WO2003102170A1 - Souches de bordetella rendues deficientes par attenuation genetique - Google Patents

Souches de bordetella rendues deficientes par attenuation genetique Download PDF

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WO2003102170A1
WO2003102170A1 PCT/FR2003/001642 FR0301642W WO03102170A1 WO 2003102170 A1 WO2003102170 A1 WO 2003102170A1 FR 0301642 W FR0301642 W FR 0301642W WO 03102170 A1 WO03102170 A1 WO 03102170A1
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Anne-Sophie Debrie
Camille Locht
Nathalie Mielcarek
Dominique Raze
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Institut Pasteur De Lille
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to the field of research and the development of new vaccines for the treatment of infections caused by Bordetella strains, in particular pertussis caused by B. pertussis.
  • the invention relates to living strains of Bordetella made deficient in the production of the toxin from B. pertussis PTX and in the release of the cytotracheal toxin (also called tracheal cytotoxin) TCT, and this, by genetic attenuation, via the mutation. or the deletion of the gene coding for the PTX toxin and the addition of a strong promoter upstream of the gene coding for the AmpG protein, which is involved in the recycling of the TCT toxin.
  • the present invention also relates to living strains of
  • Bordetella exhibiting, in addition to the above-mentioned properties, a deficiency in the production of the dermonecrotic toxin DNT, a deficiency obtained by mutation or deletion of the gene encoding said toxin.
  • the subject of the invention is living strains of Bordetella genetically attenuated and capable of producing a heterologous protein in cytoplasmic form, and / or on the surface of bacteria, and / or in secreted form.
  • This heterologous protein can in particular be a hybrid protein comprising, for example, at least part of a Bordetella adhesin, in particular a part of the filamentous hemagglutinin FHA.
  • the present invention also relates to methods for obtaining strains deficient in Bordetella by genetic attenuation.
  • the invention relates to the use of such strains for immunoprophylactic and / or therapeutic purposes. More particularly, the invention relates to the use of live strains of Bordetella genetically attenuated for the vaccination of humans or the animal against pertussis and / or various other infectious diseases. Among other interests, these strains are likely to be administered intranasally.
  • the present invention relates to immunogenic compositions comprising, as active principle, living strains of Bordetella genetically attenuated in a pharmaceutically acceptable formulation.
  • Pertussis therefore poses a major public health problem, forcing health authorities and other competent bodies, as well as medical personnel, to maintain or even strengthen the epidemiological watch networks around this disease, and to encourage the development of effective means of control. , easy to use and relatively inexpensive.
  • the so-called first generation pertussis vaccines consisted of killed strains of B. pertussis. These inactivated cell vaccines (wP for "whole cell pertussis vaccine”) have been used for about fifty years. They observed a considerable decrease in the incidence of pertussis and, by that very fact, of the mortality related to this disease. However, it turned out that these vaccines had sometimes serious side effects.
  • Second generation vaccines now used in many industrialized countries, are acellular (aP) vaccines containing between 2 and 5 purified bacterial antigenic components. These vaccines have been described as inducing fewer side effects than wP vaccines. As such, they have largely replaced the first generation vaccines in the traditional "triple" vaccine against diphtheria, tetanus and whooping cough (DTP vaccine). Analysis of T cell responses after vaccination has shown that wP vaccines stimulate a Th1 type cellular immune response in humans and mice. In contrast, aP vaccines induce a mixed Th1 / Th2 profile in humans and Th2 in mice (Mills et al. 1998. Dev. Biol. Stand. 95: 31-41.).
  • the present invention is part of an alternative vaccination strategy consisting of the intranasal administration of Bordetella strains, and in particular of ⁇ strains. pertussis, alive and genetically attenuated. Vaccination by the intranasal route is of particular interest in developing countries. In fact, compared to injection immunizations, mucosal immunizations reduce the need for medical personnel and equipment, and eliminate the problem of contamination from poorly sterilized and / or misused syringes.
  • Bordetella and in particular the strains of B. pertussis, there are mainly three protein toxins, the toxin of B. pertussis PTX, the dermonecrotic toxin DNT and adenylate cyclase AC, as well as a glycopeptide called cytotracheal toxin TCT.
  • the PTX toxin is made up of five different subunits, S1 to S5.
  • the subunits S2 to S5 are responsible for the binding of the toxin to the receptors carried by the target cells.
  • the S1 subunit on the other hand, exhibits ADP-ribosyltransferase activity (for more details on the toxins produced by 8. pertussis, see the review Locht et al. 2001. Curr. Opin. Microbiol. 4: 82-89 ).
  • the DNT toxin also called PEHLT for "Pertussis Heat-Labile Toxin" is a monomeric polypeptide of 159 kDa (for review, Locht and Antoine. 1999. In: The Comprehensive Sourcebook of bacterial protein toxins, Ed. Académie Press, pp. 130-146.). Unlike the other toxins produced and then secreted by B. pertussis, the DNT toxin remains localized in the cytoplasm of the bacteria (Cowell et al. 1979. Infect. Immun. 25: 896-901). The role of this toxin in the pathogenicity and virulence of Bordetella strains has not yet been fully elucidated.
  • the toxin DNT has been shown to be highly lethal when injected in purified form intravenously into mice (Zhang and Sekura. 1991. Infect. Immun. 59: 3754-3759).
  • the protein toxin AC has two adenylate cyclase activities, one of which is responsible for hemolysis and the other dependent on calmodulin, a cytoplasmic protein that is calcium-sensitive and which regulates its metabolism. These two activities are important during the early stages of infection, in that they probably induce apoptosis of the alveolar macrophages.
  • the TCT toxin is a low molecular weight glycopeptide which is derived from the peptidoglycan and is released by ⁇ .
  • TCT pertussis during its growth phase
  • TCT is responsible for the destruction of the hair cells of the respiratory epithelium, thereby weakening the process of "cleaning" said epithelium. It could therefore be at the origin of the characteristic cough of pertussis.
  • viralence is understood to mean the capacity of bacteria, in particular Bordetella, to develop in a host organism by producing therein toxic substances or “toxins”.
  • Toxicity refers to the ability of such a toxin to cause metabolic alterations, or even ultimately cell death within the host organism.
  • a "host organism” is a man or an animal.
  • the present invention relates to living strains of Bordetella made deficient in the production of at least two virulence factors among those mentioned above, and this, by genetic attenuation.
  • the invention is not limited to living and deficient strains belonging to the species B. pertussis, but also relates to any species of Bordetella likely to be of interest from a medical point of view or for study and research. In this case, more particularly targeted are infectious species for humans other than B. pertussis, in particular ⁇ . parapertussis and B. bronchiseptica, or infectious for animals, especially the ⁇ species. bronchiseptica for dogs or pigs, or B. avium for birds.
  • the term “attenuation” is understood to mean the fact that out of the four above-mentioned toxins, which are important for the virulence and pathogenicity of the Bordetella strains, at least two are not produced, or are produced in a non-functional form, by living strains genetically attenuated in accordance with the invention.
  • Genetic attenuation relates more precisely to genetic modifications or alterations, carried out either directly in the genes coding for said toxins, or in a roundabout way, by targeting a gene coding for a protein involved in the metabolic pathway of synthesis and / or transport and / or recycling said toxins.
  • the present invention demonstrates that, when the Bordetella strains are made deficient in the production of the only toxin DNT, they exhibit an altered immunogenicity profile, with a significant reduction in the production of antibodies directed against FHA (Example 6 ci - below).
  • the invention relates to Bordetella strains deficient in the production of the PTX toxin and in the release of the TCT cytotoxin.
  • Such strains are genetically attenuated by mutation or deletion of the gene coding for the toxin PTX and by insertion of a strong promoter upstream of the gene coding for the protein AmpG (ampG gene), which participates in the recycling of the cytotoxin TCT.
  • a “mutation” designates any alteration of the sequence of a gene coding for a toxin, said alteration rendering the protein thus coded non-toxic. It may be a point mutation resulting in the modification of one or more residues responsible for the toxicity of the protein. It can also be a mutation by shifting the reading frame. In this case, the translated sequence does not correspond to the expected sequence. Finally, a nonsense mutation can be envisaged by introducing a premature stop codon into phase within the gene. The protein then synthesized is truncated by at least the region or regions responsible for its toxicity.
  • the invention relates to Bordetella strains deficient in the production of PTX and DNT toxins, as well as in the release of the TCT cytotoxin.
  • these strains are genetically attenuated by mutation or deletion of the genes encoding the PTX and DNT toxins (ptx and dnt genes), and by insertion of a strong promoter upstream of the ampG gene.
  • the gene encoding the toxin PTX is mutated, rather than deleted.
  • This gene then has one or more mutations, preferably in the region encoding the S1 subunit of the PTX protein, said region being responsible for the toxicity thereof.
  • the deletion of the gene coding for the PTX toxin or the deletion of at least one of the genes coding for the PTX and DNT toxins can be total or partial.
  • partial deletion comparable to a mutation by reading frame shift or a nonsense mutation as defined above, at least the region or regions responsible for the toxicity of the protein must be deleted, so that it is rendered nonpoisonous.
  • the Bordetella strains which are the subject of the present invention are capable of overexpressing the AmpG protein thanks to the insertion of a strong promoter upstream of the ampG gene.
  • the promoter of the gene of the major porin of Bordetella promoter Ppordu gene por; see Example 7
  • any other strong promoter in this bacterial genus there is the promoter of the gene of the major porin of Bordetella (promoter Ppordu gene por; see Example 7), or any other strong promoter in this bacterial genus.
  • the AmpG protein thus overexpressed can be native or mutated as long as it retains its function in the metabolism of the wall in Bordetella and, more specifically, in the recycling of the cytotoxin TCT (see, for example, ampG1 and ampG2 genes in Example 7).
  • proteins coded by genes having at least 80% identity under strict hybridization conditions with the genes coding for the proteins themselves subject of the invention are proteins " similar "to the latter in structure and function (for strict hybridization conditions, see Sambrook and Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York , USA). It is understood that these similar proteins are included within the scope of the present invention. For example, proteins similar to the toxins PTX and DNT, as well as to the proteins AmpG and FHA (filamentous hemagglutinin, see infra) are also targeted by the invention.
  • Bordetella and in particular the ptx and dnt genes, can be carried out by any conventional method known to those skilled in the art (Antoine and Locht. 1990. Infect. Immun. 58: 1518-1526; and Sambrook and Russel. 2001, supra ).
  • a method for obtaining a Bordetella strain having a mutation or deletion of the ptx or dnt gene comprises the following steps: a) crossing a native and virulent Bordetella strain or a strain mutated with a mobilizing strain of Escherichia coli; b) the selection, using markers, of cells having lost the ptx or dnt gene, or having acquired a gene coding for a mutated and atoxic protein.
  • the loss of the ability of the cross strain to produce a toxin and / or the acquisition by this of the ability to synthesize a mutated and atoxic protein is the result of a double homologous recombination event between the parental strain and a plasmid of the mobilizing strain, said plasmid carrying a copy of the flanking regions and / or of the gene or of a part of the gene coding for a mutated and atoxic protein (see Examples below).
  • the selection markers must be chosen according to the Bordetella strains used. Examples of such markers are resistance to antibiotics (especially gentamicin and / or streptomycin) and resistance to a high concentration of sucrose (greater than 5%) in the culture medium.
  • the present invention relates to live genetically attenuated Bordetella strains as described above, and capable of producing a heterologous protein.
  • Such strains are characterized by the fact that they host and express a heterologous gene, which can be carried by a plasmid or integrated into the bacterial chromosome. In the two implementation cases, common molecular biology techniques are used for the construction of such strains (Sambrook and Russel. 2001, supra).
  • the heterologous protein thus produced can remain in the cytoplasm of bacterial cells, and / or be presented on the surface of said cells, such as a membrane receptor, and / or be secreted in the host organism, such as a toxin.
  • the heterologous protein is a hybrid protein and, more particularly, a hybrid protein comprising at least part of an Bordetella adhesin and at least all or part of an antigenic protein capable of being produced by pathogenic microorganisms during mucosal or systemic infections, said antigenic protein being heterologous with respect to Bordetella adhesin.
  • the term “part”, “portion”, “region” or “zone” denotes a fragment of a protein, of size greater than approximately 6 consecutive amino acids, sufficient to observe the "Biological activity of interest" which is sought.
  • the biological activity of interest is precisely the adhesin function.
  • the Bordetella adhesin in question can be native or mutated, as long as the desired adhesin function is preserved.
  • the biological activity of interest is the antigenic activity.
  • the adhesin mainly produced and secreted by Bordetella strains is filamentous hemagglutinin (FHA).
  • FHA filamentous hemagglutinin
  • This 220 kDa protein (mature form) is produced in the form of a 367 kDa precursor, which undergoes a bidirectional maturation process, from its two N- and C-terminal ends.
