JP4086945B2 - 非毒性Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ株の単離法およびその株由来のコレラワクチンの製造法 - Google Patents
非毒性Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅ株の単離法およびその株由来のコレラワクチンの製造法 Download PDFInfo
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- Y10S435/909—Vibrio
Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、非毒素産生性V. cholera菌株の分離法、およびコレラワクチンの製造におけるその使用に関する。本発明は、特にインスティテュート・オブ・マイクロバイアル・テクノロジー(Institute of Microbial Technology) 、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＴＣＣ）であって、本出願人らのコンスティテュエント・ラボラトリー(constituent laboratory)に寄託されて、受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１０を有しており、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル・メリーランド州、米国にも寄託されて、受託番号ＡＴＣＣ２０２０１０を有するV. cholerae 株を用いるコレラワクチンの製造法にも関する。本発明の方法によって製造されたワクチンは、動物実験で有効であることが明らかになった。ヒトでの試験で有効であることが明らかになれば、有効かつ安全なコレラワクチンは未だに入手可能ではないので、これをコレラ疾患の制御に用いることができる。本発明は、とりわけ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株を親株として用いるコレラワクチン製造法に関する。
【０００２】
背景技術
コレラを制御／予防する目的で、様々なワクチンが開発されてきた。非経口投与される完全死菌ワクチンは発展途上国で未だに用いられているが、防御は約５０％に過ぎず、これはまた数か月間でしかない。［(i)Fellay J.C. and Gangarosa (1978) 、コレラおよび関連の下痢（Ouchterlony, O. & Holmgren J. 監修）、第４３回ノーベル・シンポジウム・ストックホルム、２０４〜２１０頁、Karger、バーゼル。(ii) Svennerholm, A.M., Helmgren, J., Hanson, L.A., Lindblad, B.A., Quereshi, F. and Rahimtoola, R.J. (1977) Scand J Immunol 6, 1345-1349。(iii)Svennerholm, A.M. Hanson, L.A., Holmgren J., Lindblad B.S., Nilsson, and Quereshi, F. (1980) Infect Immun 30, 427-430］。組換えＤＮＡ技術の出現後、コレラ毒素Ａサブユニットを欠いている経口用の弱毒生菌株Vibrio cholerae は、腸にコロニー形成することによって感染によって誘導される免疫を模倣し、抗菌および抗毒素免疫を刺激するので、魅力的な候補であることが明かになった。［(i)Kaper, J.B., Lockman, H., Baldini, M.M. and Levine, M.M. (1984) Nature 308 655-658 。(ii) Kaper, J.B., Lockman, H., Baldini, M.M. and Levine, M.M. (1984) Biotechnology 2, 345-349。(iii)Mekalanos, J.J., Swartz, S.J., Pearson, G.D.N., Harford, N., Groyne, F. and M. de Wilde (1983) Nature 306, 551-557 ］。しかし、これまでに開発されたこれらの弱毒化したVibrio cholerae O1ワクチン菌株はいずれも、ボランティアで試験すると軽〜中度の下痢を起こすものであった。［(i) Levine, M.M., Kaper, J.B., Herrington, D.A., Losonsky, G., Morris, J.G., Clements, M.L., Black, R.E., Tall, B. and Hall, R. (1988) Infect Immun 56, 161-167 。(ii) Herrington, D., Hall, R., Losonsky, G., Mekalanos, J.J., Taylor, R.K. and Levine, M.M. (1988) J Exp Med 168, 1487-1492］。続いて、V. cholerae の毒性の強い菌株は、コレラ毒素に加えて他の毒素に対する遺伝子を有することが明かになった。更に、ｃｔｘＡＢ遺伝子は、実際にｃｔｘに加えて４種類の他の毒力遺伝子(virulence genes) 、すなわちｚｏｔ、ａｃｅ、ｃｅｐおよびｏｒｆＵをコードする毒力カセット(virulence cassette)の一部であることも明かになった。これらの因子総てをコードする遺伝子は可動性遺伝因子に属する。この要素の中で、総ての上記遺伝子はコア要素として知られているものに隣接配列として含まれている。このコア要素には、その両側にＲＳ１要素と呼ばれる２．７ｋｂ反復配列が隣接している。このＲＳ１要素は、毒素カセットのリコンビナーゼＡとは独立した組込み、重複、および増幅に関与する部位特異的組換え系をコードする。従って、次にこれら総ての既知の毒力遺伝子ｃｔｘＡ、ｚｏｔ、ａｃｅなどを欠いたワクチン菌株の作成を試みた。［Michalski, J., Galen, J.E., Fasano, A., and Kaper, J.B. (1993) Infect Immun 61, 4462-4468 ］。しかしながら、これらの菌株を試験したときに、ｚｏｔ、ace などを欠いていない他のプロトタイプワクチンと同様に反応原性であることが判明した。［Tacket, C.O., Losonsky, G., Nataro, J.P., Cryz, S.J., Edelman, R., Fasano, A., Michalski, J., Kaper, J.B. and Levine, M.M. (1993) J Infect Dis 168, 1536-1540 ］。
【０００３】
最近、本出願人らは、コレラワクチンに関する２つの南アフリカ国特許第９３／４７３６号および９５／００８２号明細書を見出だした。しかしながら、この南アフリカ国特許明細書に記載されている出発菌株は
1. Peru-2
2. Bang-2
3. Bah-2
4. Bengal-2
である。
【０００４】
菌株１〜３は、Taylor et al (1994) J. Infect Diseases 170, 1518-23 に記載されている。これらは天然の分離菌ではなく、ｃｔｘを製造する目的で遺伝子工学処理を施した菌株である。南アフリカ国特許明細書には、これらから軟寒天浸透力を欠いた突然変異株の開発が記載されている。
【０００５】
菌株４は、Waldor & Mekalanos (1994) J. Infect. Diseases, 170, 278 に記載されている。Bengal-2は遺伝子工学処理を施した構築物であり、V. cholerae 由来の天然のｃｔｘではない。Ｍ０２０はV. cholerae 0139株である。南アフリカ国特許明細書には、この菌株由来の軟寒天浸透力を欠いた突然変異株の開発が記載されている。
【０００６】
一方、本発明の出発菌株は、天然に存在するｃｔｘ ａｃｅ ｚｏｔ株である。これを処理してワクチン菌株を作成し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１ パークローン・ドライブ、ロックビル・メリーランド州２０８５２、米国に寄託されており、受託番号ＡＴＣＣ２０２０１１を受けており、これはコレラ毒素の免疫原性「Ｂ」サブユニットだけを産生する。
【０００７】
このような「欠失」法によって開発された様々なワクチンの候補によって提供された防御は良好であったが、これらの主要な欠点は、それら総てが軽度〜中度の下痢を引き起こす可能性があることであった。これらの初期のワクチン候補の反応原性は、かなりの程度まで親菌株に含まれる未知の因子によるものと思われた。安全（すなわち、非反応原性）でありかつ防御性の高い理想的なコレラワクチンの開発におけるこの問題を回避するには、代替法は、生物学的分析法で非毒素産生性でありかつ総ての既知の毒力遺伝子を欠いている菌株からワクチンを開発することであろう。
【０００８】
【発明の概要】
従って、本発明の主要な目的は、コレラワクチンの製造法を提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae の非毒素産生性株を用いてコレラワクチンの製造法を提供することである。
【００１０】
更にもう一つの本発明の目的は、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するコレラワクチンであって、免疫原性ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する非毒素産生性V. cholerae 株の染色体に組込むことによって構築されたものの製造に関する。
【００１１】
従って、本発明では、ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae の菌株の分離法、およびコレラの予防に用いられるコレラワクチンの製造法であって、
a. V. cholerae に特異的な選択培地上にコレラ患者の糞便を塗布することによって、この糞便からからV. cholerae を分離し、
b. 段階(a) の方法で分離した菌株V. cholerae の個体群から非毒素産生性株V. cholerae を分離し（この株はインスティテュート・オブ・マイクロバイアル・テクノロジー(Institute of Microbial Technology) （ＩＭＴ）、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＴＣＣ）であって、本出願人らのコンスティテュエント・ラボラトリー(constituent laboratory)に寄託されて、受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１０を有する）、
c. 免疫原性コレラ毒素（ｃｔｘ）Ｂサブユニット遺伝子を受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）の菌株の染色体に通常の方法によって組込み、ワクチンを産生させる
ことを含んでなる、方法が提供される。
【００１２】
【発明の具体的な説明】
本明細書で用いる様々な科学用語を、下記のようにアルファベット順に説明する。
【００１３】
アニーリングは、相補性塩基配列を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一本鎖が対になって二本鎖分子を形成することを表す。
【００１４】
クローンは、単一の祖先細胞またはプラスミド分子から誘導される多数の細胞またはプラスミド分子を表し、コロニーは、単一親細胞の反復分裂によって固体増殖培地で形成された目に見える細胞のクラスターを表す。
【００１５】
組換えＤＮＡ技術におけるクローニングは、特異的遺伝子またはＤＮＡ断片のプラスミドまたはファージＤＮＡのような複製可能なＤＮＡ分子への連結を表す。
【００１６】
コロニーは、単一親細胞の反復分裂によって固体増殖培地に形成された目に見える細胞のクラスターを表す。
コロニー形成は、細菌が特定の部位に止まり、増殖する能力を表す。
【００１７】
変性は、ＤＮＡの二本鎖分子から一本鎖への転換を表す。
【００１８】
ＤＮＡは、共有結合したデオキシヌクレオチド単位から形成される高分子であるデオキシリボ核酸を表す。
【００１９】
ＤＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合によって２個のＤＮＡ分子を結合する酵素である。
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型鎖の指導下でデオキシヌクレオチドからＤＮＡの合成を触媒する酵素である。
【００２１】
ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドの順序の決定を表す。
【００２２】
電解質は、負荷した電場に応答して固体支持体中で（分子の大きさの差による）分子の異なる移動速度に基づいて分子を分離するのに用いられる技術である。
【００２３】
電気穿孔は、電場による細胞中へのＤＮＡ分子の導入を表す。
【００２４】
エンテロトキシンは、腸粘膜上で特異的に作用する細菌によって分泌されるタンパク質毒素を表す。
【００２５】
遺伝子は、リボ核酸（ＲＮＡ）に転写される遺伝情報を含む遺伝単位を表し、これが加工されかつ直接機能し、またはポリペプチド鎖に翻訳される。ゲノムは、細胞によって運ばれる遺伝情報の総量を表す。相同組換えは、同一ＤＮＡ配列間での遺伝子交換を表す。
【００２６】
ハイブリダイゼーションは、２個の相補性核酸鎖がアニーリング期中に二重螺旋を構成する工程であって、特異的ヌクレオチド配列を検出するための強力な手法を表す。
【００２７】
免疫は、疾患を引き起こす薬剤に対する生物の抵抗力を表す。
【００２８】
免疫原は、免疫応答を誘導する抗原である。
【００２９】
オリゴヌクレオチドは、短い一本鎖核酸を表す。
【００３０】
オペロンは、単一プロモーターから単一メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に転写される隣接遺伝子の群を表す。
【００３１】
プラスミドは、宿主染色体の独立体(independant) を複製する染色体外遺伝要素であり、クローニングベクターとして用いられる。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、複数の重合サイクルのそれぞれの後に短時間加熱処理を行い、相補性鎖を分離することによってＤＮＡの特異領域を増幅する手法である。
【００３３】
プライマーは、長いＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションし、例えばポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡポリメラーゼによって伸張することができるオリゴヌクレオチドを表す。
【００３４】
プローブは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション分析に用いる放射性ＤＮＡ分子を表す。
【００３５】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する特異的ＤＮＡ配列を表す。
【００３６】
タンパク質は、特異配列におけるペプチド結合によって互いに連結したアミノ酸の線状ポリマーを表す。
【００３７】
組換えＤＮＡ技術は、異なるＤＮＡ分子からのＤＮＡセグメントを結合することによって新たなＤＮＡ分子を生成させるための手続きを表す。
【００３８】
組換えは、染色体またはＤＮＡ分子を分裂させた後、新たな組み合わせで再結合させる工程である。
【００３９】
制限酵素は、ＤＮＡ分子の短いヌクレオチド配列（制限部位）を認識し、その部位における分子を開裂するヌクレアーゼである。
【００４０】
リボソーム結合部位またはシャイン・ダルガルノ配列は、リボソームが結合してタンパク質合成を開始する原核ｍＲＮＡ分子の塩基配列である。
【００４１】
選択は、抗生物質に対する耐性の選択の方法と同様に、所望なタイプの細胞だけが生き残ることができる方法で設計した手続きを表す。
【００４２】
サザンハイブリダイゼーションは、核酸の電気泳動による分離の後に、変性ＤＮＡをゲルから膜フィルターへ移し、次いで再結合の条件下で放射性ＤＮＡプローブに暴露する工程である。放射性領域は、プローブと相同のＤＮＡセグメントに位置している。
【００４３】
開始コドンは、ｍＲＮＡ上のトリプレット配列ＡＵＧであって、ここからポリペプチド鎖への翻訳が開始するものを表す。
【００４４】
付着末端は、同じ分子の他端のまたは異なる分子の末端の一本鎖領域に相補性である二本鎖ＤＮＡ分子の末端の一本鎖領域を表す。
【００４５】
停止コドンは、ポリペプチド合成が停止する３種類のｍＲＮＡコドンＵＧＧ、ＵＡＡ、ＵＧＡの一つを表す。
【００４６】
サブユニットは、数本のポリペプチド鎖を含むタンパク質の一部であるポリペプチド鎖を表す。
【００４７】
自殺ベクターは、複製に必要な成分を提供しない宿主細胞で複製できないプラスミドベクターを表す。
【００４８】
タンデム重複は、同じ方向での隣接配列の染色体上でのＤＮＡセグメントの反復を表す。
【００４９】
鋳型は、塩基配列がポリメラーゼ連鎖反応でコピーされる核酸鎖である。
【００５０】
転写は、ＤＮＡのコード鎖に含まれる情報を相補性塩基配列の一本鎖ＤＮＡ分子にコピーする工程を表す。
【００５１】
転写アクチベーターは、ＤＮＡの特定部位に結合することによって転写を刺激する正の制御要素である。
【００５２】
転写ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるＲＮＡ転写体の末端に表されるＤＮＡの配列である。
【００５３】
転写開始部位は、ここからＤＮＡがＲＮＡ分子に転写される塩基である。
【００５４】
形質転換は、細菌細胞へのＤＮＡの導入を表す。
【００５５】
翻訳は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、リボソームと関連したｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列から誘導される工程を表す。
【００５６】
ベクターは、ＤＮＡセグメントを一つの生物からもう一つの生物へ運ぶことができるプラスミドクローニングビヒクルを表す。
【００５７】
コレラは、グラム陰性細菌Vibrio cholerae (V. cholerae) によって引き起こされる致命的な下痢性疾患である。数百万の人々の生命を奪ってきたこの疾患は、毎年約５０万人が罹患する主要な世界的な健康問題であり続けている。今日では、コレラに冒されていない世界の国はほとんどなく、世界保険機構（ＷＨＯ）によれば、輸入だけによるコレラの症例が報告されているヨーロッパでさえも、１９９４年には固有のコレラの症例が３０倍に増加したこと登録されている。
【００５８】
コレラで見られる激しい下痢は、コレラ毒素と呼ばれる細胞外エンテロトキシンに対する宿主の反応の結果である。コレラ毒素は、２種類の異なるタンパク質サブユニットからなり、ｃｔｘ ＡＢ（またはｃｔｘオペロン）と呼ばれる単一オペロンを形成する遺伝子ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢによってコードされる。単一のＡサブユニットと５個のＢサブユニットが、完全な毒素分子を構成している。腸上皮細胞の水および電解質バランスの微妙な制御を混乱させることによる粒体の損失に関与するのは、コレラ毒素である。Ｂサブユニットが宿主腸膜に結合して、触媒的なＡサブユニットが宿主の粘膜細胞に侵入するのを助けるものと思われる。Ｂサブユニットは、免疫原性でもあり、宿主の抗毒素免疫を誘導することができる。
【００５９】
本発明の主要な知見は、コレラ毒素の免疫原性Ｂサブユニット遺伝子を溶血素Ａ遺伝子（ｈｌｙＡ）における標的遺伝子組換えによりV. cholerae の非毒素産生性菌株の染色体に組込み、ｈｌｙＡを分断することである。
【００６０】
本発明は、非毒素産生性であり、既知の毒力遺伝子を欠き、良好なコロナイザー(colonizer) である血清型Ｏ１のV. cholerae の菌株から誘導される。この菌株はコレラ患者から回収された臨床的分離物であり、Ｏ１血清群、イナバ血清型のVibrio cholerae として同定され、エルトール生物型に属する。この菌株を、コレラ毒素、閉鎖帯毒素、副コレラエンテロトキシンなどの毒力関連因子に特異的なＤＮＡプローブの群を用いてV. cholerae の数百種類の菌株をスクリーニングした後に選択される。この菌株は、通常は毒素産生性株の４．５ｋｂ領域に位置した毒力パッケージを持たないので、コレラ毒素、または流体蓄積を悪化させることが報告されている他の既知の二次的毒素を産生しない。しかしながら、この菌株はエルトール溶血素Ａ遺伝子を有しており、免疫原性ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を組込みこれをコレラ毒素のＢサブユニットのプロデューサーとするのに好適な染色体上の標的である。この菌株は、腸でのこの菌株のコロニー形成に必要な毒素コレギュレーテドパイラスＡ(toxin coregulated pilus A) （ｔｃｐＡ）およびｃｔｘＢサブユニット遺伝子の発現の促進に必要なｔｏｘＲも有している。経口用組換えワクチンを開発するための出発菌株としてＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０を有する菌株を選択するのは、下記の理由によるものである。
1. 受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する菌株は、結紮回腸ループウサギモデルで流体を蓄積することができず、この菌株は分泌原性因子(secretogenic factors)を全く産生しないことを示している。
2. この菌株は、ＲＩＴＡＲＤモデルによって検討したところ、ウサギに悪影響を全く与えない、すなわちこの菌株は反応原性(reactogenic) ではない。
3. この菌株は、非反応原性であるにもかかわらず、ウサギモデルで著しいコロニー形成能を示し、これはVibrio cholerae のコロニー形成を助長する重要な因子である毒素共制御繊毛（coregulated pilns）が存在することによるものと思われ、この存在はサザンハイブリダイゼーションによる研究によって直接決定された。ｃｔｘＢ遺伝子がそれ自身のプロモーターおよびそれ自身のシャイン・ダルガルノ配列と共にこの菌株の染色体に導入されると、これにより消化管でこの遺伝子の発現が最適になることが判った。このようにして作製された組換えV. cholerae クローンは、動物モデルの検討において有効なワクチンとして現れることも判っている。
【００６１】
本発明の詳細な手続きを下記に示す。
ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親 V. cholerae の分離
コレラ患者の糞便標本を、無菌カテーテルで無菌マッカートニーボトルに採取した。採取後まもなく、糞便標本を実験室に輸送し、２時間以内にV. cholerae 、およびエンテロトキシン原性E. coli （ＥＴＥＣ）、Shigella、SalmonellaおよびCampylobacter spp.のような他の普通に見られる腸病原菌について標準的な公表された手法（下痢性疾患の制御のためのＷ．Ｈ．Ｏ．プログラム(W.H.O. Program for control of diarrhoeal diseases)（ＣＣＤ／８３．３改版１）、急性腸感染症の実験室での検討のためのマニュアル(Manual for laboratory investigations of acute enteric infections)、ジュネーブ、Ｗ．Ｈ．Ｏ．、１９８７年）によって検討した。
【００６２】
糞便標本からのV. cholerae 菌株を、V. cholerae に特異的なチオ硫酸塩−クエン酸胆汁塩スクロース寒天（ＴＣＢＳ）、亜テルル酸塩タウロコール酸塩ゼラチン寒天（ＴＴＧＡ）、ビブリオ寒天、スクロース亜テルル酸塩ティーポール培地、およびポリミキシンマンノース亜テルル酸塩寒天のような選択的培地上で糞便標本を培養することによって分離した。コロニーとして成長したV. cholerae 菌株を手動で集めた。このようにして得られた数百種類の菌株を、生化学試験によるV. cholerae の同定に特異的な培地で成育した。V. cholerae O1（血清型）であることが明かとなった数百種類の菌株を、ルリアブロス寒天上で個々のコロニーとして成育し、毒素遺伝子ｃｔｘ、ｚｏｔおよびａｃｅに特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることによってスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼーション実験は既知の方法で行った。毒素遺伝子ｖｉｚ、ｃｔｘ、ｚｏｔ、ａｃｅを欠いていることが判った菌株を、既知の方法によってコレラ毒素様および他の細胞毒素活性について試験した(Oku Y., Uesaka Y., Hirayama T., Takeda Y., Microbial Immunol., 1988, 32, 807-816 およびNair G.B., Oku Y., Takeda Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54, 3180-3182)。
【００６３】
これらの菌株の一つは毒素遺伝子を持たず、コレラ毒素様および他の細胞毒素活性を持たなかった。このV. cholerae は、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）の菌株である。この菌株では、潜在的溶血素Ａ遺伝子の存在をｈｌｙＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによって確かめた。コレラワクチンの製造のためのｃｔｘサブユニット遺伝子の組込みはｈｌｙＡ座における標的組換えによって行わなければならないので、これは本質的なことである。ｔｃｐＡ遺伝子の生成物は、腸におけるVibrio cholerae の効果的なコロニー形成に要する線毛の主成分であるので、その存在は、ｔｃｐＡプローブによるハイブリダイゼーションによっても確かめた。更に、ｃｔｘプロモーターの制御下での遺伝子の最適発現には転写活性化因子ＴｏｘＲが必要であるので、ｔｏｘＲ遺伝子の存在はｔｏｘＲプローブによるハイブリダイゼーションによって確かめた。
【００６４】
V. cholerae 株Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）は、De S.N., Nature 183, 1533-1534 (1949) およびFormal et al., Br. J. Exp. Pathol., 42, 504-510 (1961)に記載の結紮回腸ループ分析法で試験した。この菌株は結紮回腸ループウサギモデルで流体を蓄積することができず、この菌株は分泌原性因子を全く産生しないことを示している。
