JP3693900B2 - １ａ５ｂ構造を有する蛋白質の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１Ａ５Ｂ構造を有する蛋白質の製造に関するものであり、更に詳細には、遺伝子組換え技術により、１Ａ５Ｂ構造という高次構造を同時発現、しかも外分泌発現することにはじめて成功したものである。このようにして分泌生産された組換え蛋白質は、ワクチン用アジュバントの製造に有利に使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
コレラ菌（Vibrio cholerae）によって生産される、コレラトキシン（ＣＴ）及び大腸菌（Escherichia coli）腸管毒素産生株によって生産される、易熱性トキシン（ＬＴ）は、きわめて類似した蛋白質である（Clements and Finkelstein 1979. Infect. Immun, 24 : 760-769.）。ＣＴ及びＬＴは、２８ｋＤａのＡサブユニット（ＣＴＡまたはＬＴＡ）と、１１．５ｋＤａモノマー５個からなる非共有結合で会合したＢサブユニット（ＣＴＢまたはＬＴＢ）で構成されている。そして、Ａサブユニットが毒性に関与し、標的細胞のアデニレートシクラーゼ複合体を不可逆的に活性化するＮＡＤ−リボシル化活性を有する（Moss and Richardson 1978. J. Clin. Invest, 62 : 281-285.）。毒性のあるＡサブユニットの細胞内への侵入は、Ｂサブユニットによって促進される。このＢサブユニットは５量体からなり、ＧＭ１、モノシアロガングリオシドトキシン受容体に結合する（Cuatrecasas 1973. Biochemistry, 12 : 3558-3566.）。ＧＭ１は、粘膜上皮を含めて、哺乳動物の様々な組織の表面上に存在する。
【０００３】
ＣＴおよびＬＴは、経口的または経鼻的に投与した場合、特異的に強力な粘膜免疫原性を示すことから粘膜アジュバントとして注目されてきた。注射することと比較し、経口、または経鼻免疫で利用することの利点を例示すると、注射では取扱に細心の注意が必要なこと、また注射位置の確認をする必要のあること、特に被適用者が家畜であった場合なおのこと有効である。加えて、特殊な装置を使用しなくても大規模に投与することが容易となること、また、粘膜への免疫原の送達は、分泌免疫応答の誘起を可能にすること等である。
【０００４】
ＣＴおよびＬＴは、哺乳動物に高い毒性を示すが、最近では毒性は軽減し、かつアジュバント効果を有する変異コレラトキシン（ｍＣＴ）や変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）の例も知られている（Shingo Yamamoto et al 1997. J. Exp. Med, 185 : 1203-1210., Takao Tsuji et al 1997. Immunology, 90 : 176-182., Michio Kato et sl 1997. FEMS Microbiology Letters, 152 : 219-225.）。
【０００５】
現在までにＣＴ、ＬＴを組換体で生産した例は、大腸菌を宿主菌とした例が報告されているが（Yoshihiko Uesaka et al 1994. Microbial Pathogenesis, 16 : 71-76.）、大腸菌では生産されたＣＴ、ＬＴは菌体内に止まっており、菌体外に分泌生産した例はこれまで知られていない。加えて、ＣＴおよびＬＴは、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造を持っており、今までこのような高次構造をとって分泌生産された例もない。
【０００６】
また、コレラ菌や大腸菌はグラム陰性菌であり、その細菌壁成分であるリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は発熱、ショックなどの内毒素活性を持っており、ＣＴおよびＬＴの調製時において、ＬＰＳの除去は医薬品製造において大変重要な工程となっており、ＣＴおよびＬＴを調製する上で重大な問題点となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１Ａ５Ｂのサブユニット構造を持つトキシンであるＣＴ、ＬＴを組換え体で製造する方法を提供することにある。特に本発明では、ＬＴの毒性を軽減したＬＴの変異体であるｍＬＴ（Ａサブユニットが配列番号３（図３）、Ｂサブユニットが配列番号４（図４）で示される）を例示し、ＣＴ、ＬＴ、ｍＬＴを安全性と有効性に優れた組換え体で製造する方法及び高次構造を持った形で、高純度に回収する方法を提供することである。
更に、本発明を完成させることにより、上記組換えｍＬＴを経粘膜ワクチンのアジュバントとして使用に供することにある。
【０００８】
本課題を解決するために、本発明者らは、（１）ｍＬＴのＡサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子のポリヌクレオチドを効率よく外分泌発現させるためのベクター・宿主系を確立し、（２）ＡサブユニットとＢサブユニットを外分泌させた際、効率良く１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造（１Ａ５Ｂ）をとる発現系を構築し、（３）得られた組換えｍＬＴ（以下ｂｒｍＬＴという）をアジュバントとして経粘膜投与し、被投与動物に強力な感染・発病防御免疫を誘導するための技術を確立することを目的として鋭意研究を行った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ｍＬＴのＡサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子のＮ末端分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除した領域をブレビバチルス・チョウシネンシスの分泌発現ベクターに連結することにより高次構造（１Ａ５Ｂ）を有するｂｒｍＬＴを分泌生産することを見出した。また、５量体からなるＢサブユニット遺伝子を前にして、ＳＤ配列遺伝子をはさんで、単量体のＡサブユニット遺伝子を後ろにしてタンデムに連結することにより、より効率良く高次構造（１Ａ５Ｂ）を持つｂｒｍＬＴが分泌生産される方法を確立した。形質転換したブレビバチルス・チョウシネンシスの培養上清をアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理することによりｂｒｍＬＴを回収したところ、アジュバント活性を有し、且つ、エンドトキシンの含量の低い高純度のｂｒｍＬＴを製造する方法を確立した。
【００１０】
すなわち本発明は、Ａサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子から、各々シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除し、（Ｂサブユニット遺伝子）−（ＳＤ配列遺伝子）−（Ａサブユニット遺伝子）の順にタンデムに結合した１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡを基本的技術思想とするものであって、これらのＤＮＡは従来未知の新規物質であり、その非限定例としては次のものが例示される。
【００１１】
（１）易熱性トキシン（ＬＴ）に関する、配列番号７（図７、８）の塩基配列で示されるＤＮＡ（Ｂサブユニット遺伝子：１ｇｃｔ〜３０７ａａｃ、Ａサブユニット遺伝子：４２７ｇｃｔ〜１１４７ｔｔａ）。
（２）変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）に関する、配列番号８（図９、１０）の塩基配列で示されるＤＮＡ（Ｂサブユニット遺伝子：１ｇｃｔ〜３０７ａａｃ、Ａサブユニット遺伝子：４２７ｇｃｔ〜１１３７ｔｔａ）。
（３）コレラトキシン（ＣＴ）に関する、配列番号９（図１１、１２）の塩基配列で示されるＤＮＡ（Ｂサブユニット遺伝子：１ａｃｃ〜３０７ａａｔ、Ａサブユニット遺伝子：４２７ｇｃｔ〜１１４７ｔｔａ）。
【００１２】
また本発明は、上記したＤＮＡを含有するプラスミドでブレビバチルス・チョウシネンシス等の宿主菌を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、培養物から１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質を組換え体として製造する技術も包含するものであって、例えば次のような組換えタンパク質を製造することができる。
【００１３】
（Ｉ）１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号１（図１）、Ｂサブユニットが配列番号２（図２）のアミノ酸配列で示される大腸菌（Escherichia coli）で生産される易熱性トキシン（ＬＴ）であることを特徴とする前記（１）のＤＮＡを利用するタンパク質の製造法。
（II）１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号３（図３）、Ｂサブユニットが配列番号４（図４）のアミノ酸配列で示される変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）であることを特徴とする前記（２）のＤＮＡを利用するタンパク質の製造法。
（III）１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号５（図５）、Ｂサブユニットが配列番号６（図６）のアミノ酸配列で示される、コレラ菌（Vibrio cholerae）によって生産されるコレラトキシン（ＣＴ）であることを特徴とする前記（３）のＤＮＡを利用するタンパク質の製造法。
【００１４】
以下、本発明を変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）を例にとって説明するが、ＬＴ、ＣＴ、その他１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質も同様である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いた変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）のポリペプチドは、すでに辻らによって報告（Takao Tsuji et al., 1997 Immunology, 90 : 176-182.）されており、ＡサブユニットのArg192-Thr193-Ile194が天然型より欠失しており、それによってトリプシン感受性部位が非感受性となっている。タンパク質分解酵素による被分解部位の欠落により、その毒性形態に変化するＡサブユニットのタンパク質分解酵素によるプロセッシングが妨げられる。天然のＬＴは、細菌から単離された当初、毒性はないが、哺乳類の腸に見出されるプロテアーゼに暴露されプロセッシングを受け毒性を有する形になると考えられている。変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）は変異を受けていることにより毒性を有する形となる可能性は少ないが、免疫学的アジュバントとしての活性はなお保持している。
【００１６】
本発明は、ｍＬＴのＡサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子のＮ末端分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除した領域を５量体からなるＢサブユニット遺伝子−ＳＤ配列遺伝子−単量体のＡサブユニット遺伝子と言うようにタンデムに発現ベクターに連結し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、この該形質転換体を培養し、生産したｂｒｍＬＴを回収、精製する製造方法を提供する。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、分泌形態または非分泌形態のいずれで生産されていてもよいが、高次構造（１Ａ５Ｂ）形成、分離精製の容易さから分泌形態が好ましい。分泌形態の場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流に任意のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結させる。
【００１８】
発現ベクターとしては、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能であって、目的ＤＮＡの転写が可能な位置にプロモーターを含有している物を選択できる。または、染色体中へ直接組込み、発現させることでもよい。
【００１９】
宿主細胞としては、バチルス属細菌やBrevibacillus属細菌、特にブレビバチルス・チョウシネンシス(Brevibacillus choshinensis）が良好に使用できる。
【００２０】
形質転換法として、エレクトロポレーション法、プロトブラスト法、ＰＥＧ法などを用いることができる。
【００２１】
形質転換された宿主菌を培地中に培養し、発現ベクターに組込まれた目的ＤＮＡや染色体に組込まれた目的ＤＮＡを発現させ、公知の蛋白質精製方法を利用して組換えｍＬＴ（ｂｒｍＬＴ）を分離精製することができる。精製は、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈澱、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などの方法を組合せて行うことができる。
【００２２】
