JP2004159660A - コレラワクチンとしての欠失変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 変異株はコレラの多くの症状の原因である機能性のctxAサブユニットをコードするDNAを欠いている遺伝子操作された変異体である。変異体は、また、CTX遺伝因子の組み換えおよび増幅に必要である、いかなる機能性のattRS1配列も欠いている。これらの株は、それらがctxAコードDNAを含む野生型attRS1含有伝播体と組み換えできないので安全である。
【選択図】 なし
Description
本発明の分野はビブリオ・コレレ ワクチンである。100年以上のコレラの研究の後、効果的なコレラワクチンの必要が残っている。“古典的”な生物型に属するビブリオ・コレレの株により起こされたこの疾患の6回の汎発性流行があった。現在(第7)汎発性流行の病原体は“エルトール”生物型に属する(Finkelstein,Crit.Rev.Microbiol 2:553−623,1973,Wachsmuthら、The Lancet 337:1097−1098,1991)。近年、第7回目の汎発性流行が新たな場所、南アメリカの地に及んでいる。1991年の1月に始まり、コレラの流行がペル−、エクアドル、コロンビア、およびチリにおいて250,000以上の症例そして2,000名以上の死者を出した。この流行前には、主にインド、バングラデシュ、アフリカ、および西アジアにおいて年間200,000以上のコレラの症例が起こったと見積もられていた(Tacketら、Cholera Vaccines.In Vaccines:New Approaches to Immunological Problems,Ellis,R.W.編、Butterworth−Heinemann,Boston,1992)。
本発明はコレラに対し免疫学的保護を誘発する生菌経口ワクチンとして有用である毒素非産生性で遺伝学的に安定なビブリオ・コレレ変異株を特徴としている。この変異株は機能性のctxAサブユニットをコードするDNAを欠失し、またいかなる機能性のattRS1配列も欠失している遺伝子操作された変異体である。attRS1配列とは、CTX遺伝因子の組み換えおよび増幅に必要であるCTX遺伝因子内に含まれる17塩基対の配列または、そのような組み換えおよび増幅を可能にするために充分なその配列を意味する。“いかなる機能性のattRS1配列も欠失している”変異体はattRS1含有伝播体との効果的な部位特異的組み換えを実質的に行うことができないものである。なぜなら、野生型attRS1配列が全て欠失されているか、またはそのような組み換えを防ぐために充分に欠失されているか、または変異されているからである。その結果、本発明によるビブリオ・コレレ株は、それらがctxAをコードするDNAを含む野生型attRS1含有伝播体と組み換えできないので、より安全である。
本発明はコレラおよび可能性のある他の疾患に対して個体を保護するために、生菌、または死菌経口ワクチンとして用いることができる弱毒化ビブリオ・コレレ株を特徴としている。
1991年にペルーにおけるコレラ患者から単離されたビブリオ・コレレ株C6709−Smの弱毒化誘導体が構築されており、生菌経口コレラワクチンとして用いることができる。誘導体ペルー1およびペルー2は、コレラ毒素と関係のない腸内定着因子(ICF)、zotをコードしているDNAに加えて、コレラ毒素をコードしているDNAを取り除いている小さなタイプ1(コア)および大きなタイプ2欠失をそれぞれ担持している。過剰な腸内定着が初期の原型の生コレラワクチンを投与されたヒトにおいてみられた有害な副作用の原因の可能性があるので、ペルー1およびペルー2においてコレラ毒素およびICF両方をコードしている遺伝子の欠失は、これらの株を、ワクチン被接種者においてその免疫原性と、従って保護特性を保持しながら、より少ない反応産生性にするであろう。
attRS1およびフランキング染色体配列:
5´−TAAACCTAGAGACAAAATGTTCCTAGTGCGCATTATGTATGTTATGTTAAAT−3´
[配列番号2]
RS1の左側および染色体連接点:
5´−TAAACCTAGAGACAAAATGTTCCTAGTGCGCATTATGTGGCGCGGCAT...RS1...−3´
[配列番号3]
RS1の右側および染色体連接点:
5´−AAACCCTAGATTCCGCCGCCTTAGTGCGCATTATGTATGTTATGTTAAAT−3´
[配列番号4]
RS1の末端に存在するattRS1および類似の配列には下線が引かれている。attRS1に隣接する染色体配列がRS1の左側と右側に存在し、重複するのはRS1の左端のattRS1と同じである17塩基配列、及び、attRS1と17/18塩基対が一致する18塩基配列だけであることに注目。
