CA2384437C - Compositions acellulaires immunogenes et compositions acellulaires vaccinales contre bacillus anthracis - Google Patents
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Abstract
Composition immunogène ou composition vaccinale acellulaire pour la production d'anticorps contre B. anthracis comprenant un antigène protecteur (PA) et des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues à partir de souches mutantes de B. anthracis et leurs applications.
Description
COMPOSITIONS ACELLULAIRES IMMUNOGENES ET COMPOSITIONS
ACELLULAIRES VACCINALES CONTRE BACILLUSANTHRACIS
La présente invention concerne des compositions acellulaires immunogènes ainsi que des compositions acellulaires vaccinales contre Bacillus anthracis, et leurs applications en médecine humaine et en médecine vétérinaire.
Bacillus anthracis (B. anthracis), agent responsable de l'anthrax ou charbon est une bactérie Gram-positive, aérobie et formant des spores.
Cet agent induit une infection soit par inoculation intradermique, soit par ingestion ou inhalation des spores (Klein F. et al., (1966), J.
Infect. Dis., 116, 1213-138 ; Friedlander A.M. et al., (1993), J. Infect. Dis., 167, 1239-1242), dont la transformation en cellules végétatives, formes encapsulées et toxinogènes, permet à la bactérie de proliférer et de synthétiser ses facteurs de virulence.
Les Inventeurs ont récemment montré dans un modèle murin d'une infection pulmonaire par B. anthracis, que les macrophages alvéolaires sont le site primaire de la germination, qui est rapidement suivie par l'expression des gènes des toxines, confirmant que la rencontre de la spore avec l'hôte est cruciale pour la patho-génicité de B. anthracis (Guidi-Rontani E ; et al., Molecular Biology, (1999), 31, 9-17).
Les principaux facteurs de virulence sont :
- la capsule anti-phagocytique constituée d'acide poly-y-D-glutamique (Avakyan A. A. et al. (1965), J. ofBacteriology, 90, 1082-1095) et - trois facteurs protéiques agissant en combinaison par deux. La toxine oedématogène (PA-EF) induit un oedème après une injection sous-cutanée alors que la toxine létale (PA-LF) est responsable de la mort des animaux après injec-tion intraveineuse (J. W. Ezzell et al., (1984), Infect. Immun., 45, 761-767.
Le facteur présent dans les deux combinaisons est l'antigène protecteur (PA) qui intervient dans la fixation des toxines sur les cellules cibles. Les deux autres facteurs, le facteur oedématogène (EF) et le facteur létal (LF) sont responsables de la manifestation de l'effet toxique.
La production simultanée de la capsule et des toxines est indispen-sable pour la manifestation du pouvoir pathogène..
Les gènes codant pour les enzymes synthétisant la capsule sont portés par le plasmide pXO2 (Green B. D. et al., (1985), Infect. Immun., 49, 291-297;
Uchida I. et al., (1985), J. Gen. Microbiol., 131, 363-367) et les trois gènes pag, cya, et lef, codant respectivement pour les facteurs PA, EF et LF sont portés par le
ACELLULAIRES VACCINALES CONTRE BACILLUSANTHRACIS
La présente invention concerne des compositions acellulaires immunogènes ainsi que des compositions acellulaires vaccinales contre Bacillus anthracis, et leurs applications en médecine humaine et en médecine vétérinaire.
Bacillus anthracis (B. anthracis), agent responsable de l'anthrax ou charbon est une bactérie Gram-positive, aérobie et formant des spores.
Cet agent induit une infection soit par inoculation intradermique, soit par ingestion ou inhalation des spores (Klein F. et al., (1966), J.
Infect. Dis., 116, 1213-138 ; Friedlander A.M. et al., (1993), J. Infect. Dis., 167, 1239-1242), dont la transformation en cellules végétatives, formes encapsulées et toxinogènes, permet à la bactérie de proliférer et de synthétiser ses facteurs de virulence.
Les Inventeurs ont récemment montré dans un modèle murin d'une infection pulmonaire par B. anthracis, que les macrophages alvéolaires sont le site primaire de la germination, qui est rapidement suivie par l'expression des gènes des toxines, confirmant que la rencontre de la spore avec l'hôte est cruciale pour la patho-génicité de B. anthracis (Guidi-Rontani E ; et al., Molecular Biology, (1999), 31, 9-17).
Les principaux facteurs de virulence sont :
- la capsule anti-phagocytique constituée d'acide poly-y-D-glutamique (Avakyan A. A. et al. (1965), J. ofBacteriology, 90, 1082-1095) et - trois facteurs protéiques agissant en combinaison par deux. La toxine oedématogène (PA-EF) induit un oedème après une injection sous-cutanée alors que la toxine létale (PA-LF) est responsable de la mort des animaux après injec-tion intraveineuse (J. W. Ezzell et al., (1984), Infect. Immun., 45, 761-767.
Le facteur présent dans les deux combinaisons est l'antigène protecteur (PA) qui intervient dans la fixation des toxines sur les cellules cibles. Les deux autres facteurs, le facteur oedématogène (EF) et le facteur létal (LF) sont responsables de la manifestation de l'effet toxique.
La production simultanée de la capsule et des toxines est indispen-sable pour la manifestation du pouvoir pathogène..
Les gènes codant pour les enzymes synthétisant la capsule sont portés par le plasmide pXO2 (Green B. D. et al., (1985), Infect. Immun., 49, 291-297;
Uchida I. et al., (1985), J. Gen. Microbiol., 131, 363-367) et les trois gènes pag, cya, et lef, codant respectivement pour les facteurs PA, EF et LF sont portés par le
2 plasmide pXO1, qui a été décrit par Mikesell P. et al. (Infect. Immun, (1983), 39, 371-376).