ｂｒｍＬＴの粘膜アジュバント活性の評価試験は、既報（Takao Tsuji et al 1997, Immunology, 90 : 176-182.）に記載されたように、マウス、ウサギ等の実験動物あるいは豚、めん羊、牛などの家畜を対象とし、試験用抗原（ヘモシアニン、アルブミン、微生物の天然蛋白抗原／組換え抗原など）と被検アジュバント成分とを混合したものを経鼻、経口、経直腸、経膣的に投与し、アジュバント成分添加による免疫応答の増強性から評価するが、例えば次のようにしてもよい。豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）組換え防御抗原蛋白（４６．５ｋＰＡ：特願平１１−９４００４号）ならびに気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）由来シアル酸特異的赤血球凝集素（特許第２９６９１４７号）を抗原とした場合を例にとって説明する。
【００２３】
この豚丹毒菌の４６．５ｋＤａ抗原蛋白は、渡辺、横溝、今田らによって開発されたものである。渡辺、横溝、今田らは、豚丹毒菌の感染防御抗原遺伝子のうち、従来必要とされていたＣ末の繰り返し配列からなる断片をコードするＤＮＡ配列とＮ末の分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除したポリヌクレオチドで組換えたブレビバチルス・チョウシネンシスの大量培養液の除菌液から夾雑物を除去し、防御免疫誘導活性をもつ高純度の４６．５ｋＤａ防御抗原（46.5kDa protective antigen ; 46.5KPA）を製造できる方法を見出した（特願平１１−９４００４）。渡辺らの発明によりブレビバチルス・チョウシネンシスで発現して得られた４６．５ＫＰＡは、豚丹毒菌の副作用に関係する菌体成分を全く含まないため、ワクチンの安全性の改善に貢献するものである。
【００２４】
気管支敗血症菌由来シアル酸特異的赤血球凝集素（ＳＳＨＡ）は家畜衛生試験場及び共立商事株式会社により発明されたもので、本菌の培養上清中に含まれるシアル酸特異的赤血球凝集素を、牛の赤血球膜成分を固定化した不溶性支持体に吸着させ、カオトロピックイオンを含むイオン強度０．５以上の緩衝液で溶出させた７〜２８０ｎｍの小胞状の膜様構造物である。本成分はオイルアジュバントまたは水酸化アルミニウムゲルアジュバントをともに豚に接種すると、免疫豚の血清中には凝集抗体が産生され、また免疫豚は本菌強毒株の経鼻攻撃に対する感染防御を示すことから、ワクチンとしての利用性が高い。
この４６．５ｋＰＡとＳＳＨＡをリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ７．２）とｂｒｍＬＴまたは対照用ＰＢＳとを混合した溶液を動物の鼻腔内にマイクロチップを用いて注入／滴下するか、または噴霧器を用いてエアゾルを吸入させる。本免疫操作を一定間隔で複数回実施した後に、免疫動物の血液、鼻汁、唾液、糞便、膣粘液、乳汁を採取し、それらの検体中の試験用抗原に対する特異抗体価をＥＬＩＳＡを用いて測定する。そして、ｂｒｍＬＴと試験抗原混液を投与した動物に試験抗原単独またはｂｒｍＬＴのいずれかを単独投与した動物よりも有意に高い抗体価が検出されれば、粘膜アジュバント活性を有すると判定することができる。さらに、ｂｒｍＬＴと試験抗原とで免疫した動物での病原体攻撃に対する感染防御能（病原体の増殖抑制性、発病抑制等）の向上からも、粘膜アジュバント活性を評価することができる。
【００２５】
粘膜投与アジュバントの毒性評価試験は、既報（Takao Tsuji et al 1997, Immunology, 90 : 176-182.）に記載されたように、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性、ウサギ回腸ループテスト、あるいは投与動物の臨床症状から評価するが、既知のアミノ酸配列変異を有するｍＬＴの試験品について、家畜のワクチン用アジュバントとしての臨床応用性を評価する場合は、次のようにしてもよい。アジュバント活性評価試験に用いる１０倍量のｂｒｍＬＴを子豚に複数回、経口または経鼻投与し、投与後の食欲、動作、発熱、体重変化、下痢等を一定期間観察し、ＰＢＳ投与群との比較で異常を認めない場合、また解剖後の投与粘膜部位及び腸管組織に炎症性病理学的変化を認めなければ臨床応用上、安全と評価する。
【００２６】
以下に本発明の実施例について詳細に説明する。
【００２７】
【実施例１】
変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）遺伝子のクローニング
【００２８】
（１）大腸菌へのクローニング
変異易熱性トキシン（ｍＬＴ：ＡサブユニットのArg192-Thr193-Ile194が欠失）遺伝子のクローニングには、ＬＴのＡサブユニット遺伝子のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント由来のプラスミドｐＴＳＵ１３５（Takao Tsuji et al., 1997
Immunology, 90 : 176-182.）を使用した。
【００２９】
このプラスミドｐＴＳＵ１３５ ＤＮＡを鋳型として合成した２種類のプライマーｍＬＴＡＭ１（配列番号１０：図１３）、ｍＬＴＡＲＶ１（配列番号１１：図１４）を用いてｍＬＴのＡサブユニット遺伝子（７１４ｂｐ）をＰＣＲ法で増幅した。同様に２種類のプライマーｍＬＴＢＭ１（配列番号１２：図１５）、ｍＬＴＢＲＶ１（配列番号１３：図１６）を用いてｍＬＴのＢサブユニット遺伝子（３１２ｂｐ）を増幅した。
【００３０】
ｍＬＴＡ遺伝子の取得にはプライマーｍＬＴＡＭ１とｍＬＴＡＲＶ１を、ｍＬＴＢ遺伝子の取得にはプライマーｍＬＴＢＭ１とｍＬＴＢＲＶ１を各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、染色体鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、１００μｌＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ Ｍｇ2+、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を混合し、９５℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）プライマーのアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって増幅させた。遺伝子ｍＬＴＡ（７２３ｂｐ）とｍＬＴＢ（３１２ｂｐ）を０．８％アガロース電気泳動に供し、断片を回収した。
【００３１】
プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と先に得たｍＬＴＡ遺伝子とｍＬＴＢ遺伝子をＴ４リガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天培地（１．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％ ＮａＣｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布して、アンピシリン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＡ遺伝子、ｍＬＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＡ、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＢを得た。また、ここで得た株をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＢとした。
【００３２】
（２）ブレビバチルス・チョウシネンシスへのクローニング
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）この菌株はバチルス・チョウシネンシスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）は蛋白質を菌体外に分泌生産し、培養液中にタンパク質分解酵素を生産しない菌株であり、遺伝子組換えの宿主菌として知られている（特公平４−７４９９７号公報）。
【００３３】
プラスミドｐＮＨ３０１（プラスミドｐＮＨ３００(Yasuhiro Shiga et al 1992. Applied and Environmental Microbiology, 58 : 525-531.)の塩基配列３３３７番目のＮｃｏＩサイトに変異を入れてＮｃｏＩサイトを塩基配列９１番目の１つにしたプラスミド）をＮｃｏＩとＳａｌＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して４．０ｋｂｐの断片を回収した。さらに、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＡとＮｃｏＩとＳａｌＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して７１４ｂｐのｍＬＴＡ遺伝子断片を回収し、先に得た４．０ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地に塗布をして、ネオマイシン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡを得た。また、ここで得た株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡとした。
【００３４】
同様の方法でｐＮＨ３０１をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して４．０ｋｂｐの断片を回収した。さらにｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＢをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して３１２ｂｐのｍＬＴＢ遺伝子断片を回収し、先に得た４．０ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形成転換し、ネオマイシン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢを得た、ここで得た株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢとした。
【００３５】
（３）ブレビバチルス・チョウシネンシスのｍＬＴＡ−ｍＬＴＢ、ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡの構築
ｍＬＴは、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造（１Ａ５Ｂ）を持つ為、ＡとＢを同時に発現させなければならない。ブレビバチルス・チョウシネンシスの発現ベクターに毒素原性大腸菌の染色体の並びと同しｍＬＴＡ−ｍＬＴＢで連結した物と逆のｍＬＴＢ−ｍＬＴＡで連結した物を作製した。また、ｍＬＴＡ、ｍＬＴＢ２つの遺伝子が両方とも発現できるように、間にはブレビバチルス・チョウシネンシスで認識されるＳＤ配列を挿入した。
【００３６】
ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡをＳａｌＩとＫｐｎＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して４．７ｋｂｐの断片を回収した。さらに、ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢを鋳型として合成した２種類のプライマーＳＤＳＭ１（配列番号１４：図１７）、ｍＬＴＢＲＶ１（配列番号１３：図１６）を用いてＳＤ−ｍＬＴＢ遺伝子（４０２ｂｐ）をＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＫｐｎＩで処理して０．４ｋｂｐの断片を回収し、先に得たｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡ由来の４．７ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）をエレクトポレーション法で形質転換し、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地（１％ペプトン、０．２％酵母エキス、０．５％肉エキス、１％グルコース、０．００１％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、０．０００１％ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布して、ネオマイシン耐性を持つ株を選択しようとしたが、耐性株が得られなかった。
【００３７】
ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して４．３ｋｂｐの断片を回収した。さらに、ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡを鋳型として合成した２種類のプライマーＳＤＢＭ１（配列番号１５：図１８）、ｍＬＴＡＲＶ１（配列番号１１：図１４）を用いてＳＤ−ｍＬＴＡ遺伝子（８０４ｂｐ）をＰＣＲ法で増殖した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理して０．８ｋｂｐの断片を回収し、先に得た４．３ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイシン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡを得た（図１９）。また、ここで得た株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０００）とした。
