JPH09500538A

JPH09500538A - ナイセリア・メニンギチジス外膜グループｂポーリンタンパク質の高レベル発現、精製および再生

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Publication number: JPH09500538A
Application number: JP7505354A
Authority: JP
Inventors: ブレイク，ミラン・エス; タイ，ジョセフ・ワイ; クイ，ヒュイリン・エル; リャン，シュー−メイ; ホロノウスキー，ルクジャン・ジェイ・ジェイ; プレン，ジェフリー・ケイ
Original assignee: ザ・ロックフェラー・ユニバーシティー; ノース・アメリカン・バクシーン，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-07-23
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1997-01-21
Also published as: BR9407092A; US5879686A; PL182573B1; PL312712A1; AU690570B2; CA2167677A1; RU2181378C2; AU7371694A; US5439808A; FI960309A0; EP0713530A4; NZ269996A; NO960256D0; WO1995003413A1; FI960309A; US6013267A; EP0713530A1; NO960256L

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、外膜タンパク質髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質およびその融合タンパク質の高レベル発現方法に関する。とりわけ、本発明は、図に示すプラスミド発現ベクターｐｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂの使用によって代表される、外膜タンパク質髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質の大腸菌中での発現方法に関し、その際、該髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質およびその融合タンパク質は大腸菌中で発現された全タンパク質の２％以上を占める。本発明はまた、該髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質およびその融合タンパク質の精製および再生方法並びにワクチンにおけるその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ナイセリア・メニンギチジス外膜グループＢポーリンタンパク質の高レベル発現、精製および再生発明の背景発明の技術分野本発明は、遺伝子組換え、タンパク質発現、およびワクチンの分野に属する。本発明は、とりわけ、ナイセリア・メニンギチジス (Ｎeisseria meningitidis) からの外膜グループＢポーリンタンパク質の組換え宿主中での発現方法に関する。本発明はまた、該組換えタンパク質の精製および再生方法にも関する。発明の背景に関する説明他のグラム陰性細菌と全く同様にナイセリア種の外膜は半透過性膜であり、これら細菌のペリプラズム空間を出入りして小分子量の物質の自由な流入および流出をさせるが、大きなサイズの分子はその出入りを遅らせる（ヒースリー（Heas ley,Ｆ.Ａ.）ら、「ナイセリア・ゴノロエエ外膜透過性バリヤの再構成および特徴付け（Ｒeconstitution and characterization of the Ｎeisseria gonorrhoe ae outer membrane permeability barrier）」、Ｇenetics and Ｉmmunology of Ｎeisseria gonorrhoeae、ダニエルスン（Ｄanielsson）およびノーマーク（Ｎ ormark）編、Ｕniversity of Ｕmea、Ｕmea、１２〜１５頁（１９８０）中；ダグラス（Ｄouglas,Ｊ.Ｔ.）ら、ＦＥＭＳＭicrobiol.Ｌett.１２：３０５〜３０９（１９８１））。このことが行われる機構の一つは、包括的にポーリン（po rins）と呼ばれているタンパク質がこれら膜中に含まれていることである。これらタンパク質は３つの同一のポリペプチド鎖からなり（ジョーンズ（Ｊones,Ｒ. Ｂ.）ら、Ｉnfect.Ｉmmun.３０：７７３〜７８０（１９８０）；マックデード（ＭcＤade,Ｊr.）およびジョンストン（Ｊohnston）、Ｊ.Ｂacteriol.１４１：１１８３〜１１９１（１９８０））、天然の３量体コンホメーションにおいては、それが組み込まれた細菌の外膜や他の膜中で水分の充填された電位差に依存するチャネルを形成する（リンチ（Ｌynch,Ｅ.Ｃ.）ら、Ｂiophys.Ｊ．４１：６２（１９８３）；リンチら、Ｂiophys.Ｊ．４５：１０４〜１０７（１９８４）；ヤング（Ｙoung,Ｊ.Ｄ.Ｅ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８０：３８３１〜３８３５（１９８３）；マウロ（Ｍauro,Ａ.）ら、Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８５：１０７１〜１０７５（１９８８）；ヤングら、Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８３：１５０〜１５４（１９８６））。これらタンパク質は外膜中に比較的多く存在するので、これらタンパク質抗原はまた疫学的目的のためにナイセリア・ゴノロエエおよびナイセリア・メニンギチジスの両者を幾つかの血清型に細分類するのに用いられている（フラッシュ（Ｆrasch,Ｃ.Ｅ. ）ら、Ｒev.Ｉnfect.Ｄis.７：５０４〜５１０（１９８５）；クナップ（Ｋnapp ,Ｊ.Ｓ.）ら、「ナイセリア・ゴノロエエの栄養型／血清型分類の疫学的および臨床的応用の概観（Ｏverview of epidermiological and clinical application s of auxotype/serevar classification of Ｎeisseria gonorrhoeae）」、Ｔhe Ｐathogenic Ｎeisseriae、スクールニク（Ｓchoolnik,Ｇ.Ｋ.）編、Ａmerican Ｓociety for Ｍicrobiology、ワシントン、６〜１２頁（１９８５））。今日、淋菌および髄膜炎菌の両者からのこれらタンパク質の多くは精製されており（ヘッケルズ（Ｈeckels,Ｊ.Ｅ.）、Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiol.９９：３３３〜３４１（１９７７）；ジェームズおよびヘッケルズ、Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.４２：２２３〜２２８（１９８１）；ジュッド（Ｊudd,Ｒ.Ｃ.）、Ａnal.Ｂiochem.１７３：３０７〜３１６（１９８８）；ブレイク（Ｂlake）およびゴチュリッヒ（Ｇotschl ich）、Ｉnfect.Ｉmmun.３６：２７７〜２８３（１９８２）；ウエッツラー（Ｗ etzler,Ｌ.Ｍ.）ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１６８：１８８３〜１８９７（１９８８））、クローニングされ配列決定されている（ゴチュリッヒら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ８４：８１３５〜８１３９（１９８７）；マッギネス（ＭcＧuinnes s,Ｂ.）ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１７１：１８７１〜１８８２（１９９０）；カーボネッティ（Ｃarbonetti）およびスパーリング（Ｓparling）、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ８４：９０８４〜９０８８（１９８７）；フィーバーズ（Ｆeavers, Ｉ.Ｍ.）ら、Ｉnfect.Ｉmmun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２）；ムラカミ（Ｍurakami,Ｋ.）ら、Ｉnfect.Ｉmmun.５７：２３１８〜２３２３（１９８９）；ウォルフ（Ｗolff）およびスターン（Ｓtern）、ＦＥＭＳＭicrobiol.Ｌett.８３：１７９〜１８６（１９９１）；ウォード（Ｗard,Ｍ.Ｊ.）ら、ＦＥＭＳＭi crobiol.Ｌett.７３：２８３〜２８９（１９９２））。ポーリンタンパク質は、最初、リポ多糖とともに単離された。その結果、ポーリンタンパク質は「内毒素結合タンパク質」と呼ばれた（ビヨルンソン（Ｂjorn son）ら、Ｉnfect.Ｉmmun.５６：１６０２〜１６０７（１９８８））。野性型ポーリンの研究によれば、完全な集合およびオリゴマー形成はタンパク質環境中に対応細菌株からのＬＰＳが存在しない限り起こらないことが報告されている（ホルゼンブルク（Ｈolzenburg）ら、Ｂiochemistry２８：４１８７〜４１９３（１９８９）；セン（Ｓen）およびニカイドー（Ｎikaido）、Ｊ.Ｂiol.Ｃh em.２６６：１１２９５〜１１３００（１９９１））。髄膜炎菌のポーリンは３つの主要なクラスに細分されており、これらは以前の命名ではクラス１、２および３として知られていた（フラッシュら、Ｒev.Ｉnfe ct.Ｄis.７：５０４〜５１０（１９８５））。調べた各髄膜炎菌にはクラス２ポーリン遺伝子かまたはクラス３ポーリン遺伝子のいずれかの対立遺伝子の一方が含まれていたが両方は含まれていなかった（フィーバーズら、Ｉnfect.Ｉmmun. ６０：３６２０〜３６２９（１９９２）；ムラカミら、Ｉnfect.Ｉmmun.５７：２３１８〜２３２３（１９８９））。クラス１の遺伝子が存在するか存在しないかは場合によるように思われる。同様に、プローブしたすべての淋菌にはクラス２かまたはクラス３の対立遺伝子のいずれかに類似する一方のみのポーリン遺伝子が含まれている（ゴチュリッヒら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：８１３５〜８１３９（１９８７）；カーボネッティおよびスパーリング、Ｐroc.Ｎ atl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：９０８４〜９０８８（１９８７））。ナイセリア・ゴノロエエはクラス１の対立遺伝子を全く欠失していると思われる。これまで配列決定された遺伝子からのデータは、すべてのナイセリア系ポーリンタンパク質は互いに少なくとも７０％の相同性を有し、基本骨格（basic theme）の上に若干の変異を有することが示唆されている（フィーバーズら、Ｉnfect.Ｉmmun. ６０：３６２０〜３６２９（１９９２））。これらナイセリア系ポーリンタンパク質間で認められる変異のほとんどは、これら病原微生物がその天然の宿主であるヒト中に侵入することによってもたらされた免疫学的圧力によるものであることが示唆されている。しかしながら、ポーリンタンパク質の配列における変化がいかにしてこれらタンパク質の機能的活性に影響を及ぼすかについてはほとんどわかっていない。脂質二重層の研究において、クラス２の対立遺伝子型の単離淋菌ポーリンは、イオン選択性および電位差依存性に関してクラス３型の単離淋菌ポーリンと電気物理学的に若干異なる挙動を示すことが報告されている（リンチら、Ｂiophys. Ｊ.４１：６２（１９８３）；リンチら、Ｂiophys.Ｊ.４５：１０４〜１０７（１９８４））。