タイプ2欠失はRS1配列およびattRS1配列の全てのコピー(図1)を含むCTX遺伝因子に対応する全ての配列を取り除く。タイプ2欠失をビブリオ・コレレの染色体と図3に示すプラスミドpAR62にクロン化されたプラスミド配列との間の組み換えにより構築した。プラスミドpAR62はプラスミドpGP60の誘導体であり、図3に示すHindIII 断片を欠失したタイプ2欠失を担持している。プラスミドpGP60は、20−30kbのSau3Aによる部分消化断片をプラスミドpLAFR2(Friedmanら、1982,Gene 18:289)のBamHI部位に挿入することにより、先ずP27459株のゲノムライブラリーを作成することにより構築された。コロニーをctx領域(Mekalanos,1983,Cell 35:253)に由来するプローブを用いてハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。陽性のコロニーを採取しそこから単離されたプラスミドをpGP60と命名した。このプラスミドの制限酵素分析により、それが全てのCTX因子配列および付加的なフランキングDNAを含んでいることを確認した。プラスミドpAR62はテトラサイクリンに対する耐性をコードしている。このプラスミドを接合またはエレクトロポレーションによりビブリオ・コレレ株に導入し、続いて3μg/mlのテトラサイクリンを含む培地で選択した。次いで、そのようなプラスミドを担持する株をGoldbergおよびMekalanos(J.Bacteriol.165:723−731,1986)に記載されたように調製した放射性L−3プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。染色体に挿入されたタイプ2欠失を担持しているコロニーはL−3プローブにハイブリッドを形成せず、驚くことに、高い頻度で発生した(すなわちスクリーニングされたコロニーの約1%)。サザンブロット分析を用いて、これらの株に予想された欠失の存在を確認した。
“コア欠失”はCTX因子のコアに対応する配列だけを取り除くが、RS1因子のコピーは染色体上にそのまま残しておく(Goldbergら、J.Bacteriol.165:723−731,1986)(図2)。これらの欠失は図2に示す様にコア領域の右側と左側に位置するRS1配列間の相同的組み換えにより自然発生的に起こる。コア欠失を含むビブリオ・コレレのコロニーは2つの方法で同定できる。第一に、その株がコア領域に挿入されたカナマイシン耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカーを担持していれば、その場合コア欠失によりそのような株はカナマイシンに対して感受性になる(Goldbergら、J.Bacteriol.165:723−731,1986)。第二に、またこの欠失を担持している株とはハイブリッドを形成しない放射性CT−1プロ−ブを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより、コア欠失を含むコロニーは同定できる(Goldbergら、J.Bacteriol.165:723−731,1986)。どちらの方法によっても、これらの欠失を担持するコロニーはスクリーニングされた1000のコロニーに付き約1個の頻度で起こった。続いて、サザンブロットハイブリダイゼーションによる分析を用いて、これらの株における予想された欠失を確認した。
プラスミドpGP52はSM10λpirのようなE.coli株においてのみ複製可能である自殺プラスミドである(Pearsonら、1990,Res.Microbiol.141:893)。プラスミドpGP52は、初めにプラスミドpGP7(Mekalanos,1983,Cell 35:253)をClaIとSphIで消化することにより構築された。このプラスミドはビブリオ・コレレ株E7946−Smに由来する2つのRS1配列(RS1およびRS2と呼ぶ)を含む。RS1配列を含むDNAの断片をpBR322にクローニングし、得られるプラスミドをpGP20と命名した。続いて、このプラスミドをEcoRV(RS1配列内で切断する)で消化した。このプラスミドを再連結した時、ハイブリッドRS2配列がコア配列により隣接されているRS2* と呼ばれるRS2のハイブリッド型を含むpGP20Rと呼ばれる新規のプラスミドが生成された。続いて、RS2のSspI−SphI断片をNruIおよびSphIで予め消化された自殺プラスミドpJM703.1にサブクローニングした。プラスミドpJM703.1はMillerら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3471)に記載されている。得られるプラスミドは、pGP52と名づけられた。pGP52の構築を表す図を図4に示す。