Alors que de nombreux travaux ont montré que PA est le principal antigène responsable de la protection dans le cadre d'une immunisation naturelle ou acquise par vaccination, les Inventeurs ont montré que LF est également un immuno-gène puissant (Mock M. Annales de l Institut Pasteur décembre 1990).
Afin de clarifier le rôle des composants des toxines dans la toxicité
de B. anthracis, les Inventeurs ont construit divers mutants. Ainsi, ils ont caractérisé
une souche dépourvue du plasmide pXO2 et dépourvue de PA par modification du plasmide pXO1. Du fait de l'absence de PA, cette souche ne présente plus de caractère létal (Cataldi A. et al. (1990), Molecular Microbiology, 4, 1111-1117).
Pour rechercher les éléments susceptibles d'intervenir dans l'immunisation contre l'infection par B. anthracis, les Inventeurs ont construit des mutants, dépourvus d'au moins l'un des facteurs de toxicité responsable de la patho-génicité, c'est-à-dire déficient en PA, en EF ou en LF, voire dépourvus du plasmide pXOI et dépourvus en plus du plasmide pXO2. Bien que dépourvus de toxicité ou présentant une toxicité atténuée, les mutants simples, notamment RP9 (EF) (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-1094 en date du 2 mai 1991) et RP 10 (LF) (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-1095 en date du 2 mai 1991), et le double mutant RP 42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999), se sont révélés aptes à produire des anticorps immunoprotecteurs contre une infection par une souche Sterne sauvage. Ces mutants sont décrits dans la demande Internationale n 92/19720, et dans les articles de Pezard C. et al., (Infection and Immunity, (1991), 59, 3472-3477 et J. General Microbiology, (1993), 139, 2463).
Actuellement, le vaccin vétérinaire commercialisé (Mérial ) est un vaccin vivant composé d'une suspension de spores de la souche Sterne de B.
anthracis. Son efficacité protectrice chez l'animal varie selon les lots, sans que les causes de ces variations puissent être déterminées.
Cette efficacité aléatoire, des effets secondaires ainsi que le risque de dissémination potentielle de germes vivants dans l'environnement rendent son utilisa-tion chez l'homme impossible.
En médecine humaine, deux vaccins contre la maladie du charbon, essentiellement développés en Angleterre et aux Etats-Unis sont utilisés. Il s'agit de vaccins acellulaires constitués principalement de l'antigène protecteur (PA), préparé à
Alors que de nombreux travaux ont montré que PA est le principal antigène responsable de la protection dans le cadre d'une immunisation naturelle ou acquise par vaccination, les Inventeurs ont montré que LF est également un immuno-gène puissant (Mock M. Annales de l Institut Pasteur décembre 1990).
Afin de clarifier le rôle des composants des toxines dans la toxicité
de B. anthracis, les Inventeurs ont construit divers mutants. Ainsi, ils ont caractérisé
une souche dépourvue du plasmide pXO2 et dépourvue de PA par modification du plasmide pXO1. Du fait de l'absence de PA, cette souche ne présente plus de caractère létal (Cataldi A. et al. (1990), Molecular Microbiology, 4, 1111-1117).
Pour rechercher les éléments susceptibles d'intervenir dans l'immunisation contre l'infection par B. anthracis, les Inventeurs ont construit des mutants, dépourvus d'au moins l'un des facteurs de toxicité responsable de la patho-génicité, c'est-à-dire déficient en PA, en EF ou en LF, voire dépourvus du plasmide pXOI et dépourvus en plus du plasmide pXO2. Bien que dépourvus de toxicité ou présentant une toxicité atténuée, les mutants simples, notamment RP9 (EF) (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-1094 en date du 2 mai 1991) et RP 10 (LF) (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-1095 en date du 2 mai 1991), et le double mutant RP 42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999), se sont révélés aptes à produire des anticorps immunoprotecteurs contre une infection par une souche Sterne sauvage. Ces mutants sont décrits dans la demande Internationale n 92/19720, et dans les articles de Pezard C. et al., (Infection and Immunity, (1991), 59, 3472-3477 et J. General Microbiology, (1993), 139, 2463).
Actuellement, le vaccin vétérinaire commercialisé (Mérial ) est un vaccin vivant composé d'une suspension de spores de la souche Sterne de B.
anthracis. Son efficacité protectrice chez l'animal varie selon les lots, sans que les causes de ces variations puissent être déterminées.
Cette efficacité aléatoire, des effets secondaires ainsi que le risque de dissémination potentielle de germes vivants dans l'environnement rendent son utilisa-tion chez l'homme impossible.
En médecine humaine, deux vaccins contre la maladie du charbon, essentiellement développés en Angleterre et aux Etats-Unis sont utilisés. Il s'agit de vaccins acellulaires constitués principalement de l'antigène protecteur (PA), préparé à
3 partir de surnageants de culture de la souche toxinogène Sterne de B.
anthracis et d'un adjuvant pouvant être utilisé en médecine humaine, l'hydroxyde d'alumine.
Des étude récentes sur ces deux vaccins ont montré que le 'vaccin anglais, contenant des traces de EF et de LF induisant une réponse anticorps en ELISA, était plus efficace sur le cobaye que le vaccin américain, apparemment dépourvu de ces deux composants (Turnbull P.C. et al. (1991), Vaccine, 9, 533-539).