さらに、種々のポーリンが完全な生きた細菌からこれら脂質二重層に侵入する能力は、ポーリンの型のみならず、それが由来するナイセリア種とも関係すると思われる（リンチら、Ｂiophys.Ｊ.４５：１０４〜１０７（１９８４））。これら機能的特性の少なくとも幾つかは、ポーリンのタンパク質配列内の異なる領域と関係すると思われる。これまでにすべての淋菌クラス２様タンパク質内で同定されたそのような機能的領域の一つは、キモトリプシン開裂部位である。キモトリプシン消化すると、このクラスのポーリンは電位差に応答する能力を失い、閉鎖される。淋菌クラス３様ポーリン並びに髄膜炎菌ポーリンは該配列を欠失しており、それゆえキモトリプシン開裂に供されないが、それにも拘わらず閉鎖することによって負荷した電位差に応答する（グレコ（Ｇreco,Ｆ.）、「淋菌主要外膜タンパク質による脂質二重層でのチャネルの形成（Ｔhe formati on of channels in lipid bilayers by gonococcal major outer membrane prot ein）」、要旨集、Ｔhe Ｒockefeller Ｕniversity、ニューヨーク（１９８１）；グレコら、Ｆed.Ｐroc.３９：１８１３（１９８０））。そのような研究の主要な障害は、近代的な分子技術によってポーリン遺伝子を容易に操作し、充分な精製タンパク質を得てこれら変化したポーリンタンパク質の生物物理学的特徴付けを行う能力に関するものであった。初期の頃は、クローニングしたナイセリアのポーリン遺伝子は大腸菌中で発現させたときに宿主である大腸菌にとって致死性であると認識されていた（カーボネッティおよびスパーリング、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：９０８４〜９０８８（１９８７）；カーボネッティら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８５：６８４１〜６８４５（１９８８）；バーロウ（Ｂarlow,Ａ.Ｋ.）ら、Ｉnfect.Ｉmmun.５５：２７３４〜２７４０（１９８７））。それゆえ、これら遺伝子の多くは、全遺伝子の断片としてクローニングおよび配列決定されるかまたは厳しい発現制御下で低コピー数のプラスミド中に入れられた（カーボネッティら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ８５：６８４１〜６８４５（１９８８））。これら条件下ではたとえ全ポーリン遺伝子が発現されたとしても、さらに精製し特徴付けのために処理することができるのはごくわずかに蓄積したタンパク質である。この問題に対する他の方針でわずかの成功しか勝ち得ていないものは、ポーリン遺伝子を低コピー数の厳しく制御された発現プラスミド中にクローニングし、このポーリン遺伝子に修飾を導入し、ついで該修飾された配列をナイセリア中に再導入するというものであった（カーボネッティら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ８５：６８４１〜６８４５（１９８８））。しかしながら、この方法もまた、ナイセリア、とりわけ淋菌中に存在する精巧な制限エンドヌクレアーゼ系による問題を伴っていた（デービーズ（Ｄavies,Ｊ.Ｋ.）、Ｃlin.Ｍicrobiol.Ｒe v.２：７８〜８２頁（１９８９））。本発明は、これら困難を克服する方法に関するものである。成熟ポーリンタンパク質、たとえばクラス２およびクラス３並びにその融合タンパク質のＤＮＡ配列は、髄膜炎菌の染色体をＰＣＲ反応の鋳型として用いて増幅することができる。増幅したポーリン配列を、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクター中にライゲートし、クローニングした。ポーリン遺伝子を含むｐＥＴ−１７ｂプラスミドの一つの発現宿主として、ＤＥ３ラムダファージに対して溶原性での大腸菌株ＢＬ２１（スチュジエ（Ｓtudier）およびモファット（Ｍoffatt）、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１８９：１１３〜１３０（１９８６））（ｏｍｐＡ遺伝子を除去すべく修飾）を選択した。誘発させると、大量の髄膜炎菌ポーリンタンパク質が該大腸菌宿主に何ら顕著な致死作用を示すことなく該宿主細菌中に蓄積した。発現された髄膜炎菌ポーリンタンパク質を標準手順により抽出および処理し、最後に分子ふるいクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。分子ふるいクロマトグラフィーからの該タンパク質のプロフィールから判断されるように、この組換え髄膜炎菌ポーリンはカラムから３量体として溶出された。そのような高発現を可能とするために髄膜炎菌ポーリン遺伝子中にＰＣＲ人工産物が導入されなかったことを確実にするため、挿入されたＰｏｒＢ遺伝子配列を決定した。発現された組換えポーリンタンパク質が天然の抗原性で３量体のコンホメーションに脱変性されたという証拠をさらに得るため、抑制ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。発明の要約異なるナイセリア株および種から得られたポーリンは、アミノ酸の一次配列および機能的アッセイによって観察される生物物理学的特性の両方において差異を有することが示された。ナイセリア・ポーリン分子のアミノ酸一次配列における変化がこれら観察された生物物理学変化といかなる相関関係を有するかについてのもっと突っ込んだ研究は、近代の分子技術によってクローニングポーリン遺伝子を容易に操作し、ついで発現された修飾ポーリンタンパク質を充分に得ることによって精製しこれら生物物理学的な機能的アッセイに適用する能力が障害となっていた。本発明では、成熟ＰｏｒＢタンパク質をコードする遺伝子（ナイセリアのプロモーターおよびシグナル配列を欠く）を発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングし、大腸菌中に形質転換した。誘発させると、大量のＰｏｒＢタンパク質が産生された。ついで、発現されたポーリンタンパク質をその天然の３量体構造を再生させるために操作し、ついで精製した。抗原性の特徴付けおよび生物物理学的特徴付けをさらに行うために充分な精製組換えポーリンタンパク質が得られた。それゆえ、このことにより、これらナイセリアのポーリンタンパク質の生物物理学的特徴付けを一層詳細に行うことができる。本発明の一般的目的は、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、とりわけクラス２およびクラス３ポーリンタンパク質の発現方法を提供することにある。本発明の特定の目的は、（ａ）選択可能なマーカーおよび（i）成熟ポーリンタンパク質、および（ii）Ｔ７遺伝子のφ１０カプシドタンパク質のアミノ酸１〜２０に融合した成熟ポーリンタンパク質を含む融合タンパク質、よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで大腸菌を形質転換し、その際、該遺伝子は該Ｔ７プロモーターに機能的に連結しており、（ｂ）該形質転換した大腸菌を選択剤を含む培地中で培養し、ついで（ｃ）該タンパク質の発現を誘発させる、その際、該タンパク質は該大腸菌中で発現された全タンパク質の２％以上を占めることを特徴とする、髄膜炎菌グループＢクラス２またはクラス３ポーリンタンパク質の大腸菌中での発現方法を提供することにある。本発明の他の特定の目的は、上記方法によって産生された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質および融合タンパク質を精製および再生する方法を提供することにある。本発明の別の特定の目的は、動物においてナイセリア・メニンギチジスに対する保護抗体を産生させるに充分な量の上記方法によって産生された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質および融合タンパク質、および薬理学的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチンを提供することにある。本発明の他の特定の目的は、該髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質がナイセリア・メニンギチジスの莢膜多糖に結合している上記ワクチンを提供することにある。本発明のさらに他の特定の目的は、上記方法に従って産生された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質−ワクチンを動物に投与することを特徴とする、動物において髄膜炎を防御する方法を提供することにある。本発明の別の特定の目的は、上記髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を得、ナイセリア・メニンギチジスから多糖を得、ついで該髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を該多糖に結合させることからなる多糖結合体の製造方法を提供することにある。本発明の他の特定の目的は、形質転換した大腸菌を溶解させて髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を不溶性封入体の一部として放出させ、該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌細胞性タンパク質を除去し、該封入体を変性剤の水溶液中に再懸濁および溶解し、得られた溶液を界面活性剤中に希釈し、ついで可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質をゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製する、ことを特徴とする上記髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質の精製方法を提供することにある。本発明の別の特定の目的は、形質転換した大腸菌を溶解させて髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を不溶性封入体の一部として放出させ、該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌細胞性タンパク質を除去し、該封入体を変性剤の水溶液中に再懸濁および溶解し、得られた溶液を界面活性剤中に希釈し、ついで可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質をゲル濾過により精製して溶出液中に再生したタンパク質を得る、ことを特徴とする上記髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質の再生方法を提供することにある。本発明の別の特定の目的は、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むベクター（該ＤＮＡ分子は該ベクターのＴ７プロモーターに機能的に連結している）を含有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡ宿主細胞を提供することにある。本発明の別の特定の目的は、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡを提供することにある。本発明の他の目的および利点は以下の記載から明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１：ＰｏｒＢ遺伝子の配列決定戦略を示す模式図。実施例１に記載するＰＣＲ産物（材料および方法の部門）を発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａｍＨＩ −ＸｈｏＩ部位中にライゲートした。