  • FHA is capable of interacting with: (i) carbohydrates; (ii) heparin; and (iii) the integrin CR3 of the macrophages (Locht et al. 2001, supra). These activities allow bacteria to bind to various cells and extracellular structures in the respiratory system of the host organism, especially epithelial cells and macrophages.
  • FimD subunits In addition to FHA, Bordetella strains produce fimbriae essentially composed of Fim2 or Fim3, and FimD subunits (Locht et al. 2001, supra).
  • the FimD subunit interacts with the integrin VLA-5 of macrophages, as well as with sulfated sugars present in the respiratory system of the host organism.
  • the binding of FimD to VLA-5 activates the integrin CR3, receptor of the FHA, which ensures a cooperativity between the connections of the bacterial pili and of the FHA to the macrophages.
  • a hybrid protein produced by live Bordetella strains genetically attenuated in accordance with the invention comprises at least part of the FHA or FimD, preferably at least part of the FHA.
  • such a hybrid protein comprises at least the N-terminal region of mature FHA containing the site of interaction with heparin and sufficient alone to cause the secretion of the hybrid protein thus formed (international patent application WO 95 / 28486 in the names of the Institut Pasteur, the Institut Pasteur de Lille and INSERM).
  • this region of the FHA comprises at least the amino acids located between positions 441 and 863, defining the site of interaction with heparin (according to the numbering proposed in Delisse-Gathoye et al. 1990. Infect. Immun. 58: 2895-2905).
  • an “antigenic protein” designates a protein capable of binding with an antibody produced by a host organism, and this, via an “antigen”.
  • an “antigen” corresponds to a region of said protein and is responsible for binding with the antibody. More specifically, this region responsible for binding to the antibody comprises an "epitope", that is to say a sequence of at least 6 consecutive amino acids corresponding to the specific portion of the antigen interacting with said antibody.
  • a hybrid protein produced by a live strain of Bordetella genetically attenuated in accordance with the invention comprises at least part of the FHA as defined above and at least one epitope of a heterologous antigenic protein vis-à-vis said FHA.
  • a “microorganism” is a bacterium and preferably an infectious bacterium which is pathogenic for humans and / or the animal.
  • such a bacterium is a strain of Bordetella, for example a strain of B. pertussis.
  • Bordetella among the pathogenic microorganisms capable of producing antigenic proteins during mucosal or systemic infections, there may be mentioned, for example, strains of Shigella, Neisseria and Borrelia.
  • antigenic proteins diphtheria, tetanus or cholera toxins or toxoids, viral antigens, in particular antigens of the hepatitis B virus, of hepatitis C, of the polyovirus or of HIV, of parasitic antigens such as those produced by
  • the present invention also relates to methods for obtaining living strains of Bordetella genetically attenuated, as described above.
  • a method for obtaining such a strain comprises at least the following steps:
  • a process for obtaining a living strain of Bordetella genetically attenuated comprises at least the following steps:
  • the ptx gene is advantageously mutated, preferably in the region encoding the S1 subunit of the PTX protein (Example 4 below).
  • the deletion (s) may be total or partial.
  • the proteins synthesized are devoid of toxicity.
  • the strong promoter under whose control the ampG gene is placed is chosen from the strong Bordetella promoters, and is preferably the Ppor promoter of the Bordetella major porin gene.
  • a method for obtaining a deficient Bordetella strain comprises, in addition to the abovementioned steps, a step of introduction into the strain of at least one gene encoding a heterologous protein, preferably a hybrid protein.
  • a gene can be carried by a plasmid or inserted into the chromosome of said strain.
  • said gene codes for a hybrid protein comprising at least part of a Bordetella adhesin and at least all or part of an antigenic protein heterologous with respect to said adhesin and capable of being produced by microorganisms pathogens during mucosal or systemic infections.
  • the above-mentioned adhesin is FHA.
  • heterologous proteins in particular hybrid proteins
  • a strong promoter of Bordetella such as the promoter of the gene of the major porin Ppor.
  • Hybrid proteins comprising at least part of the FHA have in particular been described in patent applications WO 95/28486 (in the names of the Institut Pasteur, the Institut Pasteur de Lille and INSERM) and WO 98/16553 ( on behalf of the Institut Pasteur de Lille and INSERM).
  • methods for obtaining such hybrid proteins have been reported in Example V of Application WO 95/28486 and Example 5 of Application WO 98/16553. Genotypic characteristics of living strains of
  • Bordetella made deficient in the production of one or more toxins can be verified by conventional techniques known to those skilled in the art. In particular, they can be determined by Western blot and / or analysis of genomic DNA by Southern blot (see the Examples below and Sambrook and Russel. 2001, supra). With regard to the strains expressing a mutated protein, the sequence of the coding genes can be verified according to conventional methods for determining the nucleotide sequences.
  • the present invention relates to the use of a strain deficient in Bordetella as described above for the preparation of vaccines against mucosal or systemic infections linked to Bordetella, and in particular pertussis.
  • a live strain of Bordetella genetically attenuated in accordance with the invention can be used for the purposes of the production of all or part of at least one antigenic protein, as defined above, and capable of be produced by pathogenic microorganisms during mucosal or systemic infections.
  • the subject of the present invention is an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising, as active principle, at least one strain deficient in Bordetella as indicated above, in a pharmaceutically acceptable formulation.
  • a “pharmaceutically acceptable formulation” corresponds, within the meaning of the invention, to a drug formulation capable of being used in humans or animals, at doses acceptable in vivo having regard to the toxicity and the pharmacology of the compounds concerned. , while being effective therapeutically, and in particular from an immunogenic point of view.
  • the live strain (s) of Bordetella genetically attenuated serving as active principle are associated with one or more adjuvants.
  • adjuvant or “adjuvant compound”, is understood within the meaning of the present invention, a compound capable of inducing or increasing the response specific immune to an antigen or immunogen, said response consisting either of a humoral and / or cellular response.
  • This immune response generally involves stimulation of the synthesis of immunoglobulins specific for a given antigen, in particular IgG, IgA and IgM, or cytokines.
  • the active principle, live and deficient strain (s) of Bordetella, as well as the adjuvant (s), are generally mixed with pharmaceutically compatible excipients, such as water, a saline buffer, dextrose, glycerol, ethanol, or mixtures thereof.
  • pharmaceutically compatible excipients such as water, a saline buffer, dextrose, glycerol, ethanol, or mixtures thereof.
  • Such immunogenic compositions can be prepared in the form of liquid solutions, or injectable suspensions, or alternatively in a solid form, for example lyophilized, suitable for dissolving before an injection.
  • the immunogenic compositions which are the subject of the present invention are presented in a form suitable for administration by the mucosal route, and, more particularly, by the intranasal route.
  • it may be a solution intended to be instilled, or a powder to be diluted before instillation, or else a sprayable solution (for details on the vaccine formulations, see the journal Davis SS Nasal vaccines 2001. Adv. Drug Deliv. Rev. 51: 21-42).
  • An immunogenic composition according to the invention is formulated so as to allow administration by means as diverse as the nasal, oral, subcutaneous, intradermal, intramuscular, vaginal, rectal, ocular or auricular route.
  • auxiliary compounds are dictated by the mode of administration chosen.
  • Such auxiliary compounds can in particular be wetting agents, emulsifiers or buffers.
  • An immunogenic composition according to the invention is preferably formulated for administration by the intranasal route in humans and / or animals.
  • the present invention is illustrated, without however being limited, by the following figures:
  • FIG. 1 illustrates the analysis by Southern blot, using a probe corresponding to the amplification product "dnt low" (see Example 1 below) labeled with dig (Roche, Basel, Switzerland), the X ⁇ ol-digested genomic DNA from ⁇ strains. pertussis deleted from the entire dnt gene: BPSMDN (PTX +, FHA +, DNT-) (lane 2), BPDRDN (PTX-, FHA-, DNT-) (lane 3) and BPRADN (PTX-, FHA +, DNT-) ( track 5). Lanes 1 and 4 correspond to the molecular weight marker and lane 6 to the genomic DNA of the wild-type control BPSM (PTX +, FHA +, DNT +).
  • D BPRADN (PTX-, FHA +, DNT-)
  • E BPDR (PTX-, FHA-, DNT +)
  • F BPDRDN (PTX-, FHA-, DNT-).
  • FIG. 3A illustrates the colonization of the lungs of OF1 mice by ⁇ strains. pertussis BPSM (PTX +, FHA +, DNT +) and BPSMDN
  • FIG. 3B illustrates the number of BPSM bacteria present in the lungs of OF1 mice previously immunized intranasally with the strains of Figure 3A (BPSM or BPSMDN), or intraperitoneally with the Tetravac-acellular vaccine (DTaPPol; Aventis-Pasteur, France) , then infected intranasally 2 months later with the BPSM strain.
  • the control group corresponds to naive mice infected intranasally with the BPSM strain.
  • the white and black columns correspond respectively to the numbers of ⁇ . estimated viable pertussis in the lungs 3 hours and 7 days after infection. The bars above the columns represent the standard deviations (EC).
  • FIG. 4A represents the colonization of the lungs of OF1 mice by the strains of B. pertussis BPRA (PTX-, FHA +, DNT +) and BPRADN (PTX-, FHA +, DNT-).
  • FIG. 4B illustrates the number of BPSM bacteria present in the lungs of OF1 mice previously intranasally immunized with the BPSM, or BPRA, or BPRADN strain, then infected intranasally 2 months later with the BPSM strain.
  • the control group corresponds to naive mice infected intranasally with the BPSM strain.
  • the white, gray and black columns correspond respectively to the numbers of viable B. pertussis estimated in the lungs 3 hours, 10 days and 14 days after infection. The bars above the columns represent the ECs.
  • FIG. 5 illustrates the analysis on agarose gel of the amplification products resulting from the PCR reactions carried out on colonies from clones BPRA (PTX-, FHA +, DNT +) (lane 2), BPREDN (PTRE +, FHA +, DNT-) (track 3), and BPSM (PTX +, FHA +, DNT +) (track 4).
  • Lane 1 corresponds to the molecular weight marker.
  • FIG. 6 shows the evolution of colonization by the strain BPREDN (PTRE +, FHA +, DNT-) of the lungs of OF1 mice infected at the age of 3 weeks or 8 weeks.
  • FIG. 7 represents the serum IgG responses observed 44 days after intranasal administration of OF1 mice by the BPSM (PTX +, FHA +, DNT +) or BPSMDN (PTX +, FHA +, DNT-) strain, said responses being directed against: A) FHA , or
  • - Figure 8 represents the kinetics of the serum IgG anti-FHA response after administration of the B. pertussis strain BPSMDN (PTX +, FHA +, DNT-), or BPRA (PTX-, FHA +, DNT +), or even BPRADN (PTX -, FHA +, DNT-).
  • - Figure 9 illustrates the analysis on agarose gel of products from PCR reactions carried out on colonies from BPSM clones of ⁇ . pertussis containing the plasmid pCR2.1-PporG1 (lane 2), or pBBR-PporGI (lane 3), or even pBBR-PporG2 (lane 4). Lane 1 corresponds to the molecular weight marker and lane 5 to the plasmid construction pCR2.1-PporG1.
  • Example 1 Construction of a B. pertussis strain deficient in the production of the DNT toxin
  • the potentially immunomodulatory power of the DNT toxin was shown in a study revealing that the intravenous injection of purified DNT caused a decrease in the production of antibodies against co-administered antigens (Horiguchi et al. 1992. FEMS Microbiol. Lett. 90: 229-234).
  • the role of the DNT toxin in the virulence of the bacterium in humans is still unknown.
  • injection of DNT programs has been shown to cause necrotic damage in newborn mice, and the lethal dose in adult mice was obtained with nanograms of toxin (Zhang and Sekura. 1991, supra).
  • the dnt gene encoding the latter was deleted from the chromosome of the BPSM strain (Sm R , Gen s , Nal R ) (Menozzi, FD et al. 1994, Infect. Immun. 62: 769-778).
  • the BPSM strain was crossed with the mobilizing strain E. coli SM10 (pJQDN) (Sm s , Gen R , Nal s ) on a solid Bordet-Gengou medium (BG medium) containing defibrinated sheep blood and supplemented by 10 mM MgCI 2 (Bordet, J.
  • oligonucleotides C: 5'-TATATCTAGAGCGGCCTTTATTGCTTTTCC-3 '(SEQ ID No. 3) and D: 5'-TATAAAGCTTCTCATGCACGCCGGCTTCTC-3' (SEQ ID No. 4) were used to amplify the downstream region (" dnt low ”).
