BACTERIE CUNICOLE ET UTILISATIONS
La présente invention a trait à des bactéries cunicoles isolées et identifiées, qui appartiennent à une nouvelle espèce de clostridie. Elle est également relative à une composition comprenant au moins lesdites bactéries cunicoles, notamment vivantes ou mortes, ou encore des parties de celles-ci. Elle concerne aussi l'utilisation desdites bactéries cunicoles ou de ladite composition dans la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement des entéropathies du lapin, notamment de l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et de l'entéropathie mucoïde. La présente invention est aussi relative à une méthode de prévention ou de traitement d'une entéropathie chez le lapin, ladite méthode consistant à administrer une composition conforme à l'invention audit lapin. L'entéropathie épizootique du lapin (EEL), exemple parmi d'autres d'entéropathie du lapin, est une maladie multifactorielle complexe liée aux conditions d'élevage, en particulier dans les méthodes industrielles d'élevage. La maladie sévit généralement sur les lapins en cours d'engraissement approximativement vers la 3ème semaine après le sevrage, mais aussi, bien que plus rarement, sur les femelles ou les lapereaux élevés en maternité. Cette maladie se traduit par une distension anormale de l'abdomen des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux sévèrement atteints, on peut remarquer que cette distension est causée par une dilatation excessive de l'intestin et une absence totale de tonicité iléo- caeco-colique par rapport aux animaux sains. Les références bibliographiques concernant ce sujet insistent sur des signes caeco- coliques. Cette problématique se traduit en fait par une infection hautement contagieuse, très difficile à maîtriser, ayant un impact très négatif sur les effectifs et donc sur le rendement des élevages entraînant jusqu'à 50% de mortalité voire plus dans certains cas. L'apparition et l'évolution de cette maladie sont multifactorielles et font intervenir des facteurs aussi nombreux que différents liés aux conditions environnementales (localisation géographique, saison, etc.),
aux conditions d'élevage (transition alimentaire, gestion sanitaire des bâtiments, types d'aliments, aération, regroupement des animaux, gestion des matières fécales et de la distribution de l'eau de boisson, répartition des cages, etc..) et au statut immunitaire de l'animal. Comme déjà rappelé, cette maladie se traduit par un blocage anatomo-physiologique des fonctions contractiles de la musculature constitutive de la paroi de l'intestin et du caecum entraînant une parésie irréversible. Cette parésie n'empêche cependant pas la sécrétion des mucosités qui est au contraire exacerbée. Ces mucosités finissent par s'accumuler en bouchons muqueux obturant l'intestin en de multiples endroits parfois sur plusieurs centimètres. Il n'y a pas de signes particuliers d'inflammation massive mais la paroi intestinale perd totalement sa tonicité et se relâche complètement. C'est la raison pour laquelle la dénomination première de cette pathologie (entérocolite épizootique du lapin) est maintenant de plus en plus remplacée par les termes enteropathie épizootique du lapin (EEL) écartant ainsi la notion de phénomènes inflammatoires qui ne sont pas observés. Le degré de dilatation de l'iléum peut être spectaculaire pouvant atteindre jusqu'à trois fois son diamètre habituel. Contrairement à la parésie caecale, l'EEL ne se caractérise pas par un caecum très endurci du fait de la présence de matières fécales déshydratées (consistance d'un sac de son) mais par contre elle se traduit le plus souvent par la présence d'une poche gazeuse dans le caecum proche de l'iléum et d'un gradient très liquide évoluant vers une consistance pâteuse en direction du colon. Il est d'ailleurs possible de faire pratiquement la différence entre les lapins atteints d'EEL et de parésie caecale avant l'autopsie par palpation et en appuyant avec le doigt au niveau du caecum sur l'abdomen. Si la marque du doigt reste après compression, cela signifie que l'animal est plutôt atteint de parésie caecale. Si la marque du doigt redevient invisible, l'animal est plutôt atteint d'EEL ou d'entéropathie mucoïde (confirmée après autopsie). La présence de mucus dans l'iléum et/ou le colon est indifféremment observée chez les lapins atteints d'EEL et d'entéropathie mucoïde et l'intensité secrétaire est variable en fonction de la maturation de la maladie. La présence ou non de mucus n'est donc pas un critère différentiel suffisamment pertinent pour diagnostiquer l'EEL ou
l'entéropathie mucoïde hormis peut-être le fait que le mucus produit dans le cas de l'EEL et qui tapisse la paroi de l'intestin est plus chargé en gouttelettes de gaz ce qui traduirait une activité bactérienne particulière et ce qui expliquerait la présence de poche gazeuse dans la région apicale du caecum. Consécutivement à ce phénomène de stase et à la compartimeπtation de l'intestin par les mucosités, la flore intestinale profite de la situation pour proliférer exagérément et sans contrôle. La mort de l'animal survient inévitablement et très rapidement si le problème n'est pas géré dans les temps c'est-à-dire avant les premiers signes de l'apparition de la maladie (modification d'aspect du pelage, attitude moins dynamique, prostration, modification du faciès notamment autour du museau). Aujourd'hui, cette pathologie peut être contrôlée par l'utilisation d'antibiotiques dans les aliments et dans l'eau de boisson, sans pour autant que l'agent étiologique ait été identifié. Il est donc tout à fait possible que les traitements antibiotiques reconnus efficaces agissent non pas nécessairement directement sur l'agent causal de l'entéropathie épizootique mais sur une ou plusieurs espèces bactériennes se développant de façon anormale dans la flore digestive des animaux malades. Un tel usage antibiotique n'est pas satisfaisant. Par ailleurs, il prédispose à la sélection de bactéries résistantes qui, à terme, peuvent nuire au traitement de l'EEL. La recherche de l'agent étiologique à l'origine du dérèglement de l'écosystème intestinal du lapin et l'étude approfondie de l'épidémiologie de cette pathologie émergente en voie de propagation rapide dans de nombreux pays ont mobilisé plusieurs équipes scientifiques. Une liste de références est donnée dans la présente description, après la partie « exemples ». Malheureusement, cette infection s'est avérée très complexe et il est apparu extrêmement difficile de faire la différence entre les bactéries responsables de la maladie et celles qui sont présentes consécutivement à la parésie iléo-caeco-colique. De plus, dans l'état de la technique, les bactéries identifiées ont majoritairement été isolées à partir d'échantillons prélevés sans