最初の二本鎖プライマー伸長配列決定を、ｐＥＴ−１７ｂプラスミド内のＢａｍＨＩ部位のすぐ上流およびＸｈｏＩ部位のすぐ下流のオリゴヌクレオチド配列を用いて行った。別の配列データを、エキソヌクレアーゼIII／ヤエナリヌクレアーゼ反応を用いて該遺伝子の３'末端に多数の欠失を生成させることにより得た。再ライゲーションおよび大腸菌中への形質転換後、挿入物のサイズに従って幾つかのクローンを選択し、引き続き配列決定した。この配列決定は、Ｂｐｕｌ１０２１部位のすぐ下流のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、常に該遺伝子の３'末端から行った。図２：ＰＣＲ反応の生成物を示すゲル電気泳動（ＴＡＥ緩衝液を用い、１％アガロース中で電気泳動）。図３（パネル（ａ）およびパネル（ｂ））パネル（ａ）：挿入物を有しない対照のｐＥＴ−１７ｂプラスミドを有する大腸菌、および材料および方法の部門に記載する得られたＰＣＲ産物からの挿入物を含有するｐＥＴ−１７ｂプラスミドを有する大腸菌クローンの全細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。両方の培養液とも、６００ｎｍにおける吸光度が０.６になるまで増殖させ、ＩＰＴＧを加え、３７℃で２時間インキュベートした。各培養液を各１.５ｍｌ取り、遠心分離し、細菌ペレットを１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製緩衝液中に可溶化した。レーンＡは対照の試料１０μｌで得られたタンパク質プロフィールを示し、レーンＢ（５μｌ）およびＣ（１０μｌ）はＰｏｒＢタンパク質を発現する大腸菌宿主のタンパク質プロフィールを示す。パネル（ｂ）：ＩＰＴＧで２時間誘発した後の挿入物を有しない対照のｐＥＴ−１７ｂプラスミドを有する大腸菌の全細胞溶解液のウエスタンブロット分析、レーンＡ、２０μｌおよびｐｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂプラスミドを含有する対応大腸菌クローン、レーンＢ、５μｌ；レーンＣ、１０μｌ；およびレーンＤ、２０μｌ。モノクローナル抗体４Ｄ１１を一次抗体として用い、記載のようにしてウエスタンブロットを展開した。ＢＲＬからの前以て染色した低分子量標準を各場合に用いた。図４：発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングした成熟ＰｏｒＢ遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）および翻訳したアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）。以前に刊行されている血清型１５ＰｏｒＢとは異なる２つのヌクレオチドに下線を引いてある。図５：２８０ｎｍにおける吸光度およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりモニターした、髄膜炎菌株８７６５から単離した野性型クラス３タンパク質およびｒ３ｐＥＴ−１７ｂ［これは誤植か−それは実施例中には出てこない］プラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡ大腸菌株によって産生された組換えクラス３タンパク質の両者のセファクリルＳ−３００カラム溶出プロフィールを示すグラフ。カラムのボイド容積は矢印で示してある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される髄膜炎菌ポーリンを含有するフラクションおよび組換えポーリンを含有するフラクションを横棒で示してある。図６：６つのヒト免疫血清において相同野性型ＰｏｒＢが反応性抗体に競合する能力を示す抑制ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ。算術平均抑制を太線で示す。図７：６つのヒト免疫血清において精製組換えＰｏｒＢタンパク質が反応性抗体に競合する能力を示す抑制ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ。算術平均抑制を太線で示す。図８：野性型および組換えＰｏｒＢタンパク質を用いて得られたこれら２つの平均抑制の比較を示すグラフ。図９Ａおよび９Ｂ：発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングした成熟クラスIIポーリン遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）および翻訳したアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）。図１０Ａおよび１０Ｂ：発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ中にクローニングした融合クラスIIポーリン遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）および翻訳したアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）。図１１（パネルＡおよびＢ）：パネルＡはｐＥＴ−１７ｂプラスミドの制限地図を示す。パネルＢはｐＥＴ−１７ｂのＢｇｌII部位とＸｈｏＩ部位との間のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７およびＳＥＱＩＤＮＯ：９）を示す。このプラスミドによって提供される配列は通常の印字で示すが、ＰＣＲ産物から挿入した配列は太い印字で示す。このプラスミドに由来するアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：８およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０）は通常の印字で示すが、該挿入物からのアミノ酸は太い印字で示す。矢印は、図４の配列と一致する配列が開始する場所およびそれが終止する場所を画定する。発明の詳細な説明大腸菌および少数の他のグラム陰性細菌のポーリンタンパク質と異なり、ナイセリアからのポーリンの一次配列における変化がそのイオン選択性、電位差依存性、および他の生物物理学的機能にどのような影響を及ぼすかについては比較的ほとんどわかっていない。最近、２つの大腸菌ポーリンであるＯｍｐＦおよびＰｈｏＥの結晶構造が、それぞれ２.４Åおよび３.０Åに解像された（コーワン（Ｃowan,Ｓ.Ｗ.）ら、Ｎature ３５８：７２７〜７３３（１９９２））。これら大腸菌ポーリンの両方とも、その異常な安定性および分子遺伝学操作を容易に行えることのため、詳しく研究されている。これら２つのポーリンの遺伝学について得られたデータは、結晶構造と良い相関関係を示した。ナイセリアのポーリンを選択するためにモノクローナル抗体を用いだ幾つかの研究においてナイセリアの表面トポロジーがこれら２つの大腸菌ポーリンのトポロジーと極めて類似しているということが示されているが（ファン・デア・レイ（van der Ｌey,Ｐ.）ら、Ｉnfect.Ｉmmun.５９：２９６３〜２９７１（１９９１））、大腸菌のポーリンでなされているように（コーワンら、Ｎature ３５８：７２７〜７３３（１９９２））、ナイセリアのポーリンの特定領域中のアミノ酸配列の変化がその生物物理学的特性にどのような影響を及ぼすかについてはほとんど何の情報も得られていない。この研究の障害となっている主要な問題を２つ挙げると、以下の通りである：（１）近代分子技術によりナイセリアの遺伝子操作を容易に行えないこと、および（２）さらに精製して生物物理学的および生化学的特性データを得るために充分な量のナイセリアポーリンを大腸菌中で発現させることができないこと。実際、淋菌および髄膜炎菌のポーリンにおけるＤＮＡ配列データのほとんどは、該ポーリン遺伝子の重複断片をクローニングし、ついで得られた情報を再構築して全体の遺伝子配列を明らかにすることによって得られている（ゴチュリッヒら、Ｐ roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：８１３５〜８１３９（１９８７）；ムラカミら、Ｉnfect.Ｉmmun.５７：２３１８〜２３２３（１９８９））。カーボネッティらは初めて、厳しく制御したｐＴ７−５発現プラスミドを用いて淋菌の全ポーリン遺伝子を大腸菌中にクローニングした。これら研究の結果は、該ポーリン遺伝子を誘発させたときにポーリンタンパク質はごくわずかしか蓄積せず、このタンパク質の発現は大腸菌にとって致死性であることを示した（カーボネッティおよびスパーリング、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：９０８４〜９０８８（１９８７））。別の研究においてカーボネッティらは（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ８５６８４１〜６８４５（１９８８）、淋菌のポーリン遺伝子における変化をこの系において大腸菌中で起こさせ、ついで淋菌中に再導入することができることを示した。しかしながら、これら操作を容易に行うことができること、およびさらに生化学的および生物物理学的特徴付けのために充分なポーリンタンパク質を容易に得ることができることについては限度があるように思われる。フィーバーズらは、ポーリン遺伝子の５'末端および３'末端の共通配列に対して２つの合成オリゴヌクレオチドを用い、広範囲の採取源からナイセリアのポーリン遺伝子をＰＣＲにより増幅する方法を記載している（フィーバーズら、Ｉnf ect.Ｉmmun.６０；３６２０〜３６２９（１９９２））。オリゴヌクレオチドの構築は、増幅されたＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIおよびＸｈｏＩを用いてプラスミド中に強制的にクローニングし得るようにして行った。このフィーバーズらのＰＣＲ系を用い、髄膜炎菌株８７６５血清型１５からの成熟ＰｏｒＢタンパク質のＤＮＡ配列を増幅し、Ｔ７発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位中にライゲートした。このことにより、成熟ＰｏｒＢタンパク質配列は、Ｔ７プロモーターおよびリーダー配列を含むφ１０タンパク質の２０アミノ酸のすぐ後ろにインフレームで配置されることとなった。このプラスミドを含む大腸菌の培養液にＩＰＴＧを加えると、大量のＰｏｒＢタンパク質が該細菌中に蓄積した。なぜ該構築物が大腸菌にとって致死性でなく、大量のポーリンタンパク質が発現されるのかについての完璧な説明は今後の研究に待たなければならない。しかしながら、一つの可能な仮説は、これらナイセリアのプロモーターおよびシグナル配列をＴ７およびφ１０のものとそれぞれ置換することによって、ポーリン産物は外膜よりもむしろ細胞質の方へ向けられたということである。ヘニング（Ｈenning）および彼の共同研究者は、大腸菌のＯｍｐＡタンパク質およびその断片が発現された場合に、細胞質中に認められる産物はペリプラズム空間に向けられた産物よりも毒性が低いことを報告している（クローズ（Ｋlose,Ｍ.）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６３：１３２９１〜１３２９６（１９８８）；クローズら、Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.２６３：１３２９７〜１３３０２（１９８８）；フロイドル（Ｆreudl,Ｒ.）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.２０５：７７１〜７７５（１９８９））。説明がいかようであれ、いったんＰｏｒＢタンパク質が発現されたら、容易に単離、精製され、天然のポーリンと全く同様に３量体に再生すると思われる。