【００６５】
この菌株は、通常の方法の後にＲＩＴＡＲＤモデルによって検討したところ、ウサギに悪影響を全く与えない、すなわちこの菌株は反応原性ではない。この菌株は非反応原性ではあるが、通常の方法によって測定したところ顕著なコロニー形成能を示し、これは菌株にとって有効なワクチンとして機能することが必要とされている。
【００６６】
受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株は３０〜３７℃の温度でルリカ培地で成育させ、−８０℃〜−６０℃で２０％（容量／容量）グリセロールを加えた同じ培地に保管することができる。
【００６７】
ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae の親株を用いてワクチンの製造を促進するには、ｈｌｙＡ遺伝子配列が隣接したｃｔｘサブユニット遺伝子を構築する一連の遺伝子操作を行わなければならない。これらの段階を下記に示す。
(i) それ自身のＳＤ配列とｃｔｘ−オペロンのプロモーターとを用いて最初にV. cholerae 569B株（ナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージス(National Institure of Cholera and Enteric Diseases)）の染色体由来のコレラ毒素（ｃｔｘ）オペロンをクローニングした後、逆ＰＣＲによってクローニングしたオペロンからｃｔｘＡサブユニット遺伝子を欠失させることによるｃｔｘＢサブユニット遺伝子の構築物の作成。
(ii) 標的組換えを目的とした標的座溶血素Ａ遺伝子（ｈｌｙＡ）のクローニング。
(iii) 段階(i) で得られるようなｃｔｘＢサブユニット遺伝子構築物によるｈｌｙＡ遺伝子配列の分断。
(iv) ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有する分断ｈｌｙＡ構築物の自殺プラスミドベクターへのクローニング。
(v) 分断されたｈｌｙＡ構築物を有する自殺ベクターを連結によって（段階(ii)で得た）親株に移動させてｈｌｙＡ遺伝子におけるｃｔｘＢ遺伝子構築物の標的組込み。
(vi) 組込まれたｃｔｘＢ遺伝子を有する組換えV. cholerae クローンのハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応による同定。
【００６８】
これらの操作の第一段階は、既知のVibrio cholerae のｃｔｘオペロンをクローニングすることであった。既知のVibrio cholerae O1株569Bのｃｔｘオペロンを、ポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムから増幅した後、クローニングした。ポリメラーゼ連鎖反応では、Vibrio cholerae 569B染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ｃｔｘオペロンをプライマーＣＴ１およびＣＴ２で増幅する。オリゴヌクレオチドＣＴ１（５′ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ３′）は、ｃｔｘオペロンの転写開始部位の１４９〜１７２ヌクレオチド上流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。オリゴヌクレオチドＣＴ２（５′ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴＣ ３′）は、ｃｔｘの停止コドンの４３〜６７ヌクレオチド下流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。これらの２個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡ配列を増幅するときには、生成物は、プロモーターおよび５′末端の上流ＴｏｘＲ結合反復と一緒にコレラ毒素ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子、およびオペロンの３′末端の転写終結シグナルからなる完全ｃｔｘオペロンである。ポリメラーゼ連鎖反応では、初期変性段階に続いて、反応を変性段階、アニーリング段階および伸張段階で約３０回循環させた。最後のサイクルの終りに、追加の伸張段階を加えた。ポリメラーゼ連鎖反応の後に、反応混合物を等容のフェノール：クロロホルムの５０：５０混合物で抽出した。水相をSephadex G50スパン・カラム(spun column) を通過させて遊離ヌクレオチドを除去し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを再懸濁させた後、これをｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理した。これにより、５′ＴＴ−ジヌクレオチドオーバーハングを有する増幅ＤＮＡ生成物を得た。上記のようにして改質した増幅ＤＮＡをクローニングするため、プラスミドベクターｐＢＳ＋を、最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、これをｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理した。この処理により、線状化したｐＢＳ＋ベクターＤＮＡの両端の５′ＡＡオーバーハングを得た。このベクターＤＮＡ調製物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに１：２のモル比で連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成する組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘオペロン上の部位が知られている制限酵素（例えば、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ）によって分析した。ｐＧＴ１と呼ばれる一つのクローンのインサートは、制限分析およびシークエンス法によって確かめたところ、完全ｃｔｘオペロンを有している。ヌクレオチド配列を決定して、ポリメラーゼ連鎖反応中に導入されるエラーの可能性を排除した。このプラスミドクローンｐＧＴ１を、次の段階で用いた。これは、プロモーターおよび５′末端の上流ＴｏｘＲ結合反復と一緒にコレラ毒素ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子、およびオペロンの３′末端の転写終結シグナルからなる完全ｃｔｘオペロンを有する。
【００６９】
次の段階では、プラスミドクローンｐＧＴ１からの完全ｃｔｘ−Ａコード配列を互いに異なりかつｃｔｘ−Ａ遺伝子を除くプラスミドを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆ポリメラーゼ連鎖反応によって欠失を行った。逆ポリメラーゼ連鎖反応は、リン酸化オリゴヌクレオチドＣＴ３およびＣＴ４をプライマーとして、プラスミドｐＧＴ１を鋳型ＤＮＡとして用いて行った。生成する増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。次いで、これをｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＣＴ３に相当する末端に５′ＧＧ−オーバハングを、ＣＴ４に相当する末端に５′ＣＣ−オーバーハングを生成した。互いに相補性の上記ジヌクレオチドオーバハングを有する末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結生成物を用いて、E. coli Sure株を電気穿孔によって形質転換した。逆ポリメラーゼ連鎖反応生成物の再環状化によって、ｃｔｘプロモーターとｃｔｘＢサブユニット遺伝子が融合した。この構築物ｃｔｘプロモーター−Ｂは上記で説明したようにＣＴ１およびＣＴ２をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応によって様々なプラスミドクローンで同定され、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物に相当する０．６３キロベース断片を生成する。このｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物において、ｃｔｘＢサブユニット遺伝子はｃｔｘオペロンプロモーターによって制御され、その翻訳はそれ自身のＳＤ配列で開始される。様々なクローンからのＢサブユニットの発現は、ビーズＥＬＩＺＡ分析法によって確認した。一つのプラスミドクローンｐＧＴ３．１のｃｔｘ−プロモーター−Ｂ構築物のヌクレオチド配列を決定して、プロモーター−Ｂサブユニット遺伝子融合点の配列を分析した。ｐＧＴ３．１からのｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を後の段階で用いて、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子を分断した。
【００７０】
ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株にｈｌｙＡ遺伝子での標的組換えによって導入されることが決定されたので、構築物を作成してクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列をｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断するのが重要であった。このためには、V. cholerae の遺伝子をクローニングすることが必要であった。５′隣接領域および３′側のコード領域の大部分を欠いている部分ｈｌｙＡ遺伝子配列を、Vibrio cholerae ゲノムからのその増幅の後にクローニングした。ｈｌｙＡ遺伝子の完全コード領域の大きさは約２．２キロベースであり、そのｈｌｙＡ遺伝子の１．７キロベースを０１血清型菌株のV. cholerae のゲノムＤＮＡから増幅した。初期変性段階の後の適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応では、反応を変性段階、アニーリング段階および伸張段階を通って反復した。最後のサイクルの終りに、追加の伸張段階を加えた。ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、１．７キロベースＤＮＡ断片の存在についてアガロースゲル電気穿孔によって分析した。反応生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。精製ＤＮＡをｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、末端に５′ＴＴ−オーバーハングを生成させた。上記のように改質した末端を有する増幅ｈｌｙＡ遺伝子をクローニングするため、プラスミドベクターｐＵＣ９を最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、これをｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、両端に５′ＡＡオーバーハングを生成した。このベクターＤＮＡ調製物をＴ４ ＤＮＡリガーゼによって５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成するプラスミドクローンを、制限酵素エンドヌクレアーゼで消化することによって分析した。１．７キロベースのｈｌｙＡインサートを有するプラスミドクローンの一つｐＧＴ８９を次の段階で用いて、ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物によってｈｌｙＡ配列を分断した。
【００７１】
次の段階では、ｐＧＴ３．１のｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をオリゴヌクレオチドプライマーＣＴ１およびＣＴ２を用いて増幅した。増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、エタノール沈澱を行った。精製ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物断片を、ｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、両端に５′ＴＴ−オーバハングを生成した。５′ＴＴ−オーバハングを有するｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を、０．４キロベースＨｐａＩ断片の代わりにクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央に挿入した。プラスミドベクターｐＵＣ９はＨｐａＩ酵素の部位を有していないので、ｐＧＴ８９をＨｐａＩで消化すると、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央からの０．４キロベースの断片と３．９キロベースの断片を生じる。ｐＧＴ８９をＨｐａＩ酵素で消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。３．９キロベースのＨｐａＩ断片を電気溶出して精製した。次に、これをｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって処理して、両端に５′ＡＡ−オーバーハングを生成した。５′ＡＡ−オーバーハングを有する３．９キロベース断片を、５′ＴＴ−オーバーハングを有するｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物にＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結混合物を用いて、E. coli 「Sure」株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩ酵素で消化すると、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断されたｈｌｙＡ遺伝子配列の１．９キロベースインサートが得られた。一つの組換えプラスミドｐＧＴ３９からのＥｃｏＲＩインサートを用いて、これを自殺ベクターｐＧＰ７０４にクローニングした(Miller V.L. and J.J. Mekalanos (1988) J. Bac., 170, 2575-2583) 。
【００７２】
次の段階では、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を隣接ｈｌｙＡ配列と共に、プラスミド自殺ベクターにクローニングした。プラスミド自殺ｐＧＰ７０４をＥｃｏＲＩ酵素で消化し、線状化したベクターの５′リン酸基を子牛腸ホスファターゼで処理することによって除去した。ＥｃｏＲＩで消化して脱リン酸化したｐＧＰ７０４を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、相当するＤＮＡバンドを電気溶出して、精製した。これは、ベクターＤＮＡ調製物中に微量の未消化ベクターＤＮＡも存在しないようにする目的で行った。次に、これをＴ４ ＤＮＡリガーゼによってｐＧＴ３９の１．９キロベースＥｃｏＲＩインサートに１：５のモル比で連結し、この連結混合物を用いてE. coli SM10 pir株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンは、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩで消化したところ、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって分断されたクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列を表す１．９キロベースのインサートを得た。クローンｐＧＴ２７の一つを用いて、ｈｌｙＡ遺伝子での組込みのため受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株に移動した。
【００７３】
次の段階では、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とプラスミドｐＧＴ２７を含むE. coli SM10 pir株との接合によって、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae O1株へのｐＧＴ２７の移動を行った。E. coli 宿主株SM10 pir中のプラスミドクローンｐＧＴ２７と受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とは、振盪せずに対数中央増殖相(midlog phase)まではＬＢで成育した。少量のドナー株、すなわちｐＧＴ２７を有するSM10 pir株と等量のレシピエント株、すなわち受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株を１．５ｍｌ微量遠沈管中で混合し、短時間遠心分離を行い、底部に細胞を集めた。上清を除去した後、ルリアブロスを細胞ペレットに加え、細胞をピペットで吸い込みおよび吐き出しを行うことによってブロスに懸濁した。次に、細胞懸濁液をＬＢ寒天培地の表面に置いた０．４ｍｍメンブランディスク上にスポットした。懸濁液は、直ぐにメンブランに吸収された。メンブラン上のドナーおよびレシピエント細胞を、３７℃で約４〜９時間一緒に合わせたままにした。次に、メンブランフィルターを試験管に集め、ルリアブロス１ｍｌを加えた。メンブラン上の細胞を、短時間混合することによって培地に再懸濁した。このようにして得た懸濁液を、ストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌと適当な濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、ゲノム中に組込まれたプラスミドｐＧＴ２７を有する受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する組換え体V. cholerae だけを選択した。（アンピシリン耐性は、自殺プラスミドベクターによって付与される。）受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親V. cholerae のアンピシリンに対する感受性をチェックしたところ、５μｇ／ｍｌ程度の低濃度のアンピシリンでもＬＢ寒天培地上でのその成育を完全に阻止することができることを見出だした。従って、ｐＧＴ２７を組込んだ組換えクローンの選択は、ストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌと１０〜１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で行った。
【００７４】
組換えV. cholerae クローンはコロニーハイブリダイゼーションによって同定した後、上記プレート上に現れるコロニーをｃｔｘ Ｂ遺伝子をプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションによって分析した。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するレシピエントV. cholerae はｃｔｘオペロンを有しておらず、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物はｐＧＴ２７を介して導入されるので、ｐＧＴ２７を組込んだ組換えV. cholerae クローンだけがｃｔｘ Ｂ遺伝子プローブとハイブリダイゼーションを行うと予想された。総てのアンピシリン耐性コロニーはｃｔｘ Ｂプローブにハイブリダイゼーションした。数種類のコロニーから、染色体ＤＮＡを分離して、ｈｌｙ Ａ特異的プライマーＨＡ１およびＨＡ２との別のポリメラーゼ連鎖反応における鋳型ＤＮＡとして用いた。これらの２種類のプライマーは、野生型ｈｌｙＡ遺伝子からの１．７キロベースの配列と、ｈｌｙＡ遺伝子配列がｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって分断されているｐＧＴ２７からの１．９キロベースの配列を画定する。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるときには、これらのプライマーは１．７キロベースの配列だけを増幅し、組換えV. cholerae の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるときには、これらのプライマーは１．７キロベース断片の他に１．９キロベース断片も増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応によって試験した総てのクローンでは、上記断片はプライマーＨＡ１およびＨＡ２によって増幅された。これらのクローンからのｃｔｘＢサブユニットの発現は、「高感受性ビーズ−酵素結合イムノソーベントアッセイによるコレラ毒素の検出(Detection of cholera toxin by a highly sensitive bead-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)」、Yoshihiko Uesaka, Yoko Otsuka, Miksuaki Ka hida, Yuichi Oku, Kazuki Horigome, G. Balakrish Nair, S.C. Pal, Shinji Yamasaki and Yoshifumi Takeda, Microbiol. Immunology, Vol. 36(1), 43-53, (1992) の文献に記載の方法によってビーズ−ＥＬＩＺＡによって分析した。
【００７５】
ゲノムサザンハイブリダイゼーションを行うため、組換えV. cholerae クローンから分離したゲノムＤＮＡをそれぞれＸｂａＩ、ＳａｌＩおよびＨｐａＩで消化した。個々の制限消化のＤＮＡ断片をアガロースゲル上で電気泳動によって分離し、サザントランスファーによってナイロンメンブラン上に移して、固定した。固定したＤＮＡを、別個の実験でｃｔｘ Ｂプローブおよびｈｌｙ Ａプローブを用いてハイブリダイゼーションした。ゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果を分析したところ、ｐＧＴ２７は実際に受託番号Ｂ００１０を有するV. cholerae のｈｌｙＡ遺伝子に組込まれていることが明かとなった。ｐＧＴ２７は数個の組換えクローンにおいてタンデムに反復していることも明かとなった。クローンの一つをワクチン株として選択して、動物モデルで試験した。このコレラワクチン株は、インスティテュート・オブ・マイクロバイアル・テクノロジー(Institute of Microbial Technology) 、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション、本出願人らのコンスティテュエント・ラボラトリー(constituent laboratory)に寄託されて、受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を得ている。この菌株は３０〜３７℃の温度でルリアブロス培地で成育させ、２０％（容量／容量）グリセロールを含む同じ培地に−８０〜−６０℃で保管することができる。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株によるコレラ毒素のＢサブユニットを産生する能力を、Yoshihiko Uesaka, Yoko Otsuka, Miksuaki Ka hida, Yuichi Oku, Kazuki Horigome, G. Balakrish Nair, S.C. Pal, Shinji Yamasaki and Yoshifumi Takeda, Microbiol. Immunology, Vol. 36(1), 43-53, (1992) によるビーズ−ＥＬＩＺＡを用いて監視した。親株（ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０）はＢサブユニットを産生しなかったが、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株はＢサブユニットを多量に産生した。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するこの菌株によって産生されるＢサブユニットの量は、高い光学密度によって示されるように受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する菌株の数倍以上であり、単一コピーだけを有する後者と比較して前者はＣＴ−Ｂの多重コピーを有しているからであった。遺伝子操作を適当に行うことを決定したならば、次に行うことは、ワクチンが結紮ウサギ回腸ループ分析法で流体蓄積を誘導するかどうかを決定することであった。結紮回腸ループ分析法（ウサギモデル）は、De, S.N., Nature 183, 1533-1534 (1959)、およびFormal, S.B., Kundel, D., Schneider, H., Hunev, N. and Sprinz, H., Br. J. Exp. Pathol., 42, 504-510 (1961)に記載の方法で行った。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株は、流体蓄積を誘導しなかった。これにより、ワクチン構築物はＢサブユニットを産生するが、予想されるようにこのサブユニットは無毒でありかつ流体蓄積を誘導することはできないことが証明された。次の一連の実験は、ワクチン菌株がイン・ビボウサギモデルを用いて反応原性であるかどうかを決定することであった。ＲＩＴＡＲＤモデルによるウサギでのワクチン試験は、Spira, N.M., Sack, R.B. and Froehlich, J.L., (1981), Infect. Immun., 32, 739-747に記載の方法で行った。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株は、ウサギに経口投与したときには下痢を誘発しないことは明かであった。これらの結果に基づいて、El Torおよび古典型バイオタイプに属する０１血清型のV. cholerae の菌株を用いて、数バッチでチャレンジを検討した。ウサギでのチャレンジ試験のデーターは、下記のようにまとめることができる。
1. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株で免疫したウサギは、古典的バイオタイプおよびE1 Torバイオタイプ株によるチャレンジから有意に保護された。これは、免疫ウサギでは下痢が見られなかったのに対し、コントロールウサギでは激しい下痢が見られたことから明かであった。
2. 免疫ウサギでのチャレンジ株のコロニー形成能は、コントロールウサギと比較して有意に低かった。
3. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の非反応原性は、コントロールウサギでの下痢を誘発することができないことによっても明かであった。
4. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の免疫原性は、ワクチン株を経口免疫したウサギの免疫前血清と比較して免疫血清では、リポ多糖類、外膜タンパク質、全細胞溶解物およびコレラ毒素に対する抗体力価が有意に上昇したので明かであった。
【００７６】
上記の総ての実験手続きは、下記の標準的方法および実験条件に従って行う。
【００７７】
Escherichia coliおよびVibrio cholerae 株は、ルリアブロス（ＬＢ）で成育させ、維持した。必要ならば、適当な抗生物質を成長培地に加えた。アンピシリン、ストレプトマイシン硫酸塩貯蔵物、ＬＢ培地、および最近を取り扱うための他の細目の調製は、J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis 著の分子クローニング(Molecular cloning) （１９８９年）、Cold Spring Harbour Laboratoryに従って行った。
【００７８】
ポリメラーゼ連鎖反応は、VentＤＮＡポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ＋）を用いて行い、基本的反応条件は、総容量１００μｌ中で１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、４ｍＭＭｇＳＯ４、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．１％Triton X-100、１μＭプライマー、染色体ＤＮＡ鋳型１００ｎｇまたはプラスミドＤＮＡ鋳型１０〜２０ｎｇ、およびVentＤＮＡポリメラーゼ２単位であった。
【００７９】
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの処理は、適当なｄＮＴＰの存在下にて、３３ｍＭトリス酢酸塩（ｐＨ８．０）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭジチオトレイトール、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ２単位中で１２℃で３０分間行った。
【００８０】
E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片によるＤＮＡの処理は、適当なｄＮＴＰの存在下にて、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、および酵素１単位中で室温で２０分間行った。
【００８１】
ＤＮＡの連結は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１．５単位、および０．５ｍＭ ＡＴＰ中で１２℃で１２〜１６時間行った。
【００８２】
E. coli 細胞の形質転換は、BIORAD遺伝子パルサーを用いる電気穿孔によって行った。E. coli 細胞の調製または電気穿孔、および電気穿孔の詳細は、製造業者の指示に従って行った。
【００８３】
ＤＮＡのジデオキシヌクレオチドシークエンス法は、the United States Biochemicals社、クリーブランド、オハイオ州、米国から得たシークエナーゼキットを用いて行った。
【００８４】
プラスミドＤＮＡの分離操作、ＤＮＡの制限酵素による消化、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の電気溶出、ＤＮＡのフェノール抽出による精製、ポリメラーゼ連鎖反応からの遊離ヌクレオチドを除去するためのSephadex G-50 でのスパンカラムクロマトグラフィ、ＤＮＡのエタノールによる沈澱、ＤＮＡプローブの放射性標識、コロニーハイブリダイゼーション、およびサザンハイブリダイゼーションプロトコールは、総て本質的にはJ. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis 著の分子クローニング(Molecular cloning) （１９８９年）、Cold Spring Harbour Laboratoryに記載された通りである。Vibrio cholerae からゲノムＤＮＡを分離するためのプロトコールは、Ausubel et al 著のカレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)（１９８７年）、Massachusetts General Hospital & Harvard Medical School に従って行った。
【００８５】
【実施例】
本発明の方法を下記の実施例によって例示するが、これは本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００８６】
実施例１ ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０を有する親株 V. cholerae の分離
コレラ患者からの糞便標本を、伝染病病院(Infectious Diseases Hospital)、カルカッタの承認により直ちに滅菌マッカートニーボトルに滅菌カテーテルで採取した。採取後まもなく、糞便標本を実験室に輸送して、２時間以内にV. cholerae 、および腸毒素産生性E. coli （ＥＴＥＣ）、シゲラ、サルモネラおよびカンピロバクター種のような他の普通に見られる毒素産生性腸病原菌について、標準的な公表されている手法（世界保険機構、下痢性疾患の制御プログラム［ＣＣＤ／８３．３、改版１］、急性腸感染症の実験室検討のためのマニュアル(Manual for laboratory investigations of acute enteric infections)、世界保険機構、１９８７年）によって検討した。糞便標本のV. cholerae 菌株を同定するため、チオ硫酸塩−クエン酸塩−胆汁塩−スクロース寒天（ＴＣＢＳ、栄研、日本国）に糞便標本をループで２または３回塗布して、V. cholerae の選択分離を行った。３７℃で一晩インキュベーションした後、選択寒天上で成育を示すそれぞれの糞便試料からのコロニーを多目的試験培地に接種した(Nair GB, Misra S, Bhadra RK, Pal SC, Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53, 1203-1205) 。多目的試験培地で典型的なアルカリスラント−酸バット反応(alkaline slant-acid butt reaction) を示す菌株をオキシダーゼ反応について検討し、スライド凝集反応をナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージス(National Institute of Cholera and Enteric Diseases)、カルカッタ、インドで調製した多価O1および単一特異性オガワ−イナバ抗血清を用いて行った。上記の方法で得たV. cholerae O1の数百種類の菌株をルリアブロス寒天上でコロニーとして培養して、毒素遺伝子ｃｔｘ、ｚｏｔおよびａｃｅに特異的なＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。精製したＤＮＡをニックトランスレーションにより２×１０８〜８×１０８ｃｐｍ／μｇの特異活性まで［α−32Ｐ］ｄＡＴＰを取り込むことによって32Ｐで標識した。放射性標識したプローブＤＮＡを、NACS PREPAC 上で製造業者（Bethesda Research Laboratories、米国）によって指定された方法でクロマトグラフィによって精製した。コロニーブロットは、オートクレーブ処理したグリッド付きニトロセルロースフィルター(Schleicher and Schuell Co. 、BA 85/20）上で調製し、上記のような高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションを行った（文献：Karasawa T, Mihara T, Kurazono H et al. 、Vibrio cholerae O1および非−O1の菌株中のｚｏｔ（閉鎖帯毒素）遺伝子の分布、FEMS Microbiol. Lett., 1993, 106, 143-146 ）。
【００８７】
毒素遺伝子、すなわちｃｔｘ、ｚｏｔおよびａｃｅを欠くことが判った菌株を、コレラ毒素様および他の細胞毒素活性について試験した。このため、菌株を９０μｇ／ｍｌリンコマイシンを補足したカザミノ酸酵母抽出物（ＣＡＹＥ）培地中で成育し、培養濾液をコレラ毒素（Ｔ）様腸毒素の存在および熱安定な直接溶血素について高感受性ビーズ−ＥＬＩＺＡで検討した（文献：Oku Y, Uesaka Y, Hirayama T, Takeda Y,細菌タンパク質毒素の検出のための高感受性ビーズ−ＥＬＩＺＡの開発(Development of a highly sensitive Bead-ELIZA to detect bacterial protein toxins), Microbiol. Immunol., 1988, 32, 807-816; Uesaka Y, Otsuka Y, Kashida M et al., 高感受性ビーズ−酵素リンクト・イムノソーベントアッセイによるコレラ毒素の検出(Detection of cholera toxin by a highly sensitive bead-enzyme linked immunosorbent assay), Microbiol. Immunol., 1992, 36, 43-53 ）。精製CT (Sigma)またはカナガワ現象陽性V. parahaemolyticus の菌株NICED 10の培養濾液（陽性コントロール）の各種希釈物、および未接種培地（陰性コントロール）を、試験菌株の培養濾液のバッチをビーズ−ＥＬＩＺＡによって分析するときには、同時に分析した。受託番号Ｂ００１０を有する親株V. cholerae の、ウサギ、ヒツジ、ニワトリおよびヒト由来の赤血球での溶血活性を、前記の方法で測定した（文献：Nair GB, Oku Y, Takeda Y et al., カルカッタ、インドにおける環境資源からのVibrio cholerae 非-O1 の毒素分布(Toxin profiles of Vibrio cholerae non-O1 from environmental sources in Calcutta, India), Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54, 3180-3182）。毒素遺伝子を持たない菌株およびコレラ毒素様および他の細胞毒素活性を持たない菌株の一つは、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を得ている。この菌株では、潜在的溶血素Ａ遺伝子の存在が、ｈｌｙＡプローブでのハイブリダイゼーションによって確かめられている。これは、ｃｔｘＢサブユニット遺伝子の組込みはｈｌｙＡ座での標的組換えによって行わなければならないので、重要である。ｔｃｐＡ遺伝子の生成物は腸におけるVibrio cholerae の効果的なコロニー形成に要する線毛の主成分であるので、その存在はｔｃｐＡプローブでのハイブリダイゼーションによっても確かめた。更に、ｃｔｘプロモーターの制御下での遺伝子の最適発現には転写活性化因子ＴｏｘＲを必要とするので、ｔｏｘＲ遺伝子の存在をｔｏｘＲプローブでのハイブリダイゼーションによって確かめた。
【００８８】
更に、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株を結紮回腸ループ分析法およびＲＩＴＡＲＤモデルで試験して、これが反応原性であるかどうか、およびこれが腸で効果的にコロニー形成することができるかどうかをチェックした。ウサギ回腸ループ分析法のために、いずれかの性の体重が１．５〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギを選択した。実験動物を、自由に水を与えたこと以外は３６時間絶食させた。静脈内麻酔下にて外科手術を行った。回腸ループ処置は、本質的にS.N. De によって報告された処置と同様であった[De, S.N., Nature, 183, 1533-1534 (1959)] 。腸を正中切開により取り出した。選択した小腸部分を、温和な（３７℃）滅菌ＰＢＳ（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で慎重に洗浄した。それぞれのウサギで、総数で８個のループを作成した。ループおよびインターループ(inter loop)の長さは、それぞれ５ｃｍおよび２ｃｍであった。次に、約１０８個の細胞を含む生菌細胞懸濁液１ｍｌをそれぞれのループに導入した。V. cholerae 569Bを陽性コントロールとして用い、無菌ＰＢＳ（０．０１Ｍ，ｐＨ７．４）を陰性コントロールとして用いた。接種後、動物の小腸を開腹内部に慎重に戻し、切開部を縫合した。動物をケージに入れておき、水を供給した。動物を１８〜２０時間後に屠殺し、流体蓄積（ＦＡ）の指数をｍｌ／ｃｍとして表したループ流体容積対ループ長さの比率から計算した。試験調製物は、比率が＞０．９であるときには陽性と考えた。コントロール反応が不適当な場合には、結果を棄却した。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株を、２羽の異なるウサギの回腸で２回試験した。流体蓄積は全く見られなかった。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する菌株を、ＲＩＴＡＲＤモデルで下痢発生性およびコロニー形成能について試験した。このため、いずれかの性の体重が１．７〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギをコロニー形成実験に選択した。総ての動物は、実験室で１週間順応させた。実験ウサギにメトロニダゾール（１２５ｍｇ／ウサギ／日）およびスルファキノキサリンナトリウム（４６４ｍｇ／ウサギ／日）を順に投与し、この投与を２日の間隔で繰り返して、Giardia やCoccidiaのような腸内原生動物病原体を動物から除いた。経口接種源を作成するため、受託番号Ｂ００１０を有する菌株をトリプティック・ソイ・ブロス(triptic soy broth) （ＴＳＢ、Difco 、米国）中で、オービタル・シェーカーで３７℃にて１８時間成育した。菌体を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して回収した。ペレットを滅菌リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、細菌密度を分光光度計で５４０ｎｍで計算し、ＰＢＳを用いて光学密度が約１０９個の菌体まで希釈して、接種源として用いた。経口接種のため、ウサギを水を自由に与えること以外は３６時間絶食させ、経口接種の３５分前に、それぞれのウサギをケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン４ｍｇ／ｋｇ体重の筋肉内投与により麻酔した。５分後に、Ｈ２レセプターブロッカーでありかつ胃の消化細胞からのＨＣｌの分泌を抑制するシメチジン５０ｍｇをウサギに投与した。１５分後に、栄養補給チューブ（Accumark, Feeding Catheter, 米国）を経口設置し、重炭酸ナトリウムの５％溶液（SRL India 、重炭酸ナトリウムは胃に存在するＨＣｌを中和する）１５ｍｌを導入した。「０」時に、重炭酸ナトリウムの５％溶液１５ｍｌをもう１回投与し、直後に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１５ｍｌに懸濁した細菌接種源を投与した。３０分後に、アヘンのチンキ剤２ｍｌを腹腔内投与した。次いで、ウサギをケージに戻し、一定量の滅菌水と食物を与えた。下痢は、下記の特徴を用いる等級システムに従って評価した。糞便を下記のようにして等級付けした。等級１は下痢のない正常な糞便であり、等級２は粥状の軟便を有する下痢であり、中程度下痢とも表され、等級３はカタル性の水状下痢であり、重度の下痢と呼ばれる。受託番号Ｂ００１０を有する菌株は下痢を起こさず、反応原性ではないことを示している。受託番号Ｂ００１０を有するV. cholerae コロニー形成を検討するため、実験用ウサギを接種から１８時間後に屠殺した。ウサギを麻酔して外科手術により開腹した後、腸を取り出した。末端回腸１０ｃｍの両端を臍帯テープ（１１号）で結んで、切断した。この１０ｃｍの回腸を、滅菌した０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを含むビーカーに入れた。腸の切片を縦方向に開いて、緩やかに洗浄した。洗浄した材料から連続希釈物を作成した。回腸の組織片を秤量してＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）１０ｍｌと共にホモゲナイズし、ホモゲナイズした。ホモゲネートの連続希釈物を作成した。ウサギを、最終的にEuthanasia 6−溶液１（Veterinary Lab./Inc.、カンサス、米国）２ｍｌを静脈内注射によって殺した。腸洗浄液のニートおよび連続希釈物、および回腸のホモゲナイズした材料を、選択培地で培養した。プレートを３７℃でインキュベーションし、コロニーを２４時間後にコロニーカウンターを用いて計数し、コロニー形成単位として表した。受託番号Ｂ００１０を有するV. cholerae 株は、顕著なコロニー形成能を示す。これは、毒素によって同時制御される線毛の存在によるものと思われ、その存在はハイブリダイゼーションによって決定された。
【００８９】
受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV.cholerae株は、ルリアブロス中で３７℃の温度で成長し、２０％（容量／容量）グリセロールを含む同じ培地で−７０℃で保管することができる。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するこの菌株を、受託番号Ｂ００１１を有するコレラワクチン株の作成のための親株として用いた。
【００９０】
実施例２
受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するVibrio cholerae のワクチン株は、コレラ毒素のＢサブユニットをコードする遺伝子を受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親株の染色体に組込むことによって構築した。これは、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株の染色体のｈｌｙＡ座における標的組換えによって行った。これは、簡単にいえば下記の段階を含んでいる。
(i) それ自身のＳＤ配列とｃｔｘ−オペロンのプロモーターとを用いて最初に既知のV. cholerae 569B株（ナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージス(National Institure of Cholera and Enteric Diseases)）の染色体由来のコレラ毒素（ｃｔｘ）オペロンをクローニングした後、逆ＰＣＲによってクローニングしたオペロンからｃｔｘＡサブユニット遺伝子を欠失させることによるｃｔｘＢサブユニット遺伝子の構築物の作製。
(ii) 標的組換えを目的とした標的座溶血素Ａ遺伝子（ｈｌｙＡ）のクローニング。
(iii) 段階(i) で得られるようなｃｔｘＢサブユニット遺伝子構築物によるｈｌｙＡ遺伝子配列の分断。
(iv) ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有する分断ｈｌｙＡ構築物の自殺プラスミドベクターへのクローニング。
(v) 分断されたｈｌｙＡ構築物を有する自殺ベクターを連結によって（段階(ii)で得た）親株に移動させてｈｌｙＡ遺伝子におけるｃｔｘＢ遺伝子構築物の標的組込み。
(vi) 組込まれたｃｔｘＢ遺伝子を有する組換えV. cholerae クローンのハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応による同定。
【００９１】
受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親株を用いるワクチンの製造を促進するため、ｈｌｙＡ遺伝子配列が隣接したｃｔｘＢサブユニット遺伝子が製造される一連の遺伝子操作を行った。これらの操作の第一段階は、Vibrio cholerae のｃｔｘオペロンをクローニングすることであった。Vibrio cholerae O1株569Bのｃｔｘオペロンを、ポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムから増幅した後、クローニングした。ｃｔｘオペロンの増幅には、下記のプライマーを用いた。オリゴヌクレオチドＣＴ１（５′ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ３′）は、ｃｔｘオペロンの転写開始部位の１４９〜１７２ヌクレオチド上流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。オリゴヌクレオチドＣＴ２（５′ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴＣ ３′）は、ｃｔｘの停止コドンの４３〜６７ヌクレオチド下流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。これらの２個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡ配列を増幅するときには、生成物は、プロモーターおよび５′末端の上流ＴｏｘＲ結合反復と一緒にコレラ毒素ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子、およびオペロンの３′末端の転写終結シグナルからなる完全ｃｔｘオペロンである。ポリメラーゼ連鎖反応では、鋳型として既知のVibrio cholerae 569B染色体ＤＮＡ１００ｎｇを用いてｃｔｘオペロンをプライマーＣＴ１およびＣＴ２１．０μＭで増幅した。９７℃２分間の初期変性段階に続いて、反応を９４℃１分間の変性段階、６２℃１分間のアニーリング段階および７２℃２分間の伸張段階で約３０回循環させた。最後のサイクルの終りに、追加の伸張段階を７２℃１０分間加えた。ポリメラーゼ連鎖反応の後に、反応混合物を等容のフェノール：クロロホルムの５０：５０混合物で抽出した。水相をSephadex G50スパン・カラム(spun column) を通過させて遊離ヌクレオチドを除去し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを再懸濁させた後、これを２００μＭのｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理した。これにより、５′ＴＴ−ジヌクレオチドオーバーハングを有する増幅ＤＮＡ生成物を得た。上記のようにして改質した増幅ＤＮＡをクローニングするため、プラスミドベクターｐＢＳ＋を、最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、これを２００μＭのｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理した。この処理により、線状化したｐＢＳ＋ベクターＤＮＡの両端に５′ＡＡオーバーハングを得た。このベクターＤＮＡ調製物をＴ４ＤＮＡリガーゼによって５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに１：２のモル比で連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成する組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘオペロン上の部位が知られている制限酵素（例えば、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ）によって分析した。ｐＧＴ１と呼ばれる一つのクローンのインサートは、制限分析およびシークエンス法によって確かめたところ、完全ｃｔｘオペロンを有している。完全Ｂサブユニット遺伝子のヌクレオチド配列を決定して、ポリメラーゼ連鎖反応中に導入されるエラーの可能性を排除した。このプラスミドクローンｐＧＴ１を、次の段階で用いた。
【００９２】
