FR2858330A1 - Espece bacterienne de clostridie isolee chez le lapin, methode d'isolement et de diagnostic in vitro d'especes bacteriennes de clostridies, composition et vaccin contre les enteropathies du lapin - Google Patents
Espece bacterienne de clostridie isolee chez le lapin, methode d'isolement et de diagnostic in vitro d'especes bacteriennes de clostridies, composition et vaccin contre les enteropathies du lapin Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention a trait à des espèces bactériennes isolées et identifiées de clostridies à une composition en dérivant comprenant au moins une espèce bactérienne appartenant au groupe des clostridies isolées et identifiées, à une utilisation d'au moins une desdites espèces bactériennes ou de ladite composition dans la préparation d'un vaccin destiné au traitement des entéropathies du lapin, notamment l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et l'entéropathie mucoïde, à une méthode d'isolement de telles espèces bactériennes chez le lapin, à un kit et à une méthode de diagnostic in vitro de la présence chez le lapin d'une telle espèce bactérienne.
Description
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La présente invention a trait à des espèces bactériennes isolées et identifiées de clostridies, à une composition en dérivant comprenant au moins une espèce bactérienne appartenant au groupe des clostridies isolées et identifiées, à une utilisation d'au moins une desdites espèces bactériennes ou de ladite composition dans la préparation d'un vaccin destiné au traitement des entéropathies du lapin, notamment l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et l'entéropathie mucoïde, à une méthode d'isolement de telles espèces bactériennes chez le lapin, à un kit et à une méthode de diagnostic in vitro de la présence chez le lapin d'une telle espèce bactérienne, et enfin à une méthode de traitement d'une entéropathie chez le lapin consistant à administrer une composition conforme à l'invention audit lapin.
L'entéropathie épizootique du lapin (EEL), exemple parmi d'autres d'entéropathie du lapin, est une maladie multifactorielle complexe liée aux conditions d'élevages en particulier industrielles. La maladie sévit généralement sur les lapins en cours d'engraissement approximativement vers la 3ème semaine après le sevrage, mais aussi plus rarement, sur les femelles ou les lapereaux élevés en maternité.
Cette maladie se traduit par une distension anormale de l'abdomen des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux sévèrement atteints on peut remarquer que cette distension est causée par une dilatation excessive de l'intestin et une absence totale de tonicité iléo-caeco-colique par rapport aux animaux sains. Les références bibliographiques concernant ce sujet insistent sur des signes caeco-coliques.
Cette problématique se traduit en fait par une infection hautement contagieuse, très difficile à maîtriser, ayant un impact très négatif sur les effectifs et donc sur le rendement des
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élevages entraînant jusqu'à 50% de mortalité voire plus dans certains cas.
L'apparition et l'évolution de cette maladie sont multifactorielles et font intervenir des facteurs aussi nombreux que différents liés aux conditions environnementales (localisation géographique, saison, etc..), aux conditions d'élevage (transition alimentaire, gestion sanitaire des bâtiments, types d'aliments, aération, regroupement des animaux, gestion des matières fécales et de la distribution de l'eau de boisson, répartition des cages, etc...) et au statut immunitaire de l'animal.
Comme déjà rappelé, cette maladie se traduit par un blocage anatomo-physiologique des fonctions contractiles de la musculature constitutive de la paroi de l'intestin et du caecum entraînant une parésie irréversible. Cette parésie n'empêche cependant pas la sécrétion des mucosités qui est au contraire exacerbée. Ces mucosités finissent par s'accumuler en bouchons muqueux obturant l'intestin en de multiples endroits parfois sur plusieurs centimètres. Il n'y a pas de signes particuliers d'inflammation massive mais la paroi intestinale perd totalement sa tonicité et se relâche complètement. C'est la raison pour laquelle la dénomination première de cette pathologie (entérocolite épizootique du lapin) est maintenant de plus en plus remplacée par les termes entéropathie épizootique du lapin (EEL) écartant ainsi la notion de phénomènes inflammatoires qui ne sont pas observés. Le degré de dilatation de l'iléum peut être spectaculaire pouvant atteindre jusqu'à 3 fois son diamètre habituel. Contrairement à la parésie caecale, l'EEL ne se caractérise pas par un caecum très endurci du fait de la présence de matières fécales déshydratées (consistance d'un sac de son) mais par contre elle se traduit le plus souvent par la présence d'une poche gazeuse dans le caecum proche de l'iléum et d'un
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gradient très liquide évoluant vers une consistance pâteuse en direction du colon. Il est d'ailleurs possible de faire pratiquement la différence entre les lapins atteints d'EEL et de parésie caecale avant l'autopsie par palpation et en appuyant avec le doigt au niveau du caecum sur l'abdomen. Si la marque du doigt reste après compression, cela signifie que l'animal est plutôt atteint de parésie caecale. Si la marque du doigt redevient invisible, l'animal est plutôt atteint d'EEL ou d'entéropathie mucoïde (confirmée après autopsie). La présence de mucus dans l'iléum et/ou le colon est indifféremment observée chez les lapins atteints d'EEL et d'entéropathie mucoïde et l'intensité sécrétoire est variable en fonction de la maturation de la maladie. La présence ou non de mucus n'est donc pas un critère différentiel suffisamment pertinent pour diagnostiquer l'EEL ou l'entéropathie mucoïde hormis peut-être le fait que le mucus produit dans le cas de l'EEL et qui tapisse la paroi de l'intestin est plus chargé en gouttelettes de gaz ce qui traduirait une activité bactérienne particulière et ce qui expliquerait la présence de poche gazeuse dans la région apicale du caecum.
Consécutivement à ce phénomène de stase et à la compartimentation de l'intestin par les mucosités, la flore intestinale profite de la situation pour proliférer exagérément et sans contrôle.
La mort de l'animal survient inévitablement et très rapidement si le problème n'est pas géré dans les temps c'est-àdire avant les premiers signes de l'apparition de la maladie (modification d'aspect du pelage, attitude moins dynamique ; prostration, modification du faciès notamment autour du museau).
La recherche de l'agent étiologique à l'origine du dérèglement de l'écosystème intestinal du lapin et l'étude
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approfondie de l'épidémiologie de cette pathologie émergente en voie de propagation rapide dans de nombreux pays ont mobilisé plusieurs équipes scientifiques.
Une liste de références est donnée après la partie exemples .
Malheureusement, cette infection s'est avérée très complexe et il est apparu extrêmement difficile de faire la différence entre les micro-organismes responsables de la maladie et ceux qui sont présents consécutivement à la parésie iléocaeco-colique.
De plus, les micro-organismes identifiés ont majoritairement été isolés à partir d'échantillons prélevés sans précautions particulières et notamment sans tenir compte des contraintes de type respiratoire très variables selon les espèces bactériennes.
Des cultures de bactéries à partir des prélèvements sur des milieux artificiels ont été tentées pour réaliser ensuite des identifications sur la base de critères biochimiques. Il faut savoir qu'une telle opération à partir de prélèvements est un obstacle démesuré pour assurer une identification précise de la flore car seulement 20% des bactéries sont cultivables dans les meilleures conditions.
Aujourd'hui, cette pathologie peut être contrôlée par l'utilisation d'antibiotiques dans les aliments et dans l'eau de boisson, sans pour autant que l'agent étiologique ait été identifié.
Il est donc tout à fait possible que les traitements antibiotiques reconnus efficaces agissent non pas nécessairement directement sur l'agent causal de l'entéropathie épizootique mais
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sur une ou plusieurs espèces bactériennes se développant de façon anormale dans la flore digestive des animaux malades. Un tel usage antibiotique n'est pas satisfaisant ; par ailleurs il prédispose à la sélection de bactéries résistantes qui, à terme, peuvent nuire au traitement de l'EEL.
Il est donc tout particulièrement urgent pour cette filière de trouver une solution en alliant la rapidité et les progrès de la biotechnologie afin d'abaisser le taux de mortalité des animaux.
Il était donc primordial selon le présent inventeur de tenir compte de toutes les difficultés précédemment rencontrées dans la communauté scientifique pour conserver, cultiver et identifier les bactéries.
Ainsi plusieurs voies innovantes ont été entreprises par le Demandeur afin de trouver une solution au problème mentionné et de surmonter les difficultés et inconvénients cités ci-dessus, avec deux priorités essentielles : (i) rechercher le (ou les) microorganisme(s) (bactéries et/ou virus) responsables de la maladie et (ii) mettre au point une préparation vaccinale contre le (ou les) microorganisme(s) reconnu(s) comme étant fortement impliqué(s) dans les évènements provoquant des entéropathies notamment ceux initialisant l'EEL et/ou l'entéropathie mucoïde.