ヒト免疫血清を用いた抑制ＥＬＩＳＡデータの結果は、このようにして得られたＰｏｒＢタンパク質が、髄膜炎菌から精製した野性型のＰｏｒＢタンパク質の抗原特性のすべてではないにしてもそのほとんどを再獲得することを示唆している。この発現系は、それ計体、近代の分子技術によるナイセリアのポーリン遺伝子の操作を容易にするものである。加えて、この発現系は、特徴付けのために純粋なポーリンタンパク質を大量に得ることを可能にする。加えて、この発現系は、淋菌および髄膜炎菌の両方のナイセリアの多くの株からの遺伝子を同様の仕方で調べ特徴付けることを可能にする。それゆえ、本発明は、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、とりわけクラス２およびクラス３ポーリンタンパク質の発現方法に関する。一つの態様において、本発明は、（ａ）選択可能なマーカーおよび（i）成熟ポーリンタンパク質、および（ii）Ｔ７遺伝子φ１０カプシドタンパク質のアミノ酸１〜２０または２２に融合した成熟ポーリンタンパク質を含む融合タンパク質、よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで大腸菌を形質転換し、その際、該遺伝子は該Ｔ７プロモーターに機能的に連結しており、（ｂ）該形質転換した大腸菌を選択剤を含む培地中で培養し、ついで（ｃ）該タンパク質の発現を誘発させる、その際、そのようにして産生された該タンパク質は該大腸菌中で発現された全タンパク質の２％以上を占めることを特徴とする、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質の大腸菌中での発現方法に関する。好ましい態様において、発現された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質は、大腸菌中で発現された全タンパク質の約５％以上を占める。他の好ましい態様において、発現された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質は、大腸菌中で発現された全タンパク質の約１０％以上を占める。さらに別の好ましい態様において、発現された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質は、大腸菌中で発現された全タンパク質の約３０％以上を占める。Ｔ７誘発性プロモーターを含むプラスミドの例としては、発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）およびｐＥＴ−９ａが挙げられ、これらはすべてノバゲン（Ｎovagen）（ウイスコンシン５３７１１、マジソン、サイエンス・ドライブ、５６５番地）から市販されている。これらプラスミドは、順番にＴ７プロモーター、任意にｌａｃオペレーター、リボソーム結合部位、構造遺伝子の挿入を可能とするための制限部位、およびＴ７終止配列を含む。ノバゲンカタログ、３６〜４３頁（１９９３）参照。好ましい態様において、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡを用いる。上記プラスミドは、この株または野性型株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換することができる。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡが好ましい。というのは、この株では精製ポーリンタンパク質を汚染し所望でない免疫原副作用を引き起こすかもしれないＯｍｐＡタンパク質が産生されないからである。形質転換した大腸菌を、選択剤、たとえば大腸菌が感受性のアンピシリンなどのβ−ラクタムを含む培地中で増殖させる。ｐＥＴ発現ベクターは、形質転換された生物に抗生物質耐性を付与する選択マーカーを提供する。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質の高レベル発現は大腸菌中で毒性でありうる。驚くべきことに、本発明は、大腸菌が全細胞性タンパク質の少なくともほとんど３０％で＞５０％もの高レベルのタンパク質を発現することを可能にする。他の好ましい態様において、本発明は、薬理学的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤とともに、上記方法によって産生された外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を含むワクチンに関し、その際、該ワクチンは、動物においてナイセリア・メニンギチジスへの保護抗体を産生させるに充分な量にて投与する。好ましい態様において、動物は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジおよびニワトリよりなる群から選ばれる。他の好ましい態様において、動物はヒトである。別の好ましい態様において、本発明は、該外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質が髄膜炎菌グループＢ莢膜多糖（ＣＰ）に結合した上記ワクチンに関する。そのような莢膜多糖は、アシュトン（Ａshton,Ｆ .Ｅ.）ら、Ｍicrobial Ｐathog.６：４５５〜４５８（１９８９）；イェニングス（Ｊennings,Ｈ.Ｊ.）ら、Ｊ.Ｉmmunol.１３４：２６５１（１９８５）；イェニングスら、Ｊ.Ｉmmunol.１３７：１７０８〜１７１３（１９８６）；イェニングスら、Ｊ.Ｉmmunol.１４２：３５８５〜３５９１（１９８９）；イェニングスら、Ｃurrent Ｔopics in Ｍicrobiology and Ｉmmunology、１５０：１０５〜１０７（１９９０）中の「ワクチン候補としての莢膜多糖（Ｃapsular Ｐolysac charidesas Ｖaccine Ｃandidates）」の記載に従って調製することができ、これら文献の内容は参照のため本明細書中に完全に引用される。ＣＰは、フラシュ（Ｆrasch,Ｃ.Ｅ.）のＢacterial Ｖaccines、Ａlan Ｒ.Ｌi ss,Ｉnc.、１２３〜１４５頁（１９９０）中の「ナイセリア・メニンギチジスワクチンの製造および制御（Ｐroduction and Ｃontrol of Ｎeisseria meningiti dis Ｖaccines）」（その内容は参照のため本明細書中に完全に引用される）に従い、以下のようにして単離する：変性フランツ（Ｆranz）培地中で生物を１０〜２０時間増殖させる ↓ ５５℃にて１０分間、加熱により死滅させる遠心分離により不活化細胞を除去する ↓ セタブロンを０.１％まで添加培地ブロスからＣＰを沈殿 ↓ 塩化カルシウムを１Ｍまで添加ＣＰを溶解、ついで遠心分離にかけて細胞の破片を除去する ↓ エチルアルコールを２５％まで添加沈殿した核酸を遠心分離により除去する ↓ エチルアルコールを８０％まで添加粗製のＣＰを沈殿させ、アルコールを除去する。ついで、この粗製ＣＰを希酸、たとえば酢酸、ギ酸、およびトリフルオロ酢酸（０.０１〜０.５Ｎ）で部分的に脱重合した後、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製して平均分子量が１２,０００〜１６，０００の多糖の混合物を得る。ついで、このＣＰを水素化ホウ素でＮ−脱アセチル化し、Ｎ−プロピオニル化してＮ−ＰｒＧＢＭＰを得る。それゆえ、本発明の結合体ワクチン中に用いることのできるＣＰは、ＣＰ−ポーリンタンパク質結合体の一部として用いた場合に活性な免疫を誘発する限りにおいて、ＣＰ断片、Ｎ−脱アシル化ＣＰおよびその断片、並びにＮ−ＰｒＣＰおよびその断片であってよい（実施例参照）。さらに好ましい態様において、本発明は、上記外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を得、ナイセリア・メニンギチジスからＣＰを得、ついで該タンパク質を該ＣＰに結合させることからなる多糖結合体の製造方法に関する。本発明の結合体は、ＣＰの還元性末端基を還元的アミノ化によってポーリンの第一級アミノ基に反応させることにより形成させることができる。還元性基は、選択的加水分解または特異的な酸化的開裂、またはその両方により形成させることができる。ＣＰのポーリンタンパク質への結合は、イェニングスらの米国特許第４,３５６,１７０号（その内容を参照のため本明細書中に完全に引用する）に記載された方法によって行うのが好ましい。この方法は、ＣＰを過ヨウ素酸塩で制御酸化し、ついでポーリンタンパク質を還元的にアミノ化することを含む。本発明のワクチンは、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク質または結合体ワクチンを、投与経路に依存した有効量で含む。皮下または筋肉内経路の投与が好ましいが、本発明の髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク質またはワクチンはまた腹腔内または静脈内経路で投与することもできる。当業者であれば、不当な実験を行うことなく、特定の処置プロトコールに対する投与量を容易に決定できることを評価するであろう。適当な量は、体重１ｋｇ当たり該タンパク質２μｇ〜体重１ｋｇ当たり１００μｇの範囲にあることが期待されるであろう。本発明のワクチンは、経口投与のためのカプセル剤、液剤、懸濁化剤またはエリキシル剤などの剤型で、または液剤または懸濁化剤などの滅菌した液状剤型にて用いることができる。食塩水やリン酸緩衝食塩水などのあらゆる不活性な担体を用いるのが好ましく、また髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク質または結合体ワクチンが適当な溶解特性を有するあらゆる担体を用いるのが好ましい。ワクチンは、１回投与製剤の形態または大量ワクチン接種プログラムに用いることのできるバイアル（multi-dose）フラスコとすることができる。ワクチンの調製法および使用法については、レミングトンのＰharmaceutical Ｓ ciences、マック・パブリッシング、イーストン、ペンシルベニア、オソル（Ｏs ol）編（１９８０）；およびＮew Ｔrends and Ｄevelopments in Ｖaccines、ボラー（Ｖoller）ら（編）、ユニバーシティー・パーク・プレス、ボルチモア、メリーランド（１９７８）を参照。本発明の髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク質または結合体ワクチンは、ポーリン特異的な抗体の産生を促進するアジュバントをさらに含んでいてよい。そのようなアジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、ステアリルチロシン（ＳＴ、米国特許第４,２５８,０２９号参照）、ＭＤＰとして知られるジペプチド、サポニン、水酸化アルミニウムおよびリンパ球サイトカインなどの種々の油状調合物が挙げられるが、これらに限られるものではない。フロイントのアジュバントは鉱油および水の乳濁液であり、これを免疫原性物質と混合する。フロイントのアジュバントは強力ではあるが、通常、ヒトには投与しない。代わりに、アジュバントのアルム（水酸化アルミニウム）またはＳＴをヒトへの投与用に用いる。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその結合体ワクチンは水酸化アルミニウム上に吸着され、そこから注射後にゆっくりと放出される。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または結合体ワクチンはまた、フラートン（Ｆullerton）らの米国特許第４,２３５,８７７号に従ってリポソーム中に包括することもできる。他の好ましい態様において、本発明は、本発明の方法に従って製造した髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質、融合タンパク質または結合体ワクチンを細菌性髄膜炎を防ぐに充分な量で動物に投与することからなる、動物において細菌性髄膜炎を防ぐ方法に関する。