Toutefois ces deux vaccins présentent un certain nombre d'inconvénients :
- le protocole de vaccination est contraignant, car il nécessite six injections en dix-huit mois, suivies d'un rappel par an, - ils induisent des effets secondaires néfastes qui rendent leur utili-sation limitée, - la protection induite par ces vaccins acellulaires chez l'animal, envers un test d'épreuve avec une souche virulente, n'est jamais totale, contrairement à celle obtenue avec le vaccin vivant.
Compte tenu de l'importance des infections causées par B.
anthracis, de nombreux travaux sont actuellement consacrés à l'amélioration du .
vaccin afin qu'il ne présente pas les inconvénients exposés ci-dessus, tout en présen-tant la même protection que le vaccin vivant.
Dans ce cadre, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à
un vaccin acellulaire fiable, efficace, dépourvu d'effets secondaires qui pallie les inconvénients des vaccins existants et dont les propriétés vaccinales soient faciles à
contrôler.
La présente invention a en conséquence pour objet une composition immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à
B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
anthracis et d'un adjuvant pouvant être utilisé en médecine humaine, l'hydroxyde d'alumine.
Des étude récentes sur ces deux vaccins ont montré que le 'vaccin anglais, contenant des traces de EF et de LF induisant une réponse anticorps en ELISA, était plus efficace sur le cobaye que le vaccin américain, apparemment dépourvu de ces deux composants (Turnbull P.C. et al. (1991), Vaccine, 9, 533-539).
Toutefois ces deux vaccins présentent un certain nombre d'inconvénients :
- le protocole de vaccination est contraignant, car il nécessite six injections en dix-huit mois, suivies d'un rappel par an, - ils induisent des effets secondaires néfastes qui rendent leur utili-sation limitée, - la protection induite par ces vaccins acellulaires chez l'animal, envers un test d'épreuve avec une souche virulente, n'est jamais totale, contrairement à celle obtenue avec le vaccin vivant.
Compte tenu de l'importance des infections causées par B.
anthracis, de nombreux travaux sont actuellement consacrés à l'amélioration du .
vaccin afin qu'il ne présente pas les inconvénients exposés ci-dessus, tout en présen-tant la même protection que le vaccin vivant.
Dans ce cadre, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à
un vaccin acellulaire fiable, efficace, dépourvu d'effets secondaires qui pallie les inconvénients des vaccins existants et dont les propriétés vaccinales soient faciles à
contrôler.
La présente invention a en conséquence pour objet une composition immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à
B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
4 La présente invention a pour objet une composition immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à B.
anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite composition immunogène acellulaire est apte à produire des anticorps contre B.
anthracis.
La présente invention a également pour objet une composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
La présente invention a pour objet une composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique 4a chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
La présente invention a pour objet une souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un sérum polyclonal dirigé contre des spores tuées dérivées de souches obtenues, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive.
La présente invention a pour objet des préparations antigéniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles :
- sont obtenues par sélection des protéines de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa reconnues par un sérum polyclonal de souris obtenu par immunisation desdites souris avec des spores tuées de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, - consistent essentiellement en les exoantigènes de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa.
4b La présente invention a pour objet des anticorps spécifiques dirigés contre les préparations antigéniques selon l'invention.
Au sens de la présente invention, le terme acellulaire signifie que la composition immunogène ou vaccinale ne contient plus de cellules viables (spores tuées).
Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés et seront notamment, soit la saponine dans le cas du vaccin vétérinaire, soit avantageu-sement choisis dans le groupe constitué par l'hydroxyde d'alumine et le squalène, dans le cas du vaccin humain.
Dans le cadre de la présente invention, les spores peuvent être tuées par tout moyen physique ou chimique conduisant à leur inactivation. A titre d'exemple on peut citer le traitement au formaldéhyde ou l'irradiation.
Au sens de la présente invention, on entend par mutation une délé-tion, une modification ou une addition au niveau du gène concerné, qui résulte soit en un gène dépourvu de sa capacité à produire la protéine correspondante, soit apte à
produire une protéine inactive.
Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, les compo-sitions immunogènes et les compositions vaccinales peuvent comprendre en outre au moins une exotoxine détoxifiée choisie notamment dans le groupe constitué par le facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés, c'est-à-dire ayant perdu leurs propriétés toxiques.
Ces facteurs protéiques inactivés peuvent notamment être obtenus par expression des gènes mutés au niveau de la séquence codant pour le site actif desdits facteurs protéiques (cya ou lei).
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'Invention possèdent, de manière surprenante, un fort pouvoir protecteur, de l'ordre de 100 %, nettement supérieur à celui obtenu avec le PA seul ou les spores tuées seules, ce qui permet d'avoir une immunisation complète avec une seule injection
anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite composition immunogène acellulaire est apte à produire des anticorps contre B.
anthracis.
La présente invention a également pour objet une composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
La présente invention a pour objet une composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique 4a chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
La présente invention a pour objet une souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un sérum polyclonal dirigé contre des spores tuées dérivées de souches obtenues, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive.
La présente invention a pour objet des préparations antigéniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles :
- sont obtenues par sélection des protéines de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa reconnues par un sérum polyclonal de souris obtenu par immunisation desdites souris avec des spores tuées de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, - consistent essentiellement en les exoantigènes de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa.
4b La présente invention a pour objet des anticorps spécifiques dirigés contre les préparations antigéniques selon l'invention.
Au sens de la présente invention, le terme acellulaire signifie que la composition immunogène ou vaccinale ne contient plus de cellules viables (spores tuées).
Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés et seront notamment, soit la saponine dans le cas du vaccin vétérinaire, soit avantageu-sement choisis dans le groupe constitué par l'hydroxyde d'alumine et le squalène, dans le cas du vaccin humain.