次の段階では、プラスミドクローンｐＧＴ１からの完全ｃｔｘ−Ａコード配列を互いに異なりかつｃｔｘ−Ａ遺伝子を除くプラスミドを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆ポリメラーゼ連鎖反応によって欠失を行った。オリゴヌクレオチドＣＴ３（５′ ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＴＴ ＡＡＣ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＡＣ ３′）は、ｃｔｘオペロンの転写開始部位に関して＋９〜−２１ヌクレオチドに位置する染色体ＤＮＡ配列に相補的であった。オリゴヌクレオチドＣＴ４（５′ ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＧＡ ＴＴＡＡＡＴ ＴＡＡ ＡＡ−３′）は、ｃｔｘＢ遺伝子の開始コドンの最初の塩基に関して−１６〜＋１５ヌクレオチドに位置していた。オリゴヌクレオチドＣＴ３およびＣＴ４を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってそれらの５′末端をリン酸化した。逆ポリメラーゼ連鎖反応は、これらのリン酸化オリゴヌクレオチドＣＴ３およびＣＴ４をプライマーとして、プラスミドｐＧＴ１を鋳型ＤＮＡとして用いて行った。大きさが３．８キロベースの生成する増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。次いで、これを２００μＭのｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＣＴ３に相当する末端に５′ＧＧ−オーバハングを、ＣＴ４に相当する末端に５′ＣＣ−オーバーハングを生成した。互いに相補性の上記ジヌクレオチドオーバハングを有する末端は、連結混合物中のＤＮＡの最終濃度を２ｎｇ／μｌとしてＴ４ ＤＮＡリガーゼによって連結し、分子内連結を促進した。連結生成物を用いて、E. coli Sure株を電気穿孔によって形質転換した。逆ポリメラーゼ連鎖反応生成物の再環状化によって、ｃｔｘプロモーターとｃｔｘＢサブユニット遺伝子が融合した。この構築物ｃｔｘプロモーター−ＢはＣＴ１およびＣＴ２をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応によって様々なプラスミドクローンで同定され、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物に相当する０．６３キロベース断片を生成した。様々なクローンからのＢサブユニットの発現は、ビーズＥＬＩＺＡ分析法によって確認した。一つのプラスミドクローンｐＧＴ３．１のｃｔｘ−プロモーター−Ｂ構築物のヌクレオチド配列を決定して、プロモーター−Ｂサブユニット遺伝子融合点の配列を分析した。これによって、ｃｔｘオペロンプロモーターと、ｃｔｘＢサブユニット遺伝子自身のＳＤ配列を含むｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有するＴｏｘＲ結合反復との融合を確認した。ｃｔｘＢ遺伝子は理論的に完全なＳＤ配列（ＴＡＡ ＧＧＡ）を示し、文献にはｃｔｘＢリボソーム結合部位がｃｔｘＡ部位よりも約９倍も効率的であることが示されている。(J.J. Mekalanos, D.J. Swartz G.D.N. Pearson, Nitarford, I. Groyne & Michel de Wilde, (1983) Nature, 306, 551-557) 。ｐＧＴ３．１からのｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を後の段階で用いて、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子を分断した。
【００９３】
ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株にｈｌｙＡ遺伝子での標的組換えによって導入されることが決定されたので、構築物を作成してクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列をｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断するのが重要であった。このためには、V. cholerae の遺伝子をクローニングすることが必要であった。５′隣接領域および３′側のコード領域の大部分を欠いている部分ｈｌｙＡ遺伝子配列を、Vibrio cholerae ゲノムからのその増幅の後にクローニングした。増幅には、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。オリゴヌクレオチドＨＡ１（％′ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＴＴ ＡＴＡ ＴＧＣ Ｃ−３′）はｈｌｙＡ遺伝子の開始コドンに関して−１９〜＋６ヌクレオチドに位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的であり、オリゴヌクレオチドＨＡ２（５′ ＴＴＣ ＧＣＴ ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＧＴ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＴＣ ３′）はｈｌｙＡ遺伝子の開始コドンから１７１４〜１６９０ヌクレオチドに位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的であった。ｈｌｙＡ遺伝子の完全コード領域の大きさは約２．２キロベースであり、そのｈｌｙＡ遺伝子の１．７キロベースをV. cholerae 01株のゲノムＤＮＡから増幅した。９７℃２分間の初期変性段階の後、反応を９４℃１分間の変性段階、６２℃１分間のアニーリング段階および７２℃２分間の伸張段階を通って反復した。最後のサイクルの終りに、７２℃１０分間の追加の伸張段階を加えた。ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、１．７キロベースＤＮＡ断片の存在についてアガロースゲル電気穿孔によって分析した。反応生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。精製ＤＮＡを２００μＭ ｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、末端に５′ＴＴ−オーバーハングを生成させた。上記のように改質した末端を有する増幅ｈｌｙＡ遺伝子をクローニングするため、プラスミドベクターｐＵＣ９を最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、線状化したｐＵＣ９ ＤＮＡを２００μＭ ｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、両端に５′ＡＡオーバーハングを生成した。このベクターＤＮＡ調製物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって１：２のモル比の５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成するプラスミドクローンを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで消化することによって分析した。１．７キロベースのＥｃｏＲＩインサートは０．４キロベース配列によって分離された中央領域に２個のＨｐａＩ部位を有するはずである。１．７キロベースｈｌｙＡインサートを有するプラスミドクローンの一つｐＧＴ８９を次の段階で用いて、ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物によってｈｌｙＡ配列を分断した。
【００９４】
次の段階では、ｐＧＴ３．１のｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をオリゴヌクレオチドプライマーＣＴ１およびＣＴ２を用いて増幅した。増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、エタノール沈澱を行った。精製ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物断片を、ｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、両端に５′ＴＴ−オーバハングを生成した。５′ＴＴ−オーバハングを有するｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を、０．４キロベースＨｐａＩ断片の代わりにクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央に挿入しなければならなかった。プラスミドベクターｐＵＣ９はＨｐａＩ酵素の部位を有していないので、ｐＧＴ８９をＨｐａＩで消化すると、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央からの０．４キロベースの断片と３．９キロベースの断片を生じる。ｐＧＴ８９をＨｐａＩ酵素で消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。３．９キロベースのＨｐａＩ断片を電気溶出して精製した。次に、これをｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって処理して、両端に５′ＡＡ−オーバーハングを生成した。５′ＡＡ−オーバーハングを有する３．９キロベース断片を、５′ＴＴ−オーバーハングを有するｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物にＴ４ ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結混合物を用いて、E. coli 「Sure」株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩ酵素で消化すると、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断されたｈｌｙＡ遺伝子配列の１．９キロベースインサートが得られた。一つの組換えプラスミドｐＧＴ３９からのＥｃｏＲＩインサートを用いて、これを自殺ベクターｐＧＰ７０４にクローニングした。ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物のヌクレオチド配列をｐＧＴ３９の隣接ｈｌｙＡ配列と共に決定した。
【００９５】
次の段階では、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を隣接ｈｌｙＡ配列と共に、プラスミド自殺ベクターにクローニングした。プラスミド自殺ｐＧＰ７０４をＥｃｏＲＩ酵素で消化し、線状化したベクターの５′リン酸基を子牛腸ホスファターゼで処理することによって除去した。ＥｃｏＲＩで消化して脱リン酸化したｐＧＰ７０４を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、相当するＤＮＡバンドを電気溶出して、精製した。これは、ベクターＤＮＡ調製物中に微量の未消化ベクターＤＮＡも存在しないようにする目的で行った。次に、これをＴ４ ＤＮＡリガーゼによってｐＧＴ３９の１．９キロベースＥｃｏＲＩインサートに１：５のモル比で連結し、この連結混合物を用いてE. coli SM10 pir株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンは、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩで消化したところ、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって分断されたクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列を表す１．９キロベースのインサートを得た。クローンｐＧＴ２７の一つを用いて、ｈｌｙＡ遺伝子での組込みのため受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株に移動した。
【００９６】
次の段階では、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とプラスミドｐＧＴ２７を含むE. coli SM10 pir株との接合によって、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親V. cholerae 株へのｐＧＴ２７の移動を行った。E. coli 宿主株SM10 pir中のプラスミドクローンｐＧＴ２７と受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とは、振盪せずに３７℃で対数中央増殖相(midlog phase)までＬＢで成育した。ドナー株、すなわちｐＧＴ２７を有するSM10 pir株０．５ｍｌと、レシピエント株、すなわち受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株０．５ｍｌとを、１．５ｍｌ微量遠沈管中で混合し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、底部に細胞を集めた。上清を除去した後、ルリアブロスを５０μｌの量で細胞ペレットに加え、細胞をピペットで吸い込みおよび吐き出しを行うことによってブロスに懸濁した。次に、細胞懸濁液をＬＢ寒天培地の表面に置いた０．４ｍｍメンブランディスク上にスポットした。懸濁液は、直ぐにメンブランに吸収された。メンブラン上のドナーおよびレシピエント細胞を、３７℃で約４時間一緒に合わせたままにした。次に、メンブランフィルターを５ｍｌのネジ蓋付き試験管に集め、ＬＢ培地１ｍｌを加えた。メンブラン上の細胞を、短時間混合することによって培地に再懸濁した。懸濁液１０μｌを、ストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌとアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。このような高濃度のアンピシリンでは、アンピシリン耐性を与えるプラスミドｐＧＴ２７は比較的高頻度でタンデム反復し、薬剤圧力(drug pressure) のために選択されることがある。アンピシリン耐性コロニーは、ｃｔｘＢ遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーションによって分析した。このプローブとハイブリダイゼーションした組換えクローンからの染色体調製物ＤＮＡを、ｈｌｙＡ特異的プライマーＨＡ１およびＨＡ２を用いるポリメラーゼ連鎖反応で鋳型として用いた。総てのクローンから、１．７キロベースおよび１．９キロベース断片を増幅した。この場合と同様の組のプライマーによって画定される２つの異なる大きさの断片が単一コピーに存在するときには、小さいものが通常は優先的にポリメラーゼ連鎖反応で増幅された。このことは、アガロースゲル電気泳動によって検討したときにそれらのバンド強度で示された。大きいものが多重コピーに含まれているときには、増幅された大きな断片の量は、これが単一コピーとして含まれているときよりも遥かに多量となった。
【００９７】
１．７キロベースバンドより強力な１．９キロベース断片を有することが判ったクローンの１つは、ビーズＥＬＩＺＡによって測定したところ、数種類の他のクローンよりもＢサブユニットを多く分泌する。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するこのクローンをストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で約２０世代継代培養した。この培養からの細胞をストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートで培養し、得られたコロニーをｃｔｘＢ遺伝子プローブとハイブリダイゼーションした。総てのコロニーがハイブリダイゼーションし、２０世代後には組込まれたｐＧＴ２７の安定性を示していた。受託番号Ｂ００１１を有する組換えV. cholerae クローンからのゲノムＤＮＡを分離して、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩおよびＨｐａＩで個別に消化した。上記消化物のサザンブロットを、別個の実験でｃｔｘＢプローブおよびｈｌｙＢプローブを用いてハイブリダイゼーションした。
【００９８】
受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するコレラワクチンを、薬剤を全く加えずにＬＢ培地で５６回培養（継代培養）し、それぞれ培養は約２０世代を表していた。約１５００個の単一コロニーをｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーションによってｃｔｘＢの存在についてチェックした。それらの総てはこのプローブでハイブリダイゼーションし、ｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物はアンピシリンが存在しなくとも約＞１０００世代の成育の後でも維持されることを示していた。
【００９９】
受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するV. cholerae をワクチン株として選択した。これをウサギ回腸ループ分析法によって試験して、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有する菌株が反応原性であるかどうかを決定した。ウサギ回腸ループ分析法のために、いずれかの性の体重が１．５〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギを選択した。実験動物を、自由に水を与えたこと以外は３６時間絶食させた。静脈内麻酔下にて外科手術を行った。回腸ループ処置は、本質的にS.N. De によって報告された処置と同様であった[De, S.N., Nature, 183, 1533-1534 (1959)] 。腸を正中切開により取り出した。選択した小腸部分を、温和な（３７℃）滅菌ＰＢＳ（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で慎重に洗浄した。それぞれのウサギで、総数で８個のループを作成した。ループおよびインターループ(inter loop)の長さは、それぞれ５ｃｍおよび２ｃｍであった。次に、約１０８個の細胞を含む生菌細胞懸濁液１ｍｌをそれぞれのループに導入した。既知のV. cholerae 569Bを陽性コントロールとして用い、無菌ＰＢＳ（０．０１Ｍ，ｐＨ７．４）を陰性コントロールとして用いた。接種後、動物の小腸を開腹内部に慎重に戻し、切開部を縫合した。動物をケージに入れておき、水を供給した。動物を１８〜２０時間後に屠殺し、流体蓄積（ＦＡ）の指数をｍｌ／ｃｍとして表したループ流体容積対ループ長さの比率から計算した。試験調製物は、比率が＞０．９であるときには陽性と考えた。コントロール反応が不適当な場合には、結果を棄却した。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するV. cholerae 株を、２羽の異なるウサギの回腸で２回試験した。流体蓄積は全く見られなかった。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有する菌株は、流体蓄積を誘導しなかった。これは、ワクチン構築物がＢサブユニットを産生するが、予想されるように、このサブユニットは無害であり、流体蓄積を誘導することはできないことを示していた。
【０１００】
次の一連の実験を行い、イン・ビボウサギモデルを用いてワクチンのコロニー形成能および防御能を決定した。このため、いずれかの性の体重が１．７〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギをコロニー形成実験に選択した。総ての動物は、実験室で１週間順応させた。実験ウサギにメトロニダゾール（１２５ｍｇ／ウサギ／日）およびスルファキノキサリンナトリウム（４６４ｍｇ／ウサギ／日）を順に投与し、この投与を２日の間隔で繰り返して、Giardia やCoccidiaのような腸内原生動物病原体を動物から除いた。経口接種源を作成するため、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ ２０２０１１）を有する菌株をトリプティック・ソイ・ブロス(triptic soy broth) （ＴＳＢ、Difco 、米国）中で、オービタル・シェーカーで３７℃にて１８時間成育した。菌体を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して回収した。ペレットを滅菌リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、細菌密度を分光光度計で５４０ｎｍで計算し、ＰＢＳを用いて光学密度が約１０９個の菌体まで希釈して、接種源として用いた。経口免疫の前には、ウサギを水を自由に与えること以外は３６時間絶食させ、経口接種の３５分前に、それぞれのウサギをケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン４ｍｇ／ｋｇ体重の筋肉内投与により麻酔した。５分後に、Ｈ２レセプターブロッカーでありかつ胃の消化細胞からのＨＣｌの分泌を抑制するシメチジン５０ｍｇをウサギに投与した。１５分後に、栄養補給チューブ（Accumark, Feeding Catheter, 米国）を経口設置し、重炭酸ナトリウムの５％溶液（SRL India 、重炭酸ナトリウムは胃に存在するＨＣｌを中和する）１５ｍｌを導入した。「０」時に、重炭酸ナトリウムの５％溶液１５ｍｌをもう１回投与し、直後に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１５ｍｌに懸濁した細菌接種源を投与した。３０分後に、アヘンのチンキ剤２ｍｌを腹腔内投与した。次いで、ウサギをケージに戻し、一定量の滅菌水と食物を与えた。実験群およびコントロール群のウサギを、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株を０日目、７日目および１４日目に経口投与して免疫した。コントロール群のウサギには、未接種のトリプティック・ソイ・ブロス（Difco 、米国）１５ｍｌを投与した。実験の２１日目に、総ての免疫動物を同種または異種菌株でチャレンジを行い、防御の程度を測定した。動物のチャレンジで生き残る能力並びに生物のコロニー形成能を検討した。
【０１０１】
ワクチン株を含む試験菌株のコロニー形成を検討するため、実験用ウサギを接種から１８時間後に屠殺した。ウサギを麻酔して外科手術により開腹した後、腸を取り出した。末端回腸１０ｃｍの両端を臍帯テープ（１１号）で結んで、切断した。この１０ｃｍの回腸を、滅菌した０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを含むビーカーに入れた。腸の切片を縦方向に開いて、緩やかに洗浄した。洗浄した材料から連続希釈物を作成した。回腸の組織片を秤量して、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）１０ｍｌと共にホモゲナイズし、ホモゲナイズした。ホモゲネートの連続希釈物を作成した。ウサギを、最終的にEuthanasia 6−溶液１（Veterinary Lab./Inc.、カンサス、米国）２ｍｌを静脈内注射によって殺した。腸洗浄液のニートおよび連続希釈物、および回腸のホモゲナイズした材料を、選択培地で培養した。プレートを３７℃でインキュベーションし、コロニーを２４時間後にコロニーカウンターを用いて計数し、コロニー形成単位として表した。
【０１０２】
同種チャレンジ試験は、免疫感作およびチャレンジに用いたのと同じ菌株で行った。
【０１０３】
異種チャレンジ試験は、免疫感作およびチャレンジに用いたのとは異なる菌株で行った。異種菌株は、V. cholerae の両方のバイオタイプ（El Torおよび古典型）を表す目的で選択した。
【０１０４】
同種菌株および異種菌株でチャレンジを行った免疫ウサギを、臨床的下痢の徴候について観察した。下痢は、下記の特徴を用いる等級システムに従って評価した。糞便を下記のようにして等級付けした。等級１は下痢のない正常な糞便であり、等級２は粥状の軟便を有する下痢であり、中程度下痢とも表され、等級３はカタル性の水状下痢であり、重度の下痢と呼ばれる。受託番号Ｂ００１０を有する菌株はウサギに経口投与したときには下痢を起こないことが明かに観察された。これらの結果に基づいて、血清型O1、および両バイオタイプEl Torおよび古典型のV. cholerae の親株を用いるチャレンジ試験を、数バッチで行った。データーを下記のようにまとめることができる。
1. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株で免疫したウサギは、古典的バイオタイプおよびEl Torバイオタイプ株によるチャレンジから有意に保護された。これは、免疫ウサギでは下痢が見られなかったのに対し、コントロールウサギでは激しい下痢が見られたことから明かであった。
2. 免疫ウサギでのチャレンジ株のコロニー形成能は、コントロールウサギと比較して有意に低かった。
3. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の非反応原性は、コントロールウサギでの下痢を誘発することができないことによっても明かであった。
4. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の免疫原性。ワクチン株を経口免疫したウサギの免疫前血清と比較して免疫血清では、リポ多糖類、外膜タンパク質、全細胞溶解物およびコレラ毒素に対する抗体力価が有意に上昇したため。
【０１０５】
次に、まとめると、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するV.cholerae株は、総ての既知の毒性遺伝子を欠いており、動物モデルで非反応原性であり、コレラ毒素の免疫原性「Ｂ」サブユニットを同化し、ＲＩＴＡＲＤモデルではV. cholerae の両バイオタイプEl Torおよび古典型に対して完全な防御を与えることができる有力なコレラワクチン菌株である。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するコレラワクチンは、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むルリアブロスで３７℃の温度で成育し、２０％（容量／容量）グリセロールを含む同じ培地で−７０℃で保管することができる。
【０１０６】
上記の実施例は、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、非毒素産生性V. cholera菌株の分離法、およびコレラワクチンの製造におけるその使用に関する。本発明は、特にインスティテュート・オブ・マイクロバイアル・テクノロジー(Institute of Microbial Technology) 、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＴＣＣ）であって、本出願人らのコンスティテュエント・ラボラトリー(constituent laboratory)に寄託されて、受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１０を有しており、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル・メリーランド州、米国にも寄託されて、受託番号ＡＴＣＣ２０２０１０を有するV. cholerae 株を用いるコレラワクチンの製造法にも関する。本発明の方法によって製造されたワクチンは、動物実験で有効であることが明らかになった。ヒトでの試験で有効であることが明らかになれば、有効かつ安全なコレラワクチンは未だに入手可能ではないので、これをコレラ疾患の制御に用いることができる。本発明は、とりわけ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株を親株として用いるコレラワクチン製造法に関する。