【００３８】
【実施例２】
形質転換体の培養
形質転換体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０００）を中試験管を用いてネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地３ｍｌで３０℃で２日間振とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウサギｍＬＴポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により解析を行った。ｍＬＴＡ及びｍＬＴＢの推定分子量は、それぞれ２８ｋＤａ、１２ｋＤａであり、それぞれが相当の分子量の位置に染色バンドを示した。バンドの濃さよりｍＬＴＡの分泌生産量は７０ｍｇ／ｌ、ｍＬＴＢの分泌生産量は３０ｍｇ／ｌと定量した。そのパターンを図面代用写真に示す（図２０）。
【００３９】
【実施例３】
形質転換体培養物の精製
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡを５００ｍｌ三角フラスコを用いてネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地１５０ｍｌで３０℃で３日間振とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った。解析の結果、ｍＬＴＡ蛋白質が７０ｍｇ／ｌ、ｍＬＴＢ蛋白質が３０ｍｇ／ｌ培地中に生産されていることが確認された
。
【００４０】
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡの培養液６Ｌを遠心分離機を用いて菌体を沈殿させ、培養上清液を得た。次に培養上清液を３００ｍｌずつｉｍｍｏｂｉｌｌｉｚｅｄ Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ（ピアス社）５ｍｌを充填したカラムに通し、５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で洗浄後、０．２Ｍ Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ／５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で溶出した。この操作を複数くり返した。溶出した２００ｍｌの精製ｍＬＴ液を分画分子量１０，０００のミニタンカセット膜（ミリポア社）を用いて濃縮し、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）２０００ｍｌを加水することにより脱ガラクトースを行った。濃縮液のｂｒｍＬＴを回収し、分画分子量３０，０００のペリコンＸＬ膜（ミリポア社）を用いてエンドトキシンの除去を行った。透過液を回収し、１Ａ５Ｂ構造を持つｂｒｍＬＴ溶液（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２））３００ｍｌを得た。ｂｒｍＬＴの純度は９５％以上で、培養液からの回収率は約１０％であった。（表１）
【００４１】
【００４２】
【実施例４】
マウスにおけるアジュバント活性の感染防御試験による評価試験
（１）豚丹毒菌防御抗原活性を有する蛋白質（４６．５ｋＰＡ）をコードする遺伝子で形質転換したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３００ ｅｎ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６９８）を培養し、その培養物を、
（ｉ）０．２２μｍの精密濾過膜で濾過処理し、更に５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄することによって培養物中に含まれる培地由来の成分などの夾雑物を濾過画分に除き、豚丹毒菌防御抗原蛋白質と菌体を濃縮する工程、
（ii）豚丹毒菌防御抗原蛋白質と菌体の濃縮画分を０．２２μｍの精密濾過膜及を用いて５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０〜１１）で洗浄することにより豚丹毒菌防御抗原蛋白質を可溶化せしめて、これを濾過画分に集める工程、
（iii）濾過画分をＤＥＡＥによる陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離回収する工程、
によって、豚丹毒菌防御抗原（４６．５ｋＰＡ）の回収精製を行った。その結果、高純度（純度８０％）の４６．５ｋＰＡが得られた。そのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００４３】
（２）上記で得た豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡを１００μｇ／ｍｌに、ｂｒｍＬＴは１００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、それらの等量混合液５０μｌをエーテル麻酔下で６〜７週齢の雄ｄｄＹマウス（日本クレア生産ＳＰＦマウス）の鼻孔内に吸引させた。対照群には同濃度の４６．５ｋＰＡのみ、またはｂｒｍＬＴのみを鼻孔吸引させた。２週間後に同要領で追加免疫し、その１週後に豚丹毒菌のの強毒Ｆｕｊｉｓａｗａ株の１００倍５０％マウス致命量（ブレインハートインフュージョン１８時間培養菌液の１０−５希釈の０．１ｍｌ）をもって腹側皮内に攻撃接種した。２週間にわたり生死を観察した後に安楽死させ、腎臓、肝臓、脾臓の混合乳剤からの接種菌の増菌分離培養を行った。その結果、４６．５ｋＰＡまたは１００μｇ／ｍｌ以上のｂｒｍＬＴ単独で免疫したマウスは攻撃４日後に全頭死亡したが、両者の混合液で経鼻免疫したマウスは全頭が発病せずに生残耐過し、耐過マウスの臓器からは接種菌は分離されなかった。またｂｒｍＬＴ１００μｇ／ｍｌを５０ｍｌを複数回経鼻投与したマウスにおいては異常な臨床症状を認めなかった。以上から、ｂｒｍＬＴは経鼻投与により粘膜アジュバントとしての活性を有し、急性毒性を有さないと判定した。
【００４４】
【実施例５】
豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡで経鼻免疫した豚でのアジュバント活性の感染防御試験による評価
豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡを１０００μｇ／ｍｌに、ｂｒｍＬＴは２００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、それらの等量混合液１ｍｌを６〜７週齢の子豚（豚丹毒菌ワクチン非接種母豚の産子）の鼻孔内に注入した。対照群には同濃度の４６．５ｋＰＡのみ、またはｂｒｍＬＴのみを鼻内注入した。３週間後に同要領で追加免疫した。免疫１週後に採取した鼻汁及び血清中の４６．５ｋＰＡに対するＥＬＩＳＡ抗体価を測定した（実施例６参照）。また追加免疫２週後に強毒Ｆｕｊｉｓａｗａ株のブレインハートインフュージョンブロス１８時間培養菌液（５×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）の０．２ｍｌを耳根部皮内に注射した。２週間にわたり臨床症状（皮疹、発熱、関節炎、元気食欲等）を観察した後に安楽死させ、腎臓、肝臓、脾臓の混合乳剤からの接種菌の増菌分離培養を行った。その結果、４６．５ｋＰＡまたはｂｒｍＬＴ単独で免疫したそれぞれ３頭は攻撃３日に全頭が全身発疹、発熱、関節炎をもって発病し、臓器からは接種菌は分離されたが、４１．５ｋＰＡと５００μｇ／ｍｌ以上のｂｒｍＬＴとを混合した溶液で経鼻免疫した３頭は全頭ともに発病せずに耐過し、耐過豚の臓器からの接種菌分離は陰性であった。また２００μｇ／ｍｌのｂｒｍＬＴを２ｍｌづつ２週間隔で２回経鼻投与した２頭の豚には下痢、発熱、食欲不振等の異常な臨床病状を認めず、また鼻粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜には炎症反応を認めなかった。
【００４５】
【実施例６】
豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡで経鼻免疫した豚でのアジュバント活性の抗体価による評価
血清及び鼻汁中の４６．５ｋＰＡに対する抗体はＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡ抗体価の測定法には、９６穴のマイクロプレート（ＮＵＮＣ製Ｍａｘｓｏｒｐ）の各ウェルに１μｇの４６．５ｋＰＡを加え、４℃で一夜静置後、３％ゼラチンＰＢＳでブロッキングした反応用プレートを用いた。反応用プレートに１％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで１，０００倍希釈した豚血清を加え、２５℃で９０秒間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで洗浄し、これに最適濃度の抗豚ＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体を加え、上記同様に反応させ、洗浄する。最後に発色基質液を加え暗所で１０分間反応後、３Ｎ硫酸液を加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＥＬＩＳＡ抗体価とした。なお、鼻汁液のＥＬＩＳＡ抗体価測定には、綿棒で採取した鼻腔拭い液を１ｍｌのＰＢＳですずぎ、その上清を２０倍希釈したものを用い、抗豚ＩｇＡペルオキシダーゼ標識抗体を用いた以外は血清と同様の方法で反応を行った。４１．５ｋＰＡとｂｒｍＬＴの混合液で経鼻免疫した豚の血清中のＩｇＧ抗体価及び鼻汁中のＩｇＡ抗体価は、４６．５ｋＰＡ単独またはｂｒｍＬＴ単独免疫豚よりも顕著に高かった。本結果と実施例２の結果をあわせて、ｂｒｍＬＴは経鼻免疫豚において粘膜アジュバント活性を有すること、また臨床応用において異常毒性を示さないことから、豚用粘膜投与型ワクチンのアジュバントとして利用可能であると判定した。以上から、ｂｒｍＬＴと４６．５ｋＰＡとの混合溶液での経鼻免疫は、４６．５ｋＰＡ単独の経鼻免疫では得られない豚丹毒菌全身感染に対する防御免疫能を獲得させ得ることが示された。
【００４６】
【実施例７】
気管支敗血症のシアル酸特異的赤血球凝集素（ＳＳＨＡ）で経鼻免疫した豚でのアジュバント活性の感染防御試験及び抗体価による評価
ＳＳＨＡをＨＡ価２５６倍に、ｂｒｍＬＴは２００μｇ／ｍｌとなようにＰＢＳに溶解し、それらの等量混合液２ｍｌを５〜６週齢の子豚（豚ボルデテラ感染症不活化ワクチン非接種母豚の産子であり、鼻孔内からの気管支敗血症菌分離陰性の個体）の鼻腔内に注入した。対照群には同濃度のＳＳＨＡのみ、またはｂｒｍＬＴのみを鼻腔内に注入した。３週後に同要領で追加免疫した。追加免疫２週後に強毒Ａ−１９株Ｉ相菌のボルデジャング平板培地３７℃、２４時間培養菌を、ＰＢＳで４×１０7ｃｆｕ／ｍｌとなるように調整し、その菌浮遊液を１ｍｌづつ鼻腔内に注入した。２週間にわたり、３日間隔で採取した鼻汁中の攻撃接種菌の菌数推移を観察した。その結果、ＳＳＨＡ単独またはｂｒｍＬＴ単独で免疫した３頭の豚からは、２週間にわたり非免疫豚と同レベルの多数の攻撃菌が回収されたが、ＳＳＨＡとｂｒｍＬＴとを混合した溶液で経鼻免疫した３頭の豚からの回収菌数は非免疫豚のそれの１／１００以下であった。また実施例６の要領で血清、鼻汁中のＳＳＨＡに対するＥＬＩＳＡ抗体価を測定したところ、ＳＳＨＡ単独またはｂｒｍＬＴ単独で経鼻免疫した豚では有意の抗体価の上昇が認められなかったが、ＳＳＨＡとｂｒｍＬＴの混合溶液で経鼻免疫した豚では、追加免疫により鼻汁中に高レベルのＩｇＡ抗体が、また血清中には高レベルのＩｇＧ抗体の上昇が検出された。以上から、ｂｒｍＬＴとＳＳＨＡとの混合溶液での免疫は、ＳＳＨＡ単独の免疫では得られない気管支敗血症菌の鼻粘膜感染に対する防御免疫能を獲得させ得ることが示された。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によって創製されたＤＮＡを使用することにより、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造（１Ａ５Ｂ）を発現させること、つまりＡとＢとを同時に発現させること、しかもその際、外分泌させることにはじめて成功したものである。このようにして１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有する組換え蛋白質を効率的に製造することが可能となり、これら組換え蛋白質は、例えばトキシンやアジュバント等ワクチンの技術分野において有利に使用することができる。
【００４８】
【配列表】
<210> 7
<211> 1152
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60
aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 120
acatttaaga gcggcgaaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180
cagaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 240
aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300
