70℃或-20℃环境下放置30min后，在14000g条件下离心10分钟，丢弃上清液，沉淀干燥后溶于200μLTE溶液中，置于-20℃条件下保存备用。
进一步的，所述PCR扩增所需的检测反应体系为：
PCR反应条件为：94℃预变性1-3分钟，94℃变性30-60秒，47℃退火30-60秒，72℃延伸30-60秒，30个循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。
进一步的，所述电泳检测的步骤包括：
S331：将5-8μl的PCR扩增产物分别和3μl加样缓冲液混合，并点样；
S332：在9V/cm条件下电泳30分钟；
S333：在EB染色液中染色5-10分钟，在紫外检测仪下观察结果并用凝胶成像仪记录结果。
进一步的，所述测序步骤包括：
S341：将待测样品PCR产物进行TA克隆测序；
S342：将测序结果在NCBI上进行比较，选取nucleotide BLAST，比对待测样品序列和生孢梭菌或肉毒梭菌序列的匹配度。
进一步的，步骤S4中所述的毒素检测步骤包含：
S41：选取经过TA克隆测序以及API 20A鉴定为可疑菌落所对应的疱肉肉汤管作为毒素检测对象；
S42：吸取培养后的疱肉培养基上清液，选取第一部分，分别使用原液、1∶10和1∶100 倍稀释液进行检测，第二部分分别使用原液、1∶5和1∶100倍稀释后，调节PH值至6.2，每9份加10％1∶250活力胰酶水溶液1份，混匀、搅动，于36℃条件下作用60分后进行检测；
S43：选取步骤S42中所述的疱肉培养基上清液、胰酶激活处理液和明胶磷酸盐水溶液分别注射三只12-15g小白鼠，每只0.5ml，观察4天；
S44：若注射液中有肉毒毒素存在，则小白鼠在24小时内死亡，若注射液中所含菌落为生孢梭菌，则小白鼠无死亡症状，判定可以菌落为生孢梭菌。
具体实施方式
本发明可用于检测食品中生孢梭菌的存在，用于食品卫生的检验检疫工作中。
在本发明的一个实施例中，利用下列试剂和仪器实现：
所需仪器及规格：
均质器；
恒温水浴锅；
恒温培养箱；36℃±1℃或46℃±1℃、30℃±1℃
厌氧培养装置；
吸管：1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度
培养皿：90mm；
低温冰箱；
显微镜；
高速台式冷冻离心机：14000g；
PCR仪；
电泳仪；
凝胶成像分析系统；
紫外分光光度计；
微量可调移液器：0.2μL-2μL、2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL；
离心管1.5mL；
PCR反应管：200μL-500μL；
所需试剂及规格：
氯化钠胰蛋白胨稀释液：胰蛋白胨：北京陆桥公司提供，货号CM001A。制备方法为：称取氯化钠8.5g，胰蛋白胨1.0g，溶于1000mL去离子水中。调节PH为7.2±0.1，高压灭菌121℃，15min。培养基从高压灭菌完成到使用，不得超过15天。
亚硫酸铁琼脂：北京陆桥公司提供，货号CM186，按照培养基标签提供的用法进行称量、溶解、灭菌，冷却至50℃左右备用。培养基从高压灭菌完成到使用，不得超过15天。取灭菌后冷却至50℃的培养基，倾注10-15mL至无菌培养皿中，待琼脂凝固后备用。
3％过氧化氢溶液。
营养琼脂：北京陆桥公司提供，货号CM107。按照培养基标签提供的用法进行称量、溶解、灭菌，冷却至50℃左右备用。培养基从高压灭菌完成到使用，不得超过15天。
TPGY液体培养基：北京陆桥公司提供，货号CM1545，按照培养基标签提供的用法进行称量、溶解、灭菌，备用。培养基从高压灭菌完成到使用，不得超过15天。
无水乙醇和95％乙醇。
PBS缓冲液：氯化钠7.650g/L、磷酸二氢钠0.724g/L、磷酸二氢钾0.210g/L(pH7.4)，
蛋白酶K溶液：用TE配制，使用浓度为10mg/mL。
溶菌酶溶液：用TE配制，使用浓度为10mg/mL。
3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。
20％SDS溶液。
引物：FD1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，RP2：5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3
Tag DNA聚合酶
dNTP
琼脂糖：电泳级。
溴化乙锭。
DNA分子量Marker。
商品化细菌基因组DNA提取试剂盒。
明胶磷酸盐缓冲液：成分配比为：明胶2.0g，磷酸氢二钠4.0g，蒸馏水1000mL。将明胶和磷酸盐加于蒸馏水中，稍加热使溶解。高压灭菌121℃，20min。培养基从高压灭菌完成到使用，不得超过15天。
胰酶液：成分配比和制备方法为：胰酶(1∶250)1.5g，蒸馏水100.0mL。将胰酶溶于蒸馏水中，用0.45μm微孔滤膜滤器过滤除菌。