  • the “dnt up” (799 bp) and “dnt low” (712 bp) fragments were respectively digested by the pairs of restriction enzymes EcoRI and Xba ⁇ , and Xba ⁇ and Hind ⁇ , including the cleavage sites are located on either side of said fragments.
  • the two digestion products “dnt up” and “dnt low” above were ligated using the Fast Link kit (TEBU, Madison, Wl, USA).
  • the ligation mixture thus obtained was then used as a template in a PCR reaction using oligonucleotides A and D above.
  • the 1505 bp PCR fragment obtained was cloned into the plasmid pCR2.1-Topo (Invitrogen, San Diego, CA, USA).
  • the fragment resulting from the EcoRI digestion of this construction was introduced into the unique EcoRI site of the plasmid pJQ200mp18rpsL (Pradel et al. 2000. Infect.lmmun. 68: 1919-1927).
  • the resulting plasmid was transformed into E. coli SM10 (Simon et al. 1983. Bio / Technology. 1. 784-791). This strain was then conjugated with the Bordetella BPSM strain. The two homologous recombination events were selected as described in Locht et al. (1992, supra). The ⁇ strain. pertussis thus obtained was named BPSMDN. Its genotype was analyzed by Southern blot to ensure the deletion of the dnt gene ( Figure 1, lane 2). The culture supernatants of 4 BPSMDN clones were analyzed by immunoblot using an anti-FHA polyclonal antibody to ensure that the production of FHA was not altered in the mutated strain.
  • BPSMDN strain was capable of adhering to cells A549 and J774 as effectively as the wild strain BPSM (FIG. 2, columns A and B). Also, DNT did not appear as an adhesin required for the attachment of bacteria to epithelial cells and macrophages.
  • mice were instilled intranasally, at a rate of 20 ⁇ l per nostril, into OF1 mice (non-consanguineous strain, elderly female mice 6 to 8 weeks), under pentobarbital anesthesia.
  • the lungs of 3 mice were removed 3 hours, then 7, 14, 21 and 32 days after administration.
  • the lungs were homogenized in 5 ml of sterile PBS.
  • the bacteria were counted 3 to 4 days after spreading of the ground material on solid BG medium containing 100 ⁇ g / ml of streptomycin (BGS).
  • BGS streptomycin
  • Tetravac-acellular vaccine corresponding to the inactivated and adsorbed diphtheria, tetanus, acellular pertussis and poliomyelitis vaccine (DTaPPol; Aventis-Pasteur, France), injected intraperitoneally (100 ⁇ l or 1/5 of the human dose), as well as the wild strain BPSM administered intranasally, were used as references for protection against infection with BPSM.
  • the control group corresponded to naive mice infected intranasally with the BPSM strain.
  • mice means “mice immunized with X”, where “X” represents the bacterial strain having served for the immunization of mice.
  • BPSM mice and “BPSMDN mice” mean respectively “mice immunized with the BPSM strain” and “mice immunized with the BPSMDN strain”.
  • the dnt gene has been deleted from the chromosome of the BPRA strain (PTX-,
  • BPRADN did not multiply during the first week after administration. However, the persistence of BPRADN bacteria in the lungs lasted as long as that of the parental strain BPRA. The capacity of the BPRADN strain to protect the mice against a second infection with the wild strain BPSM was evaluated. The mice were immunized with 4 ⁇ 10 6 bacteria of the BPSM strain (PTX +,
  • mice Two months after immunization, the mice were infected intranasally with the wild strain BPSM.
  • mice per group Three mice per group were sacrificed at different time intervals, for a total duration of 14 days, and the number of viable B. pertussis bacteria was estimated per lung (FIG. 4B).
  • mice in the control group showed an increase in the number of BPSM bacteria in the lungs during the first 10 days, then this number decreased from the fourteenth day.
  • the number of bacteria decreased rapidly after the second BPSM infection to become undetectable from the tenth day.
  • the number of BPSM bacteria also decreased in the lungs BPRADN mice, but more slowly, and became zero on the fourteenth day after infection.
  • the BPRADN strain deficient in the production of PTX and DNT, was able to protect the mice against effective colonization of the respiratory mucous membranes by the virulent BPSM strain.
  • Example 4 Construction of a strain deficient in the production of the DNT toxin and expressing a PTX toxin made enzymatically inactive by mutation
  • the PTX toxin being a major protective antigen against ⁇ . pertussis, one or more mutations resulting in a loss of cytotoxic functions while retaining the immunogenic properties of the protein, could be preferable to the complete absence of its expression in the live strain of B. pertussis intended for use as a vaccine.
  • toxin PTRE a strain deficient in the production of the toxin DNT and expressing a toxin PTX made enzymatically inactive by mutation
  • BPRADN strain PTX-, FHA +, DNT-
  • pJQ-PTRE E. coli SM10 strain
  • the PTRE protein corresponds to an atoxic mutated form of PTX and includes the substitutions R9K and E129G in the S1 subunit of PTX, said subunit being responsible for the enzymatic activity of the toxin (Lobet, Y. et al. 1993 J. Exp. Med. 177: 79-87).
  • the ptre gene comes from the plasmid pPTRE itself deriving from the plasmid pPT2 (Antoine, R. and C. Locht. 1992. Zentbl. Bakteriol. Suppl. 23: 292-293).
  • the EcoRI fragment from pPTRE containing the ptre gene was inserted into the unique EcoRI site of the plasmid pJQ200mp18rpsL.
  • the resulting plasmid, called pJQ-PTRE was transformed into the strain of. coli SM10.
  • the ptre gene was introduced by homologous double recombination into the chromosome of the BPRA (PTX-, FHA +, DNT +) and BPRADN (PTX-, FHA +, DNT-) strains to give the BPRE (PTRE +, FHA +, DNT +) and BPREDN strains respectively. (PTRE +, FHA +, DNT-).
  • the presence of the ptre gene in the BPREDN strain was verified by PCR on colonies using the oligonucleotides E 5'-
  • mice were immunized with the strain BPSM (PTX +, FHA +, DNT +) or BPSMDN (PTX +, FHA +, DNT-) according to the intranasal route. protocol described in Example 2 above. The mice were bled 44 days later by puncture at the level of the retroorbital plexus. The sera were stored at -20 ° C for analysis. Antibody levels were determined using the ELISA technique (Enzyme- Linked ImmunoSorbant Assay: assay by immunoadsorption in the presence of an enzyme) for 3 to 5 mice per group ( Figure 7).
  • OF1 mice were immunized intranasally with 4 ⁇ 10 6 BPRADN bacteria (PTX-, FHA +, DNT-) in 40 ⁇ l.
  • the intensity of the anti-FHA IgG serum response observed in these mice was compared with that obtained after administration of the BPRA (PTX-, FHA +, DNT +) or BPSMDN (PTX +, FHA +, DNT-) strain.
  • the kinetics of the serum immune response were performed on groups of 3 to 5 mice per time ( Figure 8).
  • Example 7 Construction of plasmids allowing the overexpression of the native or mutated AmpG protein, involved in the recycling of the TCT toxin, in strains of B. pertussis Among the various toxins produced by B. pertussis and in addition to the PTX and DNT toxins, Another potential target for TCT cytotoxin is to make living Bordetella strains less virulent, or even avirulent, for use as vaccines. So we tried to reduce the release of TST. A strategy was therefore to insert a strong constitutive promoter, in this case the promoter of the major porin gene (Ppor) of B. pertussis, upstream of the ampG gene in order to increase its expression.
  • Ppor major porin gene
  • the Ppor promoter was amplified by PCR using the plasmid pBBPG, and the following oligonucleotides: G: 5'- TATACTCGAGCCCGCGCGCGATTCCGGATT-3 '(SEQ ID No. 7) and H: 5'- TTTTTCATGAAAGAAATCTCCGTTGATTTG-3' (SEQ ID No. 8).
  • the plasmid pBBPG is derived from the plasmid pBBRI MCS (Kovach, ME, ef al. 1994. Biotechniques 16: 800-802) and contains the Ppor promoter from BPSM (Li, ZM, et al. 1991. Mol. Microbiol. 5: 1649- 1656).
  • Said promoter was inserted into pBBPG at the Xho ⁇ and Bsph ⁇ sites after amplification by PCR using the oligonucleotides G and H above, and the genomic DNA of BPSM as template.
  • the PCR fragment thus obtained was cloned into the plasmid pCR2.1-Topo (supra) to give the plasmid pCR2.1-Ppor.
  • ampG1 the ampG gene of ⁇ . pertussis (ampG1) was amplified by PCR using oligonucleotides 1: 5'- TATACCATGGCGCCGCTGCTGGTGCTGGGC-3 '(SEQ ID No. 9) and J: 5'- TATATCTAGACGCTGGCCGTAACCTTAGCA-3 '(SEQ ID No. 10) and the genomic DNA of BPSM as a template.
  • the ampG1 gene has thus been mutated so as to replace the valine residue located at the N-terminal end of the AmpG1 protein with a methionine.
  • the AmpG protein of E. coli has an N-terminal extension of
  • ampG2 A variant of the ampG gene, called ampG2, has been constructed. This variant codes for the AmpG protein of B. pertussis to which the 13 N-terminal amino acids of the AmpG protein of E. coli have been added.
  • the ampG2 gene was therefore amplified by PCR using oligonucleotides K: 5'- ATTACCATGGCCAGTCAATATTTACGTATTTTTCAACAGCCGCGTGCG CCGCTGCTGGTGCTGGGCTTTGCCAGC-3 '(SEQ ID No. 11) and J (above, see the sequence of the PCR fragment). two substitutions in ampG2, replacing a methionine by a threonine in position +62 and a serine by a glycine in position +852.
  • the ampG1 and ampG2 PCR fragments were cloned into pCR2.1-Topo to form the plasmids pCR2.1-G1 and pCR2.1-G2 respectively.
  • the Ppor fragment was obtained by digestion of the plasmid pCR2.1- Ppor using the enzymes Hind ⁇ and BspH.
  • the ampG1 and ampG2 fragments were respectively obtained by digestion of pCR2.1-G1 and pCR2.1-G2 with ⁇ / col and Xba ⁇ .
  • the Ppor and ampG1 fragments, as well as Ppor and ampG2 were then ligated using the Fast Link kit (supra).
  • the ligation mixtures were used as a template for a PCR reaction using oligonucleotides G and J above.
  • the 1500 bp PCR fragments thus obtained were cloned into the plasmid pCR2.1-Topo to form the plasmids pCR2.1-Ppor-G1 and PCR2.1-Ppor-G2.
  • the EcoRI fragments derived from these plasmids were introduced into the unique EcoRI site of the plasmid pBBRI MCS (Kovach et al. 1994. Bio / Techniques. 16: 800-802) to give the plasmids pBBR-Ppor-G1 and pBBR-Ppor respectively. -G 2.
  • the plasmids pCR2.1-Ppor-G1, pCR2.1-Ppor-G2, pBBR-Ppor-G1 and pBBR-Ppor-G2 were electroporated in the BPSM strain and the presence of the plasmid constructs was verified by PCR on colonies ( figure 9).
  • Example 8 Insertion into the chromosome of B. pertussis of the genetic constructs allowing the overexpression of the native or mutated AmpG protein, involved in the recycling of the TCT toxin
  • the constructs containing the native or mutated ampG gene under the control of the porous promoter Ppor have were inserted by double homologous recombination at the chromosomal locus of ampG.
  • a fragment of 862 bp was amplified by PCR using the oligonucleotides L: 5'- TATAAAGCTTCGATTTCCTGCTGGTTTCGT-3 'and SEQ ID No. 12) and M : 5'- TATAGGATCCCGATACAGCGCCAATGTACT-3 '(SEQ ID No. 13) and the genomic DNA of BPSM as a template.
  • the met fragment is itself located upstream of an insertion sequence ⁇ S481 which has therefore been eliminated due to the double homologous recombination.
  • the PCR met fragment was cloned into the plasmid pCRII-Topo (TEBU, supra) to form the plasmid pCRII-Met.
  • This plasmid was digested with HindlW and BamHI, and the fragment of 862 bp corresponding to met was introduced into the plasmids pCR2.1-G1 and pCR2.1-G2 to give the plasmids pCR2.1-MetG1 and pCR2.1 respectively.
  • -MetG2 These latter plasmids were digested with HindlW and Xbal in order to extract a fragment containing met located upstream of the construction pPor-AmpG.
  • the 2500 bp fragments thus extracted were then cloned into the plasmid pJQ200mp18rpsL previously digested with Hindlll and Xbal, to give the plasmids pJQMetGI and pJQMetG2 respectively.
  • These plasmids were transformed into the strain of E. coli SM10 in order to allow insertion by double homologous recombination of the construct Ppor-ampG1 and Ppor-ampG2 into the genome of B. pertussis.