【０００２】
背景技術
コレラを制御／予防する目的で、様々なワクチンが開発されてきた。非経口投与される完全死菌ワクチンは発展途上国で未だに用いられているが、防御は約５０％に過ぎず、これはまた数か月間でしかない。［(i)Fellay J.C. and Gangarosa (1978) 、コレラおよび関連の下痢（Ouchterlony, O. & Holmgren J. 監修）、第４３回ノーベル・シンポジウム・ストックホルム、２０４〜２１０頁、Karger、バーゼル。(ii) Svennerholm, A.M., Helmgren, J., Hanson, L.A., Lindblad, B.A., Quereshi, F. and Rahimtoola, R.J. (1977) Scand J Immunol 6, 1345-1349。(iii)Svennerholm, A.M. Hanson, L.A., Holmgren J., Lindblad B.S., Nilsson, and Quereshi, F. (1980) Infect Immun 30, 427-430］。組換えＤＮＡ技術の出現後、コレラ毒素Ａサブユニットを欠いている経口用の弱毒生菌株Vibrio cholerae は、腸にコロニー形成することによって感染によって誘導される免疫を模倣し、抗菌および抗毒素免疫を刺激するので、魅力的な候補であることが明かになった。［(i)Kaper, J.B., Lockman, H., Baldini, M.M. and Levine, M.M. (1984) Nature 308 655-658 。(ii) Kaper, J.B., Lockman, H., Baldini, M.M. and Levine, M.M. (1984) Biotechnology 2, 345-349。(iii)Mekalanos, J.J., Swartz, S.J., Pearson, G.D.N., Harford, N., Groyne, F. and M. de Wilde (1983) Nature 306, 551-557 ］。しかし、これまでに開発されたこれらの弱毒化したVibrio cholerae O1ワクチン菌株はいずれも、ボランティアで試験すると軽〜中度の下痢を起こすものであった。［(i) Levine, M.M., Kaper, J.B., Herrington, D.A., Losonsky, G., Morris, J.G., Clements, M.L., Black, R.E., Tall, B. and Hall, R. (1988) Infect Immun 56, 161-167 。(ii) Herrington, D., Hall, R., Losonsky, G., Mekalanos, J.J., Taylor, R.K. and Levine, M.M. (1988) J Exp Med 168, 1487-1492］。続いて、V. cholerae の毒性の強い菌株は、コレラ毒素に加えて他の毒素に対する遺伝子を有することが明かになった。更に、ｃｔｘＡＢ遺伝子は、実際にｃｔｘに加えて４種類の他の毒力遺伝子(virulence genes) 、すなわちｚｏｔ、ａｃｅ、ｃｅｐおよびｏｒｆＵをコードする毒力カセット(virulence cassette)の一部であることも明かになった。これらの因子総てをコードする遺伝子は可動性遺伝因子に属する。この要素の中で、総ての上記遺伝子はコア要素として知られているものに隣接配列として含まれている。このコア要素には、その両側にＲＳ１要素と呼ばれる２．７ｋｂ反復配列が隣接している。このＲＳ１要素は、毒素カセットのリコンビナーゼＡとは独立した組込み、重複、および増幅に関与する部位特異的組換え系をコードする。従って、次にこれら総ての既知の毒力遺伝子ｃｔｘＡ、ｚｏｔ、ａｃｅなどを欠いたワクチン菌株の作成を試みた。［Michalski, J., Galen, J.E., Fasano, A., and Kaper, J.B. (1993) Infect Immun 61, 4462-4468 ］。しかしながら、これらの菌株を試験したときに、ｚｏｔ、ace などを欠いていない他のプロトタイプワクチンと同様に反応原性であることが判明した。［Tacket, C.O., Losonsky, G., Nataro, J.P., Cryz, S.J., Edelman, R., Fasano, A., Michalski, J., Kaper, J.B. and Levine, M.M. (1993) J Infect Dis 168, 1536-1540 ］。
【０００３】
最近、本出願人らは、コレラワクチンに関する２つの南アフリカ国特許第９３／４７３６号および９５／００８２号明細書を見出だした。しかしながら、この南アフリカ国特許明細書に記載されている出発菌株は
1. Peru-2
2. Bang-2
3. Bah-2
4. Bengal-2
である。
【０００４】
菌株１〜３は、Taylor et al (1994) J. Infect Diseases 170, 1518-23 に記載されている。これらは天然の分離菌ではなく、ｃｔｘを製造する目的で遺伝子工学処理を施した菌株である。南アフリカ国特許明細書には、これらから軟寒天浸透力を欠いた突然変異株の開発が記載されている。
【０００５】
菌株４は、Waldor & Mekalanos (1994) J. Infect. Diseases, 170, 278 に記載されている。Bengal-2は遺伝子工学処理を施した構築物であり、V. cholerae 由来の天然のｃｔｘではない。Ｍ０２０はV. cholerae 0139株である。南アフリカ国特許明細書には、この菌株由来の軟寒天浸透力を欠いた突然変異株の開発が記載されている。
【０００６】
一方、本発明の出発菌株は、天然に存在するｃｔｘ ａｃｅ ｚｏｔ株である。これを処理してワクチン菌株を作成し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１ パークローン・ドライブ、ロックビル・メリーランド州２０８５２、米国に寄託されており、受託番号ＡＴＣＣ２０２０１１を受けており、これはコレラ毒素の免疫原性「Ｂ」サブユニットだけを産生する。
【０００７】
このような「欠失」法によって開発された様々なワクチンの候補によって提供された防御は良好であったが、これらの主要な欠点は、それら総てが軽度〜中度の下痢を引き起こす可能性があることであった。これらの初期のワクチン候補の反応原性は、かなりの程度まで親菌株に含まれる未知の因子によるものと思われた。安全（すなわち、非反応原性）でありかつ防御性の高い理想的なコレラワクチンの開発におけるこの問題を回避するには、代替法は、生物学的分析法で非毒素産生性でありかつ総ての既知の毒力遺伝子を欠いている菌株からワクチンを開発することであろう。
【０００８】
【発明の概要】
従って、本発明の主要な目的は、コレラワクチンの製造法を提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae の非毒素産生性株を用いてコレラワクチンの製造法を提供することである。
【００１０】
更にもう一つの本発明の目的は、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するコレラワクチンであって、免疫原性ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する非毒素産生性V. cholerae 株の染色体に組込むことによって構築されたものの製造に関する。
【００１１】
従って、本発明では、ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae の菌株の分離法、およびコレラの予防に用いられるコレラワクチンの製造法であって、
a. V. cholerae に特異的な選択培地上にコレラ患者の糞便を塗布することによって、この糞便からからV. cholerae を分離し、
b. 段階(a) の方法で分離した菌株V. cholerae の個体群から非毒素産生性株V. cholerae を分離し（この株はインスティテュート・オブ・マイクロバイアル・テクノロジー(Institute of Microbial Technology) （ＩＭＴ）、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＴＣＣ）であって、本出願人らのコンスティテュエント・ラボラトリー(constituent laboratory)に寄託されて、受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１０を有する）、
c. 免疫原性コレラ毒素（ｃｔｘ）Ｂサブユニット遺伝子を受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）の菌株の染色体に通常の方法によって組込み、ワクチンを産生させる
ことを含んでなる、方法が提供される。
【００１２】
【発明の具体的な説明】
本明細書で用いる様々な科学用語を、下記のようにアルファベット順に説明する。
【００１３】
アニーリングは、相補性塩基配列を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一本鎖が対になって二本鎖分子を形成することを表す。
【００１４】
クローンは、単一の祖先細胞またはプラスミド分子から誘導される多数の細胞またはプラスミド分子を表し、コロニーは、単一親細胞の反復分裂によって固体増殖培地で形成された目に見える細胞のクラスターを表す。
【００１５】
組換えＤＮＡ技術におけるクローニングは、特異的遺伝子またはＤＮＡ断片のプラスミドまたはファージＤＮＡのような複製可能なＤＮＡ分子への連結を表す。
【００１６】
コロニーは、単一親細胞の反復分裂によって固体増殖培地に形成された目に見える細胞のクラスターを表す。
コロニー形成は、細菌が特定の部位に止まり、増殖する能力を表す。
【００１７】
変性は、ＤＮＡの二本鎖分子から一本鎖への転換を表す。
【００１８】
ＤＮＡは、共有結合したデオキシヌクレオチド単位から形成される高分子であるデオキシリボ核酸を表す。
【００１９】
ＤＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合によって２個のＤＮＡ分子を結合する酵素である。
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型鎖の指導下でデオキシヌクレオチドからＤＮＡの合成を触媒する酵素である。
【００２１】
ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドの順序の決定を表す。
【００２２】
電解質は、負荷した電場に応答して固体支持体中で（分子の大きさの差による）分子の異なる移動速度に基づいて分子を分離するのに用いられる技術である。
【００２３】
電気穿孔は、電場による細胞中へのＤＮＡ分子の導入を表す。
【００２４】
エンテロトキシンは、腸粘膜上で特異的に作用する細菌によって分泌されるタンパク質毒素を表す。
【００２５】
遺伝子は、リボ核酸（ＲＮＡ）に転写される遺伝情報を含む遺伝単位を表し、これが加工されかつ直接機能し、またはポリペプチド鎖に翻訳される。ゲノムは、細胞によって運ばれる遺伝情報の総量を表す。相同組換えは、同一ＤＮＡ配列間での遺伝子交換を表す。
【００２６】
ハイブリダイゼーションは、２個の相補性核酸鎖がアニーリング期中に二重螺旋を構成する工程であって、特異的ヌクレオチド配列を検出するための強力な手法を表す。
【００２７】
免疫は、疾患を引き起こす薬剤に対する生物の抵抗力を表す。
【００２８】
免疫原は、免疫応答を誘導する抗原である。
【００２９】
オリゴヌクレオチドは、短い一本鎖核酸を表す。
【００３０】
オペロンは、単一プロモーターから単一メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に転写される隣接遺伝子の群を表す。
【００３１】
プラスミドは、宿主染色体の独立体(independant) を複製する染色体外遺伝要素であり、クローニングベクターとして用いられる。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、複数の重合サイクルのそれぞれの後に短時間加熱処理を行い、相補性鎖を分離することによってＤＮＡの特異領域を増幅する手法である。
【００３３】
プライマーは、長いＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションし、例えばポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡポリメラーゼによって伸張することができるオリゴヌクレオチドを表す。
【００３４】
プローブは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション分析に用いる放射性ＤＮＡ分子を表す。
【００３５】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する特異的ＤＮＡ配列を表す。
【００３６】
タンパク質は、特異配列におけるペプチド結合によって互いに連結したアミノ酸の線状ポリマーを表す。
【００３７】
組換えＤＮＡ技術は、異なるＤＮＡ分子からのＤＮＡセグメントを結合することによって新たなＤＮＡ分子を生成させるための手続きを表す。
【００３８】
組換えは、染色体またはＤＮＡ分子を分裂させた後、新たな組み合わせで再結合させる工程である。
【００３９】
制限酵素は、ＤＮＡ分子の短いヌクレオチド配列（制限部位）を認識し、その部位における分子を開裂するヌクレアーゼである。
【００４０】
リボソーム結合部位またはシャイン・ダルガルノ配列は、リボソームが結合してタンパク質合成を開始する原核ｍＲＮＡ分子の塩基配列である。
【００４１】
選択は、抗生物質に対する耐性の選択の方法と同様に、所望なタイプの細胞だけが生き残ることができる方法で設計した手続きを表す。
【００４２】
サザンハイブリダイゼーションは、核酸の電気泳動による分離の後に、変性ＤＮＡをゲルから膜フィルターへ移し、次いで再結合の条件下で放射性ＤＮＡプローブに暴露する工程である。放射性領域は、プローブと相同のＤＮＡセグメントに位置している。
【００４３】
開始コドンは、ｍＲＮＡ上のトリプレット配列ＡＵＧであって、ここからポリペプチド鎖への翻訳が開始するものを表す。
【００４４】
付着末端は、同じ分子の他端のまたは異なる分子の末端の一本鎖領域に相補性である二本鎖ＤＮＡ分子の末端の一本鎖領域を表す。
【００４５】
停止コドンは、ポリペプチド合成が停止する３種類のｍＲＮＡコドンＵＧＧ、ＵＡＡ、ＵＧＡの一つを表す。
【００４６】
サブユニットは、数本のポリペプチド鎖を含むタンパク質の一部であるポリペプチド鎖を表す。
【００４７】
自殺ベクターは、複製に必要な成分を提供しない宿主細胞で複製できないプラスミドベクターを表す。
【００４８】
タンデム重複は、同じ方向での隣接配列の染色体上でのＤＮＡセグメントの反復を表す。
【００４９】
鋳型は、塩基配列がポリメラーゼ連鎖反応でコピーされる核酸鎖である。
【００５０】
転写は、ＤＮＡのコード鎖に含まれる情報を相補性塩基配列の一本鎖ＤＮＡ分子にコピーする工程を表す。
【００５１】
転写アクチベーターは、ＤＮＡの特定部位に結合することによって転写を刺激する正の制御要素である。
【００５２】
転写ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるＲＮＡ転写体の末端に表されるＤＮＡの配列である。
【００５３】
転写開始部位は、ここからＤＮＡがＲＮＡ分子に転写される塩基である。
【００５４】
形質転換は、細菌細胞へのＤＮＡの導入を表す。
【００５５】
翻訳は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、リボソームと関連したｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列から誘導される工程を表す。
【００５６】
ベクターは、ＤＮＡセグメントを一つの生物からもう一つの生物へ運ぶことができるプラスミドクローニングビヒクルを表す。
【００５７】
コレラは、グラム陰性細菌Vibrio cholerae (V. cholerae) によって引き起こされる致命的な下痢性疾患である。数百万の人々の生命を奪ってきたこの疾患は、毎年約５０万人が罹患する主要な世界的な健康問題であり続けている。今日では、コレラに冒されていない世界の国はほとんどなく、世界保険機構（ＷＨＯ）によれば、輸入だけによるコレラの症例が報告されているヨーロッパでさえも、１９９４年には固有のコレラの症例が３０倍に増加したこと登録されている。
【００５８】
コレラで見られる激しい下痢は、コレラ毒素と呼ばれる細胞外エンテロトキシンに対する宿主の反応の結果である。コレラ毒素は、２種類の異なるタンパク質サブユニットからなり、ｃｔｘ ＡＢ（またはｃｔｘオペロン）と呼ばれる単一オペロンを形成する遺伝子ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢによってコードされる。単一のＡサブユニットと５個のＢサブユニットが、完全な毒素分子を構成している。腸上皮細胞の水および電解質バランスの微妙な制御を混乱させることによる粒体の損失に関与するのは、コレラ毒素である。Ｂサブユニットが宿主腸膜に結合して、触媒的なＡサブユニットが宿主の粘膜細胞に侵入するのを助けるものと思われる。Ｂサブユニットは、免疫原性でもあり、宿主の抗毒素免疫を誘導することができる。
【００５９】
本発明の主要な知見は、コレラ毒素の免疫原性Ｂサブユニット遺伝子を溶血素Ａ遺伝子（ｈｌｙＡ）における標的遺伝子組換えによりV. cholerae の非毒素産生性菌株の染色体に組込み、ｈｌｙＡを分断することである。
【００６０】
本発明は、非毒素産生性であり、既知の毒力遺伝子を欠き、良好なコロナイザー(colonizer) である血清型Ｏ１のV. cholerae の菌株から誘導される。この菌株はコレラ患者から回収された臨床的分離物であり、Ｏ１血清群、イナバ血清型のVibrio cholerae として同定され、エルトール生物型に属する。この菌株を、コレラ毒素、閉鎖帯毒素、副コレラエンテロトキシンなどの毒力関連因子に特異的なＤＮＡプローブの群を用いてV. cholerae の数百種類の菌株をスクリーニングした後に選択される。この菌株は、通常は毒素産生性株の４．５ｋｂ領域に位置した毒力パッケージを持たないので、コレラ毒素、または流体蓄積を悪化させることが報告されている他の既知の二次的毒素を産生しない。しかしながら、この菌株はエルトール溶血素Ａ遺伝子を有しており、免疫原性ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を組込みこれをコレラ毒素のＢサブユニットのプロデューサーとするのに好適な染色体上の標的である。この菌株は、腸でのこの菌株のコロニー形成に必要な毒素コレギュレーテドパイラスＡ(toxin coregulated pilus A) （ｔｃｐＡ）およびｃｔｘＢサブユニット遺伝子の発現の促進に必要なｔｏｘＲも有している。経口用組換えワクチンを開発するための出発菌株としてＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０を有する菌株を選択するのは、下記の理由によるものである。
1. 受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する菌株は、結紮回腸ループウサギモデルで流体を蓄積することができず、この菌株は分泌原性因子(secretogenic factors)を全く産生しないことを示している。
2. この菌株は、ＲＩＴＡＲＤモデルによって検討したところ、ウサギに悪影響を全く与えない、すなわちこの菌株は反応原性(reactogenic) ではない。
3. この菌株は、非反応原性であるにもかかわらず、ウサギモデルで著しいコロニー形成能を示し、これはVibrio cholerae のコロニー形成を助長する重要な因子である毒素共制御繊毛（coregulated pilns）が存在することによるものと思われ、この存在はサザンハイブリダイゼーションによる研究によって直接決定された。ｃｔｘＢ遺伝子がそれ自身のプロモーターおよびそれ自身のシャイン・ダルガルノ配列と共にこの菌株の染色体に導入されると、これにより消化管でこの遺伝子の発現が最適になることが判った。このようにして作製された組換えV. cholerae クローンは、動物モデルの検討において有効なワクチンとして現れることも判っている。
【００６１】
本発明の詳細な手続きを下記に示す。
ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親 V. cholerae の分離
コレラ患者の糞便標本を、無菌カテーテルで無菌マッカートニーボトルに採取した。採取後まもなく、糞便標本を実験室に輸送し、２時間以内にV. cholerae 、およびエンテロトキシン原性E. coli （ＥＴＥＣ）、Shigella、SalmonellaおよびCampylobacter spp.のような他の普通に見られる腸病原菌について標準的な公表された手法（下痢性疾患の制御のためのＷ．Ｈ．Ｏ．プログラム(W.H.O. Program for control of diarrhoeal diseases)（ＣＣＤ／８３．３改版１）、急性腸感染症の実験室での検討のためのマニュアル(Manual for laboratory investigations of acute enteric infections)、ジュネーブ、Ｗ．Ｈ．Ｏ．、１９８７年）によって検討した。
【００６２】
糞便標本からのV. cholerae 菌株を、V. cholerae に特異的なチオ硫酸塩−クエン酸胆汁塩スクロース寒天（ＴＣＢＳ）、亜テルル酸塩タウロコール酸塩ゼラチン寒天（ＴＴＧＡ）、ビブリオ寒天、スクロース亜テルル酸塩ティーポール培地、およびポリミキシンマンノース亜テルル酸塩寒天のような選択的培地上で糞便標本を培養することによって分離した。コロニーとして成長したV. cholerae 菌株を手動で集めた。このようにして得られた数百種類の菌株を、生化学試験によるV. cholerae の同定に特異的な培地で成育した。V. cholerae O1（血清型）であることが明かとなった数百種類の菌株を、ルリアブロス寒天上で個々のコロニーとして成育し、毒素遺伝子ｃｔｘ、ｚｏｔおよびａｃｅに特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることによってスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼーション実験は既知の方法で行った。毒素遺伝子ｖｉｚ、ｃｔｘ、ｚｏｔ、ａｃｅを欠いていることが判った菌株を、既知の方法によってコレラ毒素様および他の細胞毒素活性について試験した(Oku Y., Uesaka Y., Hirayama T., Takeda Y., Microbial Immunol., 1988, 32, 807-816 およびNair G.B., Oku Y., Takeda Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54, 3180-3182)。
【００６３】
これらの菌株の一つは毒素遺伝子を持たず、コレラ毒素様および他の細胞毒素活性を持たなかった。このV. cholerae は、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）の菌株である。この菌株では、潜在的溶血素Ａ遺伝子の存在をｈｌｙＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによって確かめた。コレラワクチンの製造のためのｃｔｘサブユニット遺伝子の組込みはｈｌｙＡ座における標的組換えによって行わなければならないので、これは本質的なことである。ｔｃｐＡ遺伝子の生成物は、腸におけるVibrio cholerae の効果的なコロニー形成に要する線毛の主成分であるので、その存在は、ｔｃｐＡプローブによるハイブリダイゼーションによっても確かめた。更に、ｃｔｘプロモーターの制御下での遺伝子の最適発現には転写活性化因子ＴｏｘＲが必要であるので、ｔｏｘＲ遺伝子の存在はｔｏｘＲプローブによるハイブリダイゼーションによって確かめた。
【００６４】
V. cholerae 株Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）は、De S.N., Nature 183, 1533-1534 (1949) およびFormal et al., Br. J. Exp. Pathol., 42, 504-510 (1961)に記載の結紮回腸ループ分析法で試験した。この菌株は結紮回腸ループウサギモデルで流体を蓄積することができず、この菌株は分泌原性因子を全く産生しないことを示している。
【００６５】
この菌株は、通常の方法の後にＲＩＴＡＲＤモデルによって検討したところ、ウサギに悪影響を全く与えない、すなわちこの菌株は反応原性ではない。この菌株は非反応原性ではあるが、通常の方法によって測定したところ顕著なコロニー形成能を示し、これは菌株にとって有効なワクチンとして機能することが必要とされている。
【００６６】
受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株は３０〜３７℃の温度でルリカ培地で成育させ、−８０℃〜−６０℃で２０％（容量／容量）グリセロールを加えた同じ培地に保管することができる。
【００６７】
ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae の親株を用いてワクチンの製造を促進するには、ｈｌｙＡ遺伝子配列が隣接したｃｔｘサブユニット遺伝子を構築する一連の遺伝子操作を行わなければならない。これらの段階を下記に示す。
(i) それ自身のＳＤ配列とｃｔｘ−オペロンのプロモーターとを用いて最初にV. cholerae 569B株（ナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージス(National Institure of Cholera and Enteric Diseases)）の染色体由来のコレラ毒素（ｃｔｘ）オペロンをクローニングした後、逆ＰＣＲによってクローニングしたオペロンからｃｔｘＡサブユニット遺伝子を欠失させることによるｃｔｘＢサブユニット遺伝子の構築物の作成。
(ii) 標的組換えを目的とした標的座溶血素Ａ遺伝子（ｈｌｙＡ）のクローニング。
(iii) 段階(i) で得られるようなｃｔｘＢサブユニット遺伝子構築物によるｈｌｙＡ遺伝子配列の分断。