他の態様において、本発明は、形質転換した大腸菌を溶解させて髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を不溶性の封入体の一部として放出させ、該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌の細胞性タンパク質を除去し、該封入体を変性剤の水溶液中に再懸濁および溶解し、得られた溶液を界面活性剤中に希釈し、ついで可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質をゲル濾過により精製することを特徴とする、上記外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質の精製方法に関する。溶解工程は当業者に知られたいかなる方法によっても行うことができ、たとえば、超音波処理、酵素消化、浸透圧ショック、またはマルプレス（mull press）に通すことによって行うことができる。封入体の洗浄は、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質を含む封入体は可溶化することなく大腸菌の細胞性タンパク質を可溶化することができる緩衝液であればいすれも使用できる。そのような緩衝液としては、ＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８.０）、トリシン、ビシンおよびＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限られるものではない。本発明の実施に使用できる変性剤としては、２〜８Ｍの尿素または約２〜６ＭのグアニジンＨＣｌ、さらに好ましくは４〜８Ｍの尿素または約４〜６ＭのグアニジンＨＣｌ、および最も好ましくは約８Ｍの尿素または約６ＭのグアニジンＨＣｌが挙げられる。可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質を希釈するのに使用することのできる界面活性剤の例としては、ＳＤＳおよびセタブロン（カルバイオケム（Ｃalbiochem））などのイオン性界面活性剤；トゥイーン、トリトンＸ、ブリジ３５およびオクチルグルコシドなどの非イオン性界面活性剤；３,１４−ツビッタージェント（Ｚwittergent）、エンピゲン（empigen）ＢＢおよびシャンプス（Ｃhamps）などの双イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限られるものではない。最後に、可溶化された外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質をゲル濾過により精製して高分子量物質および低分子量物質を分離させる。濾過ゲルのタイプとしては、セファクリル−３００、セファロースＣＬ−６Ｂ、およびＢｉｏ− ＧｅｌＡ−１.５ｍが挙げられるが、これらに限られるものではない。カラムの溶出は、可溶化タンパク質の希釈に用いた緩衝液を用いて行う。ついで、ポーリンまたはその融合タンパク質を含むフラクションをゲル電気泳動によって同定し、フラクションをプールし、透析し、濃縮する。最後に、濃縮したフラクションをＱセファロース高速カラムに通すことにより実質的に純粋な（＞９５％）ポーリンタンパク質および融合タンパク質を得ることができる。他の態様において、本発明は、誘発性であるＴ７プロモーターを含むベクターの一部である髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質遺伝子の発現に関する。プロモーターが誘発性である場合には、転写速度は誘発剤に応答して増加する。Ｔ７プロモーターはカラム媒体にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって誘発することができる。代わりに、Ｔａｃプロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いることができる。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質遺伝子の発現は、ｐＥＴ−１７発現ベクターまたはｐＥＴ−１１ａ発現ベクター（両ベクターともＴ７プロモーターを含む）から行う。髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質遺伝子または融合タンパク質遺伝子の発現ベクター中へのクローニングは、ライゲーションのための平滑末端化または粘着末端化、制限酵素消化による適当な末端の生成、粘着末端を適当に充填すること、所望でない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なリガーゼによるライゲーションを含む常法に従って行うことができる。クローニングの一般法に関しては、サンブルック（Ｓambrook）らのモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：ＡＬab oratory Ｍanual）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９）を参照のこと。本発明に従って発現させた髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質および融合タンパク質は、天然のタンパク質の免疫学的特性を示す構造を達成するために適切に再生される必要がある。さらに他の態様において、本発明は、形質転換した大腸菌を溶解させて髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質を不溶性の封入体の一部として放出させ、該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌の細胞性タンパク質を除去し、該封入体を変性剤の水溶液中に再懸濁および溶解し、得られた溶液を界面活性剤中に希釈し、ついで可溶化された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質をゲル濾過により精製して溶出液中に再生タンパク質を得ることを特徴とする、上記外膜タンパク質および融合タンパク質の再生方法に関する。驚くべきことに、折り畳まれた３量体の髄膜炎菌グループＢクラス２およびクラス３ポーリンタンパク質および融合タンパク質がゲル濾過カラムからの溶出液中で直接得られることがわかった。他の好ましい態様において、本発明は、上記方法によって産生された実質的に純粋な再生された外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質および融合タンパク質に関する。実質的に純粋なタンパク質とは、たとえば電気泳動によって認められるように、一般にナイセリア・メニンギチジスの他の細胞性成分を含まないタンパク質である。そのような実質的に純粋なタンパク質は、クマシーブルー染色または銀染色の後の電気泳動ゲル上の濃度測定により測定されるように、＞９５％の純度を有する。以下の実施例は、本発明の方法および組成物を説明するものであるが、これらを限定するものではない。当業者に自明な当該技術分野で通常認められる種々の条件およびパラメータの他の適当な改変および適合は本発明の範囲に含まれる。実施例実施例１．グループＢナイセリア・メニンギチジスからのクラス３ポーリンタンパク質のクローニング材料および方法生物：グループＢナイセリア・メニンギチジス株８７６５（Ｂ１５：Ｐ１,３）をウエンデル・ゾリンガー（Ｗendell Ｚollinger）博士（ウォルター・リード・アーミー・インスチチュート・フォア・リサーチ（Ｗalter Ｒeed Ａrmy Ｉ nstitute for Ｒesearch））から得、３０℃に保持したインキュベーター中のロウソク消光ジャー中、以前に記載された寒天培地（スワンソン（Ｓwanson,Ｊ.Ｌ .）、Ｉnfect.Ｉmmun.２１：２９２〜３０２（１９７８））上で増殖させた。大腸菌株ＤＭＥ５５８（ベンソン（Ｓ.Ｂenson）のコレクションから；シルヘービー（Ｓilhavy,Ｔ.Ｊ.）ら、「遺伝子融合による実験（Ｅxperiments with Ｇene Ｆusions）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８４）、ＢＲＥ５１（ブレマー（Ｂremer,Ｅ. ）ら、ＦＥＭＳＭicrobiol.Ｌett.３３：１７３〜１７８（１９８６））およびＢＬ２１（ＤＥ３）を３７℃にてＬＢ寒天プレート上で増殖させた。Ｐ１形質導入：大腸菌株ＤＭＥ５５８のＰ１_vir溶解液を用い、全ｏｍｐＡ遺伝子が欠失した（シルヘービーら、遺伝子融合による実験、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８４））株ＢＲＥ５１（ブレマーら、ＦＥＭＳＭicrobiol.Ｌett.３３：１７３〜１７８（１９８６））にテトラサイクリン耐性マーカーを形質導入した。ｏｍｐＡ遺伝子に極めて近接してテトラサイクリン耐性マーカーを含有する株ＤＭＥ５５８を、６００ｎｍにおける吸光度が約０.６となる密度までＬＢ培地上で増殖させた。１ｍｌの１／１０の０.５ＭＣａＣｌ₂を、１０ｍｌ培地および１×１０⁹ ＰＦＵのＰ１_virを含む溶液０.１ｍｌに加えた。この培養液を３７℃にて３時間インキュベートした。この時間の後、細菌の細胞密度は視覚でわかるほど減少した。０.５ｍｌのクロロホルムを加え、ファージ培養液を４℃にて貯蔵した。一般に大腸菌染色体の１〜２％を各ファージ中にパッケージングすることができるので、生成したファージの数は、ｏｍｐＡ遺伝子に近接したテトラサイクリン耐性マーカーを含む細菌宿主の全染色体をカバーしている。つぎに、ｏｍｐＡ遺伝子を欠失している株ＢＲＥ５１を３７℃にてＬＢ培地中で一夜増殖させた。この一夜培養液を新たなＬＢ中に１：５０に希釈し、２時間増殖させた。菌体を遠心分離により除去し、ＭＣ塩中に再懸濁した。０.１ｍｌの細菌菌体を上記ファージ溶解液０.０５と混合し、室温にて２０分間インキュベートした。その後、等容量の１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、細菌菌体を１２ .５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上においた。プレートを３７℃にて一夜インキュベートした。テトラサイクリン耐性（１２μｇ／ｍｌ）形質導入体を、以下に記載するようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によりＯｍｐＡタンパク質発現の欠失によりスクリーニングした。この抗生物質に耐性の細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子が欠失されていた部位に非常に近接して染色体中にテトラサイクリン耐性遺伝子が組み込まれている。一つの特定の株をＢＲＥ−Ｔ^Rと称した。ついで、上記と同様の方法を用い、該株ＢＲＥ−Ｔ^Rで２回目のファージ産生を行った。このファージ集団の典型はテトラサイクリン耐性遺伝子およびＯｍｐＡ欠失の両者を有する。ついで、これらファージを回収し、貯蔵した。ついで、これらファージを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を感染させた。感染後、該細菌はテトラサイクリン耐性マーカーを含む。加えて、テトラサイクリンを含有するＬＢプレート上でＯｍｐＡ欠失が選択される高い蓋然性がある。上記プレート上で増殖した細菌のコロニーをＬＢ培地中で別に増殖させ、ＯｍｐＡタンパク質の存在について試験した。