précautions particulières et notamment sans tenir compte des contraintes de type respiratoire très variables selon les espèces bactériennes. Dans l'état de la technique, on a aussi réalisé des cultures de prélèvements de bactéries sur des milieux artificiels afin d'effectuer leur identification, sur la base de critères biochimiques. Mais une telle opération de culture des bactéries, à partir de prélèvements, en vue d'assurer une identification précise de la flore, est impossible car seulement 20% des bactéries sont cultivables dans les meilleures conditions. II est donc tout particulièrement urgent pour l'industrie d'élevage cunicole d'identifier au moins un agent causal ou un co-facteur obligatoire nécessaire au développement des entéropathies du lapin, notamment l'EEL, afin de mettre au point des compositions utiles pour prévenir ou traiter cette pathologie. Il serait donc important de trouver une solution en alliant la rapidité et les progrès de la biotechnologie afin d'abaisser le taux de mortalité des animaux. Il était donc primordial selon le présent inventeur de tenir compte de toutes les difficultés précédemment rencontrées dans la communauté scientifique pour conserver, cultiver et identifier les bactéries. Ainsi plusieurs voies innovantes ont été entreprises par le
Demandeur afin de trouver une solution au problème mentionné et de surmonter les difficultés et inconvénients cités ci-dessus, avec deux priorités essentielles : (i) rechercher le (ou les) bactéries responsables de la maladie et (ii) mettre au point une préparation vaccinale contre les bactéries reconnues comme étant fortement impliquées dans les événements provoquant des entéropathies notamment celles initialisant l'EEL et/ou l'entéropathie mucoïde. Selon l'invention, on a isolé et caractérisé une nouvelle espèce de bactérie cunicole qui constitue un facteur obligatoire au développement des entéropathies du lapin, en particuler de l'entéropathie épizootique du lapin (EEL).
La présente invention a donc pour objet une bactérie cunicole appartenant à une nouvelle espèce, qui a été appelée Clostridium buttylinum, et dont on a montré qu'elle est phylogénétiquement proche des bactéries appartenant aux espèces Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes. Les bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum selon l'invention se caractérisent en ce que la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence de son gène codant pour l'ARN ribosomal 16S possède une identité en nucléotides supérieure à 95% avec la séquence SEQ ID N°1. Préférentiellement, une bactérie cunicole appartenant à l'espèce Clostridium buttylinum correspond aux bactéries dont la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S consiste en la séquence SEQ ID N°1. De manière tout à fait préférée, ladite bactérie consiste en la bactérie cunicole déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur sous le N° CNCM 1-3029. Préférentiellement, une bactérie cunicole de l'espèce Clostridium buttylinum selon l'invention est définie en ce que la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence de son gène codant l'ARN ribosomal 16S possède une identité en nucléotides d'au moins 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% ou 99,5%, avec la séquence SEQ ID N° 1. Plus la bactérie cunicole possède une grande identité de séquence avec la séquence SEQ ID N° 1 , plus ladite bactérie cunicole est phylogénétiquement proche ou apparentée de la bactérie cunicole Clostridium buttylinum qui a été déposée à la CNCM sous le n° I-3029. La présente invention concerne également une composition comprenant des bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum. Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend en outre des bactéries d'au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes. De même, lesdites compositions peuvent comprendre également des bactéries d'au moins une espèce bactérienne choisie parmi
Clostridium butyricυm, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de l'une des compositions décrites ci-dessus pour la préparation d'un vaccin destiné à la prophylaxie et ou au traitement des entéropathies du lapin, en particulier l'EEL. La présente invention concerne également l'utilisation de bactéries de l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum, notamment la bactérie déposée à la CNCM sous le numéro 1-3029, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des entéropathies du lapin Comme déjà indiqué précédemment, la présente invention a pour objet une bactérie cunicole appartenant à une nouvelle espèce bactérienne, phylogénétiquement proche des espèces Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes, et qui est appelée dans la présente invention Clostridium buttylinum. Une souche bactérienne a été déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-3029. Conformément à l'invention, lesdites bactéries cunicoles appartenant à la nouvelle espèce bactérienne Clostridium buttylinum sont caractérisées en ce que la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence de leur gène codant pour l'ARN ribosomal 16S possède une identité en nucléotides supérieure à 95% avec la séquence SEQ ID N°1, ladite séquence SEQ ID N°1 correspondant à la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S de la souche bactérienne CNCM I-3029 déposée. Par « pourcentage d'identité » en nucléotides entre deux acides nucléiques, on entend selon l'invention le pourcentage d'identité en nucléotides entre une première séquence de référence et une seconde séquence, ce pourcentage étant calculé en utilsant le programme « BLAST 2 Séquences [blastn] » du logiciel BLAST version 2.2.6 accessible depuis le serveur http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ du National Center for Biotechnology Information. Les paramétrages de réglage sont les suivants : (1) « Match » = 1, (2) « mismatch » = -2, (3) « Open Gap » = 5, (4) « extension gap » = 2, (5) « gap x_dropoff » = 50, (6) « expect » = 10.000000 et (7) « word size » = 11.