atgaaaaact agggatccag aggaggagaa cacaaggtca tgaaaaaaag aagggtcgtt 360
aacagtgtat tgcttctgct actgctagct agtgcactcg cacttactgt tgctcccatg 420
gctttcgcta atggcgacaa attataccgt gctgactcta gacccccaga tgaaataaaa 480
cgttccggag gtcttatgcc cagagggcat aatgagtact tcgatagagg aactcaaatg 540
aatattaatc tttatgatca cgcgagagga acacaaaccg gctttgtcag atatgatgac 600
ggatatgttt ccacttctct tagtttgaga agtgctcact tagcaggaca gtctatatta 660
tcaggatatt ccacttacta tatatatgtt atagcgacag caccaaatat gtttaatgtt 720
aatgatgtat taggcgtata cagccctcac ccatatgaac aggaggtttc tgcgttaggt 780
ggaataccat attctcagat atatggatgg tatcgtgtta attttggtgt gattgatgaa 840
cgattacatc gtaacaggga atatagagac cggtattaca gaaatctgaa tatagctccg 900
gcagaggatg gttacagatt agcaggtttc ccaccggatc accaagcttg gagagaagaa 960
ccctggattc atcatgcacc acaaggttgt ggaaattcat caagaacaat tacaggtgat 1020
acttgtaatg aggagaccca gaatctgagc acaatatatc tcagggaata tcaatcaaaa 1080
gttaagaggc agatattttc agactatcag tcagaggttg acatatataa cagaattcgg 1140
aatgaattat ga 1160
<210> 8
<211> 1143
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 8
gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60
aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 120
acatttaaga gcggcgaaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180
cagaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 240
aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300
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aacagtgtat tgcttctgct actgctagct agtgcactcg cacttactgt tgctcccatg 420
gctttcgcta atggcgacaa attataccgt gctgactcta gacccccaga tgaaataaaa 480
cgttccggag gtcttatgcc cagagggcat aatgagtact tcgatagagg aactcaaatg 540
aatattaatc tttatgatca cgcgagagga acacaaaccg gctttgtcag atatgatgac 600
ggatatgttt ccacttctct tagtttgaga agtgctcact tagcaggaca gtctatatta 660
tcaggatatt ccacttacta tatatatgtt atagcgacag caccaaatat gtttaatgtt 720
aatgatgtat taggcgtata cagccctcac ccatatgaac aggaggtttc tgcgttaggt 780
ggaataccat attctcagat atatggatgg tatcgtgtta attttggtgt gattgatgaa 840
cgattacatc gtaacaggga atatagagac cggtattaca gaaatctgaa tatagctccg 900
gcagaggatg gttacagatt agcaggtttc ccaccggatc accaagcttg gagagaagaa 960
ccctggattc atcatgtacc acaaggttgt ggaaattcat caacaggtga tacttgtaat 1020
gaggagaccc agaatctgag cacaatatat ctcagggaat atcaatcaaa agttaagagg 1080
cagatatttt cagactatca gtcagaggtt gacatatata acagaattcg gaatgaatta 1140
tga 1150
<210> 9
<211> 1152
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 9
acacctcaaa atattactga tttgtgtgca gaataccaca acacacaaat acatacgcta 60
aatgataaga tattttcgta tacagaatct ctagctggaa aaagagagat ggctatcatt 120
acttttaaga atggtgcaac ttttcaagta gaagtaccag gtagtcaaca tatagattca 180
caaaaaaaag cgattgaaag gatgaaggat accctgagga ttgcatatct tactgaagct 240
aaagtcgaaa agttatgtgt atggaataat aaaacgcctc atgcgattgc cgcaattagt 300
atggcaaatt aaggatccag aggaggagaa cacaaggtca tgaaaaaaag aagggtcgtt 360
aacagtgtat tgcttctgct actgctagct agtgcactcg cacttactgt tgctcccatg 420
gctttcgcta atgatgataa gttatatcgg gcagattcta gacctcctga tgaaataaag 480
cagtcaggtg gtcttatgcc aagaggacag agtgagtact ttgaccgagg tactcaaatg 540
aatatcaacc tttatgatca tgcaagagga actcagacgg gatttgttag gcacgatgat 600
ggatatgttt ccacctcaat tagtttgaga agtgcccact tagtgggtca aactatattg 660
tctggtcatt ctacttatta tatatatgtt atagccactg cacccaacat gtttaacgtt 720
aatgatgtat taggggcata cagtcctcat ccagatgaac aagaagtttc tgctttaggt 780
gggattccat actcccaaat atatggatgg tatcgagttc attttggggt gcttgatgaa 840
caattacatc gtaatagggg ctacagagat agatattaca gtaacttaga tattgctcca 900
gcagcagatg gttatggatt ggcaggtttc cctccggagc atagagcttg gagggaagag 960
ccgtggattc atcatgcacc gccgggttgt gggaatgctc caagatcatc gatcagtaat 1020
acttgcgatg aaaaaaccca aagtctaggt gtaaaattcc ttgacgaata ccaatctaaa 1080
gttaaaagac aaatattttc aggctatcaa tctgatattg atacacataa tagaattaag 1140
gatgaattat ga 1160
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ccatggcttt cgctaatggc gacaaattat acc 33
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gtcgacttat cataattcat tccgaat 27
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ccatggcttt cgctgctccc cagactatta caga 34
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ggtaccggat ccctagtttt tcatactgat tgc 33
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gtcgacagag gaggagaaca caaggtc 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ggatccagag gaggagaaca caaggtc 27
<210> 16
<211> 402
<212> PRT
<213> Erysipelothrix rhusiopathiae
<400> 16
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＴのＡ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図２】ＬＴのＢ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図３】ｍＬＴのＡ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図４】ｍＬＴのＢ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図５】ＣＴのＡ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図６】ＣＴのＢ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図７】ＬＴ ５Ｂ−ＳＤ−１ＡのＤＮＡシーケンスを示す。
【図８】
同上続きを示す。
【図９】ｍＬＴ ５Ｂ−ＳＤ−１ＡのＤＮＡシーケンスを示す。
【図１０】同上続きを示す。
【図１１】ＣＴ ５Ｂ−ＳＤ−１ＡのＤＮＡシーケンスを示す。
【図１２】同上続きを示す。
【図１３】ｍＬＴＡＭ１プライマーを示す。
【図１４】ｍＬＴＡＲＶ１プライマーを示す。
【図１５】ｍＬＴＢＭ１プライマーを示す。
【図１６】ｍＬＴＢＲＶ１プライマーを示す。
【図１７】ＳＤＳＭ１プライマーを示す。
【図１８】ＳＤＢＭ１プライマーを示す。
【図１９】形質転換体Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNH301 mLTB-mLTAの構築図である。
【図２０】形質転換体と非形質転換体の培養物のクマシーブリリアントブルー染色像及びウェスタンブロッティング像を示す図面代用写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、１Ａ５Ｂ構造を有する蛋白質の製造に関するものであり、更に詳細には、遺伝子組換え技術により、１Ａ５Ｂ構造という高次構造を同時発現、しかも外分泌発現することにはじめて成功したものである。このようにして分泌生産された組換え蛋白質は、ワクチン用アジュバントの製造に有利に使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
コレラ菌（Vibrio cholerae）によって生産される、コレラトキシン（ＣＴ）及び大腸菌（Escherichia coli）腸管毒素産生株によって生産される、易熱性トキシン（ＬＴ）は、きわめて類似した蛋白質である（Clements and Finkelstein 1979. Infect. Immun, 24 : 760-769.）。ＣＴ及びＬＴは、２８ｋＤａのＡサブユニット（ＣＴＡまたはＬＴＡ）と、１１．５ｋＤａモノマー５個からなる非共有結合で会合したＢサブユニット（ＣＴＢまたはＬＴＢ）で構成されている。そして、Ａサブユニットが毒性に関与し、標的細胞のアデニレートシクラーゼ複合体を不可逆的に活性化するＮＡＤ−リボシル化活性を有する（Moss and Richardson 1978. J. Clin. Invest, 62 : 281-285.）。毒性のあるＡサブユニットの細胞内への侵入は、Ｂサブユニットによって促進される。このＢサブユニットは５量体からなり、ＧＭ１、モノシアロガングリオシドトキシン受容体に結合する（Cuatrecasas 1973. Biochemistry, 12 : 3558-3566.）。ＧＭ１は、粘膜上皮を含めて、哺乳動物の様々な組織の表面上に存在する。
【０００３】