Afin de pallier les inconvénients des techniques antérieures, exposés ci-avant, la présente invention propose une espèce bactérienne cunicole - associée ou non à son bactériophage spécifique- qui appartient à une espèce nouvelle
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phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ; Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes ; Clostridium sordelli et qui est appelée dans la présente invention Clostridium buttylinum. Cette espèce bactérienne a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur sous le N CNCM 1-3029.
La présente invention concerne également une composition comportant au moins une espèce bactérienne de clostridies choisie dans le groupe constitué par Clostridium buttylinum CNCM 1-3029, et par des clostridies présentant un profil épitopique et immunogène commun avec ladite Clostridium buttylinum CNCM 1- 3029 telles que Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli, et/ou au moins un virus d'au moins l'une desdites espèces bactériennes de clostridies, ladite composition étant apte à protéger un lapin contre une entéropathie du lapin.
La dite composition comporte de préférence en outre au moins une espèce bactérienne de clostridies choisie dans le groupe constitué par Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène et/ou comporte au moins un virus d'au moins l'une de ces espèces bactériennes de clostridies, ladite composition étant apte à protéger un lapin contre une entéropathie du lapin.
La présente invention concerne encore une utilisation de ladite composition dans la préparation d'un vaccin contre les entéropathies du lapin, ainsi qu'une méthode pour l'isolement chez le lapin desdites espèces bactériennes de clostridies, une méthode et un kit de diagnostic in vitro d'au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies impliquées dans les entéropathies chez le lapin.
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Aussi la présente invention a plus particulièrement pour objet : # Une espèce bactérienne cunicole associée ou non à son bactériophage spécifique, phylogénétiquement proche des espèces Clostridium botulinum ; Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes ; Clostridium sordelli et qui est appelée dans la présente invention Clostridium buttylinum. Ladite espèce bactérienne a été déposée à la
CNCM sous le numéro CNCM 1-3029.
CNCM sous le numéro CNCM 1-3029.
D'autres caractéristiques et avantages complémentaires ou alternatifs de l'espèce bactérienne cunicole conforme à l'invention sont donnés ci-dessous : # Après détermination de la séquence nucléotidique des
420 premiers nucléotides de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S, un alignement de cette séquence a été réalisé entre l'espèce isolée par l'inventeur (SEQ ID N 1) et l'espèce Clostridium botulinum de référence (SEQ ID N 2) obtenue d'une banque de données (Genbank/EMBL) sous la référence [>gi#576570#gb#L37588.1#CLORGDD. Clostridium botulinum BP2 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gène] identifiée comme étant génétiquement la plus proche.
420 premiers nucléotides de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S, un alignement de cette séquence a été réalisé entre l'espèce isolée par l'inventeur (SEQ ID N 1) et l'espèce Clostridium botulinum de référence (SEQ ID N 2) obtenue d'une banque de données (Genbank/EMBL) sous la référence [>gi#576570#gb#L37588.1#CLORGDD. Clostridium botulinum BP2 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gène] identifiée comme étant génétiquement la plus proche.
Une homologie de 95% a été observée ( 402 nucléotides sur 420 ) ; # ladite espèce déposée à la CNCM sous le N I-3029 est caractérisée en ce que l'ARNr 16S de ladite espèce présente de préférence également une très forte
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homologie génétique avec le matériel génétique des bactéries appartenant aux espèces Clostridium sporogenes et Clostridium novyi ; # ladite espèce déposée à la CNCM sous le N 1-3029 est également proche de l'espèce Clostridium sporogenes mais ne peut pas lui être directement rattachée car elle ne possède pas le même profil enzymatique. Par exemple, ladite espèce possède les caractères lipase négatif et lécithinase positif alors que c'est l'inverse pour l'espèce Clostridium sporogenes , # ladite espèce est responsable de facteurs initialisant les problèmes de parésie iléo-caeco-colique ; # ladite espèce exprime une ou plusieurs toxines héritées ou non d'un virus bactériophage spécifique ; # ladite espèce exprime de manière constitutive et/ou inductible une ou un ensemble de toxines, comme par exemple des toxines botuliniques ou apparentées héritées ou non de bactériophages spécifiques ; # lesdites toxines ont pour effet d'affecter les transmissions du système nerveux autonome en altérant la sécrétion d'acétylcholine au niveau des synapses ; # lesdites toxines sont des toxines de type C (C1 , C2 ou
C3) et D ou apparentées ; # ladite espèce favorise le développement d'espèces bactériennes dites espèces émergentes, comme par exemple, Clostridium difficile.
C3) et D ou apparentées ; # ladite espèce favorise le développement d'espèces bactériennes dites espèces émergentes, comme par exemple, Clostridium difficile.
Comme déjà précisé, la composition conforme à la présente invention comporte au moins une espèce bactérienne de clostridies choisie dans le groupe constitué par Clostridium buttylinum CNCM I-3029, et par des clostridies présentant un
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profil épitopique et immunogène commun avec ladite Clostridium buttylinum CNCM 1-3029 choisies dans le groupe constitué par Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli, et/ou au moins un virus d'au moins l'une desdites espèces bactériennes de clostridies, ladite composition étant apte à protéger un lapin contre une entéropathie du lapin.
Ladite composition peut avantageusement comporter en outre au moins une espèce bactérienne de clostridies choisie dans le groupe constitué par Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène et/ou comportant au moins un virus d'au moins l'une desdites espèces bactériennes de clostridies, ladite composition étant apte à protéger un lapin contre une entéropathie du lapin
L'inventeur de la présente invention a en effet pu montrer qu'une entéropathie peut être causée chez le lapin par au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies mentionnées ci-dessus.
L'inventeur de la présente invention a en effet pu montrer qu'une entéropathie peut être causée chez le lapin par au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies mentionnées ci-dessus.
D'autres caractéristiques complémentaires ou alternatives des modes de réalisation préférés de l'invention sont les suivants : # De préférence ladite composition conforme à l'invention comporte au moins un moyen bactérien issu d'au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies telles que définies ci-avant.
# Mieux encore, ladite composition comporte au moins un moyen bactérien issu d'au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies tuées ou vivantes mais de virulence atténuée.
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# De préférence, ledit au moins un moyen bactérien est un corps bactérien ou une enveloppe bactérienne issu d'une desdites espèces bactériennes de clostridies.