調べた選択コロニーのうち、ＳＤＳ− ＰＡＧＥウエスタンブロット上での抗体活性により判断されるように、すべてＯｍｐＡタンパク質が欠失していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以前に記載されているように（ブレイク（Ｂlake）およびゴチュリッヒ（Ｇotschlich）、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１５９：４５２〜４６２（１９８４））、レムリ法（レムリ（Ｌaemmli,Ｕ.Ｋ.）、Ｎature ２２７：６８０〜６８５（１９７０））の変法である。イモビロン（Ｉmmobilon）Ｐ（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ州）への電気泳動移動を、紙を最初にメタノール中で湿らせた他はトウビンらの方法（トウビン（Ｔowbin,Ｈ.）、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ７６：４３５０〜４３５４（１９７９））に従って行った。ウエスタンブロットをホスファターゼ結合試薬でプローブした（ブレイクら、Ａnalyt.Ｂiochem.１３６：１７５〜１７９（１９８４））。複製連鎖反応：フィーバーズらによって記載された方法（フィーバーズら、Ｉ nfect.Ｉmmun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２））を用い、ＰｏｒＢをコードする遺伝子を増幅させた。選択したプライマーは、以前に記載されているように（フィーバーズら、Ｉnfect.Ｉmmun.６０：３６２０〜３６２９（１９９簡単に説明すると、反応成分は以下の通りであった：髄膜炎菌株８７６５染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌ：５'末端および３'末端プライマー（１μ Ｍ）各２μｌ；ｄＮＴＰ（１０ｍＭストック）、各４μｌ；１０×ＰＣＲ反応緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣｌ、５００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８.３）、１０μｌ；２５ｍＭＭｇＣｌ₂、６μｌ；２回蒸留Ｈ₂Ｏ、６２μｌ；およびＴａｑポリメラーゼ（シータス・コーポレーション、５単位／μｌ）、１μｌ。反応は、０℃ にセットしたラウダ（Ｌauda）４／Ｋメタノール／水冷却システム（ブリンクマン・インスツルメンツ（Ｂrinkman Ｉnstruments,Ｉnc.、ウエストベリー、ニューヨーク州））に連結したＧＴＣ−２ジェネティックサーモサイクラー（Ｇenet ic Ｔhermocycler）（プレシジョン・インスツルメンツ（Ｐrecision Ｉnst.Ｉn c.、シカゴ）、イリノイ州）中にて行った。サーモサイクラーは、９４℃、２分；４０℃、２分；および７２℃、３分で３０回サイクルするようにプログラムされていた。これら３０サイクルの終了時、反応を７２℃で３分続け、マニアチスらによって記載されているように（マニアチスら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８２））ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上での分析の準備ができるまで、最後に４℃に保持した。ＰＣＲ産物のサブクローニング：ｐＥＴ−１７ｂプラスミド（ノバゲン）をサブクローニングに用い、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs,Ｉnc.）、ビバリー、マサチューセッツ州）で該プラスミドを二重消化することにより調製した。ついで、消化した末端をウシ腸管アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、インディアナポリス州）で脱リン酸化した。ついで、消化したプラスミドを１％アガロースゲル上で分析し、切断したプラスミドを除去し、ジーンクリーン（ＧeneＣlean）キット（Ｂｉｏ１０１、ラジョラ、カリフォルニア州）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の調製は、フェノール−クロロホルム、クロロホルムで抽出し、最後にジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて精製することにより行った。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIおよびＸｈｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で消化した。ついで、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、０.１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、５μｌグリコーゲン（２０μｇ／μｌ）、および２.５容量のエタノールを加えて沈殿させた。このＤＮＡを７０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で洗浄した後、ＴＥ緩衝液中に再溶解した。消化したＰＣＲ産物を、標準Ｔ４リガーゼ法（Ｃurrent Ｐrotocol in Ｍolecular Ｂiology、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨーク（１９９３））を用いて１６℃にて一夜、上記二重消化したｐＥＴ−１７ｂプラスミドにライゲートした。ついで、ライゲーション生成物を、シャングらの方法（シャング（Ｃhung,Ｃ.Ｔ.）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８６：２１７２〜２１７５（１９８９））によりコンピテントにした上記ＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡ中に形質転換した。形質転換体の選択を、５０μ ｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上で行った。幾つかの形質転換体を選択し、カルベニシリンおよびテトラサイクリンを含有するＬＢブロス中、３０℃にて６時間培養し、ＩＰＴＧを加えてプラスミド遺伝子発現を誘発させた。温度を３７℃に上げ、培養をさらに２時間続けた。各培養液の菌体を遠心分離により回収し、全細胞溶解液を調製し、ＳＤＳ− ＰＡＧＥおよびすべてのナイセリアポーリンと反応するモノクローナル抗体（４Ｄ１１）を用いたウエスタンブロットにより分析した。ヌクレオチド配列分析：クローニングしたクラス３ポーリン遺伝子ＤＮＡのヌクレオチド配列の決定を、記載に従い（Ｃurrent Ｐrotocol in Ｍolecular Ｂi ology、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨーク（１９９３））、変性二本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として用いたジデオキシ法により行った。シークエナーゼ（Ｓequenase）IIキット（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕnite d Ｓtates Ｂiochemical Ｃorp.）、クリーブランド、オハイオ州）を製造業者の指示に従って使用した。３つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（オペロン・テクノロジーズ（Ｏperon Ｔechnologies,Ｉnc.）、アラメダ、カリフォルニア州）をこれら反応に用いた。１つは５'末端用のものであり（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、５'ＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣからなり、２つは３'末端用のものであり、（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）５'ＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）および５'ＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣであった。該プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｐｕ１１０２１で線状化することにより重複する入れ子状の欠失を作成し、チオ−ｄＮＴＰおよびクレノーポリメラーゼを添加することにより末端を平滑化した（Ｃurrent Ｐrotocol in Ｍolecular Ｂiology、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨーク（１９９３））。ついで、線状化したプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで開裂し、供給者により教示されているようにプラスミドの３'欠失を作成するためにｅｘｏII／ヤエナリヌクレアーゼ欠失キットを用いた（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）。この戦略の地図を図１に示す。ＰｏｒＢ遺伝子産物の発現および精製：滅菌マイクロピペットの先端を用い、ＰｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂプラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡの単一のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する１０ｍｌのＬＢブロス中に接種した。この培養液を震盪しながら３０℃にて一夜インキュベートした。ついで、１０ｍｌの一夜培養液を同濃度のカルベニシリンを含有する１リットルのＬＢブロスに滅菌的に加え、ＯＤ₆₀₀が０.６〜１.０に達するまで３７℃にてシェーキングインキュベーター中で培養を続けた。この培養液にＩＰＴＧ（１００ｍＭ）のストック溶液（３ｍｌ）を加え、培養液をさらに３０分間インキュベートした。ついで、リファンピシンを加え（５．８８ｍｌのストック溶液；メタノール中に３４ｍｇ／ｍｌ）、培養をさらに２時間続けた。ＧＳ３ローター中、１０,０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行うことにより菌体を回収し、重さを測った。これら菌体を、菌体の湿重量１ｇ当たり３ｍｌのＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８.０）中に充分に再懸濁した。これに菌体の湿重量１ｇ当たり８μｌのＰＭＳＦストック溶液（無水エタノール中に５０ｍＭ）および８０ μｌのリゾチームストック溶液（水中に１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この混合物を室温にて２０分間撹拌した。撹拌しながら、菌体の湿重量１ｇ当たり４ｍｇのデオキシコール酸塩を加えた。この混合物を３７℃の水浴中に入れ、ガラス棒で撹拌した。混合物が粘稠になったら、菌体の湿重量１ｇ当たり２０μｌのＤＮアーゼＩストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。ついで、この混合物を水浴から取り、溶液がもはや粘稠でなくなるまで室温にて放置した。ついで、この混合物をＳＳ−３４ローター中、４℃にて２０分間、１５,０００ｒｐｍにて遠心分離にかけた。ペレットを確保し、ＴＥＮ緩衝液で２回充分に洗浄した。ついで、このペレットを０.１ｍＭＰＭＳＦおよび８Ｍ尿素を含有する新たに調製したＴＥＮ緩衝液中に再懸濁し、バス（bath）ソニケーター（ヒート・システムズ（Ｈea t Ｓystems,Ｉnc.）