ＣＴおよびＬＴは、経口的または経鼻的に投与した場合、特異的に強力な粘膜免疫原性を示すことから粘膜アジュバントとして注目されてきた。注射することと比較し、経口、または経鼻免疫で利用することの利点を例示すると、注射では取扱に細心の注意が必要なこと、また注射位置の確認をする必要のあること、特に被適用者が家畜であった場合なおのこと有効である。加えて、特殊な装置を使用しなくても大規模に投与することが容易となること、また、粘膜への免疫原の送達は、分泌免疫応答の誘起を可能にすること等である。
【０００４】
ＣＴおよびＬＴは、哺乳動物に高い毒性を示すが、最近では毒性は軽減し、かつアジュバント効果を有する変異コレラトキシン（ｍＣＴ）や変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）の例も知られている（Shingo Yamamoto et al 1997. J. Exp. Med, 185 : 1203-1210., Takao Tsuji et al 1997. Immunology, 90 : 176-182., Michio Kato et sl 1997. FEMS Microbiology Letters, 152 : 219-225.）。
【０００５】
現在までにＣＴ、ＬＴを組換体で生産した例は、大腸菌を宿主菌とした例が報告されているが（Yoshihiko Uesaka et al 1994. Microbial Pathogenesis, 16 : 71-76.）、大腸菌では生産されたＣＴ、ＬＴは菌体内に止まっており、菌体外に分泌生産した例はこれまで知られていない。加えて、ＣＴおよびＬＴは、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造を持っており、今までこのような高次構造をとって分泌生産された例もない。
【０００６】
また、コレラ菌や大腸菌はグラム陰性菌であり、その細菌壁成分であるリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は発熱、ショックなどの内毒素活性を持っており、ＣＴおよびＬＴの調製時において、ＬＰＳの除去は医薬品製造において大変重要な工程となっており、ＣＴおよびＬＴを調製する上で重大な問題点となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１Ａ５Ｂのサブユニット構造を持つトキシンであるＣＴ、ＬＴを組換え体で製造する方法を提供することにある。特に本発明では、ＬＴの毒性を軽減したＬＴの変異体であるｍＬＴ（Ａサブユニットが配列番号３（図３）、Ｂサブユニットが配列番号４（図４）で示される）を例示し、ＣＴ、ＬＴ、ｍＬＴを安全性と有効性に優れた組換え体で製造する方法及び高次構造を持った形で、高純度に回収する方法を提供することである。
更に、本発明を完成させることにより、上記組換えｍＬＴを経粘膜ワクチンのアジュバントとして使用に供することにある。
【０００８】
本課題を解決するために、本発明者らは、（１）ｍＬＴのＡサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子のポリヌクレオチドを効率よく外分泌発現させるためのベクター・宿主系を確立し、（２）ＡサブユニットとＢサブユニットを外分泌させた際、効率良く１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造（１Ａ５Ｂ）をとる発現系を構築し、（３）得られた組換えｍＬＴ（以下ｂｒｍＬＴという）をアジュバントとして経粘膜投与し、被投与動物に強力な感染・発病防御免疫を誘導するための技術を確立することを目的として鋭意研究を行った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ｍＬＴのＡサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子のＮ末端分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除した領域をブレビバチルス・チョウシネンシスの分泌発現ベクターに連結することにより高次構造（１Ａ５Ｂ）を有するｂｒｍＬＴを分泌生産することを見出した。また、５量体からなるＢサブユニット遺伝子を前にして、ＳＤ配列遺伝子をはさんで、単量体のＡサブユニット遺伝子を後ろにしてタンデムに連結することにより、より効率良く高次構造（１Ａ５Ｂ）を持つｂｒｍＬＴが分泌生産される方法を確立した。形質転換したブレビバチルス・チョウシネンシスの培養上清をアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理することによりｂｒｍＬＴを回収したところ、アジュバント活性を有し、且つ、エンドトキシンの含量の低い高純度のｂｒｍＬＴを製造する方法を確立した。
【００１０】
すなわち本発明は、Ａサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子から、各々シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除し、（Ｂサブユニット遺伝子）−（ＳＤ配列遺伝子）−（Ａサブユニット遺伝子）の順にタンデムに結合した１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡを基本的技術思想とするものであって、これらのＤＮＡは従来未知の新規物質であり、その非限定例としては次のものが例示される。
【００１１】
（１）易熱性トキシン（ＬＴ）に関する、配列番号７（図７、８）の塩基配列で示されるＤＮＡ（Ｂサブユニット遺伝子：１ｇｃｔ〜３０７ａａｃ、Ａサブユニット遺伝子：４２７ｇｃｔ〜１１４７ｔｔａ）。
（２）変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）に関する、配列番号８（図９、１０）の塩基配列で示されるＤＮＡ（Ｂサブユニット遺伝子：１ｇｃｔ〜３０７ａａｃ、Ａサブユニット遺伝子：４２７ｇｃｔ〜１１３７ｔｔａ）。
（３）コレラトキシン（ＣＴ）に関する、配列番号９（図１１、１２）の塩基配列で示されるＤＮＡ（Ｂサブユニット遺伝子：１ａｃｃ〜３０７ａａｔ、Ａサブユニット遺伝子：４２７ｇｃｔ〜１１４７ｔｔａ）。
【００１２】
また本発明は、上記したＤＮＡを含有するプラスミドでブレビバチルス・チョウシネンシス等の宿主菌を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、培養物から１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質を組換え体として製造する技術も包含するものであって、例えば次のような組換えタンパク質を製造することができる。
【００１３】
（Ｉ）１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号１（図１）、Ｂサブユニットが配列番号２（図２）のアミノ酸配列で示される大腸菌（Escherichia coli）で生産される易熱性トキシン（ＬＴ）であることを特徴とする前記（１）のＤＮＡを利用するタンパク質の製造法。
（II）１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号３（図３）、Ｂサブユニットが配列番号４（図４）のアミノ酸配列で示される変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）であることを特徴とする前記（２）のＤＮＡを利用するタンパク質の製造法。
（III）１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号５（図５）、Ｂサブユニットが配列番号６（図６）のアミノ酸配列で示される、コレラ菌（Vibrio cholerae）によって生産されるコレラトキシン（ＣＴ）であることを特徴とする前記（３）のＤＮＡを利用するタンパク質の製造法。
【００１４】
以下、本発明を変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）を例にとって説明するが、ＬＴ、ＣＴ、その他１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有するタンパク質も同様である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いた変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）のポリペプチドは、すでに辻らによって報告（Takao Tsuji et al., 1997 Immunology, 90 : 176-182.）されており、ＡサブユニットのArg192-Thr193-Ile194が天然型より欠失しており、それによってトリプシン感受性部位が非感受性となっている。タンパク質分解酵素による被分解部位の欠落により、その毒性形態に変化するＡサブユニットのタンパク質分解酵素によるプロセッシングが妨げられる。天然のＬＴは、細菌から単離された当初、毒性はないが、哺乳類の腸に見出されるプロテアーゼに暴露されプロセッシングを受け毒性を有する形になると考えられている。変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）は変異を受けていることにより毒性を有する形となる可能性は少ないが、免疫学的アジュバントとしての活性はなお保持している。
【００１６】
本発明は、ｍＬＴのＡサブユニット遺伝子とＢサブユニット遺伝子のＮ末端分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除した領域を５量体からなるＢサブユニット遺伝子−ＳＤ配列遺伝子−単量体のＡサブユニット遺伝子と言うようにタンデムに発現ベクターに連結し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、この該形質転換体を培養し、生産したｂｒｍＬＴを回収、精製する製造方法を提供する。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、分泌形態または非分泌形態のいずれで生産されていてもよいが、高次構造（１Ａ５Ｂ）形成、分離精製の容易さから分泌形態が好ましい。分泌形態の場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流に任意のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を連結させる。
【００１８】
発現ベクターとしては、ブレビバチルス属細菌において自律複製可能であって、目的ＤＮＡの転写が可能な位置にプロモーターを含有している物を選択できる。または、染色体中へ直接組込み、発現させることでもよい。
【００１９】
宿主細胞としては、バチルス属細菌やBrevibacillus属細菌、特にブレビバチルス・チョウシネンシス(Brevibacillus choshinensis）が良好に使用できる。
【００２０】
形質転換法として、エレクトロポレーション法、プロトブラスト法、ＰＥＧ法などを用いることができる。
【００２１】
形質転換された宿主菌を培地中に培養し、発現ベクターに組込まれた目的ＤＮＡや染色体に組込まれた目的ＤＮＡを発現させ、公知の蛋白質精製方法を利用して組換えｍＬＴ（ｂｒｍＬＴ）を分離精製することができる。精製は、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈澱、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などの方法を組合せて行うことができる。
【００２２】
ｂｒｍＬＴの粘膜アジュバント活性の評価試験は、既報（Takao Tsuji et al 1997, Immunology, 90 : 176-182.）に記載されたように、マウス、ウサギ等の実験動物あるいは豚、めん羊、牛などの家畜を対象とし、試験用抗原（ヘモシアニン、アルブミン、微生物の天然蛋白抗原／組換え抗原など）と被検アジュバント成分とを混合したものを経鼻、経口、経直腸、経膣的に投与し、アジュバント成分添加による免疫応答の増強性から評価するが、例えば次のようにしてもよい。豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）組換え防御抗原蛋白（４６．５ｋＰＡ：特願平１１−９４００４号）ならびに気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）由来シアル酸特異的赤血球凝集素（特許第２９６９１４７号）を抗原とした場合を例にとって説明する。
【００２３】
この豚丹毒菌の４６．５ｋＤａ抗原蛋白は、渡辺、横溝、今田らによって開発されたものである。渡辺、横溝、今田らは、豚丹毒菌の感染防御抗原遺伝子のうち、従来必要とされていたＣ末の繰り返し配列からなる断片をコードするＤＮＡ配列とＮ末の分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を削除したポリヌクレオチドで組換えたブレビバチルス・チョウシネンシスの大量培養液の除菌液から夾雑物を除去し、防御免疫誘導活性をもつ高純度の４６．５ｋＤａ防御抗原（46.5kDa protective antigen ; 46.5KPA）を製造できる方法を見出した（特願平１１−９４００４）。渡辺らの発明によりブレビバチルス・チョウシネンシスで発現して得られた４６．５ＫＰＡは、豚丹毒菌の副作用に関係する菌体成分を全く含まないため、ワクチンの安全性の改善に貢献するものである。
【００２４】