Dans le cadre de la présente invention, les spores peuvent être tuées par tout moyen physique ou chimique conduisant à leur inactivation. A titre d'exemple on peut citer le traitement au formaldéhyde ou l'irradiation.
Au sens de la présente invention, on entend par mutation une délé-tion, une modification ou une addition au niveau du gène concerné, qui résulte soit en un gène dépourvu de sa capacité à produire la protéine correspondante, soit apte à
produire une protéine inactive.
Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, les compo-sitions immunogènes et les compositions vaccinales peuvent comprendre en outre au moins une exotoxine détoxifiée choisie notamment dans le groupe constitué par le facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés, c'est-à-dire ayant perdu leurs propriétés toxiques.
Ces facteurs protéiques inactivés peuvent notamment être obtenus par expression des gènes mutés au niveau de la séquence codant pour le site actif desdits facteurs protéiques (cya ou lei).
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'Invention possèdent, de manière surprenante, un fort pouvoir protecteur, de l'ordre de 100 %, nettement supérieur à celui obtenu avec le PA seul ou les spores tuées seules, ce qui permet d'avoir une immunisation complète avec une seule injection
5 PCT/FROO/02494 dans les conditions du vaccin vétérinaire et deux injections dans les conditions du vaccin à usage humain.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention, les spores sont issues d'une souche de 5 B. anthracis choisie dans le groupe constitué par les souches suivantes :
Sterne 7702 (M. Sterne J. Vet. Sci. Anima. Indust., (1939), 13, 315-317), RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
Dans un autre mode de réalisation avantageux des compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention, l'antigène protecteur est choisi dans le groupe constitué par les antigènes protecteurs purifiés, issus de n'importe quelle souche Sterne sauvage ou mutée de B. anthracis, et les antigènes protecteurs recombi-nants, notamment celui produit par B. subtilis.
De manière avantageuse, l'antigène protecteur est issu de la souche RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
La présente invention a également pour objet la souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre les spores issues de souches, obtenues soit à
partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pX02, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive. En effet les antibiotiques sont le seul traitement actuel contre le charbon et doivent être administrés précocement, avant l'apparition du choc toxique. En conséquence une sérothérapie visant à la fois les toxines et la germination des spores serait un bon complément.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un animal approprié avec les spores issues de souches utilisées pour la préparation des compositions selon l'invention, dans des conditions habituelles de préparation de tels anticorps.
Les anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus de manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris immu-
Selon un autre mode de réalisation avantageux des compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention, les spores sont issues d'une souche de 5 B. anthracis choisie dans le groupe constitué par les souches suivantes :
Sterne 7702 (M. Sterne J. Vet. Sci. Anima. Indust., (1939), 13, 315-317), RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
Dans un autre mode de réalisation avantageux des compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention, l'antigène protecteur est choisi dans le groupe constitué par les antigènes protecteurs purifiés, issus de n'importe quelle souche Sterne sauvage ou mutée de B. anthracis, et les antigènes protecteurs recombi-nants, notamment celui produit par B. subtilis.
De manière avantageuse, l'antigène protecteur est issu de la souche RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
La présente invention a également pour objet la souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre les spores issues de souches, obtenues soit à
partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pX02, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive. En effet les antibiotiques sont le seul traitement actuel contre le charbon et doivent être administrés précocement, avant l'apparition du choc toxique. En conséquence une sérothérapie visant à la fois les toxines et la germination des spores serait un bon complément.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un animal approprié avec les spores issues de souches utilisées pour la préparation des compositions selon l'invention, dans des conditions habituelles de préparation de tels anticorps.
Les anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus de manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris immu-
6 nisées avec un antigène consistant en des spores issues de souches utilisées pour la préparation des compositions selon l'invention.
La présente invention a également pour objet des préparations anti-géniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont issues de spores de B.
anthracis, et comprennent par exemple un ou plusieurs des exoantigènes (protéines de spores et de l'exosporium) de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à
200 kDa, lesdits poids moléculaires étant déterminés par l'utilisation de la trousse AMERSHAM LMW Electrophoresis Calibration Kit.
Conformément à l'invention, ces compositions antigéniques sont obtenues par des techniques classiques connues de l'homme du métier.
La présente invention a de plus pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre lesdites compositions antigèniques.
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention peuvent être administrées, seules ou en combinaison avec d'autres vaccins, par injec-tion ou par toute voie habituellement utilisée pour la vaccination.
Les dose à administrer seront déterminées en fonction de l'animal ou de la personne que l'on cherche à protéger.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles :
- la figure 1 représente l'analyse par immunoblot des protéines de la spore selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5, - la figure 2 représente l'analyse par immunoblot des protéines de l'exosporium (A) révélation par un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal (35B8) (B) analyse selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5, - la figure 3 représente les différentes souches de B. anthracis utili-sées pour préparer la souche RPLC2. La souche RPLC2 produit les composants des toxines inactivés par mutations ponctuelles dans les sites actifs des protéines LF
(LF686 ; H686-*A) et EF (EF346/353 ; K346->Q et K353->Q). Dans cette figure, les nombres qui suivent à indiquent les nucléotides auxquels les délétions commencent et finissent ; Erm, Kan et Sps indiquent l'insertion de cassettes de résistance à
l'érythromycine, à la kanamycine et à la spectinomycine ; 0 correspond à un orga-nisme qui ne présente pas de résistance à ces antibiotiques.
EXEMPLE 1 : Matériel et méthode pour la préparation des compositions selon l'invention.