表1 ペルーワクチン株に関する代表的組み込みデータ
株 安定的な組み込み事象/生存可能細胞総数
ペルー1 5.2×10−5
ペルー2 検出不能(<5×10−8)
ペルー3 検出不能(<5×10−8)
ペルー4 検出不能(<5×10−8)
ペルー5 検出不能(<5×10−8)
ワクチン株ペルー2、バング2、およびバー2をそれらの血清学的および定着特性に関してさらに特徴決定した。表2に示すデータは、新たに採収された細菌細胞をDifcoビブリオ・コレレ01イナバまたはオガワタイピング血清を用いてスライド凝集により検査した場合、各誘導体はその予想された血清型(すなわち各変異体のそれぞれの親株の血清型)を保持していることを示している。この結果は、これらの株が依然としてLPS抗原を発現することを示している。他の検査はこれらの変異株が運動性、原栄養性で、そして依然としてTcp線毛を発現することを示している。従って、変異体は生ワクチン株として有用であるための能力にとって重要である多くの特性を発現する。
これらのワクチン株の定着特性を検査するために、Taylorら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:2833−2837,1987)に記載されているマウス腸内競合アッセイを用いた。このアッセイは、変異株が後に続いてヒトの志願者において検査された場合(Harringtonら、J.Exper.Med.168:1487−1492,1988)、その定着特性と正確な相関関係があることが示されている。アッセイは増殖および生存について競合できる変異株の能力を他の密接に関連している株または同遺伝子型株と比較することにより、変異株の定着性における差異を測定する。このアッセイにおいて、変異体および競合株を約1:1の比率で混合し、次いで、この混合物の約100万個の細胞を3−5日齢の乳児マウスCD−1の胃に導入した。24時間後、マウスを殺し、腸を切開し、ホモジナイズし、両株を選別するストレプトマイシンを含む細菌学的培地に塗布した。一晩のインキュベ−ション次いで増殖したコロニーを競合株から変異株を区別する別のマーカーについて検査する(すなわち、カナマイシンに対する耐性または適切な放射性DNAプローブとのハイブリダイゼーション;表3の説明文参照)。
表2 変異株の特性
変異株 親株 * 血清型 欠失の型
ペルー2 C6709-Sm イナバ タイプ-2
バング2 P27459-Sm オガワ タイプ-2
バー2 E7946-Sm イナバ タイプ-2
* 株名の後の“Sm”の名称はストレプトマイシン耐性を意味することに注意。これは100μg/mlのストレプトマイシンに耐性のある自然発生的な選択株であり、リボソームタンパク質の遺伝子における自然発生的点突然変異の結果であった。この耐性マーカーはプラスミドまたはトランスポゾンと関連しておらず、その結果腸内フローラに伝染性がない。全ての変異株は表示された親株から誘導されるので、全ての変異株もまたストレプトマイシン耐性である。
表3 幼児マウス定着競合アッセイ a
変異株 競合株 投入比率 出力比率
変異株/競合株 変異株/競合株
バング2 SM44b 0.61 0.16
バー2 SM115 c 0.92 0.07
ペルー2 C6709-Smd 0.74 0.65
バング1 SM44b 0.85 0.05
バー1 SM115 c 0.61 0.04
ペルー1 C6709-Smd 0.89 0.94
a 幼児マウス定着アッセイをTaylorら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2833−2837,1987)に記載された方法に従い行った。株の比率を抗生物質に対する感受性の差異か、または追加された下記の脚注に記載されているように適切なプローブとのコロニーハイブリダイゼーションにより決定した。
b SM44株はGoldbergおよびMekalanos(J.Bacteriol.165:723−731,1986)に記載されており、親株P27459−Smのカナマイシン耐性誘導体である。SM44においてカナマイシン耐性をコードする遺伝子をctx遺伝子座に挿入した。バング1およびバング2はP27459−Smの誘導体なので、SM44との競合はctxの喪失よりもむしろタイプ2の影響に帰することが出来る定着性の差異を測定する。バング1およびバング2株はカナマイシン感受性であり、30μg/mlのカナマイシンに対する耐性のコロニーを数えることにより、これらの競合アッセイにおいてSM44から区別された。