、プレインビュー、ニューヨーク州）中で超音波処理した。ＢＣＡキット（ピアス（Ｐierce）、ロックビル、イリノイ州）を用いてタンパク質濃度を測定し、ＴＥＮ−尿素緩衝液を用いてタンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌ未満に調節した。ついで、試料を１０％（ｗ／ｖ）ツビッタージェント３,１４（カルバイオケム、ラジョラ、カリフォルニア州）で１：１に希釈し、超音波処理し、セファクリルＳ−３００分子ふるいカラムに負荷した。セファクリルＳ −３００カラム（２.５ｃｍ×２００ｃｍ）は、１００ｍＭトリスＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０.０５％ツビッタージェント３,１４、および０.０２％アジド、ｐＨ８.０で前以て平衡化してあった。カラムの流速を８ｍｌ／時に調節し、１０ｍｌフラクションを回収した。各フラクションのＯＤ₂₈₀を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をタンパク質含有フラクションについて行った。抑制ＥＬＩＳＡアッセイ：ウエル当たり０.１ｍｌの野性型株８７６５から精製したｐｏｒＢ（２μｇ／ｍｌ）（０.０２％アジドを含有する０.１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９.６中）を加えることにより、マイクロタイタープレート（ヌンク− イムノ・プレート（Ｎunc−Ｉmmuno Ｐlate,Ｉnc.）、ネイパービル、イリノイ州）を感作させた。プレートを室温にて一夜インキュベートした。プレートを０ .９％ＮａＣｌ、０.０５％ブリジ３５、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ７.０、０ .０２％アジドで５回洗浄した。タイプ１５クラス３ＰｏｒＢタンパク質に対して産生させたヒト免疫血清を、フィリップ・オー・リビングストン（Ｐhillip Ｏ.Ｌivingston）博士（メモリアル−スローン・ケッタリング・キャンサー・センター（Ｍemorial−Ｓloan Ｋettering Ｃancer Ｃenter）、ニューヨーク、ニューヨーク州）から入手した。このヒト免疫血清を０.５％ブリジ３５を含有するＰＢＳ中に希釈し、プレートに加え、室温にて２時間インキュベートした。プレートを上記と同様にして再び洗浄し、二次抗体、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（タゴ（Ｔago Ｉnc.）、バーリンゲイム、カリフォルニア州）をＰＢＳ−ブリジ中に希釈し、プレートに加え、室温にて１時間インキュベートした。プレートを上記と同様にして洗浄し、０.１ジエタノールアミン、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０.１ｍＭＺｎＣｌ₂、０.０２％アジド、ｐＨ９.８中のｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマホスファターゼ基質１０４）（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。プレートを３７℃にて１時間インキュベートし、エリダ（Ｅlida）− ５マイクロタイタープレートリーダー（フィジカ（Ｐhysica）、ニューヨーク、ニューヨーク州）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照のウエルは一次抗体および／または二次抗体のいずれかを欠失していた。このことは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて最大読み取りの半分を与える各ヒト血清に対する力価を得るために行った。この各ヒト血清に対する力価を抑制ＥＬＩＳＡにおいて用いる。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを精製した野性型ＰｏｒＢタンパク質で感作し、上記と同様にして洗浄した。別のＶ−９６ポリプロピレンマイクロタイタープレート（ヌンク）中で、種々の量の精製した野性型ＰｏｒＢタンパク質かまたは精製した組換えＰｏｒＢタンパク質のいずれかを７５μｌの全量で加えた。ヒト血清をその最大力価の半分の２倍までＰＢＳ−ブリジ溶液中で希釈し、７５ μｌをＰｏｒＢタンパク質かまたは組換えＰｏｒＢタンパク質を含有する各ウエルに加えた。このプレートを室温にて２時間インキュベートし、マイクロタイタープレートキャリヤを備えたソーバル（Ｓorvall）ＲＴ６０００冷蔵遠心管（ウイルミングトン（Ｗilmington）、デラウエア州）中、３０００ｒｐｍにて１０分間で遠心分離にかけた。Ｖ−底（Ｖ−bottom）を回避するため、各ウエルから１００μｌを取り、感作させ洗浄したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに移した。ＥＬＩＳＡプレートをさらに２時間インキュベートし、洗浄し、結合二次抗体を上記と同様にして加えた。ついで、プレートを記載のようにして処理し、読み取った。抑制％を記載にようにして処理し、読み取った。抑制％は以下のようにして計算する：結果複製連鎖反応およびサブクローニング：容易にクローニングし、遺伝子操作し、最終的にさらなる抗原性および生物物理学的特徴付けのためにいかなる数の異なるナイセリアのポーリン遺伝子からの純粋なポーリンタンパク質を充分に得る方法を開発した。この目的のための第一の工程はナイセリアからポーリン遺伝子をクローニングすることであった。フィーバーズらによって最初に記載された技術を用い（フィーバーズら、Ｉnfect.Ｉmmun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２））、クラス３、血清型１５ポーリンからの成熟ポーリンタンパク質のＤＮＡ配列を、ＰＣＲ反応の鋳型として髄膜炎菌株８７６５の染色体を用いて増幅させた。オリゴヌクレオチドプライマーの末端上に適当なエンドヌクレアーゼ制限部位を合成し、開裂したときに、増幅させた成熟ポーリン配列が選択した発現ベクター中に直接ライゲートされクローニングされうるようにした。３０サイクル後、図２に示すＰＣＲ生成物を得た。主要な生成物は９００ｂｐと１０００ｂｐとの間に移動し、これは以前の研究結果と一致していた（フィーバーズら、Ｉnfec t.Ｉmmun.６０：３６２０〜３６２９（１９９２））。しかしながら、ＰＣＲを低アニーリング厳格さ（４０℃；５０ｍＭＫＣｌ）で行ったにもかかわらず、高分子量生成物は認められなかった。大量のクローニングポーリンタンパク質を産生させるため、ストゥディエらの厳しく制御された発現系（ストゥディエおよびモファット、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１８９：１１３〜１３０（１９８６））を用いたが、これはノバゲンから市販されているものである。増幅させたＰＣＲ生成物をプラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位中にクローニングした。この戦略により、成熟ポーリンタンパク質のＤＮＡ配列は、Ｔ７プロモーター、９アミノ酸リーダー配列および成熟 φ１０タンパク質の１１アミノ酸をコードするＤＮＡ配列のすぐ後ろにインフレームで配置された。ポーリン遺伝子を含有するｐＥＴ−１７ｂプラスミドの発現宿主として、ＤＥ３ラムダ誘導体に対して溶原性のストゥディエの大腸菌株ＢＬ２１（ストゥディエおよびモファット、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.１８９：１１３〜１３０（１９８６））を選択した。しかしながら、大腸菌発現宿主に由来するＯｍｐＡタンパク質は発現した髄膜炎菌ポーリンタンパク質とともに精製されるおそれがあることが考えられるので、この株をＰ１形質導入により修飾し、この株からｏｍｐＡ遺伝子を除去した。それゆえ、ＰＣＲ生成物およびｐＥＴ−１７ｂベクターの両者の制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーション後、生成物をＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡ中に形質転換し、形質転換体をアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性について選択した。選択プレート上で観察した多数のコロニーのうち、１０をさらに特徴付けるために選び取った。これら１０のものはすべて、対数期まで増殖させＩＰＴＧとともにインキュベートしたときに、ほぼＰｏｒＢタンパク質の分子量にて移動する大量のタンパク質を発現した。一つのそのような培養の全細胞溶解液を図３ａに示す。４Ｄ１１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析により、発現されたタンパク質がＰｏｒＢタンパク質であることがさらに示唆された（図３ｂ）。他の研究とは対照的に、ナイセリアのポーリンを大腸菌中にクローニングし発現させたときに、ＩＰＴＧ添加後においてさえも宿主細菌菌体はなんらの毒性または致死作用の兆候を示さなかった。大腸菌菌体は生存可能なように思われ、発現相を通じていずれの時期においても再培養することができた。ヌクレオチド配列分析：これら実験において発現されたＰｏｒＢの量はこれまでに観察されたものに比べて有意に大きく、この宿主大腸菌上での発現には有害な作用はないものと思われた。そのような高発現を可能とするためにＰＣＲ人工産物が髄膜炎菌ポーリン遺伝子中に導入されないことを確実にするため、該プラスミドからの二本鎖プライマー伸長により全φ１０ポーリン融合を配列決定した。その結果を図４に示す。ヌクレオチド配列は、ヘッケルス（Ｈeckels）らによって以前に報告された他の髄膜炎菌血清型１５ＰｏｒＢ遺伝子配列（ウォード（Ｗard,Ｍ.Ｊ.）ら、ＦＥＭＳＭicrobiol.Ｌett.７３：２８３〜２８９（１９９２））と同一であったが、図示した２つの例外があった。これら２つのヌクレオチド差異はコドンの第三位で起こっており、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変えないであろう。それゆえ、ヌクレオチド配列からは、大腸菌内での高タンパク質発現および毒性の欠如を説明するＰＣＲ人工産物も変異もないように思われた。さらに、このデータは、真のＰｏｒＢタンパク質が産生されたことを示唆しているであろう。発現されたｐｏｒＢ遺伝子産物の精製：大腸菌中で発現されたＰｏｒＢタンパク質はＴＥＮ緩衝液中で不溶であり、このことは、ＰｏｒＢタンパク質が発現されたときに封入体に形成されることを示唆していた。しかしながら、不溶性のＰｏｒＢタンパク質をＴＥＮ緩衝液で洗浄することによって混入する大腸菌タンパク質のほとんどが除去された。ついで、ＰｏｒＢタンパク質を新たに調製した８Ｍ尿素中に可溶化し、ツビッタージェント３,１４界面活性剤中に希釈した。最終精製はセファクリルＳ−３００分子ふるいカラムを用いて行い、これにより尿素のみならず残留する混入タンパク質も除去された。カラムから溶出されたＰｏｒＢタンパク質の大部分は野性型のＰｏｒＢと全く同様に３量体のみかけの分子量を有していた。野性型のＰｏｒＢおよび大腸菌中で発現されたＰｏｒＢの対比溶出パターンを図５に示す。ツビッタージェント界面活性剤中に希釈する前の８Ｍ尿素中のＰｏｒＢタンパク質の濃度が１０ｍｇ／ｍｌを越える場合には、３量体として認められるＰｏｒＢタンパク質の相対的量が減少し、ボイド容量中に溶出する凝集物として出現することに注目することは重要である。しかしながら、尿素緩衝液中のタンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍｌ未満である場合は、ＰｏｒＢの大部分は野性型のＰｏｒＢが溶出するのと正確に同じフラクション中に溶出した。