気管支敗血症菌由来シアル酸特異的赤血球凝集素（ＳＳＨＡ）は家畜衛生試験場及び共立商事株式会社により発明されたもので、本菌の培養上清中に含まれるシアル酸特異的赤血球凝集素を、牛の赤血球膜成分を固定化した不溶性支持体に吸着させ、カオトロピックイオンを含むイオン強度０．５以上の緩衝液で溶出させた７〜２８０ｎｍの小胞状の膜様構造物である。本成分はオイルアジュバントまたは水酸化アルミニウムゲルアジュバントをともに豚に接種すると、免疫豚の血清中には凝集抗体が産生され、また免疫豚は本菌強毒株の経鼻攻撃に対する感染防御を示すことから、ワクチンとしての利用性が高い。
この４６．５ｋＰＡとＳＳＨＡをリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ７．２）とｂｒｍＬＴまたは対照用ＰＢＳとを混合した溶液を動物の鼻腔内にマイクロチップを用いて注入／滴下するか、または噴霧器を用いてエアゾルを吸入させる。本免疫操作を一定間隔で複数回実施した後に、免疫動物の血液、鼻汁、唾液、糞便、膣粘液、乳汁を採取し、それらの検体中の試験用抗原に対する特異抗体価をＥＬＩＳＡを用いて測定する。そして、ｂｒｍＬＴと試験抗原混液を投与した動物に試験抗原単独またはｂｒｍＬＴのいずれかを単独投与した動物よりも有意に高い抗体価が検出されれば、粘膜アジュバント活性を有すると判定することができる。さらに、ｂｒｍＬＴと試験抗原とで免疫した動物での病原体攻撃に対する感染防御能（病原体の増殖抑制性、発病抑制等）の向上からも、粘膜アジュバント活性を評価することができる。
【００２５】
粘膜投与アジュバントの毒性評価試験は、既報（Takao Tsuji et al 1997, Immunology, 90 : 176-182.）に記載されたように、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性、ウサギ回腸ループテスト、あるいは投与動物の臨床症状から評価するが、既知のアミノ酸配列変異を有するｍＬＴの試験品について、家畜のワクチン用アジュバントとしての臨床応用性を評価する場合は、次のようにしてもよい。アジュバント活性評価試験に用いる１０倍量のｂｒｍＬＴを子豚に複数回、経口または経鼻投与し、投与後の食欲、動作、発熱、体重変化、下痢等を一定期間観察し、ＰＢＳ投与群との比較で異常を認めない場合、また解剖後の投与粘膜部位及び腸管組織に炎症性病理学的変化を認めなければ臨床応用上、安全と評価する。
【００２６】
以下に本発明の実施例について詳細に説明する。
【００２７】
【実施例１】
変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）遺伝子のクローニング
【００２８】
（１）大腸菌へのクローニング
変異易熱性トキシン（ｍＬＴ：ＡサブユニットのArg192-Thr193-Ile194が欠失）遺伝子のクローニングには、ＬＴのＡサブユニット遺伝子のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント由来のプラスミドｐＴＳＵ１３５（Takao Tsuji et al., 1997
Immunology, 90 : 176-182.）を使用した。
【００２９】
このプラスミドｐＴＳＵ１３５ ＤＮＡを鋳型として合成した２種類のプライマーｍＬＴＡＭ１（配列番号１０：図１３）、ｍＬＴＡＲＶ１（配列番号１１：図１４）を用いてｍＬＴのＡサブユニット遺伝子（７１４ｂｐ）をＰＣＲ法で増幅した。同様に２種類のプライマーｍＬＴＢＭ１（配列番号１２：図１５）、ｍＬＴＢＲＶ１（配列番号１３：図１６）を用いてｍＬＴのＢサブユニット遺伝子（３１２ｂｐ）を増幅した。
【００３０】
ｍＬＴＡ遺伝子の取得にはプライマーｍＬＴＡＭ１とｍＬＴＡＲＶ１を、ｍＬＴＢ遺伝子の取得にはプライマーｍＬＴＢＭ１とｍＬＴＢＲＶ１を各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、染色体鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、１００μｌＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭ Ｍｇ2+、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を混合し、９５℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）プライマーのアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって増幅させた。遺伝子ｍＬＴＡ（７２３ｂｐ）とｍＬＴＢ（３１２ｂｐ）を０．８％アガロース電気泳動に供し、断片を回収した。
【００３１】
プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と先に得たｍＬＴＡ遺伝子とｍＬＴＢ遺伝子をＴ４リガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天培地（１．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％ ＮａＣｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布して、アンピシリン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＡ遺伝子、ｍＬＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＡ、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＢを得た。また、ここで得た株をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＢとした。
【００３２】
（２）ブレビバチルス・チョウシネンシスへのクローニング
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）この菌株はバチルス・チョウシネンシスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）は蛋白質を菌体外に分泌生産し、培養液中にタンパク質分解酵素を生産しない菌株であり、遺伝子組換えの宿主菌として知られている（特公平４−７４９９７号公報）。
【００３３】
プラスミドｐＮＨ３０１（プラスミドｐＮＨ３００(Yasuhiro Shiga et al 1992. Applied and Environmental Microbiology, 58 : 525-531.)の塩基配列３３３７番目のＮｃｏＩサイトに変異を入れてＮｃｏＩサイトを塩基配列９１番目の１つにしたプラスミド）をＮｃｏＩとＳａｌＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して４．０ｋｂｐの断片を回収した。さらに、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＡとＮｃｏＩとＳａｌＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して７１４ｂｐのｍＬＴＡ遺伝子断片を回収し、先に得た４．０ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地に塗布をして、ネオマイシン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡを得た。また、ここで得た株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡとした。
【００３４】
同様の方法でｐＮＨ３０１をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して４．０ｋｂｐの断片を回収した。さらにｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｍＬＴＢをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して３１２ｂｐのｍＬＴＢ遺伝子断片を回収し、先に得た４．０ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形成転換し、ネオマイシン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢを得た、ここで得た株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢとした。
【００３５】
（３）ブレビバチルス・チョウシネンシスのｍＬＴＡ−ｍＬＴＢ、ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡの構築
ｍＬＴは、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造（１Ａ５Ｂ）を持つ為、ＡとＢを同時に発現させなければならない。ブレビバチルス・チョウシネンシスの発現ベクターに毒素原性大腸菌の染色体の並びと同しｍＬＴＡ−ｍＬＴＢで連結した物と逆のｍＬＴＢ−ｍＬＴＡで連結した物を作製した。また、ｍＬＴＡ、ｍＬＴＢ２つの遺伝子が両方とも発現できるように、間にはブレビバチルス・チョウシネンシスで認識されるＳＤ配列を挿入した。
【００３６】
ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡをＳａｌＩとＫｐｎＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して４．７ｋｂｐの断片を回収した。さらに、ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢを鋳型として合成した２種類のプライマーＳＤＳＭ１（配列番号１４：図１７）、ｍＬＴＢＲＶ１（配列番号１３：図１６）を用いてＳＤ−ｍＬＴＢ遺伝子（４０２ｂｐ）をＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＫｐｎＩで処理して０．４ｋｂｐの断片を回収し、先に得たｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡ由来の４．７ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）をエレクトポレーション法で形質転換し、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地（１％ペプトン、０．２％酵母エキス、０．５％肉エキス、１％グルコース、０．００１％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、０．０００１％ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布して、ネオマイシン耐性を持つ株を選択しようとしたが、耐性株が得られなかった。
【００３７】
ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供して４．３ｋｂｐの断片を回収した。さらに、ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＡを鋳型として合成した２種類のプライマーＳＤＢＭ１（配列番号１５：図１８）、ｍＬＴＡＲＶ１（配列番号１１：図１４）を用いてＳＤ−ｍＬＴＡ遺伝子（８０４ｂｐ）をＰＣＲ法で増殖した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理して０．８ｋｂｐの断片を回収し、先に得た４．３ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイシン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出してｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ遺伝子を保持するプラスミドｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡを得た（図１９）。また、ここで得た株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０００）とした。
【００３８】
【実施例２】
形質転換体の培養
形質転換体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０００）を中試験管を用いてネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地３ｍｌで３０℃で２日間振とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウサギｍＬＴポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により解析を行った。ｍＬＴＡ及びｍＬＴＢの推定分子量は、それぞれ２８ｋＤａ、１２ｋＤａであり、それぞれが相当の分子量の位置に染色バンドを示した。バンドの濃さよりｍＬＴＡの分泌生産量は７０ｍｇ／ｌ、ｍＬＴＢの分泌生産量は３０ｍｇ／ｌと定量した。そのパターンを図面代用写真に示す（図２０）。
【００３９】
【実施例３】
形質転換体培養物の精製
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡを５００ｍｌ三角フラスコを用いてネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地１５０ｍｌで３０℃で３日間振とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った。解析の結果、ｍＬＴＡ蛋白質が７０ｍｇ／ｌ、ｍＬＴＢ蛋白質が３０ｍｇ／ｌ培地中に生産されていることが確認された
。