# ledit corps ou ladite enveloppe bactérienne comporte au moins une structure antigénique propre à la paroi ou à l'enveloppe d'une desdites espèces bactériennes de clostridies ; # la composition conforme à l'invention est susceptible d'être obtenue à partir d'une paroi ou d'une enveloppe d'une espèce bactérienne de clostridies possédant un profil épitopique et immunogène commun à celui de
Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la
CNCM ; # ladite composition comporte au moins une structure antigénique propre à la paroi d'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant et notamment de Clostridium novyi et/ou de Clostridium sporogenes et/ou de Clostridium sordelli et/ou de Clostridium botulinum et/ou de l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM et associée ou non à une structure antigénique propre à la paroi de Clostridium difficile et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # ladite composition est susceptible d'être obtenue à partir d'une enveloppe bactérienne appartenant à l'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci- avant notamment Clostridium botulinum et/ou Clostridium sporogenes et/ou l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM et associée ou non à une structure antigénique propre à la paroi de Clostridium difficile et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène ;
Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la
CNCM ; # ladite composition comporte au moins une structure antigénique propre à la paroi d'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant et notamment de Clostridium novyi et/ou de Clostridium sporogenes et/ou de Clostridium sordelli et/ou de Clostridium botulinum et/ou de l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM et associée ou non à une structure antigénique propre à la paroi de Clostridium difficile et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # ladite composition est susceptible d'être obtenue à partir d'une enveloppe bactérienne appartenant à l'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci- avant notamment Clostridium botulinum et/ou Clostridium sporogenes et/ou l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM et associée ou non à une structure antigénique propre à la paroi de Clostridium difficile et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène ;
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# ladite composition est susceptible d'être obtenue à partir d'une enveloppe appartenant à une espèce bactérienne de clostridie beaucoup moins pathogène que l'espèce
Clostridium botulinum, mais possédant un profil épitopique et immunogène commun à celui de
Clostridium botulinum tel que celui de Clostridium sporogenes et/ou Clostridium novyi et/ou Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM ; # ladite composition comporte au moins une structure antigénique propre aux produits de sécrétion d'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci- avant, en particulier de Clostridium sporogenes et/ou de
Clostridium novyi et/ou de Clostridium botulinum et/ou de l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM, et associée ou non à une structure antigénique propre aux produits de sécrétion de Clostridium difficile, Clostridium butyricum et
Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # ladite au moins une structure antigénique est susceptible d'être obtenue à partir d'un surnageant de culture desdites espèces bactériennes ; # ladite au moins une structure antigénique est susceptible d'être obtenue à partir de toxines clostridiennes spécifiques héritées ou non de bactériophages telles que celles produites par l'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant notamment l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-
3029 à la CNCM, et/ou celles produites par Clostridium novyi ou Clostridium difficile ou Clostridium butyricum ou
Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # lesdites toxines sont soumises à des traitements physiques et/ou biochimiques dans le but d'atténuer leurs propriétés toxinogènes (anatoxines). Ainsi il est
Clostridium botulinum, mais possédant un profil épitopique et immunogène commun à celui de
Clostridium botulinum tel que celui de Clostridium sporogenes et/ou Clostridium novyi et/ou Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM ; # ladite composition comporte au moins une structure antigénique propre aux produits de sécrétion d'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci- avant, en particulier de Clostridium sporogenes et/ou de
Clostridium novyi et/ou de Clostridium botulinum et/ou de l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM, et associée ou non à une structure antigénique propre aux produits de sécrétion de Clostridium difficile, Clostridium butyricum et
Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # ladite au moins une structure antigénique est susceptible d'être obtenue à partir d'un surnageant de culture desdites espèces bactériennes ; # ladite au moins une structure antigénique est susceptible d'être obtenue à partir de toxines clostridiennes spécifiques héritées ou non de bactériophages telles que celles produites par l'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant notamment l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-
3029 à la CNCM, et/ou celles produites par Clostridium novyi ou Clostridium difficile ou Clostridium butyricum ou
Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # lesdites toxines sont soumises à des traitements physiques et/ou biochimiques dans le but d'atténuer leurs propriétés toxinogènes (anatoxines). Ainsi il est
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souhaitable, pour éviter l'effet des toxines naturelles, qui utilisées telles quelles, exerceraient un effet dévastateur, soit de diluer la quantité de toxine(s) à administrer à un organisme à traiter soit d'atténuer la virulence de ladite ou desdites toxine(s). Lorsqu'elle est diluée, une toxine conserve toutes ses propriétés mais cela rend difficile l'activation du système immunitaire dirigé contre elle. Lorsqu'on atténue la virulence toxinogène d'une toxine on peut mettre en #uvre des quantités plus importantes afin de faciliter les phénomènes de reconnaissance entre toxine atténuée et acteurs cellulaires du système immunitaire ce qui permet à l'organisme de lutter efficacement contre des toxines naturelles hautement virulentes ; # lesdites toxines sont des toxines chimères de préférence greffées sur un support protéique tel que l'albumine purifiée de sérum bovin ; # ladite au moins une structure antigénique comporte des corps bactériens d'une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant ; # lesdits corps bactériens sont utilisés seuls ou en présence de toxines atténuées comme décrites ci- dessus.
# ladite composition apte à protéger un lapin contre une entéropathie comporte au moins un moyen issu d'au moins un bactériophage spécifique d'au moins une desdites espèces bactériennes de clostridies citées ci- avant ; # ledit moyen comporte au moins une structure antigénique d'origine capsidique appartenant au bactériophage spécifique des espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant ;
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# ledit moyen comporte au moins une structure antigénique d'origine nucléotidique appartenant au bactériophage spécifique des espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant ; # ledit moyen comporte au moins une fraction nucléotidique virale inabsorbable ni par les bactéries ni par les cellules de l'intestin ; # ledit moyen comporte au moins une fraction nucléotidique virale modifiée en ajoutant une structure moléculaire lipophobe renforçant le caractère inabsorbable de la molécule et en cyclisant la molécule afin de la rendre résistante aux actions protéolytiques des enzymes du tube digestif ; # ledit moyen comporte au moins une fraction nucléotidique virale inabsorbable en association avec au moins une fraction nucléotidique virale modifiée comme décrit ci- avant ; # ladite composition conforme à l'invention comporte en outre au moins une valence antigénique appartenant à au moins une des espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant ; # ladite au moins une valence étant dépendante ou non de l'expression d'au moins un gène contenu dans un bactériophage spécifique et dont l'acide nucléique est intégré dans le génome bactérien d'au moins une espèce bactérienne de clostridies citées ci-avant ; # ledit au moins un gène, qui est intégré dans le génome du bactériophage, code pour au moins une toxine spécifique des espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant ; # ladite composition utile en tant que vaccin comprend de préférence en outre au moins un excipient tel que l'hydroxyde d'aluminium.
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La présente invention a également pour objet : # Une utilisation d'une composition telle que définie ci- avant dans la préparation d'un vaccin monovalent ou polyvalent destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des entéropathies du lapin notamment l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et l'entéropathie mucoïde. De manière générale ladite composition qui est notamment utile en tant que vaccin peut être administrée par voie sanguine, parentérale, intra-dermique, trans-cutanée, mucosale, aérienne ou orale.
La présente invention a également pour objet : # Une méthode d'isolement desdites espèces bactériennes de clostridies et en particulier de ladite nouvelle espèce
Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la
CNCM ; # La dite méthode d'isolement comporte avantageusement deux étapes fondamentales :
I. Une étape de prélèvement des échantillons de selles de lapins en conditions anaérobies et sous couvert du froid
II. Une étape d'identification par la technique dite de caractérisation du profil de la communauté microbienne de la flore (MCPC : Microbial Community and Profiling Characterization) # Ladite étape de prélèvement comporte avantageusement trois phases critiques qui de préférence doivent être appliquées en un minimum de temps sur le site de l'élevage :
Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la
CNCM ; # La dite méthode d'isolement comporte avantageusement deux étapes fondamentales :
I. Une étape de prélèvement des échantillons de selles de lapins en conditions anaérobies et sous couvert du froid
II. Une étape d'identification par la technique dite de caractérisation du profil de la communauté microbienne de la flore (MCPC : Microbial Community and Profiling Characterization) # Ladite étape de prélèvement comporte avantageusement trois phases critiques qui de préférence doivent être appliquées en un minimum de temps sur le site de l'élevage :
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(i) La première phase consiste à recueillir les échantillons de selles sans qu'ils soient en contact avec l'air ambiant, (ii) La deuxième phase consiste à absorber l'oxygène de l'air ambiant autour de l'organe ligaturé afin de créer une anaérobiose, (iii) La troisième phase consiste à congeler l'échantillon le plus rapidement possible par contact avec de la glace carbonique.
# Ladite étape de prélèvement conforme à l'invention est suivie de ladite étape d'identification qui permet de confirmer l'identification et l'importance des espèces bactériennes citées antérieurement, en particulier dans l'étiologie de l'EEL, par le biais d'une technologie de génétique moléculaire s'affranchissant de la question de la viabilité des bactéries.
Conformément à l'invention, il est appliqué la technique dite de caractérisation du profil de la communauté microbienne de la flore (MCPC) à des échantillons intestinaux de lapins. Cette technique consiste à extraire d'un échantillon l'ADN des bactéries contenues dans cet échantillon. Ces bactéries ne sont pas nécessairement vivantes mais ont conservé leur intégrité structurale.
Les gènes de l'ADN codant pour l'ARN ribosomal 16S sont amplifiés par PCR et séquentiellement découpés par des enzymes de restriction puis détectés grâce à des séquences primers fluorescentes. Le découpage successif se traduit par des fragments de poids moléculaires spécifiques qui sont séparés sur gel en électrophorèse capillaire.
Les positions relatives de chaque fragment formant des bandes dépendent de leur taille, de leur poids et de la nature des nucléotides qui les composent. L'intensité de
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la fluorescence permet d'avoir des données quantitatives. Chaque position de bande sur le gel correspond à un groupe bactérien, voire même à une espèce bactérienne, au fur et à mesure des étapes de digestion enzymatique.
L'espèce bactérienne est identifiée par référence à une banque de données accessible à la communauté scientifique regroupant les résultats spécifiques de plus de 5000 espèces bactériennes au travers de cette technologie.
Ainsi les espèces bactériennes de clostridies suivantes :
Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium botulinum, Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-
3029 à la CNCM, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens entérotoxinogène sont mises en évidence seules ou en association dans la problématique des entéropathies du lapin.
Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium botulinum, Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-
3029 à la CNCM, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens entérotoxinogène sont mises en évidence seules ou en association dans la problématique des entéropathies du lapin.