c SM115株はGoldbergおよびMekalanos(J.Bacteriol.165:723−731,1986)により記載されており、親株E7946−Smのカナマイシン耐性誘導体である。SM115においてカナマイシン耐性をコードする遺伝子をctx遺伝子座に挿入した。バー1およびバー2はP27459−Smの誘導体なので、SM115との競合はctxの喪失よりむしろタイプ2欠損の影響に帰することが出来る定着性の差異を測定する。バー1およびバー2株はカナマイシン感受性であり30μg/mlカナマイシンに対する耐性のコロニーを数えることによりこれらの競合アッセイにおいてSM115から区別された。
d C6709−Sm株はペルー1およびペルー2の親株である。ペルー2はタイプ2欠失を担持し、一方ペルー1はコア欠失を担持する。これらの両欠失はctx遺伝子を取り除き、その結果ペルー1およびペルー2はGoldbergおよびMekalanos(J.Bacteriol.165:723−731,1986)に記載されたCT−1プロ−ブで探査した場合、コロニーハイブリダイゼーションブロットにおいて陰性であったが、C6709−Sm株は同じプローブを用いて陽性であった。従って、ペルー1およびペルー2両者は、CT−1プローブを用いるハイブリダイゼーションのコロニーを数えることにより、これらの競合アッセイにおいてC6709−Smから区別された。
コレラ毒素Bサブユニットはコレラ毒素中和抗体を誘発することができる非毒性で、非常に免疫原性のある分子であることが知られている。さらに免疫原性のあるワクチン株を作成するために、新しいctxB遺伝子のコピーを上記のタイプ2欠失を含むワクチン株に導入した(なぜなら、タイプ2欠失はコレラ毒素Bサブユニットのコード配列全てを取り除くからである)。これは、下記の一連の段階で達成された。
5´−GGGCTAAAGTTAAAAGACAAATATTTTCAGGC−3´[配列番号5]。上流プライマーはA2サブユニットのカルボキシ末端の最後の24個のアミノ酸残基だけが反応の産物によりコードされ得るように設計された。このプライマーは下記の配列を有した。
5´−GGGTAGAAGTGAAACGGGGTTTACCG−3´[配列番号6]。AサブユニットをコードするDNAにおける、他の全てのヌクレオチドは反応から除外された。ctxB遺伝子発現の翻訳共役を可能にするために、CtxA2のカルボキシ末端アミノ酸をコードするDNAを最終産物に保持した。コレラ毒素に関連した毒素活性はCtxA1ポリペプチドに由来するので、A1ポリペプチドをコードする全ての配列はPCR反応から除外された。
1.それらはアンピシリン感受性であった。
2.それらはrecA− 細胞の特徴的な表現型である、LB 1mlに付き0.1mlのメチルメタンスルホネートの存在下で殺された。
3.それらはGMI−ELISAにより測定されるコレラBサブユニットを産生した。
4.recAおよびctxBプローブを用いるサザンブロット分析により、それらがctxB構築物の存在および適切なrecA配列の欠失と一致しているDNA断片を含むことを確認した。
株 遺伝子型
ペルー3 attRS1 欠失、 recA::htpP-ctxB,str
ペルー4 attRS1 欠失、 recA::ctxP-ctxB,str
バング3 attRS1 欠失、 recA::htpP-ctxB,str
バー3 attRS1 欠失、 recA::htpP-ctxB,str
バー4 attRS1 欠失、 recA::ctxP-ctxB,str
上記のワクチン株内に含まれるrecA変異は、株を相同的組み換え欠損にする。依然として相同的組み換えが可能なワクチン候補をつくるために、ctxB遺伝子を下記のようにビブリオ・コレレのlacZ遺伝子に挿入した。
株 遺伝子型
ペルー5 attRS1 欠失、 lacZ::ctxP-ctxB,str
バング5 attRS1 欠失、 lacZ::ctxP-ctxB,str
バー5 attRS1 欠失、 lacZ::ctxP-ctxB,str
株 マウス当りのCFU a 遺伝子型/構築物 b
ペルー3 9.4×105 attRS1 欠失 #2, rec A:: htp G-ctx B
ペルー2 2.5×106 attRS1 欠失 #2,
ペルー4 6.0×106 attRS1 欠失 #2 rec A:: ctx - ctx B
ペルー5 6.6×106 attRS1 欠失 #2 lec Z:: ctx - ctx B
バング2 9.9×106 attRS1 欠失 #2,
バング3 2.7×107 attRS1 欠失 #2, rec A:: htp G-ctx B
a 1匹のマウスに付き回収されたコロニー形成単位(5匹のマウスの平均)
b 構築物attRS1欠失#2は図3に記載されたプラスミドpAR62を用いて構築されたタイプ2欠失である。
構築物recA::htpG−ctxBはrecA遺伝子の欠失、およびビブリオ・コレレのhtpG