  • strains resulting from the crossing with BPRADN (PTX-, FHA +, DNT-) or BPREDN (PTRE +, FHA +, DNT-) were respectively called BPZA1 and BPZA2, and BPZE1 and BPZE2.
  • OF1 mice are immunized intranasally to verify that the BPZA1, BPZA2, BPZE1 and BPZE2 strains have retained their ability to colonize the respiratory tract of the mice.
  • Serum and mucosal responses directed against FHA and against total antigens of ⁇ . pertussis are analyzed by ELISA as described in Example 6 above.
  • the protective power of attenuated strains of ⁇ . pertussis mentioned above is evaluated as indicated in Example 2 above.

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Abstract

L'invention concerne des souches vivantes de Bordetella rendues déficientes dans la production de la toxine de B. pertussis PTX et, le cas échéant, de la toxine dermonécrotique DNT, ainsi que dans la libération de la toxine cytotrachéale TCT, et ce, par atténuation génétique, en particulier par mutation ou délétion du gène ptx et, le cas échéant, du gène dnt, et par insertion d'un promoteur fort en amont du gène codant la protéine AmpG, laquelle est impliquée dans le recyclage de la toxine TCT. La présente invention a également pour objets des procédés d'obtention de ces souches, ainsi que leur utilisation pour la préparation de vaccins. Enfin, l'invention vise des compositions immunogènes comprenant de telles souches.

Description

SOUCHES DE BORDETELLA RENDUES DEFICIENTES PAR ATTENUATION GENETIQUE
Combinant biologie moléculaire et immunologie, la présente invention relève du domaine de la recherche et la mise au point de nouveaux vaccins pour le traitement d'infections dues à des souches de Bordetella, notamment la coqueluche due à B. pertussis.
L'invention est relative à des souches vivantes de Bordetella rendues déficientes dans la production de la toxine de B. pertussis PTX et dans la libération de la toxine cytotrachéale (encore appelée cytotoxine trachéale) TCT, et ce, par atténuation génétique, via la mutation ou la délétion du gène codant la toxine PTX et l'addition d'un promoteur fort en amont du gène codant la protéine AmpG, laquelle est impliquée dans le recyclage de la toxine TCT. La présente invention concerne également des souches vivantes de
Bordetella présentant, outre les propriétés susvisées, une déficience dans la production de la toxine dermonécrotique DNT, déficience obtenue par mutation ou délétion du gène codant ladite toxine.
En outre, l'invention a pour objets des souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement et capables de produire une protéine hétérologue sous forme cytoplasmique, et/ou en surface des bactéries, et/ou sous forme sécrétée. Cette protéine hétérologue peut notamment être une protéine hybride comprenant, par exemple, au moins une partie d'une adhésine de Bordetella, notamment une partie de l'hémagglutinine filamenteuse FHA.
La présente invention vise également des procédés d'obtention de souches déficientes de Bordetella par atténuation génétique.
De plus, l'invention est relative à l'utilisation de telles souches à des fins immunoprophylactiques et/ou thérapeutiques. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation de souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement pour la vaccination de l'être humain ou de l'animal contre la coqueluche et/ou diverses autres maladies infectieuses. Entre autres intérêts, ces souches sont susceptibles d'être administrées par voie intranasale.
Enfin, la présente invention a trait à des compositions immunogènes comprenant, en tant que principe actif, des souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement dans une formulation pharmaceutiquement acceptable.
Au cours des dernières décennies, la coqueluche, essentiellement due à la bactérie à Gram négatif Bordetella pertussis, est réapparue parmi les maladies infectieuses lourdes de conséquences en termes de santé publique à travers le monde, et plus particulièrement dans les pays en voie de développement. Ainsi, selon une étude récente, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a dénombré plus de 40 millions de cas de coqueluche par an, et la mortalité a été estimée à 360 000 décès par an, ces décès affectant principalement les nourrissons (Ivanoff, B., and S.E. Robertson. 1997. Dev. Biol. Stand. 89 :3-13). Malgré l'introduction du vaccin contre la coqueluche dans les programmes de vaccination de routine chez l'enfant, cette maladie est actuellement considérée comme ré-émergente (Simondon, F., and N. Guiso. 2001. Med. Mal. Infect. 31 :5-11 ). La coqueluche pose donc un problème de santé publique majeur, obligeant les autorités sanitaires et autres organismes compétents, ainsi que le personnel médical à maintenir, voire renforcer les réseaux de veille épidémiologique autour de cette maladie, et à encourager le développement de moyens de lutte efficaces, faciles d'utilisation et relativement peu coûteux.
Les vaccins contre la coqueluche dits de première génération consistaient en des souches tuées de B. pertussis. Ces vaccins cellulaires inactivés (wP pour « whole cell pertussis vaccine ») sont utilisés depuis une cinquantaine d'années environ. Ils ont permis d'observer une diminution considérable de l'incidence de la coqueluche et, par-là même, de la mortalité liée à cette maladie. Cependant, il s'est avéré que ces vaccins présentaient des effets secondaires parfois graves.
Les vaccins de deuxième génération, désormais utilisés dans de nombreux pays industrialisés, sont des vaccins acellulaires (aP) contenant entre 2 et 5 composants antigéniques bactériens purifiés. Ces vaccins ont été décrits comme induisant moins d'effets secondaires que les vaccins wP. Ils ont, à ce titre, largement remplacé les vaccins de première génération dans le traditionnel " triple " vaccin contre la diphtérie, le tétanos et la coqueluche (vaccin DTP). L'analyse des réponses cellulaires T après vaccination a montré que les vaccins wP stimulaient une réponse immunitaire cellulaire de type Th1 chez l'homme et la souris. En revanche, les vaccins aP induisent un profil mixte Th1/Th2 chez l'homme et Th2 chez la souris (Mills et al. 1998. Dev. Biol. Stand. 95:31-41.). En outre, des études cliniques récentes ont également indiqué que les taux d'anticorps spécifiques diminuent rapidement après vaccination avec les vaccins DTaP (Cassone et al. 1997. Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 51 :283-289). En définitive, ces derniers induisent une protection immunitaire plus faible et plus transitoire que les vaccins DTwP (Simondon et al. 1997. Vaccine. 15:1606-1612). Enfin, les récents vaccins aP restent d'un coût trop élevé pour représenter un moyen de lutte prophylactique et/ou thérapeutique véritablement accessible à de nombreux pays en voie de développement (GAVI. 2001. www.vaccinealliance.org/newsletter/iun2001/update.hml).).
La présente invention s'inscrit dans le cadre d'une stratégie vaccinale alternative consistant en l'administration par voie intranasale de souches de Bordetella, et notamment de souches de β. pertussis, vivantes et atténuées génétiquement. La vaccination par voie intranasale revêt un intérêt particulier dans les pays en voie de développement. En effet, en comparaison des immunisations par injection, les immunisations par voie muqueuse diminuent les besoins en personnel médical et en équipement, et éliminent le problème posé par les contaminations du fait de seringues mal stérilisées et/ou mal utilisées.
Parmi les facteurs de virulence produits par les souches de
Bordetella, et en particulier les souches de B. pertussis, l'on dénombre principalement trois toxines protéiques, la toxine de B. pertussis PTX, la toxine dermonécrotique DNT et l'adénylate cyclase AC, ainsi qu'un glycopeptide appelé toxine cytotrachéale TCT.
La toxine PTX est formée de cinq sous-unités différentes, S1 à S5. Les sous-unités S2 à S5 sont responsables de la liaison de la toxine aux récepteurs portés par les cellules cibles. La sous-unité S1 , quant à elle, présente une activité ADP-ribosyltransférase (pour plus de détails sur les toxines produites par 8. pertussis, voir la revue Locht et al. 2001. Curr. Opin. Microbiol. 4 :82-89).
La toxine DNT, également appelée PEHLT pour " Pertussis Heat- Labile Toxin ", est un polypeptide monomerique de 159 kDa (pour revue, Locht et Antoine. 1999. In : The Comprehensive Sourcebook of bacterial protein toxins, Ed. Académie Press, pp. 130-146.). Contrairement aux autres toxines produites puis sécrétées par B. pertussis, la toxine DNT reste localisée dans le cytoplasme de la bactérie (Cowell et al. 1979. Infect. Immun. 25 : 896-901). Le rôle de cette toxine dans la pathogénicité et la virulence des souches de Bordetella n'est à ce jour pas totalement élucidé. Cependant, il a été montré que la toxine DNT était hautement létale lorsqu'elle était injectée sous forme purifiée par voie intraveineuse chez la souris (Zhang et Sekura. 1991. Infect. Immun. 59 :3754-3759). La toxine protéique AC présente deux activités adénylate cyclase, dont l'une est responsable de l'hémolyse et l'autre dépend de la calmoduline, protéine cytoplasmique affine pour le calcium et qui en régule le métabolisme. Ces deux activités sont importantes lors des stades précoces d'infection, en ce qu'elles induisent probablement une apoptose des macrophages alvéolaires. Enfin, la toxine TCT est un glycopeptide de bas poids moléculaire qui dérive du peptidoglycane et est relargué par β. pertussis durant sa phase de croissance (Cookson, B.T. et al. 1989. Biochem. 28 : 1744-1749). La TCT est responsable de la destruction des cellules ciliées de l'épithélium respiratoire, affaiblissant ainsi le processus de « nettoyage » dudit épithélium. Elle pourrait donc être à l'origine de la toux caractéristique de la coqueluche.
Conformément à l'acception usuelle, l'on entend par « virulence » la capacité des bactéries, notamment des Bordetella, à se développer chez un organisme hôte en y produisant des substances toxiques ou « toxines ».
La « toxicité » désigne la capacité d'une telle toxine à entraîner des altérations métaboliques, voire, à terme, la mort des cellules au sein de l'organisme hôte.
Au sens de la présente invention, un « organisme hôte » est un homme ou un animal.
L'efficacité d'une souche de β. pertussis délétée du gène codant la toxine PTX (gène ptx) a déjà été démontrée dans le cadre de la protection de souris contre une infection par la souche sauvage (Mielcarek N. et al. 1998. Nature Biotech. 16:454-457). L'immunité protectrice a été observée après vaccination à l'aide d'une dose unique de bactéries, ce qui présente un avantage considérable par rapport aux vaccins existants, étant donné que la réduction du nombre d'administrations est considérée par l'OMS comme l'un des objectifs à atteindre en priorité au cours des prochaines décennies. De plus, le taux de protection chez la souris adulte après infection par voie nasale avec la souche sauvage de B. pertussis pouvait être corrélé à l'efficacité vaccinale observée chez les enfants (Mills et al. 1998. Infect Immun. 66:594-602).
Cependant, une telle souche, en ce qu'elle est déficiente dans la production de la seule toxine PTX, demeure capable de produire au moins les trois autres toxines de Bordetella évoquées supra, à savoir la toxine DNT, l'AC et la cytotoxine TCT. En conséquence, la présente invention concerne des souches vivantes de Bordetella rendues déficientes dans la production d'au moins deux facteurs de virulence parmi ceux susvisés, et ce, par atténuation génétique. De manière évidente, l'invention ne se limite pas à des souches vivantes et déficientes appartenant à l'espèce B. pertussis, mais concerne également toute espèce de Bordetella susceptible de présenter un intérêt d'un point de vue médical ou à des fins d'étude et de recherche. Sont en l'occurrence plus particulièrement visées les espèces infectieuses pour l'homme autres que B. pertussis, notamment β. parapertussis et B. bronchiseptica, ou infectieuses pour les animaux, notamment l'espèce β. bronchiseptica pour le chien ou le porc, ou B. avium pour les oiseaux.
Dans le contexte de l'invention, l'on entend par « atténuation », le fait que sur les quatre toxines sus-citées, importantes pour la virulence et la pathogénicité des souches de Bordetella, au moins deux ne soient pas produites, ou soient produites sous une forme non fonctionnelle, par les souches vivantes atténuées génétiquement conformément à l'invention. L'« atténuation génétique » concerne plus précisément des modifications ou altérations génétiques, effectuées soit directement dans les gènes codant lesdites toxines, soit de manière détournée, en ciblant un gène codant une protéine impliquée dans la voie métabolique de synthèse et/ou transport et/ou recyclage desdites toxines.
La présente invention démontre que, lorsque les souches de Bordetella sont rendues déficientes dans la production de la seule toxine DNT, elles présentent un profil d'immunogenicité altéré, avec une réduction sensible de la production d'anticorps dirigés contre la FHA (Exemple 6 ci- dessous).