La présente invention a encore pour objet : # Une méthode de diagnostic de la présence d'une au moins des espèces bactériennes de clostridies citées antérieurement dans la présente invention, et/ou d'au moins un bactériophage spécifique ciblant une des espèces bactériennes de clostridies citées antérieurement dans la présente invention, et/ou d'au moins une toxine génétiquement héritée ou non d'un bactériophage spécifique à l'une des espèces bactériennes de clostridies citées antérieurement dans la présente invention et entrant dans le cadre de la problématique des entéropathies du lapin.
Le dépistage des bactéries permet avantageusement dans les élevages de lapins de prendre des dispositions
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préventives lors de la succession des bandes. Ce dépistage repose de préférence sur la mise au point d'un test ELISA ou génétique à partir d'échantillons de selles obtenus après autopsie.
# Un coffret ou kit de diagnostic pour la mise en #uvre d'une telle méthode - ledit coffret ou kit comprenant des anticorps monoclonaux et/ou des sondes nucléiques adsorbées sur une surface inerte. Les 2 variantes préférées du kit sont développées dans la partie exemples de la présente invention.
La présente invention a en outre pour objet une méthode de prévention ou de traitement des entéropathies du lapin, notamment l'EEL et l'entéropathie mucoïde, comportant une étape consistant à administrer à un lapin souffrant d'entéropathie ou susceptible de contracter une entéropathie une quantité efficace d'un point de vue immunogénique et apte à être administrée d'au moins une composition telle que définie ci avant.
Dans ladite méthode de prévention et/ou de traitement, il est provoqué de préférence la production chez le lapin d'anticorps anti Clostridium botulinum et/ou anti Clostridium novyi et/ou anti Clostridium sporogenes et/ou anti Clostridium buttylinum et/ou anti Clostridium difficile et/ou anti Clostridium butyricum et/ou anti Clostridium perfringens entérotoxinogène.
Selon la voie d'administration préconisée, il est possible d'orienter l'isotypie de l'anticorps en fonction du milieu dans lequel il devra exercer sa reconnaissance.
Par voie orale, la production d'anticorps sera par exemple principalement orientée vers la synthèse des immunoglobulines sécrétoires de type IgM et/ou IgA. La présence des anticorps traduira consécutivement l'activation de cellules
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immunocompétentes qui pourront réagir contre une éventuelle infection naturelle secondaire.
Lesdits anticorps réagissent de manière avantageuse contre au moins une des toxines desdites espèces bactériennes de clostridies.
Dans le traitement des entéropathies du lapin, ladite composition conforme à l'invention peut être associée à au moins un principe actif connu, choisi notamment dans le groupe des antibiotiques, antimicrobiens, en tenant compte des espèces de bactéries clostridies isolées conformément à l'invention.
Ledit principe actif agit notamment contre des bactéries à Gram positif et préférentiellement les bactéries appartenant au groupe des clostridies. Il est de préférence choisi dans le groupe des pleuromutilines (tiamutine) et d'autres antibiotiques antibactéries à Gram positif à spectre large.
Ainsi, de façon surprenante, le Demandeur a découvert l'importance des clostridies et leur impact clinique dans la problématique des entéropathies du lapin notamment de l'EEL et de l'entéropathie mucoïde.
Les entéropathies apparaissent donc liées au développement d'une espèce bactérienne nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM seule ou en association avec au moins une autre espèce bactérienne appartenant également au groupe des clostridies.
En particulier, les agents étiologiques bactériens de l'entéropathie épizootique du lapin sont donc notamment : une espèce bactérienne nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous
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le N 1-3029 à la CNCM seule ou en association avec Clostridium butyricum et/ou Clostridium difficile et/ou Clostridum perfringens entérotoxinogène. L'analyse des profils de flore via la technologie innovante MCPC démontre la présence de l'une ou de plusieurs des espèces bactériennes précédemment citées dans la flore de lapins atteints d'entéropathie.
Il est important de souligner que sans ces agents bactériens, il n'y aurait pas de parésie caecale. Les agents cités ci-avant qui sont au départ apportés par l'environnement ne sont pas d'emblée forcément pathogènes pour l'animal étant donné leur très faible quantité dans le tractus digestif des animaux sains.
Etant donné la vitesse de propagation de la maladie dans les élevages et à travers l'Europe, le Demandeur a identifié un vecteur de nature viral capable de déclencher et de maîtriser la synthèse de toxines. Sans vouloir être lié par aucune théorie, le Demandeur émet l'hypothèse que les gènes codant pour des toxines sont hérités de bactériophages. Des travaux de recherche seront entrepris dans un futur proche afin d'identifier et d'isoler le bactériophage concerné.
Ainsi, à l'occasion d'une infection virale, les espèces bactériennes de clostridies citées ci-avant (préférentiellement l'espèce nouvelle Clostridium buttylinum et/ou l'espèce Clostridium butyricum) synthétisent une ou plusieurs toxine(s) conjointement au développement viral qui contribue à exprimer les gènes hérités ou non de virus codant pour cette ou ces toxine(s). La population bactérienne se multiplie mais également s'effondre sous la pression virale en libérant par lyse bactérienne des toxines en même temps que des virus matures. Ces toxines ont un impact négatif sur le transit intestinal de l'animal en
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paralysant les influx nerveux responsables de la motilité de l'organe et positif sur la croissance incontrôlée de l'espèce Clostridium difficile qui profite de l'état de stase et de l'écosystème modifié pour se développer et renforcer la gravité de la maladie.
En effet, un bactériophage donné injecte spécifiquement son virion dans les bactéries appartenant strictement au groupe des clostridies et plus spécifiquement à l'espèce Clostridium botulinum et/ou Clostridium sporogenes et/ou Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM et/ou Clostridium butyricum. Le génome du virion porte également un gène codant pour l'expression et/ou l'amplification des toxines de la bactérie ciblée. Etant donné les très faibles différences génétiques entre certaines espèces de clostridies, il peut arriver dans certains cas que des espèces toxinogènes telles que Clostridium botulinum perdent pour des raisons inexpliquées leur capacité à produire des toxines. Elles ne sont alors plus toxinogènes et dérivent progressivement vers une espèce apparentée, phylogénétiquement proche, possédant les caractéristiques de Clostridium sporogenes, Clostridium botulinum et Clostridium novyi. Les bactériophages qui initialement véhiculaient les gènes codant pour des toxines botuliniques ne voient pas la différence et continuent de prendre pour cibles non pas des espèces clairement identifiées mais des espèces dérivées comme celles découvertes dans la présente invention. L'espèce bactérienne ayant perdu son pouvoir toxinogène le retrouve par le biais d'une infection virale mais au détriment de sa survie car la libération et donc les effets des toxines dans l'écosystème intestinal des lapins ne peuvent être observés que s'il y a lyse des bactéries ciblées par l'infection virale. Ce phénomène peut également être observé chez d'autres espèces de clostridies notamment chez celles qui produisent des
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neurotoxines de type botuliniques et notamment une espèce qui a été clairement identifiée par le Demandeur chez les lapins sévèrement atteints d'EEL telle que l'espèce Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi).
De manière tout à fait surprenante, le présent inventeur a réussi à isoler une espèce bactérienne identifiée comme appartenant à une espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ; Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes ; Clostridium sordelli qui n'a jamais été isolée du tube digestif des lapins et qui est étroitement et largement inféodée à cet écosystème lorsqu'il est atteint d'EEL.
C'est cette découverte qui est à la base de la présente invention. La structure génétique particulière des 420 premiers nucléotides de l'ADN constitutifs des gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S ainsi que le profil enzymatique permet de confirmer l'originalité de l'espèce bactérienne et par voie de conséquence le dépôt d'une souche bactérienne appartenant à cette espèce à la CNCM ainsi que la revendication reposant sur la découverte de cette nouvelle espèce bactérienne présente dans le tractus digestif du lapin affecté par l'EEL.
Cette espèce présente une homologie de l'ordre de 95 % au moins avec l'espèce connue Clostridium botulinum - sur la base d'une étude comparative entre la séquence génétique des 420 premiers nucléotides de l'ADN codant pour l'ARN ribosomal 16S de l'espèce bactérienne découverte et conforme à l'invention et celle d'une espèce bactérienne de référence de la même espèce et répertoriée dans une banque de données accessible à la communauté scientifique (Genbank/EMBL).
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Cette espèce bactérienne présente la particularité d'exprimer directement ou via un bactériophage spécifique une ou plusieurs toxines qui ont un effet indirect désastreux sur l'écosystème intestinal et la santé de l'animal.