熱ショックプロモーターの制御下にあるコレラ毒素Bサブユニット遺伝子の挿入である。
構築物recA::htpG−ctxBはrecA遺伝子の欠失とビブリオ・コレレの超毒素産生性5698株のctx遺伝子に由来するコレラ毒素プロモーターの制御下にあるコレラ毒素Bサブユニット遺伝子の挿入である。
構築物lacZ::ctx−ctxBはビブリオ・コレレの超毒素産生性5698株のctx遺伝子に由来するコレラ毒素プロモーターの制御下にあるコレラ毒素Bサブユニットから成るビブリオ・コレレのlacZ遺伝子中の挿入物である。
軟寒天侵入能に欠損のあるビブリオ・コレレの変異体はワクチンの産生に有用である。これらの変異体を使用する合理性を下記に示す。腸の粘液層は、粘性があると考えられており、軟寒天の侵入能に欠損のある変異体は、この粘液への侵入に欠陥がある可能性がある。粘液を通る侵入に欠損があるが、これらの変異体は、濃い粘液のゲルにより被覆されていない、そしてIgA抗体産生に特異的な抗原試食細胞を含むパイエル板に抗原を依然として提示する。その結果、侵入能欠損変異体は低い反応産生性を有するが、抗原性が高いと予測されており、これらの特徴は、生ワクチンに望ましい。非運動性変異体は、軟寒天の侵入能に欠損のある変異体のひとつの種類であるが、他の型の変異体も軟寒天侵入能欠損表現型(すなわち、遊走表現型)を生じ、ワクチンに有用である。この論法の線に沿って、完全に非運動性変異体、すなわち、寒天を含まない培地で遊走できない変異体は有用なワクチン候補である。
非常に珍しい非01で強毒性の株がインド亜大陸におけるコレラ流行の原因であると、最近発見された。初期の01血清型流行病の生存者は、この株に対して免疫学的に保護されていない。
ペルー3およびペルー5の効果のヒトでの研究を下記のように行った。
血液試料を免疫前、そして免疫後7日、14日、21日および28日目に志願者から取った。彼等の血流におけるビブリオ・コレレ抗体を測定し、そのレベルを表4に示す。ワクチンの原型であるペルー3およびペルー5の免疫原性をヒト志願者研究において評価した。志願者は、新たに採収したペルー3またはペルー5を10%重炭酸ナトリウム100ml中の3つの異なる用量で摂取した。ペルー3およびペルー5は、また抗毒素抗体を誘発することを示した(表5)。さらに、ペルー3およびペルー5は、野生型エルトールビブリオ・コレレ(表6、N16961株)の攻撃から志願者を保護することを示した。我々は、ヒトでの研究においてペルー3が特に強力な免疫応答(表4および5)を刺激し、コレラからの保護を提供する(表6)と結論する。
上記の手順はいかなる当業者によっても、広範囲の種々の外来抗原または異種抗原、例えば、ビブリオ・コレレに通常発現されない抗原を発現する能力のあるペルー2、バング2、バー2、ペルー14株および関連株の誘導体の構築に適用することが出来る。そのような誘導体は、生ワクチンとして用いられた場合、ビブリオ・コレレの抗原およびそれがコードしている外来抗原の両者に対して強力な免疫応答を誘発すると予想される。他の原形ビブリオ・コレレワクチンでの予防接種が全細胞抗原(例えば、LPS)ならびにコレラ毒素Bサブユニット(Herringtonら、1988,J.Exp.Med.168:1487−1492)のような個々のタンパク質に特異的である循環IgGと局所IgA抗体の誘発をもたらしているので全身的免疫応答および局所的免疫応答の両方が誘発されるようである。ビブリオ・コレレにより発現される外来抗原は個々のコレラタンパク質の免疫応答に類似の免疫応答を誘発すると予想される。
コレラ毒素(CT)に対する抗体を誘発するビブリオ・コレレワクチンは熱不安定性毒素(LT)を産生する毒素原性E.coli(ETEC)(Svennerholm,J.Infect.Dis.,149:884−893,1984)の株に対する交差保護をヒト被接種者に与えることが証明されている。しかしながら、ワクチン被接種者は、依然として熱不安定性毒素(ST)産生ETEC株の攻撃を受けやすい。ビブリオ・コレレの弱毒化株、ペルー3を定着因子抗原CFA/IV線毛の主要なサブユニットおよびSTの遺伝的トキソイドをコードする、ETEC由来の外来遺伝子を収容するワクチンベクターとして使用できる。そのようなワクチンベクターは、i)病原性ETEC株のヒト消化管上皮への結合を排除する抗線毛抗体およびii)STの下痢効果を無効にする抗ST抗体を誘導する。その結果は単一用量の経口投与される生菌弱毒化ビブリオ・コレレベクター化ETECワクチンである。
ETECのヒトの腸内上皮への定着能力は定着因子抗原(CFAs)および推定の定着因子(PCFs)として知られている血清学的に異なる線毛により仲介されている。CFA/4線毛は、全ETEC臨床単離体の約1/4から1/3に同定される主要な定着因子である。グループ(CS6)の原型の一員の主要なサブユニットをコードする遺伝子が他(の研究者)によりクローン化され配列決定されている。