(iv) ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有する分断ｈｌｙＡ構築物の自殺プラスミドベクターへのクローニング。
(v) 分断されたｈｌｙＡ構築物を有する自殺ベクターを連結によって（段階(ii)で得た）親株に移動させてｈｌｙＡ遺伝子におけるｃｔｘＢ遺伝子構築物の標的組込み。
(vi) 組込まれたｃｔｘＢ遺伝子を有する組換えV. cholerae クローンのハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応による同定。
【００６８】
これらの操作の第一段階は、既知のVibrio cholerae のｃｔｘオペロンをクローニングすることであった。既知のVibrio cholerae O1株569Bのｃｔｘオペロンを、ポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムから増幅した後、クローニングした。ポリメラーゼ連鎖反応では、Vibrio cholerae 569B染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ｃｔｘオペロンをプライマーＣＴ１およびＣＴ２で増幅する。オリゴヌクレオチドＣＴ１（５′ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ３′）は、ｃｔｘオペロンの転写開始部位の１４９〜１７２ヌクレオチド上流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。オリゴヌクレオチドＣＴ２（５′ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴＣ ３′）は、ｃｔｘの停止コドンの４３〜６７ヌクレオチド下流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。これらの２個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡ配列を増幅するときには、生成物は、プロモーターおよび５′末端の上流ＴｏｘＲ結合反復と一緒にコレラ毒素ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子、およびオペロンの３′末端の転写終結シグナルからなる完全ｃｔｘオペロンである。ポリメラーゼ連鎖反応では、初期変性段階に続いて、反応を変性段階、アニーリング段階および伸張段階で約３０回循環させた。最後のサイクルの終りに、追加の伸張段階を加えた。ポリメラーゼ連鎖反応の後に、反応混合物を等容のフェノール：クロロホルムの５０：５０混合物で抽出した。水相をSephadex G50スパン・カラム(spun column) を通過させて遊離ヌクレオチドを除去し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを再懸濁させた後、これをｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理した。これにより、５′ＴＴ−ジヌクレオチドオーバーハングを有する増幅ＤＮＡ生成物を得た。上記のようにして改質した増幅ＤＮＡをクローニングするため、プラスミドベクターｐＢＳ＋を、最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、これをｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理した。この処理により、線状化したｐＢＳ＋ベクターＤＮＡの両端の５′ＡＡオーバーハングを得た。このベクターＤＮＡ調製物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに１：２のモル比で連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成する組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘオペロン上の部位が知られている制限酵素（例えば、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ）によって分析した。ｐＧＴ１と呼ばれる一つのクローンのインサートは、制限分析およびシークエンス法によって確かめたところ、完全ｃｔｘオペロンを有している。ヌクレオチド配列を決定して、ポリメラーゼ連鎖反応中に導入されるエラーの可能性を排除した。このプラスミドクローンｐＧＴ１を、次の段階で用いた。これは、プロモーターおよび５′末端の上流ＴｏｘＲ結合反復と一緒にコレラ毒素ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子、およびオペロンの３′末端の転写終結シグナルからなる完全ｃｔｘオペロンを有する。
【００６９】
次の段階では、プラスミドクローンｐＧＴ１からの完全ｃｔｘ−Ａコード配列を互いに異なりかつｃｔｘ−Ａ遺伝子を除くプラスミドを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆ポリメラーゼ連鎖反応によって欠失を行った。逆ポリメラーゼ連鎖反応は、リン酸化オリゴヌクレオチドＣＴ３およびＣＴ４をプライマーとして、プラスミドｐＧＴ１を鋳型ＤＮＡとして用いて行った。生成する増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。次いで、これをｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＣＴ３に相当する末端に５′ＧＧ−オーバハングを、ＣＴ４に相当する末端に５′ＣＣ−オーバーハングを生成した。互いに相補性の上記ジヌクレオチドオーバハングを有する末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結生成物を用いて、E. coli Sure株を電気穿孔によって形質転換した。逆ポリメラーゼ連鎖反応生成物の再環状化によって、ｃｔｘプロモーターとｃｔｘＢサブユニット遺伝子が融合した。この構築物ｃｔｘプロモーター−Ｂは上記で説明したようにＣＴ１およびＣＴ２をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応によって様々なプラスミドクローンで同定され、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物に相当する０．６３キロベース断片を生成する。このｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物において、ｃｔｘＢサブユニット遺伝子はｃｔｘオペロンプロモーターによって制御され、その翻訳はそれ自身のＳＤ配列で開始される。様々なクローンからのＢサブユニットの発現は、ビーズＥＬＩＺＡ分析法によって確認した。一つのプラスミドクローンｐＧＴ３．１のｃｔｘ−プロモーター−Ｂ構築物のヌクレオチド配列を決定して、プロモーター−Ｂサブユニット遺伝子融合点の配列を分析した。ｐＧＴ３．１からのｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を後の段階で用いて、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子を分断した。
【００７０】
ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株にｈｌｙＡ遺伝子での標的組換えによって導入されることが決定されたので、構築物を作成してクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列をｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断するのが重要であった。このためには、V. cholerae の遺伝子をクローニングすることが必要であった。５′隣接領域および３′側のコード領域の大部分を欠いている部分ｈｌｙＡ遺伝子配列を、Vibrio cholerae ゲノムからのその増幅の後にクローニングした。ｈｌｙＡ遺伝子の完全コード領域の大きさは約２．２キロベースであり、そのｈｌｙＡ遺伝子の１．７キロベースを０１血清型菌株のV. cholerae のゲノムＤＮＡから増幅した。初期変性段階の後の適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応では、反応を変性段階、アニーリング段階および伸張段階を通って反復した。最後のサイクルの終りに、追加の伸張段階を加えた。ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、１．７キロベースＤＮＡ断片の存在についてアガロースゲル電気穿孔によって分析した。反応生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。精製ＤＮＡをｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、末端に５′ＴＴ−オーバーハングを生成させた。上記のように改質した末端を有する増幅ｈｌｙＡ遺伝子をクローニングするため、プラスミドベクターｐＵＣ９を最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、これをｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、両端に５′ＡＡオーバーハングを生成した。このベクターＤＮＡ調製物をＴ４ ＤＮＡリガーゼによって５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成するプラスミドクローンを、制限酵素エンドヌクレアーゼで消化することによって分析した。１．７キロベースのｈｌｙＡインサートを有するプラスミドクローンの一つｐＧＴ８９を次の段階で用いて、ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物によってｈｌｙＡ配列を分断した。
【００７１】
次の段階では、ｐＧＴ３．１のｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をオリゴヌクレオチドプライマーＣＴ１およびＣＴ２を用いて増幅した。増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、エタノール沈澱を行った。精製ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物断片を、ｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、両端に５′ＴＴ−オーバハングを生成した。５′ＴＴ−オーバハングを有するｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を、０．４キロベースＨｐａＩ断片の代わりにクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央に挿入した。プラスミドベクターｐＵＣ９はＨｐａＩ酵素の部位を有していないので、ｐＧＴ８９をＨｐａＩで消化すると、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央からの０．４キロベースの断片と３．９キロベースの断片を生じる。ｐＧＴ８９をＨｐａＩ酵素で消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。３．９キロベースのＨｐａＩ断片を電気溶出して精製した。次に、これをｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって処理して、両端に５′ＡＡ−オーバーハングを生成した。５′ＡＡ−オーバーハングを有する３．９キロベース断片を、５′ＴＴ−オーバーハングを有するｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物にＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結混合物を用いて、E. coli 「Sure」株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩ酵素で消化すると、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断されたｈｌｙＡ遺伝子配列の１．９キロベースインサートが得られた。一つの組換えプラスミドｐＧＴ３９からのＥｃｏＲＩインサートを用いて、これを自殺ベクターｐＧＰ７０４にクローニングした(Miller V.L. and J.J. Mekalanos (1988) J. Bac., 170, 2575-2583) 。
【００７２】
次の段階では、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を隣接ｈｌｙＡ配列と共に、プラスミド自殺ベクターにクローニングした。プラスミド自殺ｐＧＰ７０４をＥｃｏＲＩ酵素で消化し、線状化したベクターの５′リン酸基を子牛腸ホスファターゼで処理することによって除去した。ＥｃｏＲＩで消化して脱リン酸化したｐＧＰ７０４を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、相当するＤＮＡバンドを電気溶出して、精製した。これは、ベクターＤＮＡ調製物中に微量の未消化ベクターＤＮＡも存在しないようにする目的で行った。次に、これをＴ４ ＤＮＡリガーゼによってｐＧＴ３９の１．９キロベースＥｃｏＲＩインサートに１：５のモル比で連結し、この連結混合物を用いてE. coli SM10 pir株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンは、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩで消化したところ、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって分断されたクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列を表す１．９キロベースのインサートを得た。クローンｐＧＴ２７の一つを用いて、ｈｌｙＡ遺伝子での組込みのため受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株に移動した。
【００７３】
次の段階では、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とプラスミドｐＧＴ２７を含むE. coli SM10 pir株との接合によって、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae O1株へのｐＧＴ２７の移動を行った。E. coli 宿主株SM10 pir中のプラスミドクローンｐＧＴ２７と受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とは、振盪せずに対数中央増殖相(midlog phase)まではＬＢで成育した。少量のドナー株、すなわちｐＧＴ２７を有するSM10 pir株と等量のレシピエント株、すなわち受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株を１．５ｍｌ微量遠沈管中で混合し、短時間遠心分離を行い、底部に細胞を集めた。上清を除去した後、ルリアブロスを細胞ペレットに加え、細胞をピペットで吸い込みおよび吐き出しを行うことによってブロスに懸濁した。次に、細胞懸濁液をＬＢ寒天培地の表面に置いた０．４ｍｍメンブランディスク上にスポットした。懸濁液は、直ぐにメンブランに吸収された。メンブラン上のドナーおよびレシピエント細胞を、３７℃で約４〜９時間一緒に合わせたままにした。次に、メンブランフィルターを試験管に集め、ルリアブロス１ｍｌを加えた。メンブラン上の細胞を、短時間混合することによって培地に再懸濁した。このようにして得た懸濁液を、ストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌと適当な濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、ゲノム中に組込まれたプラスミドｐＧＴ２７を有する受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する組換え体V. cholerae だけを選択した。（アンピシリン耐性は、自殺プラスミドベクターによって付与される。）受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親V. cholerae のアンピシリンに対する感受性をチェックしたところ、５μｇ／ｍｌ程度の低濃度のアンピシリンでもＬＢ寒天培地上でのその成育を完全に阻止することができることを見出だした。従って、ｐＧＴ２７を組込んだ組換えクローンの選択は、ストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌと１０〜１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で行った。
【００７４】
組換えV. cholerae クローンはコロニーハイブリダイゼーションによって同定した後、上記プレート上に現れるコロニーをｃｔｘ Ｂ遺伝子をプローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーションによって分析した。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するレシピエントV. cholerae はｃｔｘオペロンを有しておらず、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物はｐＧＴ２７を介して導入されるので、ｐＧＴ２７を組込んだ組換えV. cholerae クローンだけがｃｔｘ Ｂ遺伝子プローブとハイブリダイゼーションを行うと予想された。総てのアンピシリン耐性コロニーはｃｔｘ Ｂプローブにハイブリダイゼーションした。数種類のコロニーから、染色体ＤＮＡを分離して、ｈｌｙ Ａ特異的プライマーＨＡ１およびＨＡ２との別のポリメラーゼ連鎖反応における鋳型ＤＮＡとして用いた。これらの２種類のプライマーは、野生型ｈｌｙＡ遺伝子からの１．７キロベースの配列と、ｈｌｙＡ遺伝子配列がｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって分断されているｐＧＴ２７からの１．９キロベースの配列を画定する。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるときには、これらのプライマーは１．７キロベースの配列だけを増幅し、組換えV. cholerae の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるときには、これらのプライマーは１．７キロベース断片の他に１．９キロベース断片も増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応によって試験した総てのクローンでは、上記断片はプライマーＨＡ１およびＨＡ２によって増幅された。これらのクローンからのｃｔｘＢサブユニットの発現は、「高感受性ビーズ−酵素結合イムノソーベントアッセイによるコレラ毒素の検出(Detection of cholera toxin by a highly sensitive bead-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)」、Yoshihiko Uesaka, Yoko Otsuka, Miksuaki Ka hida, Yuichi Oku, Kazuki Horigome, G. Balakrish Nair, S.C. Pal, Shinji Yamasaki and Yoshifumi Takeda, Microbiol. Immunology, Vol. 36(1), 43-53, (1992) の文献に記載の方法によってビーズ−ＥＬＩＺＡによって分析した。
【００７５】
ゲノムサザンハイブリダイゼーションを行うため、組換えV. cholerae クローンから分離したゲノムＤＮＡをそれぞれＸｂａＩ、ＳａｌＩおよびＨｐａＩで消化した。個々の制限消化のＤＮＡ断片をアガロースゲル上で電気泳動によって分離し、サザントランスファーによってナイロンメンブラン上に移して、固定した。固定したＤＮＡを、別個の実験でｃｔｘ Ｂプローブおよびｈｌｙ Ａプローブを用いてハイブリダイゼーションした。ゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果を分析したところ、ｐＧＴ２７は実際に受託番号Ｂ００１０を有するV. cholerae のｈｌｙＡ遺伝子に組込まれていることが明かとなった。ｐＧＴ２７は数個の組換えクローンにおいてタンデムに反復していることも明かとなった。クローンの一つをワクチン株として選択して、動物モデルで試験した。このコレラワクチン株は、インスティテュート・オブ・マイクロバイアル・テクノロジー(Institute of Microbial Technology) 、チャンディガル、インドのマイクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション、本出願人らのコンスティテュエント・ラボラトリー(constituent laboratory)に寄託されて、受託番号ＭＴＣＣ Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を得ている。この菌株は３０〜３７℃の温度でルリアブロス培地で成育させ、２０％（容量／容量）グリセロールを含む同じ培地に−８０〜−６０℃で保管することができる。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株によるコレラ毒素のＢサブユニットを産生する能力を、Yoshihiko Uesaka, Yoko Otsuka, Miksuaki Ka hida, Yuichi Oku, Kazuki Horigome, G. Balakrish Nair, S.C. Pal, Shinji Yamasaki and Yoshifumi Takeda, Microbiol. Immunology, Vol. 36(1), 43-53, (1992) によるビーズ−ＥＬＩＺＡを用いて監視した。親株（ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０）はＢサブユニットを産生しなかったが、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株はＢサブユニットを多量に産生した。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するこの菌株によって産生されるＢサブユニットの量は、高い光学密度によって示されるように受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する菌株の数倍以上であり、単一コピーだけを有する後者と比較して前者はＣＴ−Ｂの多重コピーを有しているからであった。遺伝子操作を適当に行うことを決定したならば、次に行うことは、ワクチンが結紮ウサギ回腸ループ分析法で流体蓄積を誘導するかどうかを決定することであった。結紮回腸ループ分析法（ウサギモデル）は、De, S.N., Nature 183, 1533-1534 (1959)、およびFormal, S.B., Kundel, D., Schneider, H., Hunev, N. and Sprinz, H., Br. J. Exp. Pathol., 42, 504-510 (1961)に記載の方法で行った。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株は、流体蓄積を誘導しなかった。これにより、ワクチン構築物はＢサブユニットを産生するが、予想されるようにこのサブユニットは無毒でありかつ流体蓄積を誘導することはできないことが証明された。次の一連の実験は、ワクチン菌株がイン・ビボウサギモデルを用いて反応原性であるかどうかを決定することであった。ＲＩＴＡＲＤモデルによるウサギでのワクチン試験は、Spira, N.M., Sack, R.B. and Froehlich, J.L., (1981), Infect. Immun., 32, 739-747に記載の方法で行った。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株は、ウサギに経口投与したときには下痢を誘発しないことは明かであった。これらの結果に基づいて、El Torおよび古典型バイオタイプに属する０１血清型のV. cholerae の菌株を用いて、数バッチでチャレンジを検討した。ウサギでのチャレンジ試験のデーターは、下記のようにまとめることができる。
1. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株で免疫したウサギは、古典的バイオタイプおよびE1 Torバイオタイプ株によるチャレンジから有意に保護された。これは、免疫ウサギでは下痢が見られなかったのに対し、コントロールウサギでは激しい下痢が見られたことから明かであった。
2. 免疫ウサギでのチャレンジ株のコロニー形成能は、コントロールウサギと比較して有意に低かった。
3. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の非反応原性は、コントロールウサギでの下痢を誘発することができないことによっても明かであった。
4. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の免疫原性は、ワクチン株を経口免疫したウサギの免疫前血清と比較して免疫血清では、リポ多糖類、外膜タンパク質、全細胞溶解物およびコレラ毒素に対する抗体力価が有意に上昇したので明かであった。
【００７６】
上記の総ての実験手続きは、下記の標準的方法および実験条件に従って行う。
【００７７】
Escherichia coliおよびVibrio cholerae 株は、ルリアブロス（ＬＢ）で成育させ、維持した。必要ならば、適当な抗生物質を成長培地に加えた。アンピシリン、ストレプトマイシン硫酸塩貯蔵物、ＬＢ培地、および最近を取り扱うための他の細目の調製は、J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis 著の分子クローニング(Molecular cloning) （１９８９年）、Cold Spring Harbour Laboratoryに従って行った。
【００７８】