检测时，无菌称取样品50g，放入无菌均质袋中，加50mL氯化钠胰蛋白胨稀释液，使用胃式均质器均质。
取疱肉培养基两支，煮沸10-15min后，做如下处理；
第一支：煮沸后迅速冷却；
第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却。
每15mL增菌肉汤中接种1～2g固体食品或2mL液体食品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面之下，每份样品接种两管疱肉培养基，置于30±1℃厌氧环境下培养5天。
培养5天后，检查培养物的浊度、产气、肉粒的颜色及消化并注意产生气体的气味。用显微镜检查经革兰氏染色的培养物涂片，观察菌体形态，以及是否有典型的梭状菌、是否形成芽孢和芽孢形成的程度以及芽孢在菌体内部的部位。
在本实施例中，为了分离纯培养物，可保留芽孢形成高峰期的增菌培养物并冷藏。如果培养5天的增菌液中没有细菌生长，应再培养10天以检出可能迟缓出芽的生孢梭菌芽孢。
在经过对培养物的培养后，可以在观察到有典型梭状菌或形成芽孢的情况下，进行典型菌落的分离。
在两支疱肉培养基中，挑取具有典型梭状菌现象的培养基，使用接种环进行挑取。如两支培养基中均具有典型梭状菌现象，则选取第二支培养基进行挑取。挑取时，分别划线卵黄琼脂及血琼脂平板各1块，厌氧36±1℃培养48h。生孢梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，典型菌落粗糙呈不规则蔓延状生长，菌落扁平，灰白色，菌落及周围培养基表面覆盖有特有的红彩样(或珍珠层样)薄层，也有些菌落不能产生薄层。在血琼脂平板上生长时，典型菌落呈不规则蔓延状生长，菌落扁平，灰白色，有溶血环。
将以上步骤确定的可疑菌落转移两块卵黄琼脂，分别置于需氧、厌氧条件下36±1℃培养48h。检查平板，生孢梭菌为严格厌氧菌，若可疑菌在需氧平板上生长，则可直接排除。
将经过上述步骤筛选得到的可疑菌落再次接种血平板，于36±1℃厌氧培养24h，挑取纯培养物，进行API 20A检测，结果使用API判读软件进行判读。
在进行API检测时需要制作2麦氏浊度的菌悬液，需要划线的血平板上有足够量的菌落生长，必要时连续划线两块血琼脂平板。选取鉴定结果为“好的鉴定”的“生孢梭菌/肉毒梭菌”的培养物同时接种疱肉培养基以及TPGY液体培养基。疱肉培养基于30±1℃厌氧培养5 天，进行毒素检测及特性检查确证试验；TPGY液体培养基于36±1℃厌氧培养24h，后续进行分子生物学检测试验和毒素检测试验。
在本实施例中，分子生物学检测试验包含了制备模板DNA、PCR扩增、电泳检测和测序步骤。毒素检测主要为小白鼠生物试验。在不同的实施例中，分子生物学检测可以使用市售细菌基因组提取试剂盒提取培养菌群的DNA作为模板使用；毒素检测也可使用白兔、猕猴或其他类似生物进行。
制备模板DNA的过程中，首先取1.4mL TPGY培养物转移至1.5mL离心管中，14000g离心2min，弃去上清，加入1.0mLPBS悬浮菌体沉淀，14000g离心2min，弃去上清。用400 μLPBS重悬沉淀，加入10mg/mL溶菌酶溶液100μL，37℃±1℃水浴15min，期间每5min-7min 颠倒混匀离心管。加入10mg/mL蛋白酶K溶液10μL，60℃±1℃水浴1h，期间每5min-7min 颠倒混匀离心管。沸水浴10min，14000g离心2min，上清液转移至新的灭菌小管中。加入 3mol/LNaAcμL和95％乙醇1.0mL，颠倒混匀，-70℃或-20℃放置30min，14000离心10min，弃去上清，沉淀干燥后溶于200μLTE溶液。-20℃保存。
PCR扩增过程中，预变性和变性温度选择94℃，其反应体系和反应条件如下：
PCR反应条件为：94℃预变性1-3分钟，94℃变性30-60秒，47℃退火30-60秒，72℃延伸30-60秒，30个循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。
电泳检测时，需借助凝胶进行。首先在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5～8μl PCR扩增产物分别和3μl加样缓冲液混合后进行点样。在9V/cm恒压条件下，电泳30min左右。于EB染色液中染色5-10min紫外检测仪下观察结果并用凝胶成像仪照像记录。在本实施例中，PCR扩增产物电泳检测结果为1500bp。
完成上述步骤后，需将样品的PCR产物进行TA克隆测序，测序结果在NCBI上进行比较，选取nucleotide BLAST，比对样品序列和生孢梭菌或肉毒梭菌序列的匹配度。
在进行克隆测序时，也可由测序公司对PCR产物进行测序。但须注意，PCR产物由生成至完成测序，不得超过15天。