1.1. Construction de la souche RPLC2 La souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du
La présente invention a également pour objet des préparations anti-géniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont issues de spores de B.
anthracis, et comprennent par exemple un ou plusieurs des exoantigènes (protéines de spores et de l'exosporium) de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à
200 kDa, lesdits poids moléculaires étant déterminés par l'utilisation de la trousse AMERSHAM LMW Electrophoresis Calibration Kit.
Conformément à l'invention, ces compositions antigéniques sont obtenues par des techniques classiques connues de l'homme du métier.
La présente invention a de plus pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre lesdites compositions antigèniques.
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention peuvent être administrées, seules ou en combinaison avec d'autres vaccins, par injec-tion ou par toute voie habituellement utilisée pour la vaccination.
Les dose à administrer seront déterminées en fonction de l'animal ou de la personne que l'on cherche à protéger.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles :
- la figure 1 représente l'analyse par immunoblot des protéines de la spore selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5, - la figure 2 représente l'analyse par immunoblot des protéines de l'exosporium (A) révélation par un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal (35B8) (B) analyse selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5, - la figure 3 représente les différentes souches de B. anthracis utili-sées pour préparer la souche RPLC2. La souche RPLC2 produit les composants des toxines inactivés par mutations ponctuelles dans les sites actifs des protéines LF
(LF686 ; H686-*A) et EF (EF346/353 ; K346->Q et K353->Q). Dans cette figure, les nombres qui suivent à indiquent les nucléotides auxquels les délétions commencent et finissent ; Erm, Kan et Sps indiquent l'insertion de cassettes de résistance à
l'érythromycine, à la kanamycine et à la spectinomycine ; 0 correspond à un orga-nisme qui ne présente pas de résistance à ces antibiotiques.
EXEMPLE 1 : Matériel et méthode pour la préparation des compositions selon l'invention.
1.1. Construction de la souche RPLC2 La souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du
7 juillet 1999) est construite à partir des souches indiquées dans la figure 3, selon les principes opératoires décrits par Pezard C. et al. (1993) (référence citée).
1.2. Préparation du PA
La protéine PA est préparée à partir de la souche mutante de B.
anthracis RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
Les surnageants de culture en milieu R (Ristroph J. D. et al. (1983), Infection and Immunity, 39, 483-486) sont filtrés puis concentrés sur un système Minitan (membrane Millipore PLGC OMP).
L'antigène PA est ensuite purifié par chromatographie ultra-rapide (FPLC) sur colonne monoQ selon le protocole décrit par Pezard C. et al.
(1993) (référence citée).
1.3. Préparation et inactivation des spores Les spores sont préparées à partir de la souche Sterne 7702 selon le mode opératoire décrit par Guidi-Rontani E et al. (1999) (référence citée).
Les spores sont préparées sur un milieu solide NBY, puis lavées à
l'eau distillée. Elles sont inactivées par traitement au formol, à une concentration finale de 4 %, pendant 3 heures à 37 C.
Après lavage par centrifugation, les spores sont reprises dans le volume initial de sérum physiologique (concentration finale de 109 spores/ml).
Cette suspension est utilisée pour réaliser l'immunisation.
Si nécessaire, notamment lorsque l'on veut préparer un vaccin à
usage humain, les spores peuvent être purifiées avant le traitement au formol sur un gradient de Radioselectran (Schering S.A.) de 50 % à 76 %.
1.4. Préparation des compositions vaccinales Les compositions sont préparées soit à partir de spores tuées seules préparées selon le mode opératoire décrit en 1.3, soit à partir d'un mélange de PA (à
une concentration telle qu'on injectel0 gg par souris) et de spores tuées (10e spores par souris), auxquels on ajoute comme adjuvant soit de l'hydroxyde d'alumine à
une concentration finale de 0,3 %, soit de la saponine à une concentration finale de 0,05 %.
1.5. Protocole de traitement des souris On utilise des souris Swiss femelles de six semaines fournies par la Société Iffa-Credo (BP0102 - 69592 L'ARBRESLE-Cedex).
Les animaux sont répartis en groupe de six et nourris ad libitum.
Les injections sont faites par voie sous-cutanée au niveau de l'aine sous un volume de 200 l.
1.2. Préparation du PA
La protéine PA est préparée à partir de la souche mutante de B.
anthracis RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
Les surnageants de culture en milieu R (Ristroph J. D. et al. (1983), Infection and Immunity, 39, 483-486) sont filtrés puis concentrés sur un système Minitan (membrane Millipore PLGC OMP).
L'antigène PA est ensuite purifié par chromatographie ultra-rapide (FPLC) sur colonne monoQ selon le protocole décrit par Pezard C. et al.
(1993) (référence citée).
1.3. Préparation et inactivation des spores Les spores sont préparées à partir de la souche Sterne 7702 selon le mode opératoire décrit par Guidi-Rontani E et al. (1999) (référence citée).
Les spores sont préparées sur un milieu solide NBY, puis lavées à
l'eau distillée. Elles sont inactivées par traitement au formol, à une concentration finale de 4 %, pendant 3 heures à 37 C.
Après lavage par centrifugation, les spores sont reprises dans le volume initial de sérum physiologique (concentration finale de 109 spores/ml).
Cette suspension est utilisée pour réaliser l'immunisation.
Si nécessaire, notamment lorsque l'on veut préparer un vaccin à
usage humain, les spores peuvent être purifiées avant le traitement au formol sur un gradient de Radioselectran (Schering S.A.) de 50 % à 76 %.