ポリメラーゼ連鎖反応は、VentＤＮＡポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ＋）を用いて行い、基本的反応条件は、総容量１００μｌ中で１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、４ｍＭＭｇＳＯ４、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．１％Triton X-100、１μＭプライマー、染色体ＤＮＡ鋳型１００ｎｇまたはプラスミドＤＮＡ鋳型１０〜２０ｎｇ、およびVentＤＮＡポリメラーゼ２単位であった。
【００７９】
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの処理は、適当なｄＮＴＰの存在下にて、３３ｍＭトリス酢酸塩（ｐＨ８．０）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭジチオトレイトール、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ２単位中で１２℃で３０分間行った。
【００８０】
E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片によるＤＮＡの処理は、適当なｄＮＴＰの存在下にて、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、および酵素１単位中で室温で２０分間行った。
【００８１】
ＤＮＡの連結は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１．５単位、および０．５ｍＭ ＡＴＰ中で１２℃で１２〜１６時間行った。
【００８２】
E. coli 細胞の形質転換は、BIORAD遺伝子パルサーを用いる電気穿孔によって行った。E. coli 細胞の調製または電気穿孔、および電気穿孔の詳細は、製造業者の指示に従って行った。
【００８３】
ＤＮＡのジデオキシヌクレオチドシークエンス法は、the United States Biochemicals社、クリーブランド、オハイオ州、米国から得たシークエナーゼキットを用いて行った。
【００８４】
プラスミドＤＮＡの分離操作、ＤＮＡの制限酵素による消化、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の電気溶出、ＤＮＡのフェノール抽出による精製、ポリメラーゼ連鎖反応からの遊離ヌクレオチドを除去するためのSephadex G-50 でのスパンカラムクロマトグラフィ、ＤＮＡのエタノールによる沈澱、ＤＮＡプローブの放射性標識、コロニーハイブリダイゼーション、およびサザンハイブリダイゼーションプロトコールは、総て本質的にはJ. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis 著の分子クローニング(Molecular cloning) （１９８９年）、Cold Spring Harbour Laboratoryに記載された通りである。Vibrio cholerae からゲノムＤＮＡを分離するためのプロトコールは、Ausubel et al 著のカレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)（１９８７年）、Massachusetts General Hospital & Harvard Medical School に従って行った。
【００８５】
【実施例】
本発明の方法を下記の実施例によって例示するが、これは本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００８６】
実施例１ ＭＴＣＣ受託番号Ｂ００１０を有する親株 V. cholerae の分離
コレラ患者からの糞便標本を、伝染病病院(Infectious Diseases Hospital)、カルカッタの承認により直ちに滅菌マッカートニーボトルに滅菌カテーテルで採取した。採取後まもなく、糞便標本を実験室に輸送して、２時間以内にV. cholerae 、および腸毒素産生性E. coli （ＥＴＥＣ）、シゲラ、サルモネラおよびカンピロバクター種のような他の普通に見られる毒素産生性腸病原菌について、標準的な公表されている手法（世界保険機構、下痢性疾患の制御プログラム［ＣＣＤ／８３．３、改版１］、急性腸感染症の実験室検討のためのマニュアル(Manual for laboratory investigations of acute enteric infections)、世界保険機構、１９８７年）によって検討した。糞便標本のV. cholerae 菌株を同定するため、チオ硫酸塩−クエン酸塩−胆汁塩−スクロース寒天（ＴＣＢＳ、栄研、日本国）に糞便標本をループで２または３回塗布して、V. cholerae の選択分離を行った。３７℃で一晩インキュベーションした後、選択寒天上で成育を示すそれぞれの糞便試料からのコロニーを多目的試験培地に接種した(Nair GB, Misra S, Bhadra RK, Pal SC, Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53, 1203-1205) 。多目的試験培地で典型的なアルカリスラント−酸バット反応(alkaline slant-acid butt reaction) を示す菌株をオキシダーゼ反応について検討し、スライド凝集反応をナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージス(National Institute of Cholera and Enteric Diseases)、カルカッタ、インドで調製した多価O1および単一特異性オガワ−イナバ抗血清を用いて行った。上記の方法で得たV. cholerae O1の数百種類の菌株をルリアブロス寒天上でコロニーとして培養して、毒素遺伝子ｃｔｘ、ｚｏｔおよびａｃｅに特異的なＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。精製したＤＮＡをニックトランスレーションにより２×１０８〜８×１０８ｃｐｍ／μｇの特異活性まで［α−32Ｐ］ｄＡＴＰを取り込むことによって32Ｐで標識した。放射性標識したプローブＤＮＡを、NACS PREPAC 上で製造業者（Bethesda Research Laboratories、米国）によって指定された方法でクロマトグラフィによって精製した。コロニーブロットは、オートクレーブ処理したグリッド付きニトロセルロースフィルター(Schleicher and Schuell Co. 、BA 85/20）上で調製し、上記のような高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションを行った（文献：Karasawa T, Mihara T, Kurazono H et al. 、Vibrio cholerae O1および非−O1の菌株中のｚｏｔ（閉鎖帯毒素）遺伝子の分布、FEMS Microbiol. Lett., 1993, 106, 143-146 ）。
【００８７】
毒素遺伝子、すなわちｃｔｘ、ｚｏｔおよびａｃｅを欠くことが判った菌株を、コレラ毒素様および他の細胞毒素活性について試験した。このため、菌株を９０μｇ／ｍｌリンコマイシンを補足したカザミノ酸酵母抽出物（ＣＡＹＥ）培地中で成育し、培養濾液をコレラ毒素（Ｔ）様腸毒素の存在および熱安定な直接溶血素について高感受性ビーズ−ＥＬＩＺＡで検討した（文献：Oku Y, Uesaka Y, Hirayama T, Takeda Y,細菌タンパク質毒素の検出のための高感受性ビーズ−ＥＬＩＺＡの開発(Development of a highly sensitive Bead-ELIZA to detect bacterial protein toxins), Microbiol. Immunol., 1988, 32, 807-816; Uesaka Y, Otsuka Y, Kashida M et al., 高感受性ビーズ−酵素リンクト・イムノソーベントアッセイによるコレラ毒素の検出(Detection of cholera toxin by a highly sensitive bead-enzyme linked immunosorbent assay), Microbiol. Immunol., 1992, 36, 43-53 ）。精製CT (Sigma)またはカナガワ現象陽性V. parahaemolyticus の菌株NICED 10の培養濾液（陽性コントロール）の各種希釈物、および未接種培地（陰性コントロール）を、試験菌株の培養濾液のバッチをビーズ−ＥＬＩＺＡによって分析するときには、同時に分析した。受託番号Ｂ００１０を有する親株V. cholerae の、ウサギ、ヒツジ、ニワトリおよびヒト由来の赤血球での溶血活性を、前記の方法で測定した（文献：Nair GB, Oku Y, Takeda Y et al., カルカッタ、インドにおける環境資源からのVibrio cholerae 非-O1 の毒素分布(Toxin profiles of Vibrio cholerae non-O1 from environmental sources in Calcutta, India), Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54, 3180-3182）。毒素遺伝子を持たない菌株およびコレラ毒素様および他の細胞毒素活性を持たない菌株の一つは、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を得ている。この菌株では、潜在的溶血素Ａ遺伝子の存在が、ｈｌｙＡプローブでのハイブリダイゼーションによって確かめられている。これは、ｃｔｘＢサブユニット遺伝子の組込みはｈｌｙＡ座での標的組換えによって行わなければならないので、重要である。ｔｃｐＡ遺伝子の生成物は腸におけるVibrio cholerae の効果的なコロニー形成に要する線毛の主成分であるので、その存在はｔｃｐＡプローブでのハイブリダイゼーションによっても確かめた。更に、ｃｔｘプロモーターの制御下での遺伝子の最適発現には転写活性化因子ＴｏｘＲを必要とするので、ｔｏｘＲ遺伝子の存在をｔｏｘＲプローブでのハイブリダイゼーションによって確かめた。
【００８８】
更に、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株を結紮回腸ループ分析法およびＲＩＴＡＲＤモデルで試験して、これが反応原性であるかどうか、およびこれが腸で効果的にコロニー形成することができるかどうかをチェックした。ウサギ回腸ループ分析法のために、いずれかの性の体重が１．５〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギを選択した。実験動物を、自由に水を与えたこと以外は３６時間絶食させた。静脈内麻酔下にて外科手術を行った。回腸ループ処置は、本質的にS.N. De によって報告された処置と同様であった[De, S.N., Nature, 183, 1533-1534 (1959)] 。腸を正中切開により取り出した。選択した小腸部分を、温和な（３７℃）滅菌ＰＢＳ（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で慎重に洗浄した。それぞれのウサギで、総数で８個のループを作成した。ループおよびインターループ(inter loop)の長さは、それぞれ５ｃｍおよび２ｃｍであった。次に、約１０８個の細胞を含む生菌細胞懸濁液１ｍｌをそれぞれのループに導入した。V. cholerae 569Bを陽性コントロールとして用い、無菌ＰＢＳ（０．０１Ｍ，ｐＨ７．４）を陰性コントロールとして用いた。接種後、動物の小腸を開腹内部に慎重に戻し、切開部を縫合した。動物をケージに入れておき、水を供給した。動物を１８〜２０時間後に屠殺し、流体蓄積（ＦＡ）の指数をｍｌ／ｃｍとして表したループ流体容積対ループ長さの比率から計算した。試験調製物は、比率が＞０．９であるときには陽性と考えた。コントロール反応が不適当な場合には、結果を棄却した。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株を、２羽の異なるウサギの回腸で２回試験した。流体蓄積は全く見られなかった。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する菌株を、ＲＩＴＡＲＤモデルで下痢発生性およびコロニー形成能について試験した。このため、いずれかの性の体重が１．７〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギをコロニー形成実験に選択した。総ての動物は、実験室で１週間順応させた。実験ウサギにメトロニダゾール（１２５ｍｇ／ウサギ／日）およびスルファキノキサリンナトリウム（４６４ｍｇ／ウサギ／日）を順に投与し、この投与を２日の間隔で繰り返して、Giardia やCoccidiaのような腸内原生動物病原体を動物から除いた。経口接種源を作成するため、受託番号Ｂ００１０を有する菌株をトリプティック・ソイ・ブロス(triptic soy broth) （ＴＳＢ、Difco 、米国）中で、オービタル・シェーカーで３７℃にて１８時間成育した。菌体を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して回収した。ペレットを滅菌リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、細菌密度を分光光度計で５４０ｎｍで計算し、ＰＢＳを用いて光学密度が約１０９個の菌体まで希釈して、接種源として用いた。経口接種のため、ウサギを水を自由に与えること以外は３６時間絶食させ、経口接種の３５分前に、それぞれのウサギをケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン４ｍｇ／ｋｇ体重の筋肉内投与により麻酔した。５分後に、Ｈ２レセプターブロッカーでありかつ胃の消化細胞からのＨＣｌの分泌を抑制するシメチジン５０ｍｇをウサギに投与した。１５分後に、栄養補給チューブ（Accumark, Feeding Catheter, 米国）を経口設置し、重炭酸ナトリウムの５％溶液（SRL India 、重炭酸ナトリウムは胃に存在するＨＣｌを中和する）１５ｍｌを導入した。「０」時に、重炭酸ナトリウムの５％溶液１５ｍｌをもう１回投与し、直後に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１５ｍｌに懸濁した細菌接種源を投与した。３０分後に、アヘンのチンキ剤２ｍｌを腹腔内投与した。次いで、ウサギをケージに戻し、一定量の滅菌水と食物を与えた。下痢は、下記の特徴を用いる等級システムに従って評価した。糞便を下記のようにして等級付けした。等級１は下痢のない正常な糞便であり、等級２は粥状の軟便を有する下痢であり、中程度下痢とも表され、等級３はカタル性の水状下痢であり、重度の下痢と呼ばれる。受託番号Ｂ００１０を有する菌株は下痢を起こさず、反応原性ではないことを示している。受託番号Ｂ００１０を有するV. cholerae コロニー形成を検討するため、実験用ウサギを接種から１８時間後に屠殺した。ウサギを麻酔して外科手術により開腹した後、腸を取り出した。末端回腸１０ｃｍの両端を臍帯テープ（１１号）で結んで、切断した。この１０ｃｍの回腸を、滅菌した０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを含むビーカーに入れた。腸の切片を縦方向に開いて、緩やかに洗浄した。洗浄した材料から連続希釈物を作成した。回腸の組織片を秤量してＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）１０ｍｌと共にホモゲナイズし、ホモゲナイズした。ホモゲネートの連続希釈物を作成した。ウサギを、最終的にEuthanasia 6−溶液１（Veterinary Lab./Inc.、カンサス、米国）２ｍｌを静脈内注射によって殺した。腸洗浄液のニートおよび連続希釈物、および回腸のホモゲナイズした材料を、選択培地で培養した。プレートを３７℃でインキュベーションし、コロニーを２４時間後にコロニーカウンターを用いて計数し、コロニー形成単位として表した。受託番号Ｂ００１０を有するV. cholerae 株は、顕著なコロニー形成能を示す。これは、毒素によって同時制御される線毛の存在によるものと思われ、その存在はハイブリダイゼーションによって決定された。
【００８９】
受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV.cholerae株は、ルリアブロス中で３７℃の温度で成長し、２０％（容量／容量）グリセロールを含む同じ培地で−７０℃で保管することができる。受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するこの菌株を、受託番号Ｂ００１１を有するコレラワクチン株の作成のための親株として用いた。
【００９０】
実施例２
受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するVibrio cholerae のワクチン株は、コレラ毒素のＢサブユニットをコードする遺伝子を受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親株の染色体に組込むことによって構築した。これは、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株の染色体のｈｌｙＡ座における標的組換えによって行った。これは、簡単にいえば下記の段階を含んでいる。
(i) それ自身のＳＤ配列とｃｔｘ−オペロンのプロモーターとを用いて最初に既知のV. cholerae 569B株（ナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージス(National Institure of Cholera and Enteric Diseases)）の染色体由来のコレラ毒素（ｃｔｘ）オペロンをクローニングした後、逆ＰＣＲによってクローニングしたオペロンからｃｔｘＡサブユニット遺伝子を欠失させることによるｃｔｘＢサブユニット遺伝子の構築物の作製。
(ii) 標的組換えを目的とした標的座溶血素Ａ遺伝子（ｈｌｙＡ）のクローニング。
(iii) 段階(i) で得られるようなｃｔｘＢサブユニット遺伝子構築物によるｈｌｙＡ遺伝子配列の分断。
(iv) ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有する分断ｈｌｙＡ構築物の自殺プラスミドベクターへのクローニング。
(v) 分断されたｈｌｙＡ構築物を有する自殺ベクターを連結によって（段階(ii)で得た）親株に移動させてｈｌｙＡ遺伝子におけるｃｔｘＢ遺伝子構築物の標的組込み。
(vi) 組込まれたｃｔｘＢ遺伝子を有する組換えV. cholerae クローンのハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応による同定。
【００９１】
受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親株を用いるワクチンの製造を促進するため、ｈｌｙＡ遺伝子配列が隣接したｃｔｘＢサブユニット遺伝子が製造される一連の遺伝子操作を行った。これらの操作の第一段階は、Vibrio cholerae のｃｔｘオペロンをクローニングすることであった。Vibrio cholerae O1株569Bのｃｔｘオペロンを、ポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムから増幅した後、クローニングした。ｃｔｘオペロンの増幅には、下記のプライマーを用いた。オリゴヌクレオチドＣＴ１（５′ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ３′）は、ｃｔｘオペロンの転写開始部位の１４９〜１７２ヌクレオチド上流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。オリゴヌクレオチドＣＴ２（５′ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴＣ ３′）は、ｃｔｘの停止コドンの４３〜６７ヌクレオチド下流に位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的である。これらの２個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡ配列を増幅するときには、生成物は、プロモーターおよび５′末端の上流ＴｏｘＲ結合反復と一緒にコレラ毒素ＡおよびＢサブユニットをコードする遺伝子、およびオペロンの３′末端の転写終結シグナルからなる完全ｃｔｘオペロンである。ポリメラーゼ連鎖反応では、鋳型として既知のVibrio cholerae 569B染色体ＤＮＡ１００ｎｇを用いてｃｔｘオペロンをプライマーＣＴ１およびＣＴ２１．０μＭで増幅した。９７℃２分間の初期変性段階に続いて、反応を９４℃１分間の変性段階、６２℃１分間のアニーリング段階および７２℃２分間の伸張段階で約３０回循環させた。最後のサイクルの終りに、追加の伸張段階を７２℃１０分間加えた。ポリメラーゼ連鎖反応の後に、反応混合物を等容のフェノール：クロロホルムの５０：５０混合物で抽出した。水相をSephadex G50スパン・カラム(spun column) を通過させて遊離ヌクレオチドを除去し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを再懸濁させた後、これを２００μＭのｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理した。これにより、５′ＴＴ−ジヌクレオチドオーバーハングを有する増幅ＤＮＡ生成物を得た。上記のようにして改質した増幅ＤＮＡをクローニングするため、プラスミドベクターｐＢＳ＋を、最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、これを２００μＭのｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理した。この処理により、線状化したｐＢＳ＋ベクターＤＮＡの両端に５′ＡＡオーバーハングを得た。このベクターＤＮＡ調製物をＴ４ＤＮＡリガーゼによって５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに１：２のモル比で連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成する組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘオペロン上の部位が知られている制限酵素（例えば、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ）によって分析した。ｐＧＴ１と呼ばれる一つのクローンのインサートは、制限分析およびシークエンス法によって確かめたところ、完全ｃｔｘオペロンを有している。完全Ｂサブユニット遺伝子のヌクレオチド配列を決定して、ポリメラーゼ連鎖反応中に導入されるエラーの可能性を排除した。このプラスミドクローンｐＧＴ１を、次の段階で用いた。
【００９２】
次の段階では、プラスミドクローンｐＧＴ１からの完全ｃｔｘ−Ａコード配列を互いに異なりかつｃｔｘ−Ａ遺伝子を除くプラスミドを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆ポリメラーゼ連鎖反応によって欠失を行った。オリゴヌクレオチドＣＴ３（５′ ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＴＴ ＡＡＣ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＡＣ ３′）は、ｃｔｘオペロンの転写開始部位に関して＋９〜−２１ヌクレオチドに位置する染色体ＤＮＡ配列に相補的であった。オリゴヌクレオチドＣＴ４（５′ ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＧＡ ＴＴＡＡＡＴ ＴＡＡ ＡＡ−３′）は、ｃｔｘＢ遺伝子の開始コドンの最初の塩基に関して−１６〜＋１５ヌクレオチドに位置していた。オリゴヌクレオチドＣＴ３およびＣＴ４を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってそれらの５′末端をリン酸化した。逆ポリメラーゼ連鎖反応は、これらのリン酸化オリゴヌクレオチドＣＴ３およびＣＴ４をプライマーとして、プラスミドｐＧＴ１を鋳型ＤＮＡとして用いて行った。大きさが３．８キロベースの生成する増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。次いで、これを２００μＭのｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＣＴ３に相当する末端に５′ＧＧ−オーバハングを、ＣＴ４に相当する末端に５′ＣＣ−オーバーハングを生成した。互いに相補性の上記ジヌクレオチドオーバハングを有する末端は、連結混合物中のＤＮＡの最終濃度を２ｎｇ／μｌとしてＴ４ ＤＮＡリガーゼによって連結し、分子内連結を促進した。連結生成物を用いて、E. coli Sure株を電気穿孔によって形質転換した。逆ポリメラーゼ連鎖反応生成物の再環状化によって、ｃｔｘプロモーターとｃｔｘＢサブユニット遺伝子が融合した。この構築物ｃｔｘプロモーター−ＢはＣＴ１およびＣＴ２をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応によって様々なプラスミドクローンで同定され、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物に相当する０．６３キロベース断片を生成した。様々なクローンからのＢサブユニットの発現は、ビーズＥＬＩＺＡ分析法によって確認した。一つのプラスミドクローンｐＧＴ３．１のｃｔｘ−プロモーター−Ｂ構築物のヌクレオチド配列を決定して、プロモーター−Ｂサブユニット遺伝子融合点の配列を分析した。これによって、ｃｔｘオペロンプロモーターと、ｃｔｘＢサブユニット遺伝子自身のＳＤ配列を含むｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有するＴｏｘＲ結合反復との融合を確認した。ｃｔｘＢ遺伝子は理論的に完全なＳＤ配列（ＴＡＡ ＧＧＡ）を示し、文献にはｃｔｘＢリボソーム結合部位がｃｔｘＡ部位よりも約９倍も効率的であることが示されている。(J.J. Mekalanos, D.J. Swartz G.D.N. Pearson, Nitarford, I. Groyne & Michel de Wilde, (1983) Nature, 306, 551-557) 。ｐＧＴ３．１からのｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を後の段階で用いて、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子を分断した。