Aussi, dans le cadre du problème posé selon la présente invention, à savoir proposer une alternative aux vaccins existants contre la coqueluche et/ou d'autres maladies infectieuses pour l'homme et l'animal, ladite alternative étant à la fois efficace, d'une utilisation aisée et peu coûteuse, il ne peut être envisagé de rendre des souches vivantes de Bordetella déficientes dans la production de n'importe quelle toxine ou combinaison de toxines, faute de quoi ces souches pourraient ne pas pouvoir être utilisées comme vaccins. Selon un premier mode de réalisation, l'invention a pour objets des souches de Bordetella déficientes dans la production de la toxine PTX et dans la libération de la cytotoxine TCT. De telles souches sont atténuées génétiquement par mutation ou délétion du gène codant la toxine PTX et par insertion d'un promoteur fort en amont du gène codant la protéine AmpG (gène ampG), laquelle participe au recyclage de la cytotoxine TCT.
En effet, la plupart des bactéries à Gram négatif produisent des glycopeptides du type de la TCT par clivage de leur peptidoglycane à l'aide d'enzymes périplasmiques. Cependant, ces produits sont recyclés par les microorganismes en question et ne sont donc pas relargués, contrairement à ce que l'on observe chez B. pertussis. Chez E. coli, ce mécanisme de recyclage est effectué par le transporteur protéique AmpG, présent dans la membrane cytoplasmique. La détermination de la séquence du génome de S. pertussis au Centre Sanger, UK, a révélé, chez cette espèce, la présence d'un gène homologue au gène ampG auparavant identifié chez E. coli. C'est cette observation qui a conduit à envisager, dans le cadre de la présente invention, la surexpression de la protéine AmpG chez les souches de Bordetella.
Au sens de l'invention, une « mutation » désigne toute altération de la séquence d'un gène codant une toxine, ladite altération rendant la protéine ainsi codée atoxique. Il peut s'agir d'une mutation ponctuelle entraînant la modification d'un ou plusieurs résidus responsables de la toxicité de la protéine. Ce peut également être une mutation par décalage de cadre de lecture. En ce cas, la séquence traduite ne correspond pas à la séquence attendue. Enfin, l'on peut envisager une mutation non sens en introduisant en phase au sein du gène un codon stop prématuré. La protéine alors synthétisée est tronquée d'au moins la ou les régions responsables de sa toxicité.
Selon un deuxième mode de réalisation, l'invention vise des souches de Bordetella déficientes dans la production des toxines PTX et DNT, ainsi que dans la libération de la cytotoxine TCT. Là encore, ces souches sont atténuées génétiquement par mutation ou délétion des gènes codant les toxines PTX et DNT (gènes ptx et dnt), et par insertion d'un promoteur fort en amont du gène ampG.
Dans ce dernier mode de réalisation, il peut être envisagé de : (i) muter les gènes ptx et dnt ; ou (ii) déléter ces deux gènes, en tout ou en partie ; ou encore (iii) muter l'un des deux et déléter l'autre.
Avantageusement, le gène codant la toxine PTX est muté, plutôt que délété. Ce gène présente alors une ou plusieurs mutations, de préférence dans la région codant la sous-unité S1 de la protéine PTX, ladite région étant responsable de la toxicité de celle-ci. A titre d'exemple, l'on peut citer les mutations ponctuelles R9K et E129G caractéristiques de la protéine PTRE, mutant atoxique de PTX (voir Exemple 4 ci-après).
Dans les modes de réalisation précités, la délétion du gène codant la toxine PTX ou la délétion d'au moins un des gènes codant les toxines PTX et DNT peut être totale ou partielle. En cas de délétion partielle, assimilable à une mutation par décalage de cadre de lecture ou une mutation non sens telle que définie supra, au moins la ou les régions responsables de la toxicité de la protéine doivent être délétées, afin que celle-ci soit rendue atoxique. Les souches de Bordetella objets de la présente invention sont capables de surexprimer la protéine AmpG grâce à l'insertion d'un promoteur fort en amont du gène ampG. Parmi les promoteurs forts susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention, figure le promoteur du gène de la porine majeure de Bordetella (promoteur Ppordu gène por ; voir Exemple 7), ou tout autre promoteur fort chez ce genre bactérien. Il convient de noter que la protéine AmpG ainsi surexprimée peut être native ou mutée dès lors qu'elle conserve sa fonction dans le métabolisme de la paroi chez Bordetella et, plus précisément, dans le recyclage de la cytotoxine TCT (voir, par exemple, les gènes ampG1 et ampG2 dans l'Exemple 7).
D'une manière générale, l'on considère que les protéines codées par des gènes présentant au moins 80 % d'identité en conditions strictes d'hybridation avec les gènes codant les protéines elles-mêmes objets de l'invention, sont des protéines « similaires » à ces dernières dans leur structure et leur fonction (pour les conditions strictes d'hybridation, voir Sambrook et Russel. 2001. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA). Il est entendu que ces protéines similaires sont comprises dans le cadre de la présente invention. Par exemple, des protéines similaires aux toxines PTX et DNT, ainsi qu'aux protéines AmpG et FHA (hémagglutinine filamenteuse, voir infra) sont également visées par l'invention.
La délétion ou la mutation d'un gène dans le chromosome de
Bordetella, et en particulier des gènes ptx et dnt, peut être effectuée par toute méthode conventionnelle connue de l'homme du métier (Antoine et Locht. 1990. Infect. Immun. 58 :1518-1526 ; et Sambrook et Russel. 2001 , supra).
A titre d'exemple, un procédé d'obtention d'une souche de Bordetella présentant une mutation ou délétion du gène ptx ou dnt comprend les étapes suivantes : a) le croisement d'une souche de Bordetella native et virulente ou d'une souche mutée avec une souche mobilisante d'Escherichia coli ; b) la sélection, à l'aide de marqueurs, des cellules ayant perdu le gène ptx ou dnt, ou ayant acquis un gène codant une protéine mutée et atoxique. La perte de la capacité de la souche croisée à produire une toxine et/ou l'acquisition par celle-ci de l'aptitude à synthétiser une protéine mutée et atoxique est le résultat d'un double événement de recombinaison homologue entre la souche parentale et un plasmide de la souche mobilisante, ledit plasmide portant une copie des régions flanquantes et/ou du gène ou d'une partie du gène codant une protéine mutée et atoxique (voir Exemples ci-dessous).
Lors de l'étape b) du procédé supra, les marqueurs de sélection doivent être choisis en fonction des souches de Bordetella utilisées. Des exemples de tels marqueurs sont la résistance à des antibiotiques (notamment la gentamicine et/ou la streptomycine) et la résistance à une concentration élevée de sucrose (supérieure à 5 %) dans le milieu de culture.
En outre, la présente invention concerne des souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement telles que décrites supra, et capables de produire une protéine hétérologue.
De telles souches sont caractérisées par le fait qu'elles hébergent et expriment un gène hétérologue, lequel peut être porté par un plasmide ou intégré au chromosome bactérien. Dans les deux cas de mise en œuvre, il est fait appel, pour la construction de telles souches, à des techniques de biologie moléculaire courantes (Sambrook et Russel. 2001 , supra).
La protéine hétérologue ainsi produite peut demeurer dans le cytoplasme des cellules bactériennes, et/ou être présentée à la surface desdites cellules, tel un récepteur membranaire, et/ou être sécrétée dans l'organisme hôte, telle une toxine.
De manière préférée, la protéine hétérologue est une protéine hybride et, plus particulièrement, une protéine hybride comprenant au moins une partie d'une adhésine de Bordetella et au moins tout ou partie d'une protéine antigénique susceptible d'être produite par des microorganismes pathogènes lors d'infections muqueuses ou systémiques, ladite protéine antigénique étant hétérologue vis-à-vis de l'adhésine de Bordetella.
Selon la présente invention, l'on désigne par « partie », « portion », « région » ou « zone », un fragment d'une protéine, d'une taille supérieure à environ 6 acides aminés consécutifs, suffisant pour observer l'« activité biologique d'intérêt » qui est recherchée. Ainsi, s'agissant de la « partie d'une adhésine », l'activité biologique d'intérêt est précisément la fonction adhésine. A cet égard, l'adhésine de Bordetella en question peut être native ou mutée, dès lors que la fonction adhésine recherchée est conservée. Pour la « partie d'une protéine antigénique », l'activité biologique d'intérêt est l'activité antigénique.
L'adhésine principalement produite et sécrétée par les souches de Bordetella est l'hémagglutinine filamenteuse (FHA). Cette protéine de 220 kDa (forme mature) est produite sous la forme d'un précurseur de 367 kDa, lequel subit un processus de maturation bidirectionnel, à partir de ses deux extrémités N- et C-terminales. La FHA est capable d'interagir avec : (i) des hydrates de carbone ; (ii) l'héparine ; et (iii) l'intégrine CR3 des macrophages (Locht et al. 2001 , supra). Ces activités permettent aux bactéries de se lier à diverses cellules et structures extracellulaires dans l'appareil respiratoire de l'organisme hôte, en particulier les cellules épithéliales et les macrophages.
En sus de la FHA, les souches de Bordetella produisent des fimbriae essentiellement composés de sous-unités Fim2 ou Fim3, et FimD (Locht et al. 2001 , supra). La sous-unité FimD interagit avec l'intégrine VLA-5 des macrophages, ainsi qu'avec les sucres sulfatés présents dans l'appareil respiratoire de l'organisme hôte. La liaison de FimD à VLA-5 active l'intégrine CR3, récepteur de la FHA, ce qui assure une coopérativité entre les liaisons des pili bactériens et de la FHA aux macrophages.
Ainsi, une protéine hybride produite par les souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement conformément à l'invention comprend au moins une partie de la FHA ou de FimD, de préférence au moins une partie de la FHA.
Avantageusement, une telle protéine hybride comprend au moins la région N-terminale de la FHA mature contenant le site d'interaction avec l'héparine et suffisante à elle seule pour entraîner la sécrétion de la protéine hybride ainsi formée (demande de brevet internationale WO 95/28486 aux noms de l'Institut Pasteur, l'Institut Pasteur de Lille et l'INSERM). En particulier, cette région de la FHA comprend au moins les acides aminés situés entre les positions 441 et 863, définissant le site d'interaction avec l'héparine (d'après la numérotation proposée dans Delisse-Gathoye et al. 1990. Infect. Immun. 58 :2895-2905).
Au sens de la présente invention, une « protéine antigénique » désigne une protéine capable de se lier avec un anticorps produit par un organisme hôte, et ce, par l'intermédiaire d'un « antigène ». Un tel « antigène » correspond à une région de ladite protéine et est responsable de la liaison avec l'anticorps. Plus précisément, cette région responsable de la liaison avec l'anticorps comprend un « épitope », c'est-à-dire une séquence d'au moins 6 acides aminés consécutifs correspondant à la portion spécifique de l'antigène interagissant avec ledit anticorps. Afin de faciliter la lecture de la présente description, le terme
« antigène » pourra désigner l'antigène lui-même, ou bien la protéine antigénique, ou bien encore un épitope dudit antigène. L'homme du métier déduira alors sans ambiguïté du contexte le sens qu'il conviendra de donner à ce terme. Avantageusement, une protéine hybride produite par une souche vivante de Bordetella atténuée génétiquement conformément à l'invention comprend au moins une partie de la FHA telle que définie ci-dessus et au moins un épitope d'une protéine antigénique hétérologue vis-à-vis de ladite FHA. Un « microorganisme » est, selon l'invention, une bactérie et, de préférence, une bactérie infectieuse et pathogène pour l'homme et/ou l'animal. En particulier, une telle bactérie est une souche de Bordetella, par exemple une souche de B. pertussis.
Outre les Bordetella, parmi les microorganismes pathogènes susceptibles de produire des protéines antigéniques lors d'infections muqueuses ou systémiques, l'on peut citer par exemple des souches de Shigella, Neisseria et Borrelia.
D'autres exemples de protéines antigéniques sont des toxines ou toxoïdes diphtériques, tétaniques ou cholériques, des antigènes viraux, notamment des antigènes du virus de l'hépatite B, de l'hépatite C, du polyovirus ou du VIH, des antigènes parasitaires tels ceux produits par
Plasmodium, Schistosoma ou par les toxoplasmes.
La présente invention a également pour objets des procédés d'obtention de souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement, telles que décrites ci-dessus. Selon un premier mode de mise en œuvre, un procédé d'obtention d'une telle souche comprend au moins les étapes suivantes :
- la mutation ou la délétion du gène ptx ; et
- l'insertion d'un promoteur fort en amont du gène ampG.
Quel que soit le procédé envisagé, il convient de noter que l'ordre des étapes est indifférent pour parvenir au résultat recherché.
Selon un deuxième mode de mise en œuvre, un procédé d'obtention d'une souche vivante de Bordetella atténuée génétiquement conformément à la description fournie supra, comprend au moins les étapes suivantes :
- la mutation ou la délétion des gènes ptx et dnt ; et - l'insertion d'un promoteur fort en amont du gène ampG.