D'autres caractéristiques et avantages complémentaires ou alternatifs des bactéries cunicoles de l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum conformes à l'invention sont décrites ci-dessous. Après détermination de la séquence nucléotidique des 420 premiers nucléotides de l'ADN du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S de la souche CNCM I-3029, un alignement de cette séquence (SEQ ID N° 1) a été réalisé avec la séquence codant l'ARN ribosomal 16S des bactéries Clostridium botulinum de référence (SEQ ID N°2) obtenues d'une banque de données (Genbank/EMBL) sous la référence [>gi|576570|gb|L37588.1|CLORGDD. Clostridium botulinum BP2 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gène], la souche de Clostridium botulinum ayant été identifiée comme étant génétiquement la plus proche de Clostridium buttylinum. Une identité en nucléotides de 95% a été calculée c'est-à-dire 400 nucléotides identiques sur les 420 nucléotides alignés en raison de 18 mésappariements et de deux brèches (gap). En outre, ladite bactérie Clostridium buttylinum de l'invention est caractérisée en ce que son ARNr présente de préférence également une très forte identité génétique avec le matériel génétique des bactéries appartenant aux espèces Clostridium sporogenes et Clostridium novyi. Toutefois cette identité génétique n'est pas supérieure à 95% d'identité en nucléotides pour la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence de leur gène codant pour l'ARN ribosomal 16S. Ainsi, un alignement a été réalisée entre les 420 premiers nucléotides de la séquence codant l'ARN 16S des bactéries Clostridium buttylinum de la souche I-3029 (SEQ ID N°1 ) et la séquence correspondante des bactéries Clostridium sporogenes (SEQ ID N°3) obtenue à partir d'une banque de données (Denbank/EMBL) sous la référence [>gi|395963|emb|X68189.1 |CSG16S Clostridium sporogenes rrn gène for 16S RNA]. A l'instar de l'alignement entre SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2, une indentité en nucléotides de 95% a été observée entre la séquence SEQ ID N°1 et la séquence SEQ ID N°3 c'est-à-dire 400 nucléotides identiques sur les 420 nucléotides alignés en raison de 18 mésappariements et de deux brèches (gap). Par ailleurs, les bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum selon l'invention sont également proches des bactéries de l'espèce Clostridium
sporogenes. Toutefois les deux espèces bactériennes ne sont pas directement rattachées car elles ne possèdent pas le même profil enzymatique. Par exemple, les bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum possèdent les caractères « lipase négatif » et « lécithinase positif », alors que c'est l'inverse pour les bactéries de l'espèce Clostridium sporogenes. On a montré selon l'invention que les bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum sont responsables des problèmes de parésie iléo- caeco-colique rencontrés dans les entéropathies du lapin, en particulier dans l'EEL. En particulier, les bactéries de l'espèe Clostridium buttylinum favorisent le développement de bactéries appartenant à des espèces bactériennes, dites espèces émergentes, comme par exemple Clostridium difficile. Comme déjà précisé, la présente invention concerne une composition comprenant des bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum, notamment des bactéries de la souche CNCM 1-3029. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition peut avantageusement comprendre en outre des bactéries d'au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes. De même, ladite composition peut avantageusement comprendre également des bactéries d'au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène. Le demandeur a en effet pu montrer qu'une enteropathie peut être causée chez le lapin par les bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum, en particulier les bactéries de la souche CNCM 1-3029, éventuellement en combinaison avec les bactéries d'au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies mentionnées ci-dessus. D'autres caractéristiques complémentaires ou alternatives des modes de réalisation préférés de l'invention sont les suivants : Un autre objet de l'invention consiste en une composition comprenant le corps bactérien de bactéries appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum, en particulier de bactéries de la
souche CNCM 1-3029. Le corps bactérien désigne la bactérie en général, c'est-à-dire indépendamment de son état physiologique. Par conséquent, l'expression « corps bactérien » désigne indifféremment les bactéries vivantes, les bactéries vivantes mais atténuées, ou encore les bactéries tuées. Préférentiellement, ladite composition conforme à l'invention comprend le corps bactérien mort ou vivant, mais de virulence atténuée, de l'espèce Clostridium buttylinum, en particulier de la souche CNCM I- 3029. Selon un aspect particulier, la composition ci-dessus peut comprendre avantageusement en outre le corps bactérien mort ou vivant, mais de virulence atténuée, appartenant à une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène. En outre, une composition conforme à l'invention peut comprendre l'enveloppe bactérienne appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum, en particulier la souche CNCM I-3029. L'enveloppe bactérienne désigne une partie du corps bactérien qui est constituée essentiellement, sinon exclusivement, de la paroi bactérienne. Selon un aspect particulier, la composition ci -dessus comprend avantageusement en outre au moins une enveloppe bactérienne appartenant à une espèce bactérienne de Clostridies choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène. Enfin, selon un mode de réalisation particulier, une composition selon l'invention peut aussi comprendre, en plus des bactéries et/ou des corps bactériens morts ou vivants mais de virulence atténuée et/ou des enveloppes bactériennes, au moins une toxine sécrétée par au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène. Lesdites toxines présentent un grand intérêt d'un point de vue vaccinal. En effet, ce sont des produits de sécrétion des bactéries
clostridiennes et, en cela, elles sont reconnues comme un antigène par l'organisme hôte. Les toxines sécrétées par les bactéries appartenant aux espèces
Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène sont notamment décrites dans Toxigenic Clostridia.