Les toxines libérées par cette espèce bactérienne affectent les transmissions nerveuses du système nerveux autonome en altérant la sécrétion d'acétylcholine au niveau des synapses, en désorganisant le fonctionnement des fibres d'actino-myosine responsables de la contraction des muscles lisses de l'intestin, en activant la sécrétion de mucus des cellules gobelets constitutives de la muqueuse intestinale.
Ces effets sont évocateurs de l'action de toxines de type C (sans que l'on puisse dire s'il s'agit plutôt des types C1, C2 ou C3) et D. De plus le fait que le vecteur bactérien des gènes codant pour ces toxines appartienne à une espèce nouvelle permet également de proposer l'hypothèse d'une sécrétion de pro-toxines ou de toxines apparentées aux toxines de type C non seulement par cette nouvelle espèce mais également par les espèces Clostridium sporogenes, Clostridium novyi étant donné leur très importantes similitudes génétiques avec l'espèce Clostridium botulinum et avec celle découverte par l'inventeur du présent brevet.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui va suivre pour la compréhension de laquelle il sera fait référence aux dessins annexés dans lesquels : # La Figure 1 illustre la répartition spatiale d'échantillons prélevés de lapin malades et sains, la localisation de
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chaque spot de cette figure étant la résultante statistique qualitative et quantitative des diverses espèces bactériennes qui composent l'échantillon concerné.
Chacun des axes représentés est associé à une fonction statistique donnée et porte les valeurs quantitatives calculée pour tous les échantillons étudiés Sur cette figure 1, les échantillons provenant de lapins sévèrement affectés par l'EEL sont matérialisés par des spots noirs (Re+ ; E+). Les échantillons provenant de lapins sains dans un environnement chroniquement affectés par l'EEL sont matérialisés par des spots blancs (Re- ; E+) et enfin les échantillons provenant de lapins sains dans un environnement n'ayant jamais été affecté par l'EEL sont matérialisés par des spots gris ( Re- ; E-).On remarque clairement une répartition spatiale différente entre les échantillons des animaux malades et ceux des animaux sains. Par contre il n'existe pas de différence significative entre la répartition spatiale des échantillons provenant des animaux sains qu'il s'agisse d'un environnement chroniquement affecté ou non par l'EEL.
Les bactéries responsables de cette différence constituent un groupe unique qui appartient à celui des clostridies. Les espèces retenues sont : Clostridium buttylinum, proche de Clostridium botulinum, Clostridium sporogenes, Clostridium novyi et Clostridium sordelli ;
Clostridium butyricum (anciennement kainantoi) ;
Clostridium difficile et Clostridium perfingens entérotoxinogène, pour lesquelles les homologies génétiques sont importantes ;
Clostridium butyricum (anciennement kainantoi) ;
Clostridium difficile et Clostridium perfingens entérotoxinogène, pour lesquelles les homologies génétiques sont importantes ;
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# La Figure 2 illustre l'analyse par la technologie dite
MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion.
MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion.
En partant de la gauche vers la droite sur l'axe des abscisses la barre grise représente les échantillons provenant d'animaux sévèrement affectés par l'EEL (Re+, E+). La barre blanche représente les échantillons provenant d'animaux sains dans un environnement chroniquement affecté (Re- ; E+) ou non (Re- ; E-) par l'EEL.
L'axe des ordonnées reporte toutes les longueurs de fragments nucléotidiques comprises entre 214 et 258 nucléotides. On note très clairement que les échantillons provenant d'animaux malades contiennent des fragments de 229-230 nucléotides. La taille et la position de ces fragments correspondent à l'espèce Clostridium botulinum et/ou l'espèce phylogénétiquement proche de
Clostridium botulinum telle que celle découverte dans la présente invention et déposée sous le numéro CNCM-I-
3029 ; # la Figure 3 illustre l'analyse par la technologie dite
MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion.
Clostridium botulinum telle que celle découverte dans la présente invention et déposée sous le numéro CNCM-I-
3029 ; # la Figure 3 illustre l'analyse par la technologie dite
MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion.
En partant de la gauche vers la droite sur l'axe des abscisses la barre grise représente les échantillons provenant d'animaux sévèrement affectés par l'EEL (Re+ ; E+). La barre blanche représente les échantillons provenant d'animaux sains dans un environnement chroniquement affecté (Re- ; E+) ou non (Re- ; E-) par l'EEL.
L'axe des ordonnées reporte toutes les longueurs de fragments nucléotidiques comprises entre 510 et 558
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nucléotides. On note très clairement que les échantillons provenant d'animaux malades contiennent des fragments de 522 nucléotides. D'après les informations recueillies par la banque de donnée, la taille et la position de ces fragments correspondent à l'espèce Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi).
Cette espèce n'a jamais été isolée ni identifiée chez le lapin et le fait qu'elle puisse exprimer des gènes codant pour des neurotoxines fait de cette espèce un pathogène potentiel au même titre que l'espèce bactérienne que le présent inventeur a isolée et qui est phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ; # la Figure 4 illustre l'analyse par la technologie MCPC des fragments nucléotidiques d'ADN codant pour les gènes de l'ARNr 16S après digestion.
En partant de la gauche vers la droite sur l'axe des abscisses la barre grise représente les échantillons provenant d'animaux sévèrement affectés par l'EEL (Re+ ; E+). La barre blanche représente les échantillons provenant d'animaux sains dans un environnement chroniquement affecté (Re- ; E+) ou non (Re- ; E-) par l'EEL.
L'axe des ordonnées reporte toutes les longueurs des fragments nucléotidiques comprises entre 410 et 458 nucléotides. On note très clairement que les échantillons provenant d'animaux malades contiennent des fragments de 457-458 nucléotides. La taille et la position de ces fragments correspondent à l'espèce Clostridium difficile ; et # la Figure 5 illustre la liste des espèces bactériennes classées par ordre décroissant et présentant la plus forte homologie de séquence avec l'espèce isolée par le
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présent inventeur. Cette liste a été déterminée après interrogation de la banque de données intitulée Genbank / EMBL database.
Certaines des figures sont illustrées en prenant comme exemple d'affection l'EEL. Toutefois la présente invention ne se limite pas à l'EEL mais concerne toutes les entéropathies du lapin en général, notamment l'entéropathie mucoïde.
L'isolement de l'espèce bactérienne de clostridie phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ; Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli ainsi que son degré d'association dans l'écosystème intestinal des lapins malades avec les espèces Clostridium difficile, Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi) et Clostridium perfringens entérotoxinogène a conduit le présent inventeur à imaginer la mise au point d'un vaccin constitué de corps bactériens tués avec ou sans protéines toxinogènes atténuées pour une application cunicole.
Aussi la présente invention concerne notamment la préparation d'un vaccin en cuniculture à partir d'au moins une espèce bactérienne originale pathogène, notamment celle déposée sous le n CNCM 1-3029, présentant 95% d'homologie avec l'espèce Clostridium botulinum et qui n'avait jamais été identifiée jusqu'ici chez le lapin.
Du fait que ladite au moins une espèce bactérienne est extrêmement pathogène par libération de toxines neurodégénératrices héritées ou non de bactériophages, la présente invention vise aussi : * l'utilisation d'une espèce moins pathogène, toujours d'origine cunicole mais pourvue d'une paroi antigénique
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similaire d'un point de vue épitopique et immunogène permettant ainsi d'atténuer les risques de contamination lors d'une production industrielle de l'espèce bactérienne.
Une telle espèce peut être par exemple l'espèce
Clostridium novyi et/ou Clostridium sporogenes et/ou
Clostridium sordelli * un vaccin à valences multiples comportant de préférence en outre des corps bactériens appartenant aux espèces
Clostridium buttylinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
Clostridium novyi et/ou Clostridium sporogenes et/ou
Clostridium sordelli * un vaccin à valences multiples comportant de préférence en outre des corps bactériens appartenant aux espèces
Clostridium buttylinum, Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
Les préparations antigéniques seront constituées de corps bactériens appartenant à l'espèce bactérienne nouvelle Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM et/ou Clostridium novyi et/ou Clostridium sporogenes et/ou Clostridium difficile et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène isolées également à partir d'échantillons de lapins et ceci avec ou sans présence de particules bactériophages spécifiques.