【００４０】
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡの培養液６Ｌを遠心分離機を用いて菌体を沈殿させ、培養上清液を得た。次に培養上清液を３００ｍｌずつｉｍｍｏｂｉｌｌｉｚｅｄ Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ（ピアス社）５ｍｌを充填したカラムに通し、５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で洗浄後、０．２Ｍ Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ／５０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で溶出した。この操作を複数くり返した。溶出した２００ｍｌの精製ｍＬＴ液を分画分子量１０，０００のミニタンカセット膜（ミリポア社）を用いて濃縮し、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）２０００ｍｌを加水することにより脱ガラクトースを行った。濃縮液のｂｒｍＬＴを回収し、分画分子量３０，０００のペリコンＸＬ膜（ミリポア社）を用いてエンドトキシンの除去を行った。透過液を回収し、１Ａ５Ｂ構造を持つｂｒｍＬＴ溶液（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２））３００ｍｌを得た。ｂｒｍＬＴの純度は９５％以上で、培養液からの回収率は約１０％であった。（表１）
【００４１】
【実施例４】
マウスにおけるアジュバント活性の感染防御試験による評価試験
（１）豚丹毒菌防御抗原活性を有する蛋白質（４６．５ｋＰＡ）をコードする遺伝子で形質転換したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３００ ｅｎ２（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６９８）を培養し、その培養物を、
（ｉ）０．２２μｍの精密濾過膜で濾過処理し、更に５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄することによって培養物中に含まれる培地由来の成分などの夾雑物を濾過画分に除き、豚丹毒菌防御抗原蛋白質と菌体を濃縮する工程、
（ii）豚丹毒菌防御抗原蛋白質と菌体の濃縮画分を０．２２μｍの精密濾過膜及を用いて５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０〜１１）で洗浄することにより豚丹毒菌防御抗原蛋白質を可溶化せしめて、これを濾過画分に集める工程、
（iii）濾過画分をＤＥＡＥによる陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離回収する工程、
によって、豚丹毒菌防御抗原（４６．５ｋＰＡ）の回収精製を行った。その結果、高純度（純度８０％）の４６．５ｋＰＡが得られた。そのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【００４３】
（２）上記で得た豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡを１００μｇ／ｍｌに、ｂｒｍＬＴは１００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、それらの等量混合液５０μｌをエーテル麻酔下で６〜７週齢の雄ｄｄＹマウス（日本クレア生産ＳＰＦマウス）の鼻孔内に吸引させた。対照群には同濃度の４６．５ｋＰＡのみ、またはｂｒｍＬＴのみを鼻孔吸引させた。２週間後に同要領で追加免疫し、その１週後に豚丹毒菌のの強毒Ｆｕｊｉｓａｗａ株の１００倍５０％マウス致命量（ブレインハートインフュージョン１８時間培養菌液の１０−５希釈の０．１ｍｌ）をもって腹側皮内に攻撃接種した。２週間にわたり生死を観察した後に安楽死させ、腎臓、肝臓、脾臓の混合乳剤からの接種菌の増菌分離培養を行った。その結果、４６．５ｋＰＡまたは１００μｇ／ｍｌ以上のｂｒｍＬＴ単独で免疫したマウスは攻撃４日後に全頭死亡したが、両者の混合液で経鼻免疫したマウスは全頭が発病せずに生残耐過し、耐過マウスの臓器からは接種菌は分離されなかった。またｂｒｍＬＴ１００μｇ／ｍｌを５０ｍｌを複数回経鼻投与したマウスにおいては異常な臨床症状を認めなかった。以上から、ｂｒｍＬＴは経鼻投与により粘膜アジュバントとしての活性を有し、急性毒性を有さないと判定した。
【００４４】
【実施例５】
豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡで経鼻免疫した豚でのアジュバント活性の感染防御試験による評価
豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡを１０００μｇ／ｍｌに、ｂｒｍＬＴは２００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、それらの等量混合液１ｍｌを６〜７週齢の子豚（豚丹毒菌ワクチン非接種母豚の産子）の鼻孔内に注入した。対照群には同濃度の４６．５ｋＰＡのみ、またはｂｒｍＬＴのみを鼻内注入した。３週間後に同要領で追加免疫した。免疫１週後に採取した鼻汁及び血清中の４６．５ｋＰＡに対するＥＬＩＳＡ抗体価を測定した（実施例６参照）。また追加免疫２週後に強毒Ｆｕｊｉｓａｗａ株のブレインハートインフュージョンブロス１８時間培養菌液（５×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）の０．２ｍｌを耳根部皮内に注射した。２週間にわたり臨床症状（皮疹、発熱、関節炎、元気食欲等）を観察した後に安楽死させ、腎臓、肝臓、脾臓の混合乳剤からの接種菌の増菌分離培養を行った。その結果、４６．５ｋＰＡまたはｂｒｍＬＴ単独で免疫したそれぞれ３頭は攻撃３日に全頭が全身発疹、発熱、関節炎をもって発病し、臓器からは接種菌は分離されたが、４１．５ｋＰＡと５００μｇ／ｍｌ以上のｂｒｍＬＴとを混合した溶液で経鼻免疫した３頭は全頭ともに発病せずに耐過し、耐過豚の臓器からの接種菌分離は陰性であった。また２００μｇ／ｍｌのｂｒｍＬＴを２ｍｌづつ２週間隔で２回経鼻投与した２頭の豚には下痢、発熱、食欲不振等の異常な臨床病状を認めず、また鼻粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜には炎症反応を認めなかった。
【００４５】
【実施例６】
豚丹毒菌の４６．５ｋＰＡで経鼻免疫した豚でのアジュバント活性の抗体価による評価
血清及び鼻汁中の４６．５ｋＰＡに対する抗体はＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡ抗体価の測定法には、９６穴のマイクロプレート（ＮＵＮＣ製Ｍａｘｓｏｒｐ）の各ウェルに１μｇの４６．５ｋＰＡを加え、４℃で一夜静置後、３％ゼラチンＰＢＳでブロッキングした反応用プレートを用いた。反応用プレートに１％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで１，０００倍希釈した豚血清を加え、２５℃で９０秒間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで洗浄し、これに最適濃度の抗豚ＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体を加え、上記同様に反応させ、洗浄する。最後に発色基質液を加え暗所で１０分間反応後、３Ｎ硫酸液を加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＥＬＩＳＡ抗体価とした。なお、鼻汁液のＥＬＩＳＡ抗体価測定には、綿棒で採取した鼻腔拭い液を１ｍｌのＰＢＳですずぎ、その上清を２０倍希釈したものを用い、抗豚ＩｇＡペルオキシダーゼ標識抗体を用いた以外は血清と同様の方法で反応を行った。４１．５ｋＰＡとｂｒｍＬＴの混合液で経鼻免疫した豚の血清中のＩｇＧ抗体価及び鼻汁中のＩｇＡ抗体価は、４６．５ｋＰＡ単独またはｂｒｍＬＴ単独免疫豚よりも顕著に高かった。本結果と実施例２の結果をあわせて、ｂｒｍＬＴは経鼻免疫豚において粘膜アジュバント活性を有すること、また臨床応用において異常毒性を示さないことから、豚用粘膜投与型ワクチンのアジュバントとして利用可能であると判定した。以上から、ｂｒｍＬＴと４６．５ｋＰＡとの混合溶液での経鼻免疫は、４６．５ｋＰＡ単独の経鼻免疫では得られない豚丹毒菌全身感染に対する防御免疫能を獲得させ得ることが示された。
【００４６】
【実施例７】
気管支敗血症のシアル酸特異的赤血球凝集素（ＳＳＨＡ）で経鼻免疫した豚でのアジュバント活性の感染防御試験及び抗体価による評価
ＳＳＨＡをＨＡ価２５６倍に、ｂｒｍＬＴは２００μｇ／ｍｌとなようにＰＢＳに溶解し、それらの等量混合液２ｍｌを５〜６週齢の子豚（豚ボルデテラ感染症不活化ワクチン非接種母豚の産子であり、鼻孔内からの気管支敗血症菌分離陰性の個体）の鼻腔内に注入した。対照群には同濃度のＳＳＨＡのみ、またはｂｒｍＬＴのみを鼻腔内に注入した。３週後に同要領で追加免疫した。追加免疫２週後に強毒Ａ−１９株Ｉ相菌のボルデジャング平板培地３７℃、２４時間培養菌を、ＰＢＳで４×１０7ｃｆｕ／ｍｌとなるように調整し、その菌浮遊液を１ｍｌづつ鼻腔内に注入した。２週間にわたり、３日間隔で採取した鼻汁中の攻撃接種菌の菌数推移を観察した。その結果、ＳＳＨＡ単独またはｂｒｍＬＴ単独で免疫した３頭の豚からは、２週間にわたり非免疫豚と同レベルの多数の攻撃菌が回収されたが、ＳＳＨＡとｂｒｍＬＴとを混合した溶液で経鼻免疫した３頭の豚からの回収菌数は非免疫豚のそれの１／１００以下であった。また実施例６の要領で血清、鼻汁中のＳＳＨＡに対するＥＬＩＳＡ抗体価を測定したところ、ＳＳＨＡ単独またはｂｒｍＬＴ単独で経鼻免疫した豚では有意の抗体価の上昇が認められなかったが、ＳＳＨＡとｂｒｍＬＴの混合溶液で経鼻免疫した豚では、追加免疫により鼻汁中に高レベルのＩｇＡ抗体が、また血清中には高レベルのＩｇＧ抗体の上昇が検出された。以上から、ｂｒｍＬＴとＳＳＨＡとの混合溶液での免疫は、ＳＳＨＡ単独の免疫では得られない気管支敗血症菌の鼻粘膜感染に対する防御免疫能を獲得させ得ることが示された。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によって創製されたＤＮＡを使用することにより、１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットからなる高次構造（１Ａ５Ｂ）を発現させること、つまりＡとＢとを同時に発現させること、しかもその際、外分泌させることにはじめて成功したものである。このようにして１Ａ５Ｂのサブユニット構造を有する組換え蛋白質を効率的に製造することが可能となり、これら組換え蛋白質は、例えばトキシンやアジュバント等ワクチンの技術分野において有利に使用することができる。
【００４８】
【配列表】
<211> 1152
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60
aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 120
acatttaaga gcggcgaaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180
cagaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 240
aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300
atgaaaaact agggatccag aggaggagaa cacaaggtca tgaaaaaaag aagggtcgtt 360
aacagtgtat tgcttctgct actgctagct agtgcactcg cacttactgt tgctcccatg 420
gctttcgcta atggcgacaa attataccgt gctgactcta gacccccaga tgaaataaaa 480
cgttccggag gtcttatgcc cagagggcat aatgagtact tcgatagagg aactcaaatg 540
aatattaatc tttatgatca cgcgagagga acacaaaccg gctttgtcag atatgatgac 600
ggatatgttt ccacttctct tagtttgaga agtgctcact tagcaggaca gtctatatta 660
tcaggatatt ccacttacta tatatatgtt atagcgacag caccaaatat gtttaatgtt 720
aatgatgtat taggcgtata cagccctcac ccatatgaac aggaggtttc tgcgttaggt 780
ggaataccat attctcagat atatggatgg tatcgtgtta attttggtgt gattgatgaa 840
cgattacatc gtaacaggga atatagagac cggtattaca gaaatctgaa tatagctccg 900
gcagaggatg gttacagatt agcaggtttc ccaccggatc accaagcttg gagagaagaa 960
ccctggattc atcatgcacc acaaggttgt ggaaattcat caagaacaat tacaggtgat 1020
acttgtaatg aggagaccca gaatctgagc acaatatatc tcagggaata tcaatcaaaa 1080