Comme indiqué précédemment, le gène ptx est avantageusement muté, de préférence dans la région codant la sous-unité S1 de la protéine PTX (Exemple 4 ci-après).
Dans le cadre des modes de mise en œuvre sus-cités, la ou les délétions peuvent être totales ou partielles. En cas de délétions partielles, comme en cas de mutations, les protéines synthétisées sont dépourvues de toxicité.
Le promoteur fort sous le contrôle duquel est placé le gène ampG est choisi parmi les promoteurs forts de Bordetella, et est de préférence le promoteur Ppor du gène de la porine majeure de Bordetella.
Avantageusement, un procédé d'obtention d'une souche de Bordetella déficiente comprend, outre les étapes sus-citées, une étape d'introduction dans la souche d'au moins un gène codant une protéine hétérologue, de préférence une protéine hybride. Un tel gène peut être porté par un plasmide ou inséré dans le chromosome de ladite souche.
De manière préférée, ledit gène code une protéine hybride comprenant au moins une partie d'une adhésine de Bordetella et au moins tout ou partie d'une protéine antigénique hétérologue vis-à-vis de ladite adhésine et susceptible d'être produite par des microorganismes pathogènes lors d'infections muqueuses ou systémiques.
Selon un mode de mise en œuvre particulier, l'adhésine sus-visée est la FHA.
L'expression d'un ou plusieurs gènes codant des protéines hétérologues, notamment des protéines hybrides, peut être placée sous le contrôle d'un promoteur fort de Bordetella, tel le promoteur du gène de la porine majeure Ppor.
Des protéines hybrides comprenant au moins une partie de la FHA ont notamment été décrites dans les demandes de brevet WO 95/28486 (aux noms de l'Institut Pasteur, l'Institut Pasteur de Lille et l'INSERM) et WO 98/16553 (aux noms de l'Institut Pasteur de Lille et l'INSERM). En particulier, des procédés d'obtention de telles protéines hybrides ont été rapportés dans l'exemple V de la demande WO 95/28486 et l'exemple 5 de la demande WO 98/16553. Les caractéristiques génotypiques des souches vivantes de
Bordetella rendues déficientes dans la production d'une ou plusieurs toxines peuvent être vérifiées par des techniques classiques connues de l'homme du métier. En particulier, elles peuvent être déterminées par Western-blot et/ou analyse de l'ADN génomique par Southern-blot (voir les Exemples ci-dessous et Sambrook et Russel. 2001 , supra). S'agissant des souches exprimant une protéine mutée, la séquence des gènes codants peut être vérifiée selon des méthodes conventionnelles de détermination des séquences nucléotidiques.
En outre, la présente invention concerne l'utilisation d'une souche déficiente de Bordetella telle que décrite supra pour la préparation de vaccins contre des infections muqueuses ou systémiques liées à des Bordetella, et notamment la coqueluche.
Selon un autre mode de mise en œuvre, une souche vivante de Bordetella atténuée génétiquement conformément à l'invention peut être utilisée aux fins de la production de tout ou partie d'au moins une protéine antigénique, telle que définie supra, et susceptible d'être produite par des microorganismes pathogènes lors d'infections muqueuses ou systémiques.
Enfin, la présente invention a pour objet une composition immunogène comprenant, en tant que principe actif, au moins une souche déficiente de Bordetella comme indiqué ci-dessus, dans une formulation pharmaceutiquement acceptable.
Une « formulation pharmaceutiquement acceptable » correspond, au sens de l'invention, à une formulation médicamenteuse susceptible d'être utilisée chez l'homme ou l'animal, à des doses acceptables in vivo eu égard à la toxicité et la pharmacologie des composés concernés, tout en étant efficaces sur le plan thérapeutique, et en particulier d'un point de vue immunogène.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la ou les souches vivantes de Bordetella atténuées génétiquement servant de principe actif sont associées à un ou plusieurs adjuvants. Par « adjuvant » ou « composé adjuvant », l'on entend au sens de la présente invention, un composé apte à induire ou à augmenter la réponse immunitaire spécifique vis-à-vis d'un antigène ou immunogène, ladite réponse consistant indifféremment en une réponse humorale et/ou cellulaire. Cette réponse immunitaire passe généralement par une stimulation de la synthèse d'immunoglobulines spécifiques d'un antigène donné, en particulier des IgG, IgA et IgM, ou de cytokines.
Le principe actif, souche(s) vivante(s) et déficiente(s) de Bordetella, ainsi que le ou les adjuvants, sont généralement mélangés à des excipients pharmaceutiquement compatibles, tels que l'eau, un tampon salin, du dextrose, du glycérol, de l'éthanol, ou des mélanges de ceux-ci. De telles compositions immunogènes peuvent être préparées sous la forme de solutions liquides, ou de suspensions injectables, ou encore sous une forme solide, par exemple lyophilisée, adaptée à la mise en solution préalablement à une injection.
De manière préférée, les compositions immunogènes objets de la présente invention sont présentées sous une forme adaptée à l'administration par voie muqueuse, et, plus particulièrement, par voie intranasale. Par exemple, il peut s'agir d'une solution destinée à être instillée, ou d'une poudre à diluer avant instillation, ou encore d'une solution pulvérisable (pour des détails sur les formulations vaccinales, voir la revue Davis S.S. Nasal vaccines. 2001. Adv. Drug Deliv. Rev. 51 :21-42).
Une composition immunogène selon l'invention est formulée de manière à permettre une administration par des voies aussi diverses que la voie nasale, orale, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, vaginale, rectale, oculaire, ou auriculaire. En particulier, le choix des composés auxiliaires est dicté par le mode d'administration choisi. De tels composés auxiliaires peuvent être notamment des agents mouillants, émulsifiants ou tampons.
Une composition immunogène selon l'invention est de préférence formulée pour une administration par voie intranasale chez l'homme et/ou l'animal. La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures suivantes :
- La figure 1 illustre l'analyse par Southern-blot, en utilisant une sonde correspondant au produit d'amplification « dnt low » (voir Exemple 1 ci-après) marqué à la dig (Roche, Bâle, Suisse), de l'ADN génomique digéré par XΛol des souches de β. pertussis délétées de la totalité du gène dnt : BPSMDN (PTX+, FHA+, DNT-) (piste 2), BPDRDN (PTX-, FHA-, DNT- ) (piste 3) et BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-) (piste 5). Les pistes 1 et 4 correspondent au marqueur de poids moléculaire et la piste 6 à l'ADN génomique de la souche sauvage témoin BPSM (PTX+, FHA+, DNT+).
- La figure 2 illustre l'efficacité des souches suivantes à adhérer aux cellules A549 et J774 :
A : BPSM (PTX+, FHA+, DNT+) B : BPSMDN (PTX+, FHA+, DNT-) C : BPRA (PTX-, FHA+, DNT+)
D : BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-) E : BPDR (PTX-, FHA-, DNT+) F: BPDRDN (PTX-, FHA-, DNT-).
- La figure 3A illustre la colonisation des poumons de souris OF1 par les souches de β. pertussis BPSM (PTX+, FHA+, DNT+) et BPSMDN
(PTX+, FHA+, DNT-).
- La figure 3B illustre le nombre de bactéries BPSM présentes dans les poumons de souris OF1 préalablement immunisées intranasalement avec les souches de la figure 3A (BPSM ou BPSMDN), ou intrapéritonéalement avec le vaccin Tetravac-acellulaire (DTaPPol ; Aventis-Pasteur, France), puis infectées intranasalement 2 mois plus tard avec la souche BPSM. Le groupe contrôle correspond à des souris naïves infectées intranasalement avec la souche BPSM. Les colonnes blanches et noires correspondent respectivement aux nombres de β. pertussis viables estimés dans les poumons 3 heures et 7 jours après l'infection. Les barres au-dessus des colonnes représentent les écarts-type (EC). - La figure 4A représente la colonisation des poumons de souris OF1 par les souches de B. pertussis BPRA (PTX-, FHA+, DNT+) et BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-).
- La figure 4B illustre le nombre de bactéries BPSM présentes dans les poumons de souris OF1 préalablement immunisées intranasalement avec la souche BPSM, ou BPRA, ou encore BPRADN, puis infectées intranasalement 2 mois plus tard avec la souche BPSM. Le groupe contrôle correspond à des souris naïves infectées intranasalement avec la souche BPSM. Les colonnes blanches, grises et noires correspondent respectivement aux nombres de B. pertussis viables estimés dans les poumons 3 heures, 10 jours et 14 jours après l'infection. Les barres au- dessus des colonnes représentent les EC.
- La figure 5 illustre l'analyse sur gel d'agarose des produits d'amplification issus des réactions de PCR réalisées sur colonies à partir de clones BPRA (PTX-, FHA+, DNT+) (piste 2), BPREDN (PTRE+, FHA+, DNT-) (piste 3), et BPSM (PTX+, FHA+, DNT+) (piste 4). La piste 1 correspond au marqueur de poids moléculaire.
- La figure 6 représente l'évolution de la colonisation par la souche BPREDN (PTRE+, FHA+, DNT-) des poumons de souris OF1 infectées à l'âge de 3 semaines ou 8 semaines.
- La figure 7 représente les réponses sériques IgG observées 44 jours après administration intranasale de souris OF1 par la souche BPSM (PTX+, FHA+, DNT+) ou BPSMDN (PTX+, FHA+, DNT-), lesdites réponses étant dirigées contre : A) la FHA, ou
B) les antigènes totaux de BPSM.
Les barres au-dessus des colonnes représentent les EC.
- La figure 8 représente la cinétique de la réponse sérique IgG anti- FHA après administration de la souche de B. pertussis BPSMDN (PTX+, FHA+, DNT-), ou BPRA (PTX-, FHA+, DNT+), ou encore BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-). - La figure 9 illustre l'analyse sur gel d'agarose des produits issus des réactions de PCR réalisées sur colonies à partir de clones BPSM de β. pertussis contenant le plasmide pCR2.1-PporG1 (piste 2), ou pBBR- PporGI (piste 3), ou encore pBBR-PporG2 (piste 4). La piste 1 correspond au marqueur de poids moléculaire et la piste 5 à la construction plasmidique pCR2.1-PporG1.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants, donnés à titre purement illustratif. Il est entendu que la présente invention ne se limite en aucune façon auxdits exemples. EXEMPLES
Exemple 1 : Construction d'une souche de B. pertussis déficiente dans la production de la toxine DNT
Le pouvoir potentiellement immunomodulateur de la toxine DNT a été montré lors d'une étude révélant que l'injection intraveineuse de DNT purifiée entraînait une diminution de la production d'anticorps contre des antigènes coadministrés (Horiguchi et al. 1992. FEMS Microbiol. Lett. 90 : 229-234). Le rôle de la toxine DNT dans la virulence de la bactérie chez l'homme reste encore méconnu. Il a cependant été montré que l'injection de programmes de DNT entraînaît des lésions nécrotiques chez la souris nouveau-né, et la dose létale chez des souris adultes était obtenue avec des nanogrammes de toxine (Zhang et Sekura. 1991 , supra).