1.4. Préparation des compositions vaccinales Les compositions sont préparées soit à partir de spores tuées seules préparées selon le mode opératoire décrit en 1.3, soit à partir d'un mélange de PA (à
une concentration telle qu'on injectel0 gg par souris) et de spores tuées (10e spores par souris), auxquels on ajoute comme adjuvant soit de l'hydroxyde d'alumine à
une concentration finale de 0,3 %, soit de la saponine à une concentration finale de 0,05 %.
1.5. Protocole de traitement des souris On utilise des souris Swiss femelles de six semaines fournies par la Société Iffa-Credo (BP0102 - 69592 L'ARBRESLE-Cedex).
Les animaux sont répartis en groupe de six et nourris ad libitum.
Les injections sont faites par voie sous-cutanée au niveau de l'aine sous un volume de 200 l.
8 1.6. Mesure des taux d'anticorps Les taux d'anticorps sont mesurés par un test ELISA classique.
EXEMPLE 2: Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin acellulaire humain (protocole n 1) 2.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indi-qué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 28 jours d'intervalles et - une injection d'épreuve est réalisée au 43 sème jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit :
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule (groupe témoin), - le second groupe reçoit une dose de PA de 10 gg par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris et - le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 g de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent au 431Cme jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 10 spores par souris.
2.2. Résultats Les taux de survie sont donnés dans le Tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie 43 sème jour au 431tme jour Adjuvant seul 6/6 0%
PA seul 3/6 50%
Spores tuées seules 2/6 33 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
EXEMPLE 2: Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin acellulaire humain (protocole n 1) 2.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indi-qué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 28 jours d'intervalles et - une injection d'épreuve est réalisée au 43 sème jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit :
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule (groupe témoin), - le second groupe reçoit une dose de PA de 10 gg par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris et - le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 g de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent au 431Cme jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 10 spores par souris.
2.2. Résultats Les taux de survie sont donnés dans le Tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie 43 sème jour au 431tme jour Adjuvant seul 6/6 0%
PA seul 3/6 50%
Spores tuées seules 2/6 33 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
9 Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vacci-nales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète.
EXEMPLE 3: Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin à usage humain (protocole n 2) 3.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indi-qué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 21 jours d'intervalles et - une injection d'épreuve est réalisée au 32 "me jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit :
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule, - le second groupe reçoit une dose de PA de 10 g par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris et - le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 g de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent, au 32"e jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
3.2. Résultats 3.2.1. Taux de survie Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie 32 'eme jour au 32 "me jour Adjuvant seul 6/6 0%
PA seul 1/6 83%
Spores tuées seules 1/7 85 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vacci-nales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète.
3.2.2. Taux d'anticorps Les taux d'anticorps dirigés contre les spores sont élevés, de l'ordre 5 de 10 000 à 15 000, et identiques dans les deux groupes qui les ont reçues, que ces spores soient seules ou associées à PA.
Ces résultats confirment l'effet de synergie des compositions selon l'invention, qui, avec un taux d'anticorps identique à celui obtenu par injection des spores tuées seules, permettent une protection complète.
EXEMPLE 3: Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin à usage humain (protocole n 2) 3.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indi-qué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 21 jours d'intervalles et - une injection d'épreuve est réalisée au 32 "me jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit :
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule, - le second groupe reçoit une dose de PA de 10 g par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris et - le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 g de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent, au 32"e jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
3.2. Résultats 3.2.1. Taux de survie Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie 32 'eme jour au 32 "me jour Adjuvant seul 6/6 0%
PA seul 1/6 83%
Spores tuées seules 1/7 85 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vacci-nales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète.
3.2.2. Taux d'anticorps Les taux d'anticorps dirigés contre les spores sont élevés, de l'ordre 5 de 10 000 à 15 000, et identiques dans les deux groupes qui les ont reçues, que ces spores soient seules ou associées à PA.
Ces résultats confirment l'effet de synergie des compositions selon l'invention, qui, avec un taux d'anticorps identique à celui obtenu par injection des spores tuées seules, permettent une protection complète.
10 EXEMPLE 4 : Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage vétérinaire (une seule injection en utilisant la saponine comme adjuvant) :
épreuve avec souche 17JB.
4.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- une injection de compositions vaccinales préparées comme indiqué
au point 1.4. ou de saponine est réalisée à JO et - une injection d'épreuve est réalisée au 321Cme jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Cinq groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit - le premier groupe reçoit la saponine seule (groupe témoin), - le second groupe reçoit une dose de PA de 10 g par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris, - le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 g de PA et 10$ spores par souris et - le cinquième groupe reçoit le vaccin vivant Sterne préparé à
l'Institut Pasteur.
Tous les groupes reçoivent une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 105 spores au 32 sème jour 4.2. Résultats Ils sont donnés dans le Tableau III ci-dessous.
épreuve avec souche 17JB.
4.1. Traitement des animaux Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- une injection de compositions vaccinales préparées comme indiqué
au point 1.4. ou de saponine est réalisée à JO et - une injection d'épreuve est réalisée au 321Cme jour avec la souche virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par la Société Rhône-Mérieux.
Cinq groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme suit - le premier groupe reçoit la saponine seule (groupe témoin), - le second groupe reçoit une dose de PA de 10 g par souris, - le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores par souris, - le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de manière à avoir 10 g de PA et 10$ spores par souris et - le cinquième groupe reçoit le vaccin vivant Sterne préparé à
l'Institut Pasteur.
Tous les groupes reçoivent une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 105 spores au 32 sème jour 4.2. Résultats Ils sont donnés dans le Tableau III ci-dessous.