gttaagaggc agatattttc agactatcag tcagaggttg acatatataa cagaattcgg 1140
aatgaattat ga 1160
<210> 8
<211> 1143
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 8
gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60
aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 120
acatttaaga gcggcgaaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180
cagaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 240
aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300
atgaaaaact agggatccag aggaggagaa cacaaggtca tgaaaaaaag aagggtcgtt 360
aacagtgtat tgcttctgct actgctagct agtgcactcg cacttactgt tgctcccatg 420
gctttcgcta atggcgacaa attataccgt gctgactcta gacccccaga tgaaataaaa 480
cgttccggag gtcttatgcc cagagggcat aatgagtact tcgatagagg aactcaaatg 540
aatattaatc tttatgatca cgcgagagga acacaaaccg gctttgtcag atatgatgac 600
ggatatgttt ccacttctct tagtttgaga agtgctcact tagcaggaca gtctatatta 660
tcaggatatt ccacttacta tatatatgtt atagcgacag caccaaatat gtttaatgtt 720
aatgatgtat taggcgtata cagccctcac ccatatgaac aggaggtttc tgcgttaggt 780
ggaataccat attctcagat atatggatgg tatcgtgtta attttggtgt gattgatgaa 840
cgattacatc gtaacaggga atatagagac cggtattaca gaaatctgaa tatagctccg 900
gcagaggatg gttacagatt agcaggtttc ccaccggatc accaagcttg gagagaagaa 960
ccctggattc atcatgtacc acaaggttgt ggaaattcat caacaggtga tacttgtaat 1020
gaggagaccc agaatctgag cacaatatat ctcagggaat atcaatcaaa agttaagagg 1080
cagatatttt cagactatca gtcagaggtt gacatatata acagaattcg gaatgaatta 1140
tga 1150
<210> 9
<211> 1152
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 9
acacctcaaa atattactga tttgtgtgca gaataccaca acacacaaat acatacgcta 60
aatgataaga tattttcgta tacagaatct ctagctggaa aaagagagat ggctatcatt 120
acttttaaga atggtgcaac ttttcaagta gaagtaccag gtagtcaaca tatagattca 180
caaaaaaaag cgattgaaag gatgaaggat accctgagga ttgcatatct tactgaagct 240
aaagtcgaaa agttatgtgt atggaataat aaaacgcctc atgcgattgc cgcaattagt 300
atggcaaatt aaggatccag aggaggagaa cacaaggtca tgaaaaaaag aagggtcgtt 360
aacagtgtat tgcttctgct actgctagct agtgcactcg cacttactgt tgctcccatg 420
gctttcgcta atgatgataa gttatatcgg gcagattcta gacctcctga tgaaataaag 480
cagtcaggtg gtcttatgcc aagaggacag agtgagtact ttgaccgagg tactcaaatg 540
aatatcaacc tttatgatca tgcaagagga actcagacgg gatttgttag gcacgatgat 600
ggatatgttt ccacctcaat tagtttgaga agtgcccact tagtgggtca aactatattg 660
tctggtcatt ctacttatta tatatatgtt atagccactg cacccaacat gtttaacgtt 720
aatgatgtat taggggcata cagtcctcat ccagatgaac aagaagtttc tgctttaggt 780
gggattccat actcccaaat atatggatgg tatcgagttc attttggggt gcttgatgaa 840
caattacatc gtaatagggg ctacagagat agatattaca gtaacttaga tattgctcca 900
gcagcagatg gttatggatt ggcaggtttc cctccggagc atagagcttg gagggaagag 960
ccgtggattc atcatgcacc gccgggttgt gggaatgctc caagatcatc gatcagtaat 1020
acttgcgatg aaaaaaccca aagtctaggt gtaaaattcc ttgacgaata ccaatctaaa 1080
gttaaaagac aaatattttc aggctatcaa tctgatattg atacacataa tagaattaag 1140
gatgaattat ga 1160
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ccatggcttt cgctaatggc gacaaattat acc 33
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gtcgacttat cataattcat tccgaat 27
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ccatggcttt cgctgctccc cagactatta caga 34
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ggtaccggat ccctagtttt tcatactgat tgc 33
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gtcgacagag gaggagaaca caaggtc 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ggatccagag gaggagaaca caaggtc 27
<210> 16
<211> 402
<212> PRT
<213> Erysipelothrix rhusiopathiae
<400> 16
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＴのＡ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図２】ＬＴのＢ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図３】ｍＬＴのＡ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図４】ｍＬＴのＢ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図５】ＣＴのＡ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図６】ＣＴのＢ ｓｕｂｕｎｉｔのアミノ酸シーケンスを示す。
【図７】ＬＴ ５Ｂ−ＳＤ−１ＡのＤＮＡシーケンスを示す。
【図８】
同上続きを示す。
【図９】ｍＬＴ ５Ｂ−ＳＤ−１ＡのＤＮＡシーケンスを示す。
【図１０】同上続きを示す。
【図１１】ＣＴ ５Ｂ−ＳＤ−１ＡのＤＮＡシーケンスを示す。
【図１２】同上続きを示す。
【図１３】ｍＬＴＡＭ１プライマーを示す。
【図１４】ｍＬＴＡＲＶ１プライマーを示す。
【図１５】ｍＬＴＢＭ１プライマーを示す。
【図１６】ｍＬＴＢＲＶ１プライマーを示す。
【図１７】ＳＤＳＭ１プライマーを示す。
【図１８】ＳＤＢＭ１プライマーを示す。
【図１９】形質転換体Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNH301 mLTB-mLTAの構築図である。
【図２０】形質転換体と非形質転換体の培養物のクマシーブリリアントブルー染色像及びウェスタンブロッティング像を示す図面代用写真である。
Claims (9)
- １個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットから成るタンパク質である、易熱性トキシン（ＬＴ）又はコレラトキシン（ＣＴ）又はこれらの変異体（ｍＬＴ又はｍＣＴ）タンパク質のいずれかのＡサブユニット遺伝子をコードするＤＮＡ、及び、いずれかのＢサブユニット遺伝子をコードするＤＮＡから、各サブユニット遺伝子をコードするＤＮＡ自身が有するシグナルをコードするＤＮＡ配列を削除し、（Ｂサブユニット遺伝子のＤＮＡ）−（ＳＤ配列遺伝子のＤＮＡ）−（Ａサブユニット遺伝子のＤＮＡ）の順にタンデムに結合した１個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットから成るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ。
- 配列番号７〜９の少なくともひとつの塩基配列で示される請求項１に記載の遺伝子のＤＮＡ。
- ブレビバチルス・チョウシネンシス菌体内で作用するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターのシグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流に請求項１又は２に記載のＤＮＡを挿入した発現ベクターでブレビバチルス・チョウシネンシスを形質転換し、該ブレビバチルス・チョウシネンシスの形質転換体を培養することによりタンパク質を培地中に分泌生産することを特徴とする１個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットから成るタンパク質の製造法。
- １個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットから成るタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号１、Ｂサブユニットが配列番号２のアミノ酸配列で示される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で生産される易熱性トキシン（ＬＴ）であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の製造法。
- １個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットから成るタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号３、Ｂサブユニットが配列番号４のアミノ酸配列で示される変異易熱性トキシン（ｍＬＴ）であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の製造法。
- １個のＡサブユニットと５個のＢサブユニットから成るタンパク質が、Ａサブユニットが配列番号５、Ｂサブユニットが配列番号６のアミノ酸配列で示される、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）によって生産されるコレラトキシン（ＣＴ）であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の製造法。
- 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有してなるプラスミド。
- 該プラスミドがｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡであることを特徴とする請求項７に記載のプラスミド。
- 形質転換体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３０１ ｍＬＴＢ−ｍＬＴＡ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０００）。
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