Afin de déterminer le rôle de la toxine DNT dans l'efficacité protectrice de β. pertussis, le gène dnt codant cette dernière a été délété du chromosome de la souche BPSM (SmR, Gens, NalR) (Menozzi, F.D. et al. 1994, Infect. Immun. 62 :769-778). Pour ce faire, la souche BPSM a été croisée avec la souche mobilisante E. coli SM10(pJQDN) (Sms, GenR, Nals) sur un milieu solide Bordet-Gengou (milieu BG) contenant du sang défibriné de mouton et supplémenté par 10 mM MgCI2 (Bordet, J. et Gengou, O. 1906. Ann. Institut Pasteur (Paris). 20 :731-741 ). La construction du plasmide pJQDN a été réalisée en plusieurs étapes. Dans un premier temps, les régions flanquantes 5' et 3' du gène dnt ont été amplifiées par PCR (Polymerase Chain Reaction : réaction de polymérisation en chaîne) en utilisant l'ADN génomique de la souche BPSM comme matrice. Les oligonucléotides A: 5'- TATAGAATTCGCTCGGTTCGCTGGTCAAGG-3' (SEQ ID No. 1 ) et B: 5'- TATATCTAGAGCAATGCCGATTCATCTTTA-3' (SEQ ID No. 2) ont été utilisés pour amplifier la région en amont (« dnt up ») tandis que les oligonucléotides C: 5'-TATATCTAGAGCGGCCTTTATTGCTTTTCC-3' (SEQ ID No. 3) et D: 5'-TATAAAGCTTCTCATGCACGCCGGCTTCTC-3' (SEQ ID No. 4) ont servi à l'amplification de la région en aval (« dnt low »). Les fragments « dnt up » (799 pb) et « dnt low » (712 pb) ont respectivement été digérés par les couples d'enzymes de restriction EcoRI et Xba\, et Xba\ et Hind\\\, dont les sites de coupure sont situés de part et d'autre desdits fragments. Les deux produits de digestion « dnt up » et « dnt low » ci-dessus ont été ligaturés en utilisant le kit Fast Link (TEBU, Madison, Wl, USA). Le mélange de ligature ainsi obtenu a ensuite été utilisé comme matrice dans une réaction de PCR utilisant les oligonucléotides A et D ci-dessus. Le fragment PCR de 1505 pb obtenu a été clone dans le plasmide pCR2.1-Topo (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Le fragment issu de la digestion par EcoRI de cette construction a été introduit dans le site EcoRI unique du plasmide pJQ200mp18rpsL (Pradel et al. 2000. Infect.lmmun. 68 : 1919-1927). Le plasmide résultant, nommé pJQDN, a été transformé dans E. coli SM10 (Simon et al. 1983. Bio/Technology. 1 .784-791 ). Cette souche a ensuite été conjuguée avec la souche de Bordetella BPSM. Les deux événements de recombinaison homologue ont été sélectionnés comme décrit dans Locht et al. (1992, supra). La souche de β. pertussis ainsi obtenue a été nommée BPSMDN. Son génotype a été analysé par Southern blot pour s'assurer de la délétion du gène dnt (figure 1 , piste 2). Les surnageants de culture de 4 clones BPSMDN ont été analysés par immunoblot en utilisant un anticorps polyclonal anti-FHA pour s'assurer que la production de la FHA n'était pas altérée dans la souche mutée. La capacité de B. pertussis à adhérer à plusieurs types cellulaires présents dans les poumons étant essentielle lors de la première étape de l'infection, l'adhérence de BPSMDN a été comparée à celle de la souche sauvage BPSM sur une lignée de cellules épithéliales pulmonaires humaines (A549 ; ATCC n°CCL-185) et sur une lignée de macrophages murins (J774 ; ATCC n°TIB-67). Dans cette expérience, illustrée par la figure 2, les lignées cellulaires A549 et J774 ont été cultivées pendant deux jours dans du milieu RPMI modifié comme décrit dans Alonso et al. (2001. Infect. Immun. 69 :6038-6043). Il a ainsi été observé que la souche BPSMDN était capable d'adhérer aux cellules A549 et J774 de manière aussi efficace que la souche sauvage BPSM (figure 2, colonnes A et B). Aussi, la DNT n'est pas apparue comme une adhésine requise pour l'attachement des bactéries aux cellules épithéliales et aux macrophages.
Exemple 2 : Protection contre une infection par B. pertussis de souris préalablement immunisées avec une souche déficiente dans la production de la toxine DNT
Dans un premier temps, la capacité de la souche BPSMDN à coloniser le tractus respiratoire des souris a été vérifiée. 4 x 106 bactéries en suspension dans du PBS stérile (cellules grattées d'une culture sur milieu solide BG) ont été instillées par voie intranasale, à raison de 20 μl par narine, à des souris OF1 (souche non consanguine, souris femelles âgées de 6 à 8 semaines), sous anesthésie au pentobarbital.
Les poumons de 3 souris ont été prélevés 3 heures, puis 7, 14, 21 et 32 jours après l'administration. Les poumons ont été homogénéisés dans 5 ml de PBS stérile. Les bactéries ont été comptées 3 à 4 jours après étalement des broyats sur du milieu solide BG contenant 100 μg/ml de streptomycine (BGS). Comme le montre la figure 3A, le nombre de bactéries BPSMDN augmentait dans les poumons des souris durant les sept premiers jours après l'administration intranasale, puis chutait au cours des quatre semaines suivantes, à l'instar du nombre de bactéries correspondant à la souche sauvage BPSM.
Afin de déterminer si la souche déficiente dans la production de la toxine DNT protégeait de manière efficace contre une infection par la souche virulente de B. pertussis, des souris OF1 ont été infectées par la souche BPSM deux mois après l'administration intranasale de la souche
BPSMDN.
Le vaccin commercial Tetravac-acellulaire, correspondant au vaccin diphtérique, tétanique, pertussique acellulaire et poliomyélitique inactivé et adsorbé (DTaPPol ; Aventis-Pasteur, France), injecté par voie intrapéritonéale (100 μl soit 1/5 de la dose humaine), ainsi que la souche sauvage BPSM administrée par voie intranasale, ont été utilisés comme références pour la protection contre une infection avec BPSM. Le groupe contrôle correspondait à des souris naïves infectées intranasalement avec la souche BPSM.
L'on convient, afin de faciliter la lecture des Exemples, que l'expression « souris X » signifie « souris immunisées par X », où « X » représente la souche bactérienne ayant servi à l'immunisation des souris. Par exemple, « souris BPSM » et « souris BPSMDN » signifient respectivement « souris immunisées par la souche BPSM » et « souris immunisées par la souche BPSMDN ».
Sept jours après la seconde infection par BPSM, aucune bactérie viable n'était détectée dans les poumons des souris BPSMDN, pas plus que dans les poumons de souris BPSM (figure 3B). Comme attendu, les bactéries BPSM colonisaient les poumons des souris naïves du groupe contrôle. Les souris ayant reçu le vaccin commercial contre la coqueluche présentaient une réduction du nombre de bactéries d'un facteur 100 environ par rapport au groupe contrôle. Aussi, la souche BPSMDN était capable de protéger les souris contre une infection par la souche virulente BPSM. Exemple 3 : Construction d'une souche déficiente dans la production des toxines DNT et PTX et analyse de son pouvoir protecteur
Le gène dnt a été délété du chromosome de la souche BPRA (PTX-,
FHA+, DNT+) (Antoine, R. and Locht, C. 1990. Infect. Immun. 58 :1518- 1526) par conjugaison avec la souche mobilisante E. coli SMIO(pJQDN) comme décrit dans l'Exemple 1. La souche de B. pertussis ainsi obtenue a été appelée BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-). Son génotype a été analysé par Southern-blot afin de vérifier la délétion du gène dnt (figure 1 , piste 5).
La capacité de la souche BPRADN à coloniser le tractus respiratoire des souris a été étudiée. Comme le montre la figure 4A, la souche
BPRADN ne se multipliait pas au cours de la première semaine qui suivait l'administration. Cependant, la persistance des bactéries BPRADN au niveau des poumons durait aussi longtemps que celle de la souche parentale BPRA. La capacité de la souche BPRADN à protéger les souris contre une seconde infection avec la souche sauvage BPSM a été évaluée. Les souris ont été immunisées avec 4 x 106 bactéries de la souche BPSM (PTX+,
FHA+, DNT+), ou BPRA (PTX-, FHA+, DNT+), ou encore BPRADN (PTX-,
FHA+, DNT-) en suivant le protocole d'immunisation décrit dans l'Exemple 2 supra. Le groupe contrôle correspondait à des souris non-immunisées.
Deux mois après l'immunisation, les souris ont été infectées par voie intranasale avec la souche sauvage BPSM.
Trois souris par groupe ont été sacrifiées à différents intervalles de temps, sur une durée totale de 14 jours, et le nombre de bactéries B. pertussis viables a été estimé par poumon (figure 4B).
Les souris du groupe contrôle présentaient une augmentation du nombre de bactéries BPSM dans les poumons durant les 10 premiers jours, puis ce nombre diminuait à partir du quatorzième jour. Chez les souris BPSM et BPRA, le nombre de bactéries diminuait rapidement après la seconde infection par BPSM pour devenir indétectable dès le dixième jour. Le nombre de bactéries BPSM diminuait également dans les poumons des souris BPRADN, mais plus lentement, et devenait nul au quatorzième jour après l'infection.
Donc, la souche BPRADN, déficiente dans la production de PTX et DNT, était capable de protéger les souris contre une colonisation efficace des muqueuses respiratoires par la souche virulente BPSM.
Exemple 4 : Construction d'une souche déficiente dans la production de la toxine DNT et exprimant une toxine PTX rendue enzymatiquement inactive par mutation La toxine PTX étant un antigène protecteur majeur contre β. pertussis, une ou plusieurs mutations entraînant une perte des fonctions cytotoxiques tout en conservant les propriétés immunogéniques de la protéine, pourraient être préférables à l'absence totale de son expression chez la souche vivante de B. pertussis destinée à être utilisée comme vaccin.
Dans ce contexte, une souche déficiente dans la production de la toxine DNT et exprimant une toxine PTX rendue enzymatiquement inactive par mutation (ci-après dénommée toxine PTRE), a été construite. A cette fin, la souche BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-) a été croisée sur milieu solide BG avec la souche E. coli SM10(pJQ-PTRE) afin d'introduire le gène ptre codant la protéine PTRE par double recombinaison homologue au niveau du locus chromosomique occupé en temps normal par le gène ptx. La protéine PTRE correspond à une forme mutée atoxique de PTX et comprend les substitutions R9K et E129G dans la sous-unité S1 de PTX, ladite sous-unité étant responsable de l'activité enzymatique de la toxine (Lobet, Y. ét al. 1993. J. Exp. Med. 177 :79-87).
Le gène ptre provient du plasmide pPTRE dérivant lui-même du plasmide pPT2 (Antoine, R. and C. Locht. 1992. Zentbl. Bakteriol. Suppl. 23 : 292-293). Le fragment EcoRI de pPTRE contenant le gène ptre a été inséré dans le site EcoRI unique du plasmide pJQ200mp18rpsL. Le plasmide résultant, appelé pJQ-PTRE, a été transformé dans la souche d'E. coli SM10. Le gène ptre a été introduit par double recombinaison homologue dans le chromosome des souches BPRA (PTX-, FHA+, DNT+) et BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-) pour donner respectivement les souches BPRE (PTRE+, FHA+, DNT+) et BPREDN (PTRE+, FHA+, DNT-). La présence du gène ptre dans la souche BPREDN a été vérifiée par PCR sur colonies à l'aide des oligonucléotides E 5'-
GCATCGCGTATTCGTTCTAGACCT-3' (SEQ ID No. 5) et F: 5'- CGTCGGCCAGGGCGGGGGAAAGATG-3" (SEQ ID No. 6) qui permettent l'amplification du gène codant la sous-unité S2 (838pb) de PTX conservée dans PTRE (figure 5, piste 3).
Exemple 5 : Analyse de la capacité de la souche BPREDN à coloniser le tractus respiratoire murin
La capacité de la souche BPREDN à coloniser le tractus respiratoire de souris, respectivement âgées de 3 et 8 semaines au moment de l'infection, a été vérifiée. Comme le montre la figure 6, le nombre de bactéries BPREDN augmentait dans les poumons de souris durant les sept premiers jours suivant l'administration intranasale, puis chutait au cours des deux semaines suivantes.
Exemple 6 : Analyse de l'immunogénicité des souches de B. pertussis déficientes dans la production de la toxine DNT après administration intranasale
Afin de déterminer si la toxine DNT joue un rôle dans l'immunogénicité de B. pertussis, des souris ont été immunisées avec la souche BPSM (PTX+, FHA+, DNT+) ou BPSMDN (PTX+, FHA+, DNT-) par voie intranasale conformément au protocole décrit dans l'Exemple 2 supra. Les souris ont été saignées 44 jours plus tard par ponction au niveau du plexus rétroorbital. Les sérums ont été conservés à -20°C pour analyse. Les taux d'anticorps ont été déterminés selon la technique ELISA (Enzyme- Linked ImmunoSorbant Assay : dosage par immunoadsorption en présence d'une enzyme) pour 3 à 5 souris par groupe (figure 7).
Comme l'illustre la figure 7A, une réduction significative de la réponse anti-FHA était observée chez les souris BPSMDN, en comparaison de la réponse des souris BPSM. Sur cette figure, le crochet horizontal et l'astérisque indiquent que la différence est significativement différente [p < 0,05] en appliquant le test de Student aux résultats obtenus. De manière remarquable, cette différence était spécifique de la réponse anti-FHA puisqu'elle n'était pas observée s'agissant de la réponse IgG sérique contre les antigènes totaux de BPSM (figure 7B). Donc, la production de la toxine DNT par B. pertussis influençait l'induction d'une réponse immunitaire spécifique contre la FHA.
Il a précédemment été montré que l'administration intranasale de la souche BPRA (PTX-, FHA+, DNT+) induisait une réponse sérique spécifique anti-FHA plus précoce et plus élevée que l'administration de la souche BPSM (PTX+, FHA+, DNT+) (Mielcarek et al. 1998. Nat. Biotechnol. 16 :454-457, demande de brevet FR 96 12461 , demande internationale de brevet WO 98/16553).