11 TABLEAU III
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie 32 ième jour au 32 ième jour Adjuvant seul 6/6 00/0 PA seul 1/6 83 %
Spores vivantes 0/6 10011/0 Spores tuées seules 4/6 33 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
Ces résultats montrent clairement que les compositions vaccinales selon l'invention sont aussi efficaces que le vaccin vivant et pourraient par conséquent être avantageusement utilisées comme vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 5: Analyse par immunoblot des protéines de spores de B. anthracis 5.1. Matériel et méthode 5.1.1. Préparation des anticorps polyclonaux et monoclonaux.
Un sérum polyclonal de souris immunisées avec des spores tuées issues, par exemple, de la souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du juillet 1999) est préparé selon des techniques classiques et connues de l'homme du métier.
L'anticorps monoclonal spécifique de la surface de la spore (35B8) est préparé selon la technique décrite par Kohler et al., (1975), Nature, 296, 495-497.
5.1.2. Extraction des spores Les protéines de la spore sont solubilisées par traitement des spores avec un tampon Tris-HCI à pH 9,8 contenant 8 M d'urée et 2 % de SDS ou avec un tampon Tris10 mM à pH 9,5 contenant 10 mM d'EDTA et 1 % de SDS, selon la technique décrite par Garcia-Patrone, (1995), Molecular and Cellular Biochem., 145, 29-37).
5.2. Résultats Ils sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2.
Le sérum polyclonal de souris reconnaît 3 espèces protéiques de poids moléculaire respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa et une espèce protéique de poids moléculaire supérieur à 200 kDa. (Figure 1).
L'espèce la plus lourde est également reconnue par l'anticorps monoclonal 35B8 et semble appartenir à l'exosporium (Figure 2A).
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie 32 ième jour au 32 ième jour Adjuvant seul 6/6 00/0 PA seul 1/6 83 %
Spores vivantes 0/6 10011/0 Spores tuées seules 4/6 33 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
Ces résultats montrent clairement que les compositions vaccinales selon l'invention sont aussi efficaces que le vaccin vivant et pourraient par conséquent être avantageusement utilisées comme vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 5: Analyse par immunoblot des protéines de spores de B. anthracis 5.1. Matériel et méthode 5.1.1. Préparation des anticorps polyclonaux et monoclonaux.
Un sérum polyclonal de souris immunisées avec des spores tuées issues, par exemple, de la souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du juillet 1999) est préparé selon des techniques classiques et connues de l'homme du métier.
L'anticorps monoclonal spécifique de la surface de la spore (35B8) est préparé selon la technique décrite par Kohler et al., (1975), Nature, 296, 495-497.
5.1.2. Extraction des spores Les protéines de la spore sont solubilisées par traitement des spores avec un tampon Tris-HCI à pH 9,8 contenant 8 M d'urée et 2 % de SDS ou avec un tampon Tris10 mM à pH 9,5 contenant 10 mM d'EDTA et 1 % de SDS, selon la technique décrite par Garcia-Patrone, (1995), Molecular and Cellular Biochem., 145, 29-37).
5.2. Résultats Ils sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2.
Le sérum polyclonal de souris reconnaît 3 espèces protéiques de poids moléculaire respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa et une espèce protéique de poids moléculaire supérieur à 200 kDa. (Figure 1).
L'espèce la plus lourde est également reconnue par l'anticorps monoclonal 35B8 et semble appartenir à l'exosporium (Figure 2A).
12 En effet l'analyse par immunoblot des protéines de l'exosporium montre que les différents anticorps monoclonaux utilisés, dont 35B8, reconnaissent une espèce protéique de poids moléculaire supérieur à 200 kDa (Figure 2A).
Il ressort de ce qui précède que les compositions vaccinales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète aussi bien dans les condi-tions du vaccin humain que du vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 6: Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention administrées selon le protocole n 1 de l'Exemple 2, avec l'antigène PA seul, chez la souris ou chez le cobaye : épreuve avec la souche 9602.
A. Souris Swiss 6.1. Traitement des animaux :
Le protocole d'injection pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections des compositions vaccinales préparées comme indiqué au point 1.4 dans l'exemple 1 sont réalisées à 15 jours d'intervalle (JO et J15), et - une injection d'épreuve est réalisée au 35ème jour avec le souche virulente 9602 (M. Berthier et al., Lancet, 1996, 347, 9004:828) isolée à
partir d'un cas mortel de charbon humain et dont la virulence est dix fois supérieure à
celle de la souche 17JB utilisée dans les exemples précédents ; ladite souche est injectée en sous-cutanée.
4 groupes d'animaux tels que définis à l'exemple 2 sont immunisés selon ce protocole.
Tous les groupes reçoivent au 35ème jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
6.2. Résultats Les expériences ont été répétées 3 fois, avec des préparations diffé-rentes, sur des lots de 6 à 8 souris par point (pour raison de confinement P3).
Les taux de survie sont illustrés dans le Tableau IV ci-après.
TABLEAU IV
Traitement Pourcentage de survie au 35è` jour et jusqu'au 43ème jour Adjuvant seul 0%
PA seul 0%
Spores tuées seules 0%
PA + spores tuées 100 %
Il ressort de ce qui précède que les compositions vaccinales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète aussi bien dans les condi-tions du vaccin humain que du vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 6: Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention administrées selon le protocole n 1 de l'Exemple 2, avec l'antigène PA seul, chez la souris ou chez le cobaye : épreuve avec la souche 9602.