Hatheway C. et al. Clinical Microbiology Reviews, Jan 1990 : 66-98. La ou les toxine(s) est (sont) susceptible(s) d'être obtenue(s) à partir d'un surnageant de culture d'au moins l'une desdites espèces bactériennes, selon les méthodes connues. Lesdites toxines sont soumises à des traitements physiques et/ou biochimiques dans le but d'atténuer leurs propriétés toxinogènes (anatoxines). Ainsi il est souhaitable, pour éviter l'effet des toxines naturelles qui utilisées telles quelles exerceraient un effet dévastateur, soit de diluer la quantité de toxine(s) à administrer à un organisme à traiter soit d'atténuer la virulence de ladite ou desdites toxine(s). Lorsqu'elle est diluée, une toxine conserve toutes ses propriétés mais cela rend difficile l'activation du système immunitaire dirigé contre elle. Lorsqu'on atténue la virulence toxinogène d'une toxine, on peut mettre en œuvre des quantités plus importantes afin de faciliter les phénomènes de reconnaissance entre toxine atténuée et acteurs cellulaires du système immunitaire ce qui permet à l'organisme de lutter efficacement contre des toxines naturelles hautement virulentes. Lesdites toxines sont des toxines chimères de préférence greffées sur un support protéique tel que l'albumine purifiée de sérum bovin. Lesdites bactéries, les corps bactériens et/ou les enveloppes bactériennes sont utilisés seuls ou en présence de toxines atténuées comme décrites ci-dessus. Une composition selon l'invention, lorsqu'elle est destinée à être utilisée en tant que vaccin, comprend de préférence en outre au moins un excipient adjuvant de l'immunité, comme par exemple l'hydroxyde d'aluminium. De même, ladite composition, dans son mode de réalisation d'une composition de vaccin, peut comprendre tout autre excipient pharmaceutiquement ou physiologiquement acceptable bien connu de
l'homme du métier, et adapté à la préparation de compositions vaccinales. Dans le traitement des entéropathies du lapin, ladite composition conforme à l'invention peut être associée à au moins un principe actif connu, choisi notamment dans le groupe des antibiotiques, antimicrobiens, en tenant compte des espèces de bactéries clostridies isolées conformément à l'invention. Ledit principe actif contenu dans une composition de l'invention peut consister en un principe actif qui agit notamment contre des bactéries à Gram positif et préférentiellement les bactéries appartenant au groupe des clostridies. Il est de préférence choisi dans le groupe des pleuromutilines (tiamutine) et d'autres antibiotiques anti-bactéries à Gram positif à spectre large. Lesdites compositions détaillées ci-avant peuvent être préparées selon des méthodes bien connues décrites dans « Veterinary vaccinology », P.P. Pastorel et al., Elsevier Science B.V., 1997 ;
Monographie « Vaccins pour usage vétérinaire », Pharmacopée
Européenne, 4è a édition, janvier 2004. A titre d'exemple, et comme indiqué précédemment, les composés entrant dans lesdites compositions, notamment les bactéries et/ou les toxines, peuvent être utilisés sous une forme inactivée. Pour réaliser l'inactivation, il est bien connu d'utiliser des traitements à base de formaldéhyde (Brown F.
Forma Idéhyde as an inactivant. Vaccine 1995 ; 13 : 231 ). La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition telle que définie ci-avant pour la préparation d'un vaccin destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des entéropathies du lapin, notamment l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et l'entéropathie mucoïde. De manière générale, ladite composition qui est notamment utile en tant que vaccin peut être administrée par voie sanguine, parentérale, intra-dermique, trans-cutanée, mucosale, aérienne ou orale. La présente invention a en outre pour objet une méthode de prévention ou de traitement des entéropathies du lapin, notamment l'EEL et l'entéropathie mucoïde, ladite méthode comprenant une étape consistant à administrer à un lapin souffrant d'entéropathie, ou
susceptible de contracter une enteropathie, une quantité efficace d'un point de vue immunogénique et apte à être administrée d'au moins une composition telle que définie ci avant. Dans ladite méthode de prévention et/ou de traitement, on induit de préférence la production, chez le lapin, d'anticorps anti Clostridium botulinum et/ou anti Clostridium novyi et/ou anti Clostridium sporogenes et/ou anti Clostridium buttylinum et/ou anti Clostridium difficile et/ou anti Clostridium butyricum et/ou anti Clostridium sordelli et/ou anti Clostridium perfringens entérotoxinogène. Selon la voie d'administration utilisée, il est possible d'orienter l'isotypie de l'anticorps en fonction du milieu dans lequel il devra exercer sa reconnaissance. Par voie orale, la production d'anticorps sera par exemple principalement orientée vers la synthèse des immunoglobulines secrétaires de type IgM et/ou IgA. La présence des anticorps illustre l'activation de cellules immunocompétentes qui pourront réagir contre une éventuelle infection naturelle secondaire. Lesdits anticorps réagissent de manière avantageuse contre au moins une des toxines desdites espèces bactériennes de clostridies. Ainsi, de façon surprenante, le Demandeur a découvert l'importance des clostridies et leur impact clinique dans la problématique des entéropathies du lapin notamment de l'EEL et de l'entéropathie mucoïde. Les entéropathies apparaissent donc liées au développement de bactéries appartenant à une espèce bactérienne nouvelle Clostridium buttylinum en particulier la souche déposée sous le N° 1-3029 à la CNCM, seules ou en association avec les bactéries d'au moins une autre espèce bactérienne de clostridies. On a montré selon l'invention que les agents étiologiques bactériens de l'entéropathie épizootique du lapin sont, notamment, une bactérie de l'espèce bactérienne nouvelle Clostridium buttylinum, en particulier de la souche CNCM 1-3029, seule ou en association avec des bactéries des espèces Clostridium butyricum et/ou Clostridium difficile et/ou Clostridum perfringens entérotoxinogène. L'analyse des profils de flore via la technologie innovante MCPC démontre la présence des
bactéries de l'une ou de plusieurs des espèces bactériennes précédemment citées dans la flore de lapins atteints d'entéropathie. Il est important de souligner que sans ces bactéries, il n'y aurait pas de parésie caecale. Les bactéries citées ci-avant, qui sont au départ apportées par l'environnement, ne sont pas d'emblée forcément pathogènes pour l'animal étant donné leur très faible quantité dans le tractus digestif des animaux sains. De manière tout à fait surprenante, le demandeur a réussi à isoler des bactéries identifiées comme appartenant à une espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes, qui n'a jamais auparavant été isolée du tube digestif des lapins, et qui est étroitement et largement lié à cet écosystème lorsque les lapins sont atteints d'EEL. C'est cette observation surprenante qui est à la base de la présente-invention. La structure génétique particulière des 420 premiers nucléotides de l'ADN constitutifs des gènes codant pour l'ARN ribosomal
16S ainsi que le profil enzymatique permet de confirmer l'originalité de l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum. Les bactéries appartenant à la nouvelle espèce Clostridium buttylinum présentent une identité en nucléotides de 95 % avec les bactéries de l'espèce connue Clostridium botulinum - sur la base d'une étude comparative entre la séquence génétique des 420 premiers nucléotides de l'ADN codant pour l'ARN ribosomal 16S des bactéries de l'espèce bactérienne découverte et conforme à l'invention et celle des bactéries d'une espèce bactérienne de référence et répertoriée dans une banque de données accessible à la communauté scientifique
(Genbank/EMBL). D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre pour la compréhension de laquelle il sera fait référence aux dessins annexés dans lesquels : La Figure 1 illustre la répartition spatiale d'échantillons prélevés de lapin malades et sains, la localisation de chaque spot de cette figure étant la résultante statistique qualitative et quantitative des diverses espèces bactériennes qui composent l'échantillon concerné.