ETECは定着および2つの別々の毒素の産生により下痢を引き起こす。熱不安定性毒素(LT)は配列、構造、および生物活性においてコレラ毒素(CT)とほぼ同じである。従って、ペルー3誘導体によるCTの産生は両毒素を中和できる抗体を誘発するのに充分である。しかしながら、CTでの免疫処置は多くの臨床単離体、そのうちのいくつかはLTを産生しないことにより産生される非常に小さなポリペプチド(19のアミノ酸)であるETEC熱不安定性毒素(ST)からの保護を付与しない。従って、この毒素に対する抗体を誘発するためにコレラ/ETECワクチン候補における重要な要素は、ペルー3にST配列を包含することである。
AF/R1を発現するペルー3の最初の検査をウサギで行う。細菌をニュージーランドホワイトラビットに用量2×102 、2×104 、2×106 、2×108 で経口投与する。便の試料を採集し100μg/mlのストレプトマイシンを有するLB寒天プレートで培養し細菌の定着性および放出を数える。血液をワクチンの投与前、ならびに投与後7日、14日、21日、そして28日目に取る。血清を調製し、マイクロタイタープレートに結合した精製されたAF/R1を用いて酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)によりAF/R1タンパク質に特異的な抗体の存在、およびRDEC−1細菌を凝集する能力を分析する。
CS6およびSTオキソイド・A2を発現するペルー3株の最初の検査を上記のように行う。血清を調製し精製したCS6かまたはマイクロタイタ−プレ−トに結合したガングリオシドを用いて酵素結合抗体免疫吸着(ELISA)によりCS6またはSTオキソイド・A2キメラタンパク質に特異的な抗体の存在を分析する。抗CS6血清は補体を固定でき、CS6産生E.coliを溶菌できる抗体の存在についても分析できる。このアッセイにおいて、CS6を担持する細菌を血清およびモルモットの補体と混合し、LBブロスを加え、細菌をLB寒天に塗布する。殺菌作用の結果、回収される生存菌数の減少を生じる。最後に幼児マウス毒性アッセイにおいて抗STオキソイド・A2血清をST活性を中和できる抗体について検査する。
上記の方法と類似のアプローチを用いてヒト免疫不全ウイルス(HIV)の抗原を発現するビブリオ・コレレワクチン株を構築する。
経口HIV−1予防ワクチンとしてビブリオ・コレレ組み換え体ペルー101の免疫原性を検査するために、成熟した(おとなの)雌アカゲザル[マカカ・マラッタ(Macaca mulatta)]6匹それぞれに重炭酸水30ml中に含まれる新たに調製した生菌2×106 CFUを与える。同じ年齢と性別群のさらに別の動物2匹に対照として同じ用量のペルー2を与える。予防接種の2日後、動物の便の試料を分析し、LBストレプトマイシンプレート上でのコロニー形成単位を測定することにより腸内のビブリオ・コレレの増殖を検出することが出来る。HIV−1およびCT−Bに特異的な、IgAとIgGを含む、膣、直腸、唾液および血清の抗体を予防接種後2週間毎に検査する。投入HIV−1抗原に特異的な宿主動物のT細胞増殖およびCTL応答も検査する。予防接種した動物の最初の免疫応答のレベルによるが、精製されたHIV−1抗原の経口による、または筋内および静脈注射による1回または数回の追加免疫を必要とすることがある。
ビブリオ・コレレ変異株ペルー1、ペルー2、バング1、バング2、バー1、バー2、ベンガル2、ベンガル3、ペルー14および上記の追加の変異体は生ワクチンとして用いられた場合、コレラおよび他の関連毒素産生疾患に対して免疫学的保護の供給源として有用である。他のそのような疾患には、コレラBサブユニットと免疫学的交差中和可能な毒素を産生する毒素原性E.coliおよび他の細菌により誘発される疾患が含まれるがこれらに限定されない。
これらワクチンの適切な用量および投与の決定は本質的にはHerringtonら(1988,J.Exper.Med.168:1487−1492)に記載されているように行う。一般的に、そのような用量は用量当たり105 から109 の間の生存している細菌であるが、これらの数値には限定されない。
ワクチンとして用いられる細菌は標準的ビブリオ・コレレ実験培地で増殖できる。細胞を採集し、次いで生存性を保存する製剤中で冷凍乾燥する(例えば、5mM CaCl2 および容積で10%重量のグリゼロールを含む減菌スキムミルクまたは食塩水)。