在进行毒素检测试验过程中，首先将经过TA克隆测序以及API 20A鉴定为可疑菌落所对应的疱肉肉汤管进行毒素检测。吸取培养后的疱肉培养基上清液。分别取原液、1∶10和 1∶100倍稀释液检测。
另取一部分原液、1∶5、1∶100倍稀释液，调PH值6.2，每9份加10％胰酶(活力1∶250)水溶液1份，混匀、搅动，于36℃作用60min，进行检测。
取上述离心上清液、胰酶激活处理液以及空白对照液(明胶磷酸盐水溶液)分别注射小白鼠三只(体重12～15g)，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。若注射液中所含菌落为生孢梭菌，则小白鼠无上述典型症状。无论上清液或其胰酶处理液，凡不能致小白鼠典型症状发病、死亡者，均可判定为生孢梭菌。
依据API 20A、测序结果以及毒理试验结果综合判断，凡是测序结果与生孢梭菌或肉毒梭菌的匹配度达到99％，API 20A鉴定结果为“好的鉴定”的“生孢梭菌/肉毒梭菌”，毒理试验测试不含肉毒毒素的样品，可以判定为生孢梭菌检出。在本实施例中，以生孢梭菌(J-201) 作为阳性对照，产气荚膜梭菌(ATCC-13124)作为阴性对照。其中，生孢梭菌(J-201)的 16SrRNA序列如附表所示。
以上对本发明所提供的通用数据采集控制系统进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明技术方案的限制。
Claims (10)
1.一种测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，测定方法包含如下步骤：
S1：接种和培养菌落，培养周期为5天；
S2：分离典型菌落；
S3：进行分子生物学检测和毒素检测试验；
S4：以生孢梭菌(J-201)为阳性对照，以产气荚膜梭菌(ATCC-13124)为阴性对照，进行结果判定。
2.根据权利要求1所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，步骤S1中所述的接种和培养菌落步骤优选为：煮沸两只疱肉培养基后，分别进行如下处理：第一支迅速冷却，第二支冷却至60℃后接种检样，继续保温10min后，急速冷却。
3.根据权利要求1所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，步骤S1中还包括培养物的检查和判断步骤：
S11：用显微镜检查经革兰氏染色的培养物涂片，观察菌体形态，判定是否有典型的梭状菌，是否形成芽孢和芽孢形成的程度以及芽孢在菌体内部的部位；
S12：若已培养5天的增菌液内没有细菌生长，应继续培养10天以检出可能迟缓出芽的生孢梭菌芽孢。
4.根据权利要求1所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，步骤S2中所述的分离典型菌落步骤包括：
S21：用接种环挑取1环具有典型现象的培养物，分别划线卵黄琼脂及血琼脂平板各一块，在厌氧条件下36±1℃培养48小时，若两个支管均有典型现象时，则只挑取第二支管上的培养物；
S22：将步骤S21中确定的可疑菌落转移两块卵黄琼脂，分别置于需氧、厌氧条件下36±1℃培养48小时，若可疑菌在需氧平板上生长，则排除待测样品中包含生孢梭菌可能性；
S23：将步骤S22中筛选出的可疑菌落再次接种血琼脂平板，于厌氧条件下36±1℃培养24小时，挑取纯培养物进行API 20A检测并进行结果判读；
S24：选取判读结果良好的培养物同时接种疱肉培养基和TPGY液体培养基，其中，疱肉培养基于厌氧条件下30±1℃培养5天，TPGY液体培养基于厌氧条件下36±1℃培养24小时，所得培养物待用。
5.根据权利要求1所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，步骤S3中还包括制备模板DNA和、PCR扩增、电泳检测和测序的步骤。
6.根据权利要求5所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，所述制备模板DNA的步骤包括：
S311：取1.4ml TPGY培养物置于1.5ml离心管中，在冷冻离心条件下离心2分钟，丢弃上清液后，加入1.0ml LPBS悬浮菌体沉淀，在冷冻离心条件下离心2分钟，丢弃上清液；
S312：对步骤S311中所得物用400μl LPBS重悬沉淀后，加入10mg/ml溶菌酶溶液100μl后，30±1℃环境水浴15分钟，期间每5-7分钟颠倒混匀一次；
S313：对步骤312中所得物沸水浴10分钟后，在冷冻离心条件下离心2分钟后，将上清液移至新的灭菌小管中；
S314：在盛放步骤313所得物的灭菌小管中加入3mol/L NaAcμl和95％乙醇1.0ml，颠倒混匀，在-70℃或-20℃环境下放置30min后，在冷冻离心条件下离心10分钟，丢弃上清液，沉淀干燥后溶于200μLTE溶液中，置于-20℃条件下保存备用。