Chacun des axes représentés est associé à une fonction statistique donnée et porte les valeurs quantitatives calculée pour tous les échantillons étudiés. Sur cette figure 1, les échantillons provenant de lapins sévèrement affectés par l'EEL sont matérialisés par des spots noirs (Re+ ; E+). Les échantillons provenant de lapins sains dans un environnement chroniquement affectés par l'EEL sont matérialisés par des spots blancs (Re- ; E+) et enfin les échantillons provenant de lapins sains dans un environnement n'ayant jamais été affecté par l'EEL sont matérialisés par des spots gris ( Re- ; E-). On remarque clairement une répartition spatiale différente entre les échantillons des animaux malades et ceux des animaux sains. Par contre, il n'existe pas de différence significative entre la répartition spatiale des échantillons provenant des animaux sains qu'il s'agisse d'un environnement chroniquement affecté ou non par l'EEL. Les bactéries responsables de cette différence constituent un groupe unique qui appartient à celui des clostridies. Les espèces retenues sont : Clostridium buttylinum, proche de Clostridium botulinum, Clostridium sporogenes et Clostridium novyi pour lesquelles les homologies génétiques sont importantes, Clostridium butyricum (anciennement kainantoi), Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfingens entérotoxinogène La Figure 2 illustre l'analyse par la technologie dite MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion. En partant de la gauche vers la droite sur l'axe des abscisses la barre grise représente les échantillons provenant d'animaux sévèrement affectés par l'EEL (Re+, E+). La barre blanche représente les échantillons provenant d'animaux sains dans un environnement chroniquement affecté (Re- ; E+) ou non (Re- ; E-) par l'EEL. L'axe des ordonnées reporte toutes les longueurs de fragments nucléotidiques comprises entre 214 et 258 nucléotides. On note très clairement que les échantillons provenant d'animaux malades contiennent des fragments de 229-230 nucléotides. La taille et la position de ces fragments correspondent à l'espèce Clostridium botulinum et/ou
l'espèce phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum telle que celle découverte dans la présente invention et déposée sous le numéro CNCM-l-3029. La Figure 3 illustre l'analyse par la technologie dite MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion. En partant de la gauche vers la droite sur l'axe des abscisses la barre grise représente les échantillons provenant d'animaux sévèrement affectés par l'EEL (Re+ ; E+). La barre blanche représente les échantillons provenant d'animaux sains dans un environnement chroniquement affecté (Re- ; E+) ou non (Re- ; E-) par l'EEL. L'axe des ordonnées reporte toutes les longueurs de fragments nucléotidiques comprises entre 510 et 558 nucléotides. On note très clairement que les échantillons provenant d'animaux malades contiennent des fragments de 522 nucléotides. D'après les informations recueillies par la banque de donnée, la taille et la position de ces fragments correspondent à l'espèce Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi). Cette espèce n'a jamais été isolée ni identifiée chez le lapin et le fait qu'elle puisse exprimer des gènes codant pour des neurotoxines fait de cette espèce un pathogène potentiel au même titre que l'espèce bactérienne que le présent inventeur a isolée et qui est phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum. La Figure 4 illustre l'analyse par la technologie MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion. En partant de la gauche vers la droite sur l'axe des abscisses la barre grise représente les échantillons provenant d'animaux sévèrement affectés par l'EEL (Re+ ; E+). La barre blanche représente les échantillons provenant d'animaux sains dans un environnement chroniquement affecté (Re- ; E+) ou non (Re- ; E-) par l'EEL. L'axe des ordonnées reporte toutes les longueurs des fragments nucléotidiques comprises entre 410 et 458 nucléotides. On note très clairement que les échantillons provenant d'animaux malades
contiennent des fragments de 457-458 nucléotides. La taille et la position de ces fragments correspondent à l'espèce Clostridium difficile. La Figure 5 illustre la liste des espèces bactériennes classées par ordre décroissant et présentant la plus forte homologie de séquence avec l'espèce isolée par le présent inventeur. Cette liste a été déterminée après interrogation de la banque de données intitulée Genbank / EMBL database. Certaines des figures sont illustrées en prenant comme exemple d'affection l'EEL. Toutefois la présente invention ne se limite pas à l'EEL mais concerne toutes les entéropathies du lapin en général, notamment l'entéropathie mucoïde. L'isolement des bactéries appartenant à l'espèce bactérienne de clostridie phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes ainsi que son degré d'association dans l'écosystème intestinal des lapins malades avec les espèces Clostridium difficile, Clostridium sordelli, Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi) et Clostridium perfringens entérotoxinogène a conduit le présent inventeur à imaginer la mise au point d'un vaccin constitué de corps bactériens tués avec ou sans protéines toxinogènes atténuées pour une application cunicole. La présente invention a également pour objet une méthode d'isolement des bactéries appartenant aux espèces bactériennes de clostridie et, en particulier, les bactéries de ladite nouvelle espèce Clostridium buttylinum déposées sous le N° 1-3029 à la CNCM. Ledit isolement des bactéries appartenant à l'espèce Clostridium buttylinum 1-3029 a été réalisé selon une méthode d'isolement précise. Ladite méthode d'isolement comporte avantageusement deux étapes fondamentales à savoir : I. Une étape de prélèvement des échantillons de selles de lapins en conditions anaérobies et sous couvert du froid II. Une étape d'identification par la technique dite de caractérisatioπ du profil de la communauté microbienne de la flore (MCPC : Microbial Community and Profiling Characterization)
Ladite étape de prélèvement comporte avantageusement trois phases critiques qui, de préférence, doivent être appliquées en un minimum de temps sur le site de l'élevage à savoir : (i) Une première phase consistant à recueillir les échantillons de selles sans qu'ils soient en contact avec l'air ambiant, (ii) Une deuxième phase consistant à absorber l'oxygène de l'air ambiant autour de l'organe ligaturé afin de créer une anaérobiose, (iii) Une troisième phase consistant à congeler l'échantillon le plus rapidement possible par contact avec de la glace carbonique. Ladite étape de prélèvement conforme à l'invention est suivie de ladite étape d'identification qui permet de confirmer l'identification et l'importance des espèces bactériennes citées antérieurement, en particulier dans l'étiologie de l'EEL, par le biais d'une technologie de génétique moléculaire s'affranchissant de la question de la viabilité des bactéries. Conformément à l'invention, il est appliqué la technique dite de caractérisation du profil de la communauté microbienne de la flore
(MCPC) à des échantillons intestinaux de lapins. Cette technique consiste à extraire d'un échantillon l'ADN des bactéries contenues dans cet échantillon. Ces bactéries ne sont pas nécessairement vivantes mais ont conservé leur intégrité structurale. Les gènes de l'ADN codant pour l'ARN ribosomal 16S sont amplifiés par PCR et séquentiellement découpés par des enzymes de restriction puis détectés grâce à des séquences primers fluorescentes.