A. Souris Swiss 6.1. Traitement des animaux :
Le protocole d'injection pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections des compositions vaccinales préparées comme indiqué au point 1.4 dans l'exemple 1 sont réalisées à 15 jours d'intervalle (JO et J15), et - une injection d'épreuve est réalisée au 35ème jour avec le souche virulente 9602 (M. Berthier et al., Lancet, 1996, 347, 9004:828) isolée à
partir d'un cas mortel de charbon humain et dont la virulence est dix fois supérieure à
celle de la souche 17JB utilisée dans les exemples précédents ; ladite souche est injectée en sous-cutanée.
4 groupes d'animaux tels que définis à l'exemple 2 sont immunisés selon ce protocole.
Tous les groupes reçoivent au 35ème jour, comme précisé ci-dessus, une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par souris.
6.2. Résultats Les expériences ont été répétées 3 fois, avec des préparations diffé-rentes, sur des lots de 6 à 8 souris par point (pour raison de confinement P3).
Les taux de survie sont illustrés dans le Tableau IV ci-après.
TABLEAU IV
Traitement Pourcentage de survie au 35è` jour et jusqu'au 43ème jour Adjuvant seul 0%
PA seul 0%
Spores tuées seules 0%
PA + spores tuées 100 %
13 B. Cobayes.
Les expériences ont été réalisées 2 fois, sur des lots de 5 cobayes. Le protocole est similaire à celui utilisé chez la souris, à l'exception des points suivants - les doses de PA sont de 40 g par animal, - l'injection d'épreuve est réalisée par voie intramusculaire.
On obtient 100 % de survivants pour la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA, contre 40 % chez les animaux recevant PA seul, composition du vaccin classique.
6.3. Taux d'anticorps.
Ces expériences (souris et cobayes) ont été accompagnées du suivi de la réponse en anticorps par ELISA sur des échantillons de sérum de souris et de cobayes. Les titres en anticorps envers PA sont élevés (> 5000) ; une réponse du même ordre est détectée envers des antigènes spécifiques de la spore.
EXEMPLE 7: Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage vétérinaire telles que décrites à l'Exemple 4 (épreuve avec souche 9602).
Le test a été réalisé sur souris Swiss (dans les conditions décrites à
l'Exemple 4). L'injection d'épreuve est réalisée avec la souche 9602 (M.
Berthier et al., précité) chez des souris ayant reçu une seule injection, soit de spores vivantes (RPLC2), soit de la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA.
L'efficacité de protection, de 83 %, est identique pour les deux lots.
Ces résultats montrent clairement qu'il est possible de protéger à
100 % des souris et des cobayes avec une combinaison vaccinale comportant des spores tuées et de l'antigène PA.
Les expériences ont été réalisées 2 fois, sur des lots de 5 cobayes. Le protocole est similaire à celui utilisé chez la souris, à l'exception des points suivants - les doses de PA sont de 40 g par animal, - l'injection d'épreuve est réalisée par voie intramusculaire.
On obtient 100 % de survivants pour la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA, contre 40 % chez les animaux recevant PA seul, composition du vaccin classique.
6.3. Taux d'anticorps.
Ces expériences (souris et cobayes) ont été accompagnées du suivi de la réponse en anticorps par ELISA sur des échantillons de sérum de souris et de cobayes. Les titres en anticorps envers PA sont élevés (> 5000) ; une réponse du même ordre est détectée envers des antigènes spécifiques de la spore.
EXEMPLE 7: Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage vétérinaire telles que décrites à l'Exemple 4 (épreuve avec souche 9602).
Le test a été réalisé sur souris Swiss (dans les conditions décrites à
l'Exemple 4). L'injection d'épreuve est réalisée avec la souche 9602 (M.
Berthier et al., précité) chez des souris ayant reçu une seule injection, soit de spores vivantes (RPLC2), soit de la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA.
L'efficacité de protection, de 83 %, est identique pour les deux lots.
Ces résultats montrent clairement qu'il est possible de protéger à
100 % des souris et des cobayes avec une combinaison vaccinale comportant des spores tuées et de l'antigène PA.
Claims (11)
1. Composition immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition immunogène acellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est apte à produire des anticorps contre B.
anthracis.
anthracis.
3. Composition vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
- un antigène protecteur (PA), - des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un adjuvant.
4. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, ou composition vaccinale selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une exotoxine détoxifiée choisie dans le groupe constitué
par le facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés.
par le facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés.
5. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, ou composition vaccinale selon la revendication 3, caractérisée en ce que les spores sont issues d'une souche de B. anthracis choisie dans le groupe constitué
par les souches suivantes : Sterne 7702, RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
par les souches suivantes : Sterne 7702, RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
6. Composition immunogène ou composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'antigène protecteur est choisi dans le groupe constitué par les antigènes protecteurs purifiés, issus de n'importe quelle souche Sterne sauvage ou mutée de B. anthracis, et les antigènes protecteurs recombinants.
7. Composition immunogène ou composition vaccinale selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'antigène protecteur est issu de la souche RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2271 en date du 28 juillet 1999).
8. Souche RPLC2 déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999.
9. Utilisation d'un sérum polyclonal dirigé contre des spores tuées dérivées de souches obtenues, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive.
anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, pour la fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive.
10. Préparations antigéniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles :
- sont obtenues par sélection des protéines de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa reconnues par un sérum polyclonal de souris obtenu par immunisation desdites souris avec des spores tuées de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, - consistent essentiellement en les exoantigènes de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa.
- sont obtenues par sélection des protéines de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa reconnues par un sérum polyclonal de souris obtenu par immunisation desdites souris avec des spores tuées de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur létal (LF) et un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, - consistent essentiellement en les exoantigènes de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa.
11. Anticorps spécifiques dirigés contre les préparations antigéniques selon la revendication 10.
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