Les antigènes les plus pertinents sont ceux qui sont représentés à la surface des bactéries appartenant à l'espèce Clostridium buttylinum déposée sous le N 1-3029 à la CNCM ; aux espèces Clostridium sporogenes, Clostridium novyi, Clostridium botulinum, car ce sont des espèces bactériennes phylogénétiquement proches de l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum, et ceux qui sont exprimés à la surface des bactéries appartenant aux espèces Clostridium difficile, Clostridium butyricum (anciennement appelée Clostridium kainantoi) et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
Un vaccin conçu pour protéger contre une infection provoquée par l'une de ces bactéries implique que le
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bactériophage ne pourra exercer son activité destructrice faute de trouver son vecteur bactérien.
La présente invention vise aussi une composition vaccinale dont les valences bactériennes sont enrichies en ajoutant des structures protéiques toxinogènes atténuées provenant de toxines sécrétées par les corps bactériens concernés et de virulence atténuée. En effet, l'identification des agents étiologiques des entéropathies, notamment de l'EEL ou de l'entéropathie mucoïde, permet de concevoir de nouveaux moyens de protection contre cette pathologie : - Un premier domaine de protection moléculaire consiste à rechercher des molécules capables de contrecarrer l'activité des toxines clostridiennes par la recherche de récepteurs analogues ou en recherchant des moyens d'antagoniser l'activité de ces toxines.
- Un deuxième domaine de protection concerne un éventail de préparations vaccinales dirigées contre les clostridies elles-mêmes, leurs toxines ou les virus (de type bactériophages) qui leur sont associés.
Une étude parallèle consiste à isoler les toxines spécifiques produites par l'espèce Clostridium novyi et/ou Clostridium sporogenes et/ou l'espèce bactérienne conforme à l'invention et/ou Clostridium butyricum et/ou Clostridium perfringens entérotoxinogène par le biais d'une prolifération virale intra-cytoplasmique ( bactériophage ) ou non et à faire subir auxdites toxines des traitements physiques et/ou biochimiques capables d'atténuer leurs propriétés toxinogènes.
Un ajustement des traitements couplés à des tests in vitro/in vivo permet d'utiliser ces molécules sans risque de tuer
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l'animal ou d'induire une entéropathie tout en conservant leurs propriétés épitopiques et immunogènes.
La protection effective des lapins est vérifiée en modifiant selon les expériences les voies ou modes d'administration des préparations antigéniques. La protection peut être assurée aussi bien en vaccinant les lapins en cours de croissance que les mères (dans ce cas, l'immunité est transmise par le lait maternel). Les études et recherches du Demandeur visent notamment à mettre en évidence la participation du système immunitaire général et/ou intestinal à médiation cellulaire et/ou humorale.
Ainsi, les vaccins peuvent être administrés par voie sanguine, parentérale, intra-dermique, trans-cutanée, mucosale, aérienne ou orale. Ils peuvent être monovalents ou polyvalents.
Ils peuvent être constitués : - de corps bactériens morts ou vivants appartenant aux espèces bactériennes de clostridies ciblées dans la présente invention - de structures antigéniques d'origine capsidique et/ou nucléotidique appartenant à l'espèce bactériophage spécifique aux pathogènes ciblés. Le vaccin peut également comporter plusieurs valences antigéniques en fonction de la nature du gène exogène présent dans le génome viral et codant pour l'expression d'une toxine spécifique dans la bactérie ciblée et infectée appartenant aux espèces bactériennes citées ci-avant, - de fractions nucléotidiques virales inabsorbables et/ou modifiées (queue lipophobe couplée à la séquence nucléotidique virale (approche vaccinale nucléotidique directe en stimulant l'immunité locale des muqueuses respiratoires et intestinales),
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- de toxines clostridiennes chimériques et greffées sur un support protéique les rendant inabsorbables permettant ainsi l'obtention d'un complexe qui présenterait les propriétés immunogènes initiales des toxines au système immunitaire local sans développer de toxicité pour l'organisme porteur.
Parallèlement à cette approche préventive sur le terrain, il est également important de pouvoir diagnostiquer avec certitude si des toxines clostridiennes et des bactériophages spécifiques de clostridies sont présents dans les élevages de lapins. La mise au point d'un kit de détection rapide avec des anticorps monoclonaux spécifiques dirigés contre le bactériophage (capside) et/ou contre des toxines permet de suivre épidémiologiquement l'incidence de la maladie et de prendre des dispositions préventives.
Définitions et abréviations : Dans le cadre de la présente invention on entend par : # espèces bactériennes de clostridies, les espèces notamment choisies dans le groupe constitué par
Clostridium buttylinum déposée à la CNCM sous le N 1-
3029, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, et
Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # toxines, les toxines clostridiennes desdites espèces bactériennes de clostridies, notamment de l'espèce bactérienne déposée sous le N I-3029 à la CNCM ; # vaccin monovalent, un vaccin apte à provoquer une réponse immunitaire chez le lapin et dirigée contre un seul type d'antigène ; # vaccin à valences multiples, un vaccin provoquant une réponse immunitaire chez le lapin dirigée contre plus d'une toxine clostridienne ;
Clostridium buttylinum déposée à la CNCM sous le N 1-
3029, Clostridium butyricum, Clostridium difficile, et
Clostridium perfringens entérotoxinogène ; # toxines, les toxines clostridiennes desdites espèces bactériennes de clostridies, notamment de l'espèce bactérienne déposée sous le N I-3029 à la CNCM ; # vaccin monovalent, un vaccin apte à provoquer une réponse immunitaire chez le lapin et dirigée contre un seul type d'antigène ; # vaccin à valences multiples, un vaccin provoquant une réponse immunitaire chez le lapin dirigée contre plus d'une toxine clostridienne ;
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# quantité efficace d'un point de vue immunogénique, une quantité d'immunogène requise pour provoquer une réponse immunitaire (par exemple une production d'anticorps) suffisamment importante pour assurer la protection chez le lapin suite à la vaccination ; # surnageant, toute solution liquide ou fluide pouvant éventuellement contenir des particules solubles telles que protéines (par exemple des toxines... ) et susceptible d'être obtenue par tout moyen y compris la centrifugation de culture de clostridies, la filtration, l'ultrasonication etc.
Dans ce qui suit sont donnés, à titre purement illustratif et non limitatif, des exemples de réalisation des objets de l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode de prélèvement des échantillons biologiques sur le terrain
Conformément à la présente invention des échantillons intestinaux sont prélevés en euthanasiant des lapins fortement atteints d'entéropathie. Cette phase préliminaire est primordiale car d'elle dépend directement le succès de la méthode. Il est en effet essentiel d'assurer la stabilité des échantillons dès leur prélèvement sur le site de l'élevage et d'éviter que les matières fécales soient en contact avec l'air ambiant.
Exemple 1 : Méthode de prélèvement des échantillons biologiques sur le terrain
Conformément à la présente invention des échantillons intestinaux sont prélevés en euthanasiant des lapins fortement atteints d'entéropathie. Cette phase préliminaire est primordiale car d'elle dépend directement le succès de la méthode. Il est en effet essentiel d'assurer la stabilité des échantillons dès leur prélèvement sur le site de l'élevage et d'éviter que les matières fécales soient en contact avec l'air ambiant.
Les animaux sévèrement atteints d'entéropathie et au stade de l'agonie sont rapidement euthanasiés puis disséqués dans une ambiance chaude et sèche en prenant soin de ne pas percer la paroi intestinale.
Des portions intestinales appartenant à l'iléum, au caecum et au colon sont ligaturées. Les segments délimités sont ensuite coupés en dehors des ligatures. Ces segments avec leur contenu
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sont transférés dans un tube stérile et ventilé, lui-même enfermé hermétiquement dans un sac muni d'un générateur d'anaérobiose hyper-actif.
Les sacs sont ensuite placés dans de la carboglace pilée à -70 C afin de figer les bactéries présentes le plus rapidement possible dans les matières fécales. Ces sacs peuvent également être remplacés par des flacons en verre de faibles contenances, stériles et munis de 2 cannelures plastifiées bouchées avec du coton cardé et fermées avec une pince métallique. Une de ces cannelures permet d'injecter du gaz ( type C02 ou N2) via des bouteilles de gaz de faible capacité et sous pression alors que la deuxième cannelure permet l'échappement de l'air ambiant. Un indicateur d'anaérobiose permet alors de certifier dans le flaconnage la formation d'une atmosphère anaérobie en un minimum de temps.
Entre le moment où les segments intestinaux sont détachés de l'animal et le moment où ils sont congelés, de manière très avantageuse, il ne doit pas s'écouler plus de 2 minutes.
Ces conditions draconiennes de prélèvements sont très avantageuses pour éviter la destruction massive des espèces bactériennes anaérobies présentes dans la partie distale du tube digestif et pour assurer la conservation de l'intégrité structurale des corps bactériens, l'objectif à atteindre étant non seulement d'optimiser l'identification des bactéries via la technologie MCPC mais également d'être en mesure d'isoler les germes intéressants à l'issue des résultats d'analyse.