ワクチンの投与は2つのエンベロープまたはバイアル、すなわちひとつは凍結乾燥したワクチン株または株の組み合わせを含み、もうひとつは水および胃酸を中和するために充分な重炭酸ナトリウムかまたは代わりの緩衝液を含む(約2グラム)、内容物の組み合わせを必要とする。次に、ワクチンは被接種者により飲み込まれる。または、凍結乾燥したワクチンを耐酸性“腸溶被覆”で被覆される錠剤に組み込まれる。そのような形態のワクチンは、数日から数週間の間隔をおいて1以上(3まで)の用量で被接種者に投与される。“追加免疫”ワクチンとして使用される場合、ワクチンは同じように数日から数週間の間隔をおいて1以上(3まで)の用量を以前予防接種を受けた個人に投与される。2以上の株が投与されている場合、それらは共に、または個々の用量で7−28日間をおいて提供されてもよい。
改良された死菌経口コレラワクチンの調製は上記の株から行われる。現在入手できる実験コレラワクチンは精製されたコレラ毒素Bサブユニットと混合されたホルマリンおよび熱で死滅したビブリオ・コレレ約1011個から成る(Blackら、Infect.Immun.55:1116,1987)。このワクチンの細菌成分の調製に用いられる4つの株は被接種者に投与される前に完全に不活性化されなければならない活性コレラ毒素を産生する。上記の新規株は下記のそれぞれの理由によりBlackら(上記)のワクチンと比較して著しく改良されているワクチンを提供する。
改良された経口死菌コレラワクチンは下記のように調製できる。好ましくはオガワ血清型(例えば、バー3)からイナバ血清型(例えば、ペルー3、ペルー14またはバング3)までから選択される最小限2つの株およびベンガル血清型(例えば、ベンガル2またはベンガル3)を別々の培養で増殖する。当業者は、37℃で細胞増殖を最大にするために条件、培地等の調製の仕方を知っている。例えば、CYE(Mekalanosら、1977,Infect.Immun.16:789)またはグルコ−ス、すなわちAGM4(van de Walleら、1990,Appl.Microbiol.Biotechnol.33:389)を含む最小培地のような培地中で高いレベルの通気下で増殖した培養物を用いる。細菌の増殖が飽和に達した時、全細胞を遠心により培地から回収し、一方上清フラクション内に含まれるタンパク質(Bサブユニットを含む)は超遠心によりまたは沈殿により得られる。細胞はBlackらの方法(Infect.Immun.55:1116,1987)を用いて、またはより緩和な方法(例えば、マイクロ波処理、アルファー、ベータ、またはガンマ線を用いる照射)、エタノールまたはアセトンのような有機溶媒での処理により不活性化でき、または細胞を界面活性剤での処理により、または例えば音波処理またはフレンチプレスの使用による機械的方法により溶菌してもよい。次いで不活性化した細胞を細菌のタンパク質(Bサブユニットを含む)を含む、濾過し濃縮した上清と混合し、混合物を経口投与に適切な製剤学的に許容できる溶液(例えば滅菌した食塩水また2%重炭酸ナトリウム)に懸濁する。
ワクチンは被接種者が2グラムの重炭酸ナトリウムを摂取した数分後に被接種者により飲み込まれる経口食塩水溶液として被接種者に投与される。または、調製物は凍結乾燥され、錠剤に圧縮され、続いて、被接種者への投与前に耐酸性“腸溶被覆”で被覆される。錠剤は、また、腸内の粘液性組織による調製物の摂取を促進するためにポリマーを用いてマイクロカプセルに封入することができる。
ワクチンの単一用量は約1011の細胞および約100−5000μgのコレラBサブユニットを含むべきである。被接種者は約2週間以上の間隔をおいて投与される約2つ以上の個別用量のワクチンを必要とすることが予想される。
特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下でビブリオ・コレレ株C6709−Sm、P27459−Sm、E7946−Sm、ベンガル2、ベンガル3、MO10、およびペルー14が米国メリ−ランド州ロックビル市のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、寄託物はATCC受託番号ATCC55331(C6709−Sm)、ATCC55333(P27459−Sm)、ATCC55332(E7946−Sm)、ATCC55436(0139、ベンガル2)、ATCC55437(0139、ベンガル3)およびATCC55438(0139、MO10)を与えられた。ペルー14は1993年6月30日にATCCに寄託された。
Claims (26)
- 毒素非産生性で遺伝学的に安定なビブリオ・コレレの変異株であって、機能的なctxAサブユニットをコードするDNAを欠き、更に機能的なattRS1配列を全く欠く、遺伝子操作された欠失変異体であるビブリオ・コレレの変異株。
- 機能的なctxAサブユニットをコードするDNAを欠き、さらに機能的なattRS1配列を全く欠く、遺伝学的に安定なビブリオ・コレレの変異株を作成する方法であって、