Afin d'évaluer l'immunogénicité d'une souche déficiente dans la production des deux toxines PTX et DNT, des souris OF1 ont été immunisées par voie intranasale avec 4 x 106 bactéries BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-) dans 40μl. L'intensité de la réponse sérique IgG anti-FHA observée chez ces souris a été comparée à celle obtenue après administration de la souche BPRA (PTX-, FHA+, DNT+) ou BPSMDN (PTX+, FHA+, DNT-). La cinétique de la réponse immunitaire sérique a été effectuée sur des groupes de 3 à 5 souris par temps (figure 8).
Une faible réponse anticorps anti-FHA a été détectée chez les souris BPSMDN, avec un titre maximum obtenu 44 jours après immunisation (figure 8). En revanche, une production élevée d'anticorps anti-FHA a été obtenue 20 jours après administration de la souche BPRADN. Cette production a ensuite diminué progressivement durant les 45 jours qui ont suivi. Cette cinétique de réponse immunitaire était comparable à celle observée chez les souris BPRA, indiquant donc que le défaut de production de la toxine DNT dans une souche également déficiente dans la production de la toxine PTX n'influençait pas de manière significative l'immunogénicité de la souche de B. pertussis.
Exemple 7 : Construction de plasmides permettant la surexpression de la protéine AmpG native ou mutée, impliquée dans le recyclage de la toxine TCT, dans des souches de B. pertussis Parmi les différentes toxines produites par B. pertussis et outre les toxines PTX et DNT, la cytotoxine TCT représente une autre cible potentielle permettant de rendre les souches vivantes de Bordetella moins virulentes, voire avirulentes, aux fins de leur utilisation comme vaccins. Ainsi a-t-on cherché à réduire la libération de la TCT. Une stratégie était donc d'insérer un promoteur constitutif fort, en l'occurrence le promoteur du gène de la porine majeure (Ppor) de B. pertussis, en amont du gène ampG afin d'en augmenter l'expression. Le promoteur Ppor a été amplifié par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pBBPG, et les oligonucléotides suivants : G : 5'- TATACTCGAGCCCGCGCGCGATTCCGGATT-3' (SEQ ID No. 7) et H : 5'- TTTTTCATGAAAGAAATCTCCGTTGATTTG-3' (SEQ ID No. 8). Le plasmide pBBPG dérive du plasmide pBBRI MCS (Kovach, M.E., ef al. 1994. Biotechniques 16 :800-802) et contient le promoteur Ppor de BPSM (Li, Z.M., et al. 1991. Mol. Microbiol. 5 :1649-1656). Ledit promoteur a été inséré dans pBBPG au niveau des sites Xho\ et Bsph\ après amplification par PCR en utilisant les oligonucléotides G et H supra, et l'ADN génomique de BPSM comme matrice. Le fragment PCR ainsi obtenu a été clone dans le plasmide pCR2.1-Topo (supra) pour donner le plasmide pCR2.1-Ppor.
En parallèle, le gène ampG de β. pertussis (ampG1) a été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides 1 : 5'- TATACCATGGCGCCGCTGCTGGTGCTGGGC-3' (SEQ ID No. 9) et J : 5'- TATATCTAGACGCTGGCCGTAACCTTAGCA-3' (SEQ ID No. 10) et l'ADN génomique de BPSM comme matrice. Le gène ampG1 a ainsi été muté de manière à remplacer le résidu valine situé à l'extrémité N-terminale de la protéine AmpG1 par une méthionine. La protéine AmpG d'E. coli possède une extension N-terminale de
13 acides aminés que la protéine homologue de B. pertussis ne possède pas. Un variant du gène ampG, appelé ampG2, a été construit. Ce variant code la protéine AmpG de B. pertussis à laquelle ont été rajoutés les 13 acides aminés N-terminaux de la protéine AmpG de E. coli. Le gène ampG2 a donc été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides K : 5'- ATTACCATGGCCAGTCAATATTTACGTATTTTTCAACAGCCGCGTGCG CCGCTGCTGGTGCTGGGCTTTGCCAGC-3' (SEQ ID No. 11 ) et J (supraj. L'analyse de la séquence du fragment PCR ainsi obtenu a mis en évidence deux substitutions dans ampG2, remplaçant une méthionine par une thréonine en position +62 et une serine par une glycine en position +852.
Les fragments PCR ampG1 et ampG2 ont été clones dans pCR2.1- Topo pour former respectivement les plasmides pCR2.1-G1 et pCR2.1-G2. Le fragment Ppor a été obtenu par digestion du plasmide pCR2.1- Ppor à l'aide des enzymes Hind\\\ et BspH . Les fragments ampG1 et ampG2 ont été respectivement obtenus par digestion de pCR2.1-G1 et pCR2.1-G2 par Λ/col et Xba\. Les fragments Ppor et ampG1, ainsi que Ppor et ampG2, ont ensuite été ligaturés en utilisant le kit Fast Link (supra). Les mélanges de ligature ont été utilisés comme matrice pour une réaction de PCR utilisant les oligonucléotides G et J ci-dessus. Les fragments PCR de 1500 pb ainsi obtenus ont été clones dans le plasmide pCR2.1-Topo pour former les plasmides pCR2.1-Ppor-G1 et PCR2.1-Ppor-G2. Les fragments EcoRI dérivant de ces plasmides ont été introduits dans le site EcoRI unique du plasmide pBBRI MCS (Kovach et al. 1994. Bio/Techniques. 16:800-802) pour donner respectivement les plasmides pBBR-Ppor-G1 et pBBR-Ppor-G2. Les plasmides pCR2.1-Ppor-G1 , pCR2.1-Ppor-G2, pBBR-Ppor-G1 et pBBR-Ppor-G2 ont été électroporés dans la souche BPSM et la présence des constructions plasmidiques a été vérifiée par PCR sur colonies (figure 9).
Exemple 8 : Insertion dans le chromosome de B. pertussis des constructions génétiques permettant la surexpression de la protéine AmpG native ou mutée, impliquée dans le recyclage de la toxine TCT Les constructions contenant le gène ampG natif ou muté sous le contrôle du promoteur porine Ppor ont été insérées par double recombinaison homologue au niveau du locus chromosomique de ampG.
Pour permettre cette double recombinaison homologue, un fragment de 862 pb, nommé met et situé en amont du gène ampG, a été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides L : 5'- TATAAAGCTTCGATTTCCTGCTGGTTTCGT-3' (SEQ ID No. 12) et M : 5'- TATAGGATCCCGATACAGCGCCAATGTACT-3' (SEQ ID No. 13) et l'ADN génomique de BPSM comme matrice. Le fragment met est lui-même situé en amont d'une séquence d'insertion \S481 qui a été par conséquent éliminée du fait la double recombinaison homologue. Le fragment PCR met a été clone dans le plasmide pCRII-Topo (TEBU, supra) pour former le plasmide pCRII-Met. Ce plasmide a été digéré par HindlW et BamHI, et le fragment de 862 pb correspondant à met a été introduit dans les plasmides pCR2.1-G1 et pCR2.1-G2 pour donner respectivement les plasmides pCR2.1-MetG1 et pCR2.1-MetG2. Ces derniers plasmides ont été digérés par HindlW et Xbal afin d'extraire un fragment contenant met situé en amont de la construction pPor-AmpG. Les fragments de 2500 pb ainsi extraits ont alors été clones dans le plasmide pJQ200mp18rpsL préalablement digéré par Hindlll et Xbal, pour donner respectivement les plasmides pJQMetGI et pJQMetG2. Ces plasmides ont été transformés dans la souche de E. coli SM10 afin de permettre l'insertion par double recombinaison homologue de la construction Ppor-ampG1 et Ppor-ampG2 dans le génome de B. pertussis. Les souches issues du croisement avec BPRADN (PTX-, FHA+, DNT-) ou BPREDN (PTRE+, FHA+, DNT-) ont été respectivement appelées BPZA1 et BPZA2, et BPZE1 et BPZE2.
Des souris OF1 sont immunisées par voie intranasale afin de vérifier que les souches BPZA1 , BPZA2, BPZE1 et BPZE2 ont gardé leur capacité à coloniser le tractus respiratoire des souris. Les réponses sériques et muqueuses (dans les lavages broncho-alvéolaires) dirigées contre la FHA et contre les antigènes totaux de β. pertussis sont analysées par ELISA comme décrit dans l'Exemple 6 supra. Le pouvoir protecteur des souches atténuées de β. pertussis sus-citées est évalué comme indiqué dans l'Exemple 2 ci-dessus.

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche de Bordetella déficiente dans la production de la toxine de B.pertussis PTX par atténuation génétique via la mutation ou la délétion du gène codant ladite toxine PTX et déficiente dans la libération de la toxine cytotrachéale TCTpar insertion d'un promoteur fort en amont du gène codant la protéine AmpG.
2. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est en outre déficiente dans la production de la toxine dermonécrotique DNT par atténuation génétique via la mutation ou la délétion du gène codant la toxine DNT.
3. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le gène codant la toxine PTX est muté au niveau de la région codant la sous- unité S1 de ladite toxine.
4. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite délétion est totale ou partielle.
5. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 à 4, caractérisée en ce que ladite mutation ou ladite délétion partielle entraîne la synthèse d'une protéine atoxique.
6. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit promoteur fort est choisi parmi les promoteurs forts de Bordetella, et est de préférence le promoteur du gène de la porine majeure de Bordetella.
7. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle produit au moins une protéine hétérologue, de préférence hybride.
8. Souche selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine hétérologue est cytoplasmique et/ou de surface et/ou sécrétée.
9. Souche selon la revendication 7, caractérisée en ce que le gène codant ladite protéine hétérologue est porté par un plasmide ou inséré dans le chromosome.
10. Souche selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine hétérologue est une protéine hybride comprenant au moins une partie d'une adhésine de Bordetella et au moins tout ou partie d'une protéine antigénique hétérologue vis-à-vis de ladite adhésine et susceptible d'être exprimée par des microorganismes pathogènes lors d'infections muqueuses ou systémiques.
11. Souche selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite adhésine est la FHA.
12. Souche selon la revendication 11 , caractérisée en ce que la partie de la FHA comprend au moins la région N-terminale de la FHA mature contenant le site d'interaction avec l'héparine et suffisante à elle seule pour entraîner la sécrétion de la protéine hybride formée.
13. Souche selon la revendication 10, caractérisée en ce que la partie de la protéine antigénique comprend au moins un épitope de celle-ci.
14. Souche selon la revendication 10, caractérisée en ce que la protéine antigénique est choisie dans le groupe comprenant la toxine tétanique et la toxine diphtérique.
15. Procédé d'obtention d'une souche selon la revendication 1, comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mutation ou la délétion du gène codant la toxine de B. pertussis PTX ; et
- l'insertion d'un promoteur fort en amont du gène codant la protéine AmpG.
16. Procédé d'obtention d'une souche selon la revendication 2, comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mutation ou la délétion des gènes codant la toxine de β. pertussis PTX et la toxine dermonécrotique DNT ; et
- l'insertion d'un promoteur fort en amont du gène codant la protéine AmpG.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que le gène codant la toxine PTX est muté au niveau de la région codant la sous- unité S1 de ladite toxine.
18. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ladite délétion est totale ou partielle.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que ladite mutation ou ladite délétion partielle entraîne la synthèse d'une protéine atoxique.
20. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ledit promoteur fort est choisi parmi les promoteurs forts de Bordetella, et est de préférence le promoteur du gène de la porine majeure de Bordetella.
21. Procédé selon la revendication 15 ou 16, comprenant en outre une étape d'introduction dans la souche d'au moins un gène codant une protéine hétérologue, de préférence hybride.
22. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que ledit gène est porté par un plasmide ou inséré dans le chromosome.
23. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que ledit gène code une protéine hybride comprenant au moins une partie d'une adhésine de Bordetella et au moins tout ou partie d'une protéine antigénique hétérologue vis-à-vis de ladite adhésine et susceptible d'être exprimée par des microorganismes pathogènes lors d'infections muqueuses ou systémiques.
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'adhésine est la FHA.
25. Utilisation d'une souche déficiente de Bordetella selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour la préparation de vaccins contre des infections muqueuses ou systémiques liées à Bordetella, notamment contre la coqueluche.
26. Utilisation d'une souche déficiente de Bordetella selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, pour la production de tout ou partie d'au moins une protéine antigénique susceptible d'être exprimée par des microorganismes pathogènes lors d'infections muqueuses ou systémiques.
27. Composition immunogène comprenant, en tant que principe actif, au moins une souche déficiente de Bordetella selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans une formulation pharmaceutiquement acceptable.
28. Composition immunogène selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite souche est associée à des adjuvants.
29. Composition immunogène selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être administrée par voie intranasale chez l'homme et/ou chez l'animal.
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