Exemple 2 : Méthode d'identification et d'isolement des espèces bactériennes impliquées dans l'EEL
Les analyses des prélèvements ont été réalisées selon un procédé original qui permet d'identifier les bactéries tout en
Les analyses des prélèvements ont été réalisées selon un procédé original qui permet d'identifier les bactéries tout en
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s'affranchissant de la viabilité des bactéries contrairement aux techniques conventionnelles. Cette technologie appelée MCPC (Microbial Community Profiling and Characterisation) n'a jamais été réalisée sur des échantillons de lapins et peut mettre en évidence un nombre très important d'espèces bactériennes aussi bien minoritaires que difficilement cultivables en se référant à un large répertoire de gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S spécifiques à chacune des espèces recherchées.
La technologie dite MCPC a ainsi permis de mettre en évidence une association de bactéries jusqu'alors insoupçonnée dans la problématique de l'EEL. Pour ce faire il a été procédé à des comparaisons entre des échantillons de selles obtenus de lapins sains âgés de 56 jours provenant d'un environnement naturel n'ayant jamais connu d'épisode d'EEL, des échantillons d'animaux sains provenant d'un environnement subissant une EEL chronique et ceux d'animaux malades provenant d'un environnement subissant une EEL chronique.
En référence à la Fig. 1, une étude de la répartition graphique des échantillons dans l'espace en fonction de la composition bactérienne et du nombre respectif de chaque espèce représentée par échantillon permet de confirmer 1)que la flore des animaux sains était radicalement différente de celle des animaux sévèrement malades issus d'un même élevage subissant une EEL chronique; 2) que les flores des animaux sains étaient très proches voire identiques que l'environnement soit ou non chroniquement affecté par des épisodes d'EEL. 3) que la répartition très significativement différente des échantillons provenant exclusivement d'animaux affectés est causée par la présence significative et jusqu'alors insoupçonnée d'une association de bactéries appartenant au grand groupe desdites clostridies.
Comme illustré à la Fig. 2, à la Fig 3 et à la Fig. 4, une analyse fine de la composition et de la longueur des fragments
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d'ADN a permis clairement d'identifier en particulier 3 espèces bactériennes, une espèce ayant une valeur de P457 ( nombre de nucléotides ) correspondant à Clostridium difficile et une espèce ayant une valeur de P229/P230 correspondant à l'espèce phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ; Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli et qui a été isolée par l'inventeur du présent document et déposée à la CNCM sous le numéro CNCM 1-3029.
Les caractéristiques intrinsèques de ces espèces permettent au Demandeur, par le biais de la technologie dite MCPC, d'affirmer que ces germes sont associés dans la phase aiguë de l'EEL.
L'espèce nouvelle découverte par l'inventeur et identifiée comme étant phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum est responsable de facteurs initialisant les problèmes de parésie iléo-caeco-colique alors que les espèces Clostridium difficile et Clostridium butyricum sont des espèces pathogènes plutôt émergentes qui profitent de la stase de l'écosystème pour se développer et amplifier la pathologie de la maladie par la sécrétion respectivement de toxines A et B et de neurotoxines Exemple 3 : Identification comparative entre l'espèce bactérienne découverte et les espèces bactériennes existantes appartenant au groupe des clostridies.
Plusieurs laboratoires de notoriété publique (Institut Pasteur : Centre National de Référence des bactéries anaérobies) et des Instituts Européens spécialisés en génie génétique sont d'accord pour confirmer que le profil enzymatique de l'espèce bactérienne et l'identification des 420 premiers nucléotides qui constituent la séquence de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S ne permettent pas d'affilier cette espèce précisément à une espèce actuellement connue.
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Comme illustré à la Fig. 5, les résultats obtenus auprès d'une banque de données montrent que les espèces qui présentent les homologies génétiques les plus proches avec l'espèce bactérienne de clostridie découverte par l'inventeur sont Clostridium botulinum et Clostridium sporogenes.
L'alignement de la séquence des 420 premiers nucléotides montre une homologie de l'ordre de 95% avec l'espèce Clostridium botulinum. L'espèce conforme à l'invention qui a été isolée est propre au tube digestif des lapins et n'est pas toxinogène.
Le pouvoir toxinogène est hérité par le biais de bactériophages spécifiques qui ne seraient pas capables de faire la différence entre deux espèces de clostridies, conséquence d'une dérive génétique entre les 2 espèces concernées, Clostridium botulinum d'une part, et Clostridium buttylinum qui lui est phylogénétiquement proche d'autre part. Les bactériophages inféodés à l'espèce Clostridium botulinum portent les gènes codant pour les toxines naturellement sécrétées par cette espèce mais, compte tenu de la proximité génétique entre les 2 espèces, Clostridium buttylinum reçoit le virion et l'exprime avec les toxines au détriment de sa survie. Ainsi, même si cette dernière espèce n'est pas pathogène en soit, le fait qu'elle éclate en libérant des toxines stockées dans son cytoplasme contribue au développement d'une parésie localisée n'ayant pas une action aussi foudroyante que celle provoquée par l'espèce Clostridium botulinum qui elle est capable de produire la toxine naturellement et en permanence tout en restant vivante.
Exemple 4 : composition vaccinale
L'isolement d'une nouvelle espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum
Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli
L'isolement d'une nouvelle espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum
Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli
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a conduit le Demandeur à la mise au point d'un vaccin constitué de corps bactériens tués ou vivants mais de virulence atténuée appartenant à cette nouvelle espèce ainsi qu'aux espèces phylogénétiquement proches, avec ou sans protéines toxinogènes atténuées et avec ou sans le bactériophage impliqué dans l'étiologie de l'EEL.
L'aspect innovant de cette mise au point d'une préparation vaccinale consiste à protéger un lapin contre l'entéropathie épizootique ou l'entéropathie mucoïde en utilisant (i) soit une enveloppe bactérienne appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum en combinaison ou non avec des enveloppes bactériennes appartenant à des espèces différentes émergentes ou non telles que Clostridium butyricum,
Clostridium difficile, Clostridium perfringens enterotoxinogène.; (ii) soit en utilisant une enveloppe bactérienne appartenant à une autre espèce telle que Clostridium botulinum, Clostridium novyi ou Clostridium sordelli, possédant un profil épitopique et immunogène commun à celui de l'espèce bactérienne conforme à la présente invention, en combinaison ou non avec des enveloppes bactériennes appartenant à des espèces différentes émergentes ou non telles que
Clostridium butyricum, Clostridium difficile,
Clostridium perfringens enterotoxinogène.
Clostridium difficile, Clostridium perfringens enterotoxinogène.; (ii) soit en utilisant une enveloppe bactérienne appartenant à une autre espèce telle que Clostridium botulinum, Clostridium novyi ou Clostridium sordelli, possédant un profil épitopique et immunogène commun à celui de l'espèce bactérienne conforme à la présente invention, en combinaison ou non avec des enveloppes bactériennes appartenant à des espèces différentes émergentes ou non telles que
Clostridium butyricum, Clostridium difficile,
Clostridium perfringens enterotoxinogène.
(iii) soit en utilisant une préparation constituée de bactériophages dont le développement nécessite la présence des espèces bactériennes précédemment citées (iv) soit en utilisant une préparation obtenue de combinaisons simples ou complexes comportant les
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éléments toxinogènes et/ou viraux et/ou bactériens cités précédemment.
Exemple 5 : Tests validant ces faits et réalisés chez le lapin.
Les animaux sont immunisés : # soit avec la souche appartenant à l'espèce bactérienne phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum ;
Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli conforme à l'invention, # soit avec une souche appartenant à l'espèce Clostridium botulinum de type C d'origine cunicole # soit avec une souche de l'espèce bactérienne Clostridium novyi d'origine cunicole # soit avec une souche d'origine cunicole appartenant aux espèces bactériennes Clostridium sporogenes et/ou
Clostridium butyricum et/ou Clostridium difficile et/ou
Clostridium perfringens entérotoxinogène # soit avec une association de 2 ou plusieurs souches appartenant aux espèces précédemment citées # soit avec des combinaisons variables de toxines sécrétées issues de gènes codant pour des toxines de type C1, C2, C3 ; A ; ou apparentées.