Le découpage successif se traduit par des fragments de poids moléculaires spécifiques qui sont séparés sur gel en électrophorèse capillaire. Les positions relatives de chaque fragment formant des bandes dépendent de leur taille, de leur poids et de la nature des nucléotides qui les composent. L'intensité de la fluorescence permet d'avoir des données quantitatives. Chaque position de bande sur le gel correspond à
un groupe bactérien, voire même à une espèce bactérienne, au fur et à mesure des étapes de digestion enzymatique. L'espèce bactérienne à laquelle appartiennent les bactéries est identifiée par référence à une banque de données accessible à la communauté scientifique regroupant les résultats spécifiques de plus de 5000 espèces bactériennes au travers de cette technologie. Ainsi les bactéries des espèces bactériennes de clostridies
Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium botulinum,
Clostridium buttylinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, et Clostridium perfringens entérotoxinogène sont mises en évidence seules ou en association dans la problématique des entéropathies du lapin. Aussi la présente invention concerne notamment la préparation d'un vaccin en cuniculture à partir d'au moins une espèce bactérienne originale pathogène de Clostridium buttylinum, notamment la souche déposée sous le n° CNCM 1-3029, présentant 95% d'homologie avec l'espèce Clostridium botulinum et qui n'avait jamais été identifiée jusqu'ici chez le lapin. La présente invention vise aussi : * l'utilisation d'une espèce moins pathogène, toujours d'origine cunicole mais pourvue d'une paroi antigénique similaire d'un point de vue épitopique et immunogène permettant ainsi d'atténuer les risques de contamination lors d'une production industrielle de l'espèce bactérienne. Une telle espèce peut être par exemple l'espèce Clostridium novyi et/ou Clostridium sporogenes ; * un vaccin à valences multiples comportant de préférence en outre des corps bactériens appartenant aux espèces Clostridium buttylinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène. Les préparations antigéniques (ou vaccins) sont constituées de corps bactériens appartenant à l'espèce bactérienne nouvelle Clostridium buttylinum, en particulier la souche déposée sous le N° I- 3029 à la CNCM, et ou Clostridium no vyi et/ou Clostridium sporogenes et/ou Clostridium difficile et/ou Clostridium sordelli et/ou Clostridium
butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène isolées également à partir d'échantillons de lapins. Les antigènes préférentiels sont ceux qui sont représentés à la surface des bactéries appartenant à l'espèce Clostridium buttylinum en particulier à la souche déposée sous le N° 1-3029 à la CNCM, aux espèces Clostridium sporogenes, Clostridium novyi, Clostridium botulinum, car ce sont des espèces bactériennes phylogénétiquement proches de l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum, et ceux qui sont exprimés à la surface des bactéries appartenant aux espèces Clostridium difficile, Clostridum sordelli, Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi) et Clostridium perfringens entérotoxinogène. La protection effective des lapins est vérifiée en modifiant selon les expériences les voies ou modes d'administration des préparations antigéniques. La protection peut être assurée aussi bien en vaccinant les lapins en cours de croissance que les mères (dans ce cas, l'immunité est transmise par le lait maternel). Les études et recherches du Demandeur visent notamment à mettre en évidence la participation du système immunitaire général et/ou intestinal à médiation cellulaire et/ou humorale. Ainsi, les vaccins peuvent être administrés par voie sanguine, parentérale, intra-dermique, trans-cutanée, mucosale, aérienne ou orale. Ils peuvent être monovalents ou polyvalents. Ils peuvent être constitués : - de corps bactériens morts ou vivants appartenant aux espèces bactériennes de clostridies ciblées dans la présente invention - de toxines clostridiennes chimériques et greffées sur un support protéique les rendant inabsorbables permettant ainsi l'obtention d'un complexe qui présenterait les propriétés immunogènes initiales des toxines au système immunitaire local sans développer de toxicité pour l'organisme porteur.