ctxA配列及びattRS1配列が変異されたビブリオ・コレレのDNAの断片を含むプラスミドを野生型ビブリオ・コレレに導入することを含み、前記DNAは前記ビブリオ・コレレ内において野生型ビブリオ・コレレDNAと組換えを起こし、その結果、前記変異株を生成することができる方法。 - 前記株がエルトール血清グループに属する親株に由来する、請求項1記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株がイナバまたはオガワ血清型に属する親株に由来する、請求項3記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株がペルー2,バング2、またはバー2である、請求項4記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株が非01血清グループに由来する、請求項1記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株がCTXコア配列を欠き、且つ、全ての前記attRS1配列を完全に欠失している、請求項1記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株が更に機能的recA遺伝子を欠失している、請求項1記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株が更にコレラ毒素のBサブユニットをコードする、請求項1、7または8記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株がさらに異種抗原をコードする、請求項1、7、または8記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記異種抗原が、シガ様毒素、シゲラリポ多糖抗原、E.coli線毛抗原、またはHIV抗原である請求項10記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記異種抗原をコードするDNA配列がビブリオ・コレレのlacZ遺伝子に挿入されている、請求項10記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株がペルー3、ペルー4、バング3、バー3またはバー4である、請求項9記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記ビブリオ・コレレ株がペルー2、バング2、またはバー2である、請求項2記載の方法。
- 前記変異株がCTXコア配列及び全てのattRS1配列を欠失している、請求項2記載の方法。
- 前記変異株がさらに機能的recA遺伝子を欠失している、請求項2記載の方法。
- 前記変異株がさらに異種抗原をコードする、請求項2記載の方法。
- さらに前記変異株のlacZ遺伝子へ、抗原をコードするDNAの断片を導入することを含む、請求項2記載の方法。
- 前記変異株がペルー5、バング5,またはバー5である、請求項18記載の方法。
- 死菌経口ワクチンであって、前記ワクチンは生理学的に許容される担体に懸濁された少なくとも第一及び第二のビブリオ・コレレ株を含み、各株は機能的ctxAサブユニットをコードするDNAを欠き、前記株のうち少なくとも2つは異なる血清型であり、前記ビブリオ・コレレは生育不能であり、前記ワクチンが更に前記ビブリオ・コレレ株の前記血清型の少なくとも一つにより過剰生産されるコレラ毒素Bサブユニットを含む死菌経口ワクチン。
- 前記血清型の一つがオガワ血清型であり、前記血清型の別の一つがイナバ血清型である、請求項20記載のワクチン。
- 前記ワクチンがバー3及びペルー3若しくはバング3のいずれか、またはペルー3およびバング3の両方を含む、請求項21記載のワクチン。
- 死菌ビブリオ・コレレワクチンを生成する方法であって、
死滅させた請求項20記載の少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株を提供する工程、
前記株の少なくとも1つによって生産されるコレラ毒素Bサブユニットを、前記死滅株に添加する工程、ここで前記毒素Bサブユニットは前記株を増殖させた培地から得られ、並びに
前記死滅させた株及び前記毒素Bサブユニットを生理学的に許容される担体に懸濁する工程
を含む方法。 - 生理学的に許容される担体中に請求項1記載の株を含むワクチン。
- 前記株がベンガル血清グループのものである、請求項6記載のビブリオ・コレレ株。
- 前記株がベンガル2またはベンガル3である、請求項6記載のビブリオ・コレレ株。
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