【００９３】
ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物を受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株にｈｌｙＡ遺伝子での標的組換えによって導入されることが決定されたので、構築物を作成してクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列をｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断するのが重要であった。このためには、V. cholerae の遺伝子をクローニングすることが必要であった。５′隣接領域および３′側のコード領域の大部分を欠いている部分ｈｌｙＡ遺伝子配列を、Vibrio cholerae ゲノムからのその増幅の後にクローニングした。増幅には、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。オリゴヌクレオチドＨＡ１（％′ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＴＴ ＡＴＡ ＴＧＣ Ｃ−３′）はｈｌｙＡ遺伝子の開始コドンに関して−１９〜＋６ヌクレオチドに位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的であり、オリゴヌクレオチドＨＡ２（５′ ＴＴＣ ＧＣＴ ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＧＴ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＴＣ ３′）はｈｌｙＡ遺伝子の開始コドンから１７１４〜１６９０ヌクレオチドに位置した染色体ＤＮＡ配列に相補的であった。ｈｌｙＡ遺伝子の完全コード領域の大きさは約２．２キロベースであり、そのｈｌｙＡ遺伝子の１．７キロベースをV. cholerae 01株のゲノムＤＮＡから増幅した。９７℃２分間の初期変性段階の後、反応を９４℃１分間の変性段階、６２℃１分間のアニーリング段階および７２℃２分間の伸張段階を通って反復した。最後のサイクルの終りに、７２℃１０分間の追加の伸張段階を加えた。ポリメラーゼ連鎖反応生成物は、１．７キロベースＤＮＡ断片の存在についてアガロースゲル電気穿孔によって分析した。反応生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて遊離ヌクレオチドを除去して、エタノール沈澱を行った。精製ＤＮＡを２００μＭ ｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、末端に５′ＴＴ−オーバーハングを生成させた。上記のように改質した末端を有する増幅ｈｌｙＡ遺伝子をクローニングするため、プラスミドベクターｐＵＣ９を最初に制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。次いで、線状化したｐＵＣ９ ＤＮＡを２００μＭ ｄＡＴＰの存在下にてE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、両端に５′ＡＡオーバーハングを生成した。このベクターＤＮＡ調製物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって１：２のモル比の５′ＴＴ−オーバーハングを有する増幅ｃｔｘオペロンに連結した。このジヌクレオチド付着末端連結の後に、反応混合物を用いて電気穿孔によってE. coli 「Sure」株を形質転換した。生成するプラスミドクローンを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで消化することによって分析した。１．７キロベースのＥｃｏＲＩインサートは０．４キロベース配列によって分離された中央領域に２個のＨｐａＩ部位を有するはずである。１．７キロベースｈｌｙＡインサートを有するプラスミドクローンの一つｐＧＴ８９を次の段階で用いて、ｃｔｘプロモーター−Ｂ遺伝子構築物によってｈｌｙＡ配列を分断した。
【００９４】
次の段階では、ｐＧＴ３．１のｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をオリゴヌクレオチドプライマーＣＴ１およびＣＴ２を用いて増幅した。増幅生成物をフェノール処理し、Sephadex G-50 スパン・カラムを通過させて、エタノール沈澱を行った。精製ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物断片を、ｄＴＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、両端に５′ＴＴ−オーバハングを生成した。５′ＴＴ−オーバハングを有するｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を、０．４キロベースＨｐａＩ断片の代わりにクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央に挿入しなければならなかった。プラスミドベクターｐＵＣ９はＨｐａＩ酵素の部位を有していないので、ｐＧＴ８９をＨｐａＩで消化すると、クローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列の中央からの０．４キロベースの断片と３．９キロベースの断片を生じる。ｐＧＴ８９をＨｐａＩ酵素で消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。３．９キロベースのＨｐａＩ断片を電気溶出して精製した。次に、これをｄＧＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって処理して、両端に５′ＡＡ−オーバーハングを生成した。５′ＡＡ−オーバーハングを有する３．９キロベース断片を、５′ＴＴ−オーバーハングを有するｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物にＴ４ ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結混合物を用いて、E. coli 「Sure」株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンを、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩ酵素で消化すると、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって中央で分断されたｈｌｙＡ遺伝子配列の１．９キロベースインサートが得られた。一つの組換えプラスミドｐＧＴ３９からのＥｃｏＲＩインサートを用いて、これを自殺ベクターｐＧＰ７０４にクローニングした。ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物のヌクレオチド配列をｐＧＴ３９の隣接ｈｌｙＡ配列と共に決定した。
【００９５】
次の段階では、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物を隣接ｈｌｙＡ配列と共に、プラスミド自殺ベクターにクローニングした。プラスミド自殺ｐＧＰ７０４をＥｃｏＲＩ酵素で消化し、線状化したベクターの５′リン酸基を子牛腸ホスファターゼで処理することによって除去した。ＥｃｏＲＩで消化して脱リン酸化したｐＧＰ７０４を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、相当するＤＮＡバンドを電気溶出して、精製した。これは、ベクターＤＮＡ調製物中に微量の未消化ベクターＤＮＡも存在しないようにする目的で行った。次に、これをＴ４ ＤＮＡリガーゼによってｐＧＴ３９の１．９キロベースＥｃｏＲＩインサートに１：５のモル比で連結し、この連結混合物を用いてE. coli SM10 pir株を電気穿孔によって形質転換した。組換えプラスミドクローンは、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションによって同定した。組換えプラスミドをＥｃｏＲＩで消化したところ、ｃｔｘプロモーター−Ｂ構築物によって分断されたクローニングしたｈｌｙＡ遺伝子配列を表す１．９キロベースのインサートを得た。クローンｐＧＴ２７の一つを用いて、ｈｌｙＡ遺伝子での組込みのため受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株に移動した。
【００９６】
次の段階では、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とプラスミドｐＧＴ２７を含むE. coli SM10 pir株との接合によって、受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有する親V. cholerae 株へのｐＧＴ２７の移動を行った。E. coli 宿主株SM10 pir中のプラスミドクローンｐＧＴ２７と受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するVibrio cholerae 株とは、振盪せずに３７℃で対数中央増殖相(midlog phase)までＬＢで成育した。ドナー株、すなわちｐＧＴ２７を有するSM10 pir株０．５ｍｌと、レシピエント株、すなわち受託番号Ｂ００１０（ＡＴＣＣ２０２０１０）を有するV. cholerae 株０．５ｍｌとを、１．５ｍｌ微量遠沈管中で混合し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、底部に細胞を集めた。上清を除去した後、ルリアブロスを５０μｌの量で細胞ペレットに加え、細胞をピペットで吸い込みおよび吐き出しを行うことによってブロスに懸濁した。次に、細胞懸濁液をＬＢ寒天培地の表面に置いた０．４ｍｍメンブランディスク上にスポットした。懸濁液は、直ぐにメンブランに吸収された。メンブラン上のドナーおよびレシピエント細胞を、３７℃で約４時間一緒に合わせたままにした。次に、メンブランフィルターを５ｍｌのネジ蓋付き試験管に集め、ＬＢ培地１ｍｌを加えた。メンブラン上の細胞を、短時間混合することによって培地に再懸濁した。懸濁液１０μｌを、ストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌとアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。このような高濃度のアンピシリンでは、アンピシリン耐性を与えるプラスミドｐＧＴ２７は比較的高頻度でタンデム反復し、薬剤圧力(drug pressure) のために選択されることがある。アンピシリン耐性コロニーは、ｃｔｘＢ遺伝子プローブを用いるハイブリダイゼーションによって分析した。このプローブとハイブリダイゼーションした組換えクローンからの染色体調製物ＤＮＡを、ｈｌｙＡ特異的プライマーＨＡ１およびＨＡ２を用いるポリメラーゼ連鎖反応で鋳型として用いた。総てのクローンから、１．７キロベースおよび１．９キロベース断片を増幅した。この場合と同様の組のプライマーによって画定される２つの異なる大きさの断片が単一コピーに存在するときには、小さいものが通常は優先的にポリメラーゼ連鎖反応で増幅された。このことは、アガロースゲル電気泳動によって検討したときにそれらのバンド強度で示された。大きいものが多重コピーに含まれているときには、増幅された大きな断片の量は、これが単一コピーとして含まれているときよりも遥かに多量となった。
【００９７】
１．７キロベースバンドより強力な１．９キロベース断片を有することが判ったクローンの１つは、ビーズＥＬＩＺＡによって測定したところ、数種類の他のクローンよりもＢサブユニットを多く分泌する。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するこのクローンをストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で約２０世代継代培養した。この培養からの細胞をストレプトマイシン硫酸塩１０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートで培養し、得られたコロニーをｃｔｘＢ遺伝子プローブとハイブリダイゼーションした。総てのコロニーがハイブリダイゼーションし、２０世代後には組込まれたｐＧＴ２７の安定性を示していた。受託番号Ｂ００１１を有する組換えV. cholerae クローンからのゲノムＤＮＡを分離して、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩおよびＨｐａＩで個別に消化した。上記消化物のサザンブロットを、別個の実験でｃｔｘＢプローブおよびｈｌｙＢプローブを用いてハイブリダイゼーションした。
【００９８】
受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するコレラワクチンを、薬剤を全く加えずにＬＢ培地で５６回培養（継代培養）し、それぞれ培養は約２０世代を表していた。約１５００個の単一コロニーをｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーションによってｃｔｘＢの存在についてチェックした。それらの総てはこのプローブでハイブリダイゼーションし、ｃｔｘＰｒ−Ｂ構築物はアンピシリンが存在しなくとも約＞１０００世代の成育の後でも維持されることを示していた。
【００９９】
受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するV. cholerae をワクチン株として選択した。これをウサギ回腸ループ分析法によって試験して、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有する菌株が反応原性であるかどうかを決定した。ウサギ回腸ループ分析法のために、いずれかの性の体重が１．５〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギを選択した。実験動物を、自由に水を与えたこと以外は３６時間絶食させた。静脈内麻酔下にて外科手術を行った。回腸ループ処置は、本質的にS.N. De によって報告された処置と同様であった[De, S.N., Nature, 183, 1533-1534 (1959)] 。腸を正中切開により取り出した。選択した小腸部分を、温和な（３７℃）滅菌ＰＢＳ（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で慎重に洗浄した。それぞれのウサギで、総数で８個のループを作成した。ループおよびインターループ(inter loop)の長さは、それぞれ５ｃｍおよび２ｃｍであった。次に、約１０８個の細胞を含む生菌細胞懸濁液１ｍｌをそれぞれのループに導入した。既知のV. cholerae 569Bを陽性コントロールとして用い、無菌ＰＢＳ（０．０１Ｍ，ｐＨ７．４）を陰性コントロールとして用いた。接種後、動物の小腸を開腹内部に慎重に戻し、切開部を縫合した。動物をケージに入れておき、水を供給した。動物を１８〜２０時間後に屠殺し、流体蓄積（ＦＡ）の指数をｍｌ／ｃｍとして表したループ流体容積対ループ長さの比率から計算した。試験調製物は、比率が＞０．９であるときには陽性と考えた。コントロール反応が不適当な場合には、結果を棄却した。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するV. cholerae 株を、２羽の異なるウサギの回腸で２回試験した。流体蓄積は全く見られなかった。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有する菌株は、流体蓄積を誘導しなかった。これは、ワクチン構築物がＢサブユニットを産生するが、予想されるように、このサブユニットは無害であり、流体蓄積を誘導することはできないことを示していた。
【０１００】
次の一連の実験を行い、イン・ビボウサギモデルを用いてワクチンのコロニー形成能および防御能を決定した。このため、いずれかの性の体重が１．７〜２．５ｋｇの異系交雑したNew Zealand 白ウサギをコロニー形成実験に選択した。総ての動物は、実験室で１週間順応させた。実験ウサギにメトロニダゾール（１２５ｍｇ／ウサギ／日）およびスルファキノキサリンナトリウム（４６４ｍｇ／ウサギ／日）を順に投与し、この投与を２日の間隔で繰り返して、Giardia やCoccidiaのような腸内原生動物病原体を動物から除いた。経口接種源を作成するため、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ ２０２０１１）を有する菌株をトリプティック・ソイ・ブロス(triptic soy broth) （ＴＳＢ、Difco 、米国）中で、オービタル・シェーカーで３７℃にて１８時間成育した。菌体を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して回収した。ペレットを滅菌リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁し、細菌密度を分光光度計で５４０ｎｍで計算し、ＰＢＳを用いて光学密度が約１０９個の菌体まで希釈して、接種源として用いた。経口免疫の前には、ウサギを水を自由に与えること以外は３６時間絶食させ、経口接種の３５分前に、それぞれのウサギをケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン４ｍｇ／ｋｇ体重の筋肉内投与により麻酔した。５分後に、Ｈ２レセプターブロッカーでありかつ胃の消化細胞からのＨＣｌの分泌を抑制するシメチジン５０ｍｇをウサギに投与した。１５分後に、栄養補給チューブ（Accumark, Feeding Catheter, 米国）を経口設置し、重炭酸ナトリウムの５％溶液（SRL India 、重炭酸ナトリウムは胃に存在するＨＣｌを中和する）１５ｍｌを導入した。「０」時に、重炭酸ナトリウムの５％溶液１５ｍｌをもう１回投与し、直後に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１５ｍｌに懸濁した細菌接種源を投与した。３０分後に、アヘンのチンキ剤２ｍｌを腹腔内投与した。次いで、ウサギをケージに戻し、一定量の滅菌水と食物を与えた。実験群およびコントロール群のウサギを、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株を０日目、７日目および１４日目に経口投与して免疫した。コントロール群のウサギには、未接種のトリプティック・ソイ・ブロス（Difco 、米国）１５ｍｌを投与した。実験の２１日目に、総ての免疫動物を同種または異種菌株でチャレンジを行い、防御の程度を測定した。動物のチャレンジで生き残る能力並びに生物のコロニー形成能を検討した。
【０１０１】
ワクチン株を含む試験菌株のコロニー形成を検討するため、実験用ウサギを接種から１８時間後に屠殺した。ウサギを麻酔して外科手術により開腹した後、腸を取り出した。末端回腸１０ｃｍの両端を臍帯テープ（１１号）で結んで、切断した。この１０ｃｍの回腸を、滅菌した０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０ｍｌを含むビーカーに入れた。腸の切片を縦方向に開いて、緩やかに洗浄した。洗浄した材料から連続希釈物を作成した。回腸の組織片を秤量して、ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）１０ｍｌと共にホモゲナイズし、ホモゲナイズした。ホモゲネートの連続希釈物を作成した。ウサギを、最終的にEuthanasia 6−溶液１（Veterinary Lab./Inc.、カンサス、米国）２ｍｌを静脈内注射によって殺した。腸洗浄液のニートおよび連続希釈物、および回腸のホモゲナイズした材料を、選択培地で培養した。プレートを３７℃でインキュベーションし、コロニーを２４時間後にコロニーカウンターを用いて計数し、コロニー形成単位として表した。
【０１０２】
同種チャレンジ試験は、免疫感作およびチャレンジに用いたのと同じ菌株で行った。
【０１０３】
異種チャレンジ試験は、免疫感作およびチャレンジに用いたのとは異なる菌株で行った。異種菌株は、V. cholerae の両方のバイオタイプ（El Torおよび古典型）を表す目的で選択した。
【０１０４】
同種菌株および異種菌株でチャレンジを行った免疫ウサギを、臨床的下痢の徴候について観察した。下痢は、下記の特徴を用いる等級システムに従って評価した。糞便を下記のようにして等級付けした。等級１は下痢のない正常な糞便であり、等級２は粥状の軟便を有する下痢であり、中程度下痢とも表され、等級３はカタル性の水状下痢であり、重度の下痢と呼ばれる。受託番号Ｂ００１０を有する菌株はウサギに経口投与したときには下痢を起こないことが明かに観察された。これらの結果に基づいて、血清型O1、および両バイオタイプEl Torおよび古典型のV. cholerae の親株を用いるチャレンジ試験を、数バッチで行った。データーを下記のようにまとめることができる。
1. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株で免疫したウサギは、古典的バイオタイプおよびEl Torバイオタイプ株によるチャレンジから有意に保護された。これは、免疫ウサギでは下痢が見られなかったのに対し、コントロールウサギでは激しい下痢が見られたことから明かであった。
2. 免疫ウサギでのチャレンジ株のコロニー形成能は、コントロールウサギと比較して有意に低かった。
3. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の非反応原性は、コントロールウサギでの下痢を誘発することができないことによっても明かであった。
4. 受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するワクチン株の免疫原性。ワクチン株を経口免疫したウサギの免疫前血清と比較して免疫血清では、リポ多糖類、外膜タンパク質、全細胞溶解物およびコレラ毒素に対する抗体力価が有意に上昇したため。
【０１０５】
次に、まとめると、受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するV.cholerae株は、総ての既知の毒性遺伝子を欠いており、動物モデルで非反応原性であり、コレラ毒素の免疫原性「Ｂ」サブユニットを同化し、ＲＩＴＡＲＤモデルではV. cholerae の両バイオタイプEl Torおよび古典型に対して完全な防御を与えることができる有力なコレラワクチン菌株である。受託番号Ｂ００１１（ＡＴＣＣ２０２０１１）を有するコレラワクチンは、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むルリアブロスで３７℃の温度で成育し、２０％（容量／容量）グリセロールを含む同じ培地で−７０℃で保管することができる。
【０１０６】
上記の実施例は、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
Claims (5)
- 非毒素産生性菌株V. cholerae（ＡＴＣＣ２０２０１０）の分離法であって、
a. V. cholerae に特異的な選択培地上にコレラ患者の糞便を塗布することによって、この糞便からからV. cholerae を分離すること、および
b. 段階(a) の方法で分離した菌株V. cholerae の個体群から非毒素産生性株V. cholerae を分離することを含む方法。 - 段階(a) で用いた培地が、チオ硫酸塩−クエン酸胆汁塩スクロース寒天（ＴＣＢＳ）、亜テルル酸塩タウロコール酸塩ゼラチン寒天（ＴＴＧＡ）、ビブリオ寒天、スクロース亜テルル酸塩ティーポール培地、およびポリミキシンマンノース亜テルル酸塩寒天から選択される、請求項１記載の方法。
- コレラの予防に用いるコレラワクチンの製造法であって、
a. V. cholerae に特異的な選択培地上にコレラ患者の糞便を塗布することによって、この糞便からV. cholerae を分離すること、
b. 段階(a) の方法で分離した菌株V. cholerae の個体群から非毒素産生性株V. cholerae （ＡＴＣＣ２０２０１０）を分離すること、および
c. 免疫原性コレラ毒素（ｃｔｘ）Ｂサブユニット遺伝子を受託番号ＡＴＣＣ２０２０１０の菌株の染色体に通常の方法によって組込み、ワクチンを産生させること
を含んでなる、方法。 - 段階(a) で用いる培地が、チオ硫酸塩−クエン酸胆汁塩スクロース寒天（ＴＣＢＳ）、亜テルル酸塩タウロコール酸塩ゼラチン寒天（ＴＴＧＡ）、ビブリオ寒天、スクロース亜テルル酸塩ティーポール培地、およびポリミキシンマンノース亜テルル酸塩寒天から選択される、請求項３記載の方法。
- 請求項３に記載のコレラワクチンの製造法であって、工程ｃが
（ｉ） まず、V. cholerae 569B株（ナショナル・インスティテュート・オブ・コレラ・アンド・エンテリック・ディジージズ(National Institute of Cholera and Enteric Diseases)の染色体からのコレラ毒素（ｃｔｘ）オペロンをクローニングした後、クローニングしたオペロンから逆ＰＣＲによってｃｔｘＡ遺伝子サブユニットを欠失させることによって、それ自身のシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列とｃｔｘオペロンのプロモーターを有するｃｔｘＢサブユニット遺伝子構築物を作製し、
（ ii ） V. cholerae 由来のヘモリシンＡ遺伝子（ｈｌｙＡ）をプラスミドにクローン化し、
(iii) 段階(ｉ)で得られたｃｔｘＢサブユニット遺伝子構築物によって、段階 (ii) のクローン化されたｈｌｙＡ遺伝子配列を分断し、
(iv) ｃｔｘＢサブユニット遺伝子を有する分断された段階（ iii ）からのｈｌｙＡ構築物を、自殺プラスミドベクターにクローニングし、
（ｖ） 段階（ iv ）で得られた分断されたｈｌｙＡ構築物を有する自殺ベクターで大腸菌株を形質転換し、
（ vi ） 段階（ｖ）で得られた形質転換された大腸菌株からの分断されたｈｌｙＡ構築物を有する自殺ベクターを、非毒素産生性菌株 V. cholerae （ＡＴＣＣ２０２０１０）に接合によって移動させ、
(vii) 組込まれたｃｔｘＢ遺伝子を有する組換えV. cholerae クローンをハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応によって同定する
工程を含んでなる、方法。
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