Dans le cadre de la présente invention on entend par : • vaccin monovalent, un vaccin apte à provoquer une réponse immunitaire chez le lapin et dirigée contre un seul type d'antigène ;
* vaccin à valences multiples, un vaccin provoquant une réponse immunitaire chez le lapin dirigée contre plus d'un antigène ; • profil épitopique et immunogène, un ensemble de tout ou partie des antigènes exprimés à la surface de la paroi bactérienne et/ou tout ou partie de produits de sécrétion de la bactérie, notamment les toxines, lesdites antigènes et/ou produits de sécrétion suscitant une activation du système immunaitaire ;
Dans ce qui suit sont donnés, à titre purement illustratif et non limitatif, des exemples de réalisation des objets de l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode de prélèvement des échantillons biologiques sur le terrain Conformément à la présente invention des échantillons intestinaux sont prélevés en euthanasiant des lapins fortement atteints d'entéropathie. Cette phase préliminaire est primordiale car d'elle dépend directement le succès de la méthode. Il est en effet essentiel d'assurer la stabilité des échantillons dès leur prélèvement sur le site de l'élevage et d'éviter que les matières fécales soient en contact avec l'air ambiant. Les animaux sévèrement atteints d'entéropathie et au stade de l'agonie sont rapidement euthanasiés puis disséqués dans une ambiance chaude et sèche en prenant soin de ne pas percer la paroi intestinale. Des portions intestinales appartenant à l'iléum, au caecum et au colon sont ligaturées. Les segments délimités sont ensuite coupés en dehors des ligatures. Ces segments avec leur contenu sont transférés dans un tube stérile et ventilé, lui-même enfermé hermétiquement dans un sac muni d'un générateur d'anaérobiose hyper-actif. Les sacs sont ensuite placés dans de la carboglace pilée à -70°C afin de figer les bactéries présentes le plus rapidement possible dans les matières fécales. Ces sacs peuvent également être remplacés par des flacons en verre de faibles contenances, stériles et munis de 2 cannelures plastifiées bouchées avec du coton cardé et fermées avec une pince métallique. Une de ces cannelures permet d'injecter du gaz ( type CO2 ou N2) via des bouteilles de gaz de faible capacité et sous
pression alors que la deuxième cannelure permet l'échappement de l'air ambiant. Un indicateur d'anaérobiose permet alors de certifier dans le flaconnage la formation d'une atmosphère anaérobie en un minimum de temps. Entre le moment où les segments intestinaux sont détachés de l'animal et le moment où ils sont congelés, de manière très avantageuse, il ne doit pas s'écouler plus de 2 minutes. Ces conditions draconiennes de prélèvements sont très avantageuses pour éviter la destruction massive des espèces bactériennes anaérobies présentes dans la partie distale du tube digestif et pour assurer la conservation de l'intégrité structurale des corps bactériens, l'objectif à atteindre étant non seulement d'optimiser l'identification des bactéries via la technologie MCPC mais également d'être en mesure d'isoler les germes intéressants à l'issue des résultats d'analyse.
Exemple 2 : Méthode d'identification et d'isolement des espèces bactériennes impliquées dans l'EEL Les analyses des prélèvements ont été réalisées selon un procédé original qui permet d'identifier les bactéries tout en s'affranchissant de la viabilité des bactéries contrairement aux techniques conventionnelles. Cette technologie appelée MCPC (Microbial Community Profiling and Characterisation) n'a jamais été réalisée sur des échantillons de lapins et peut mettre en évidence un nombre très important d'espèces bactériennes aussi bien minoritaires que difficilement cultivables en se référant à un large répertoire de gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S spécifiques à chacune des espèces recherchées. La technologie dite MCPC a ainsi permis de mettre en évidence une association de bactéries jusqu'alors insoupçonnée dans la problématique de l'EEL. Pour ce faire il a été procédé à des comparaisons entre des échantillons de selles obtenus de lapins sains âgés de 56 jours provenant d'un environnement naturel n'ayant jamais connu d'épisode d'EEL, des échantillons d'animaux sains provenant d'un
environnement subissant une EEL chronique et ceux d'animaux malades provenant d'un environnement subissant une EEL chronique. En référence à la Fig. 1, une étude de la répartition graphique des échantillons dans l'espace en fonction de la composition bactérienne et du nombre respectif de chaque espèce représentée par échantillon permet de confirmer 1) que la flore des animaux sains était radicalement différente de celle des animaux sévèrement malades issus d'un même élevage subissant une EEL chronique; 2) que les flores des animaux sains étaient très proches voire identiques que l'environnement soit ou non chroniquement affecté par des épisodes d'EEL. 3) que la répartition très significativement différente des échantillons provenant exclusivement d'animaux affectés est causée par la présence significative et jusqu'alors insoupçonnée d'une association de bactéries appartenant au grand groupe desdites clostridies. Comme illustré à la Fig. 2, à la Fig. 3 et à la Fig. 4, une analyse fine de la composition et de la longueur des fragments d'ADN a permis clairement d'identifier en particulier 3 espèces bactériennes, une espèce ayant une valeur de P457 ( nombre de nucléotides ) correspondant à Clostridium difficile et une espèce ayant une valeur de P229/P230 correspondant à l'espèce phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ; Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli et qui a été isolée par l'inventeur du présent document et déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-3029. Les caractéristiques intrinsèques de ces espèces permettent au Demandeur, par le biais de la technologie dite MCPC, d'affirmer que ces germes sont associés dans la phase aiguë de l'EEL. L'espèce nouvelle découverte par l'inventeur et identifiée comme étant phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum est responsable de facteurs initialisant les problèmes de parésie iléo-caeco- colique alors que les espèces Clostridium difficile et Clostridium butyricum sont des espèces pathogènes plutôt émergentes qui profitent de la stase de l'écosystème pour se développer et amplifier la pathologie de la maladie par la sécrétion respectivement de toxines A et B et de neurotoxines
Exemple 3 : Identification comparative entre l'espèce bactérienne découverte et les espèces bactériennes existantes appartenant au groupe des clostridies. Plusieurs laboratoires de notoriété publique (Institut Pasteur : Centre National de Référence des bactéries anaérobies) et des Instituts Européens spécialisés en génie génétique sont d'accord pour confirmer que le profil enzymatique de l'espèce bactérienne et l'identification des 420 premiers nucléotides qui constituent la séquence de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S ne permettent pas d'affilier cette espèce précisément à une espèce actuellement connue. Comme illustré à la Fig. 5, les résultats obtenus auprès d'une banque de données montrent que les espèces qui présentent les homologies génétiques les plus proches avec l'espèce bactérienne de clostridie découverte par l'inventeur sont Clostridium botυlinum et Clostridium sporogenes. L'alignement de la séquence des 420 premiers nucléotides montre une homologie de l'ordre de 95% avec l'espèce Clostridium botulinum. L'espèce conforme à l'invention qui a été isolée est propre au tube digestif des lapins et n'est pas toxinogène.