Clostridium novyi ; Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli conforme à l'invention, # soit avec une souche appartenant à l'espèce Clostridium botulinum de type C d'origine cunicole # soit avec une souche de l'espèce bactérienne Clostridium novyi d'origine cunicole # soit avec une souche d'origine cunicole appartenant aux espèces bactériennes Clostridium sporogenes et/ou
Clostridium butyricum et/ou Clostridium difficile et/ou
Clostridium perfringens entérotoxinogène # soit avec une association de 2 ou plusieurs souches appartenant aux espèces précédemment citées # soit avec des combinaisons variables de toxines sécrétées issues de gènes codant pour des toxines de type C1, C2, C3 ; A ; ou apparentées.
# soit avec des particules virales démontrées comme étant spécifiques à l'espèce citée et découverte dans la présente invention et à l'espèce Clostridium botulinum.
# soit avec la combinaison bactéries/particules toxinogènes ou avec la combinaison bactéries/particules virales ou avec la combinaison particules toxinogènes et virales ou avec l'ensemble des combinaisons.
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Exemple 6 : Développement d'un kit de diagnostic
Le kit de diagnostic repose de préférence sur un concept de reconnaissance immunologique des éléments clefs étudiés dans la présente invention qui attestent de la présence d'une infection EEL.
Le kit de diagnostic repose de préférence sur un concept de reconnaissance immunologique des éléments clefs étudiés dans la présente invention qui attestent de la présence d'une infection EEL.
Des lignées d'hybridomes sont sélectionnées afin de reconnaître les acteurs bactériens appartenant aux espèces Clostridium botulinum et phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum telle que l'espèce bactérienne découverte par l'inventeur de la présente invention dont une souche a été déposée à la CNCM sous le numéro 1-3029 et/ou les acteurs bactériens plus émergents appartenant aux espèces Clostridium difficile, Clostridum butyricum et/ou les neurotoxines toxines de types C/D ou apparentées et/ou les entérotoxines produites par les souches de Clostridium perfringens entérotoxinogènes et/ou les capsides virales de bactériophages.
Les bactéries et/ou toxines et/ou virus sont reconnus par les anticorps monoclonaux adsorbés sur une surface inerte et des anticorps polyclonaux ou anticorps monoclonaux couplés à des enzymes permettent de révéler la présence des bactéries reconnues par les anticorps adsorbés sur la surface inerte via la dégradation d'un substrat chromogène.
En variante, le kit de diagnostic peut également reposer sur un concept de reconnaissance génétique des éléments clefs de natures bactérienne, virale ou toxinogène.
Dans ce concept, le kit utilise des microcellules fermées dans lesquelles sont adsorbées tous les éléments enzymatiques et moléculaires nécessaires à une amplification spécifique d'un matériel génétique reconnu par une sonde couplée à un fluorochrome. Les échantillons sont déposés dans une autre cellule et un jeu de pressions permet de transférer les
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échantillons dans la microcellule réactionnelle afin de permettre le déroulement d'une PCR. L'intensité de la fluorescence comparée à des témoins permet d'apprécier la présence ou non des facteurs recherchés et de faire le bon diagnostic.
Des analyses sériques peuvent être également réalisées en permettant avantageusement de valider si des phénomènes de reconnaissances croisées via les anticorps sont possibles en fonction des différents modes d'administration des préparations antigéniques tout en combinant diverses préparations vaccinales et si cette reconnaissance est capable de protéger les animaux contre l'EEL via une activation du système immunitaire à médiation cellulaire.
REFERENCES
Epizootic enterocolitis of the rabbit : a review of current research. Licois D et al.. World Rabbit Science, 2000, Vol.8 (Suppl.1) : 187-194.
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Caecal microflora of growing-rabbits affected by a non specific enteropathy. Bennegadi N et al. Reproduction Nutrition Development, 2002,42 ( Suppl. 1 : S 15).
Note d'information sur les travaux de recherche conduits sur l'entérocolite épizootique du lapin. Lebas F et al., Enterocolite du Lapin, 2002, Note n 3 : 1-3.
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TABLEAU : COMPARAISON DE SEQUENCES Espèce bactérienne de Référence (ligne supérieure),banque de données Genbank/EMBL avec en regard (ligne inférieure) l'espèce bactérienne isolée conforme à l'invention CNCM N I-3029. gtaccgtcattatgttcccagaaaacagggctttacaatccgaagaccttcatcacccac 60 gtaccgtcattatcgtcccagaaaacagggctttacaatccgaagaccttcatcacccac 371 gcggcgttgctgcgtcagggtttcccccatttgcgcaatatgccccacggctgcctcccg 120 gcggsgttgntgcgtcagggtttcccccatt-gngcaatattccccactgctgcctcccg 312 taggagtctggaccgtgttctcagttccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctac 180 taggagtctggaccgtgt-ctcagttccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctac 253 gcatcgttgccttggtaggccgttaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatct 240 gcatcgttgccttggtaggccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatct 193 caaagcgataaatctttgataagataatcatgccaatttctcatattatgcggtattaat 300 caaagcaataaatctttgataagaaaatcatgcgattatcttatattatgcggtattaat 133 ctccctttcgggaggctatcccccactttgaggtaggttacccacgtgttactcacacgt 360 cttcctttcggaaggctatcccccactttgaggcaggttacccacgtgttactcacccgt 73 ccgccgctaatccacttcccgaaggaagcttcatcgctcgacttgcatgtgttaagcacg 420 ccgccgctaatccacttcccgaaggaagcttcatcgctcgacttgcatgtgttaagcacg 13 Après détermination de la séquence nucléotidique des 420 premiers nucléotides de l'ADN correspondant aux gènes codant pour l'ARN ribosomal 16S, un alignement de séquences a été réalisée entre l'espèce isolée par l'inventeur et l'espèce
Clostridium botulinum de référence obtenue d'une banque de données : [>gi#576570#gb#L37588.1#CLORGDD. Clostridium botulinum BP2 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene] identifiée comme étant génétiquement la plus proche. Une homologie de l'ordre de 95% est observée (402 nucléotides sur 420).
Clostridium botulinum de référence obtenue d'une banque de données : [>gi#576570#gb#L37588.1#CLORGDD. Clostridium botulinum BP2 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene] identifiée comme étant génétiquement la plus proche. Une homologie de l'ordre de 95% est observée (402 nucléotides sur 420).
Claims (17)
1. Bactérie cunicole appartenant à une nouvelle espèce, appelée
Clostridium buttylinum, phylogénétiquement proche de Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli, caractérisée en ce que la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S possède une identité supérieure à 95% avec la séquence SEQ ID N 1.
2.Bactérie cunicole selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence des 420 premiers nucléotides de la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S consiste en la séquence SEQ ID N 1.
3. Bactérie cunicole selon l'une des revendications 1 et 2, déposée à la CNCM sous le n I-3029.
4. Composition comprenant des bactéries de l'espèce Clostridium buttylinum CNCM I-3029, telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3.
5 Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des bactéries d'au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes et Clostridium sordelli.
6.Composition selon l'une quelconque des revendications 4 et 5 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des bactéries d'au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
7. Composition comprenant le corps bactérien mort ou vivant, mais de virulence atténuée, appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3.
8. Composition selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins le corps bactérien mort ou vivant, mais de virulence atténuée, appartenant à une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes,
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Clostridium sordelli, Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
9. Composition comprenant l'enveloppe bactérienne appartenant à l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3.
10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une enveloppe bactérienne appartenant à une espèce bactérienne de Clostridium choisie parmi Clostridium botulinum,
Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium sordelli, Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 10 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une toxine sécrétée par au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium buttylinum,
Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes,
Clostridium sordelli, Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
12. Composition comprenant au moins une toxine sécrétée par l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum selon l'une des revendications 1 à 3.
13.Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une toxine sécrétée par au moins une espèce bactérienne choisie parmi Clostridium botulinum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes, Clostridium sordelli, Clostridium butyricum, Clostridium difficile et Clostridium perfringens entérotoxinogène.
14. Composition selon l'un e quelconque des revendications 4 à 13, caractérisée en ce qu'elle consiste en une composition de vaccin.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme compatible avec une voie d'administration choisie parmi la voie sanguine, la voie parentérale, la voie trans-cutanée, la voie intra-dermique, la voie mucosale , la voie aérienne ou la voie orale.
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16. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 15 , pour la préparation d'un vaccin destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des entéropathies du lapin notamment l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et/ou l'entéropathie mucoïde.
17. Utilisation de bactéries de l'espèce bactérienne Clostridium buttylinum selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un vaccin destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des entéropathies du lapin notamment l'entéropathie épizootique du lapin (EEL) et/ou l'entéropathie mucoïde.
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|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20080430 |