7.根据权利要求5所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，所述PCR扩增所需的检测反应体系为：
PCR反应条件为：94℃预变性1-3分钟，94℃变性30-60秒，47℃退火30-60秒，72℃延伸30-60秒，30个循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。
8.根据权利要求5所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，所述电泳检测的步骤包括：
S331：将5-8μl的PCR扩增产物分别和3μl加样缓冲液混合，并点样；
S332：在9V/cm条件下电泳30分钟；
S333：在EB染色液中染色5-10分钟，在紫外检测仪下观察结果并用凝胶成像仪记录结果。
9.根据权利要求5所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，所述测序步骤包括：
S341：将待测样品PCR产物进行TA克隆测序；
S342：将测序结果在NCBI上进行比较，选取nucleotide BLAST，比对待测样品序列和生孢梭菌或肉毒梭菌序列的匹配度。
10.根据权利要求5所述的测定食品中生孢梭菌的方法，其特征在于，步骤S4中所述的毒素检测步骤包含：
S41：选取经过TA克隆测序以及API 20A鉴定为可疑菌落所对应的疱肉肉汤管作为毒素检测对象；
S42：吸取培养后的疱肉培养基上清液，选取第一部分，分别使用原液、1∶10和1∶100倍稀释液进行检测，第二部分分别使用原液、1∶5和1∶100倍稀释后，调节PH值至6.2，每9份加10％1∶250活力胰酶水溶液1份，混匀、搅动，于36℃条件下作用60分后进行检测；
S43：选取步骤S42中所述的疱肉培养基上清液、胰酶激活处理液和明胶磷酸盐水溶液分别注射三只12-15g小白鼠，每只0.5ml，观察4天；
S44：若注射液中有肉毒毒素存在，则小白鼠在24小时内死亡，若注射液中所含菌落为生孢梭菌，则小白鼠无死亡症状，判定可以菌落为生孢梭菌。
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| WO2005011732A2 (fr) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Ceva Sante Animale Sa | Bacterie cunicole et utilisations |
| US20110076673A1 (en) * | 2006-09-07 | 2011-03-31 | Osterreichisches Rotes Kreuz Landesverband Oberosterreich | Detection of bacteria |
-
2020
- 2020-07-10 CN CN202010666976.8A patent/CN112538515A/zh active Pending
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| WO2005011732A2 (fr) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Ceva Sante Animale Sa | Bacterie cunicole et utilisations |
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Inventor after: Lu Yun Inventor after: Wang Fang Inventor after: Xue Xiaojing Inventor after: Wu Yuping Inventor after: Wang Jing Inventor after: Liu Hanxia Inventor after: Zheng Lixin Inventor after: Tian Shimin Inventor before: Lu Yun Inventor before: Wang Fang Inventor before: Xue Xiaojing Inventor before: Wu Yuping Inventor before: Wang Jing Inventor before: Liu Hanxia Inventor before: Zheng Lixin Inventor before: Tian Shi |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20210323 |