Exemple 4 : composition vaccinale L'isolement des bactéries appartenant à la nouvelle espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes a conduit le Demandeur à la mise au point d'un vaccin constitué de corps bactériens tués ou vivants mais de virulence atténuée appartenant à cette nouvelle espèce ainsi qu'aux espèces phylogénétiquement proches, avec ou sans protéines toxinogènes atténuées. L'aspect innovant de cette mise au point d'une préparation vaccinale consiste à protéger un lapin contre l'entéropathie épizootique ou l'entéropathie mucoïde en utilisant : (i) soit une enveloppe bactérienne de bactéries appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum
(ii) soit une enveloppe bactérienne de bactéries appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum en combinaison avec des enveloppes bactériennes de bactéries appartenant à des espèces différentes émergentes ou non telles que Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène.; (iii) soit en utilisant une enveloppe bactérienne de bactéries appartenant à une autre espèce telle que Clostridium botulinum, Clostridium novyi ou Clostridium sporogenes, possédant un profil épitopique et immunogène commun à celui de l'espèce bactérienne conforme à la présente invention, en combinaison ou non avec des enveloppes bactériennes appartenant à des espèces différentes émergentes ou non telles que Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium sordelli et Clostridium perfringens entérotoxinogène. (iv) soit en utilisant une préparation obtenue de combinaisons simples ou complexes comportant les éléments toxinogènes et/ou bactériens cités précédemment.
Exemple 5 : Tests validant ces faits et réalisés chez le lapin. Les animaux sont immunisés : • soit avec la souche appartenant à l'espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum, Clostridium novyi et Clostridium sporogenes conforme à l'invention, • soit avec une souche appartenant à l'espèce Clostridium botulinum de type C d'origine cunicole, • soit avec une souche de l'espèce bactérienne Clostridium novyi d'origine cunicole, • soit avec une souche d'origine cunicole appartenant aux espèces bactériennes Clostridium sporogenes et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium difficile et/ou
Clostridium sordelli et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène, soit avec une association de deux ou plusieurs souches appartenant aux espèces précédemment citées, soit avec des combinaisons variables de toxines sécrétées issues de gènes codant pour des toxines de type C1, C2, C3 ;
D ; A ; B ou apparentées, soit avec la combinaison bactéries/particules toxinogènes.
REFERENCES
Epizootic enterocolitis of the rabbit : a review of current research. Licois D et al.. World Rabbit Science, 2000, Vol.8 (Suppl.1) : 187-194.
Caecal microflora of growing-rabbits affected by a non spécifie enteropathy. Bennegadi N et al. Reproduction Nutrition Development, 2002, 42 ( Suppl. 1 : S 15). Note d'information sur les travaux de recherche conduits sur l'entérocolite épizootique du lapin. Lebas F et al., Entérocolite du Lapin, 2002, Note n°3 : 1-3.
TABLEAU 1 : COMPARAISON DE SEQUENCES
Espèce bactérienne de Référence (ligne inférieure), banque de données Genbank/EMBL avec en regard (ligne supérieure) l'espèce bactérienne isolée conforme à l'invention CNCM N° I-3029. gtaccgtcattatgttcccagaaaacagggctttacaatccgaagaccttcatcacccac 60
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I INI I I I I I I I II I I I I gtaccgtcattatcgtcccagaaaacagggctttacaatccgaagaccttcatcacccac 371
gcggcgttgctgcgtcagggtttcccccatttgcgcaatatgccccacggctgcctcccg 120
Mil Mil I I 11 M 11 I 111111 I I I 11 I I III III gcggsgttgntgcgtcagggtttcccccatt-gngcaatattccccactgctgcctcccg 312
taggagtctggaccgtgttctcagttccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctac 180 M II II II I I I I I I MM I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I taggagtctggaccgtgt-ctcagttccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctac 253
gcatcgttgccttggtaggccgttaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatct 2 0 M II II M I I II I II III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I gcatcgttgocttggtaggccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatct 193
caaagcgataaatctttgataagataatcatgccaatttctcatattatgcggtattaat 300 III II lllll I I I III III Mil caaagcaataaatctttgataagaaaatcatgcgattatcttatattatgcggtattaat 133
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ccgccgctaatccacttcccgaaggaagcttcatcgctcgacttgcatgtgttaagcacg 420 11 II M M I M I I 11 II M I I 11 II I M 1111 M 111111 M I II I I II II M II 111 I I ccgccgctaatccacttcccgaaggaagcttcatcgctcgacttgcatgtgttaagcacg 13
Après détermination de la séquence nucléotidique des 420 premiers nucléotides de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN
ribosomal 16S, un alignement de séquences a été réalisée entre l'espèce isolée par l'inventeur et l'espèce Clostridium botulinum de référence obtenue d'une banque de données :
[>gi|576570|gb|L37588.1|CLORGDD. Clostridium botulinum BP2 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gène] identifiée comme étant génétiquement la plus proche. Une identité en nucléotides de 95% est observée c'est-à- dire 400 nucléotides identiques sur les 420 alignés en raison de 18 mésappariements et de deux brèches.
TABLEAU 2 : COMPARAISON DE SEQUENCES
Espèce bactérienne Clostridium sporogenes (séquence incluse dans la séquence SEQ ID N°3, ligne inférieure), banque de données Genbank/EMBL avec en regard (ligne supérieure) l'espèce bactérienne isolée conforme à l'invention CNCM N° 1-3029. qt:':_ tacgt .^ caat.roα ac i l ! I I i ! ' I l i l M ! M l M tcatca_ogt. e-^atceα&a-: cαg g tgctg≈qtc :cat . hg-gc atactfccec&cgαe ccLccc IZ j i M M !.! ι j j.U M. I l M' l'i i l! I M U 1 gc^ cç fegGiç σtTcaçgq ttccc t-g gc^aia ccccao c gcçtç cg 343
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Après détermination de la séquence nucléotidique des 420 premiers nucléotides de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S, un alignement de séquences a été réalisée entre l'espèce isolée par l'inventeur et l'espèce Clostridium sporogenes obtenue d'une banque de données :
[>gi|395963|emb|X68189.1 |CSG16S[395963]. Clostridium sporogenes rrn gène for 16S ribosomal]. Une identité en nucléotides de 95% est observée c'est-à-dire 400 nucléotides identiques sur les 420 alignés en raison de 18 mésappariements et de deux brèches.