また、Ｔ７−Ｔａｇモノクローナル抗体およびウエスタンブロット分析を用い、成熟Ｔ７カプシドタンパク質の１１アミノ酸がアミノ末端として保持されることも決定された。１リットルの大腸菌からの髄膜炎菌ポーリンタンパク質の全収量は約５０ｍｇであった。抑制ＥＬＩＳＡアッセイ：精製した３量体の組換えＰｏｒＢが野性型の髄膜炎菌株８７６５で産生されるＰｏｒＢに比較して同様の抗原性のコンホメーションを有するかどうかを決定するため、野性型の髄膜炎菌タイプ１５ＰｏｒＢタンパク質をワクチンした６人の患者の血清を抑制ＥＬＩＳＡアッセイに用いた。抑制アッセイにおいて、天然のＰｏｒＢに反応性の抗体は、種々の量の精製組換えＰｏｒＢかまたは相同な精製野性型ＰｏｒＢのいずれかにより競合的に抑制された。これら６人のヒト血清のそれぞれの相同な精製ＰｏｒＢによる抑制の結果およびこれら血清の平均抑制を図６に示す。これら血清の精製組換えＰｏｒＢによる対応抑制は図６ｂに示してある。図６および図７からの平均抑制の比較を図８にプロットしてある。これらデータは、これら６人の患者の血清に含まれる抗体が相同な精製野性型ＰｏｒＢおよび精製組換えＰｏｒＢの両者において同様のエピトープを認識していることを示唆している。このことから、組換えＰｏｒＢは野性型ＰｏｒＢに認められる天然のコンホメーションのすべてではないにしてもそのほとんどを保持しているという証拠がさらに得られた。実施例２．グループＢナイセリア・メニンギチジス株ＢＮＣＶＭ９８６からのクラス２ポーリンのクローニング以前に記載された方法を用い（サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））、約０.５ｇのグループＢナイセリア・メニンギチジス株ＢＮＣＶＭ９８６（血清型２ａ）からゲノムＤＮＡを単離した。ついで、このＤＮＡを、標準ＰＣＲ反応において２つのクラス２ポーリン特異的オリゴヌクレオチドに対する鋳型として用いた。これらオリゴヌクレオチドは、クラス２ポーリンの５'および３'フランキング領域に相補的で、断片のクローニングを容易にするためにＥｃｏＲＩ制限部位を有するように設計されていた。これらオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであっついで、複製連鎖反応を用いてクラス２ポーリンを得た。反応条件は以下の通りであった：ＢＮＣＶＭ９８６ゲノムＤＮＡ２００ｎｇ、上記２つのオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ１μＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、ＰＣＲ反応緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３）、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ、以上を蒸留Ｈ₂Ｏで１００μｌに調整。ついで、この反応混合物を、９５℃にて１分、５０℃にて２分および７２℃にて１.５分の２５サイクルに供した。このサイクル期間の終了時、反応混合物を１％アガロースゲル上に負荷し、２時間電気泳動した後、１.３ｋｂのバンドを除去し、ジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いてＤＮＡを回収した。ついで、このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、再精製し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いてＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１９にライゲートした。このライゲーション混合物を用いてコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。組換えプラスミドを選択し、配列決定した。挿入配列はクラス２ポーリンのものと一致するＤＮＡ配列を有していることがわかった。ムラカミら、Ｉnfect.Ｉmmun.５７：２３１８〜２３２３（１９８９）を参照。プラスミドｐＥＴ−１７ｂ（ノバゲン）を用いてクラス２ポーリンを発現させた。以下に記載するように、２つのプラスミドを構築し、２つの異なるタンパク質を産生した。一方のプラスミドは成熟クラス２ポーリンを産生するように設計し、他方のプラスミドはＴ７遺伝子φ１０カプシドタンパク質からの２０アミノ酸に融合したクラス２ポーリンを産生するように設計した。成熟クラス２ポーリンの構築を用いてｐＵＣ１９−クラス２ポーリン構築物を贈幅することにより、成熟クラス２ポーリンを構築した。この戦略により、プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位中に増幅クラス２ポーリンをクローニングすることができ、それゆえ成熟クラス２ポーリンを産生させることができた。鋳型としてのｐＵＣ１９−クラス２および上記２つのオリゴヌクレオチドを用いて標準ＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応により、１.０％アガロースゲル上で分析したときに１.１ｋｂの生成物が得られた。このＰＣＲ反応で得られたＤＮＡをゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。生成された１.１ｋｂＤＮＡを再びゲル精製し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いてＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ消化したｐＥＴ −１７ｂにライゲートした。ついで、このライゲーション混合物を用いてコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１.１ｋｂ挿入を含有するコロニーをさらに分析するために選択した。ＤＨ５αクローンからのＤＮＡを制限マッピングにより分析し、選択したプラスミドのクローニング結合部の配列を決定した。この分析後、ＤＨ５αクローンから得られたＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡを形質転換した。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ−寒天上で形質転換体を選択した。クラス２ポーリンタンパク質を生成する能力について幾つかの形質転換体をスクリーニングした。このことは、クローンを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび０.４％グルコースを含有するＬＢ液体培地中、３０℃にてＯＤ₆₀₀＝０.６まで増殖させ、ついでＩＰＴＧ（０.４ｍＭ）で培養液を誘発することにより行った。ついで、菌体を破砕し、菌体抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。融合クラス２ポーリンの構築を用いてｐＵＣ１９−クラス２ポーリン構築物を増幅することにより、融合クラス２ポーリンを構築した。この戦略により、プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位中に増幅クラス２ポーリンをクローニングすることができ、それゆえ該プラスミドに含まれるＴ７φ１０カプシドタンパク質に由来する２２アミノ酸をさらにＮ末端に含む融合クラス２ポーリンを産生させることができた。鋳型としてのｐＵＣ１９−クラス２および上記２つのオリゴヌクレオチドを用いて標準ＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応により、１.０％アガロースゲル上で分析したときに１.１ｋｂの生成物が得られた。このＰＣＲ反応で得られたＤＮＡをゲル精製し、反応酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。生成された１.１ｋｂＤＮＡを再びゲル精製し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ消化したｐＥＴ−１７ｂにライゲートした。ついで、このライゲーション混合物を用いてコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１.１ｋｂ挿入を含有するコロニーをさらに分析するために選択した。ＤＨ５αクローンからのＤＮＡを制限酵素マッピングにより分析し、選択したプラスミドのクローニング結合部の配列を決定した。この分析後、ＤＨ５αクローンから得られたＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡを形質転換した。１００ μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ−寒天上で形質転換体を選択した。幾つかの形質転換体を、クラス２ポーリンタンパク質を生成する能力についてスクリーニングした。このことは、クローンを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび０.４％グルコースを含有するＬＢ液体培地中、３０℃にてＯＤ₆₀₀＝０. ６まで増殖させ、ついでＩＰＴＧ（０.４ｍＭ）で培養液を誘発することにより行った。ついで、菌体を破砕し、菌体抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。実施例３．グループＢナイセリア・メニンギチジス株８７６５からの成熟クラス３ポーリンの大腸菌中でのクローニングおよび発現上記方法を用い（サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））、約０.５ｇのグループＢナイセリア・メニンギチジス株８７６５からゲノムＤＮＡを単離した。ついで、このＤＮＡを、標準ＰＣＲ反応において２つのクラス３ポーリン特異的オリゴヌクレオチドに対する鋳型として用いた。を用いて８７６５からのゲノムＤＮＡを増幅することにより、成熟クラス３ポーリンを構築した。この戦略により、プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位中に増幅クラス３ポーリンをクローニングすることができ、それゆえ成熟クラス３ポーリンを産生させることができた。鋳型としての８７６５から単離したゲノムＤＮＡおよび上記２つのオリゴヌクレオチドを用いて標準ＰＣＲを行った。反応条件は以下の通りであった：８７６５ゲノムＤＮＡを２００ｎｇ、上記２つのオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ１μＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、ＰＣＲ反応緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３）、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ、以上を蒸留水で１００μｌに調整。ついで、この反応混合物を、９５℃にて１分、５０℃にて２分および７２℃にて１.５分の２５サイクルに供した。このＰＣＲ反応により、１％アガロースゲル上で分析したときに約９３０ｂｐの生成物が得られた。このＰＣＲ反応で得られたＤＮＡをゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。この９３０ｂｐ生成物を再びゲル精製し、Ｔ４リガーゼを用いてＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ−２４ａ（＋）にライゲートした。ついで、このライゲーション混合物を用いてコンピテントな大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。９３０ｂｐ挿入を含有するコロニーをさらに分析するために選択した。大腸菌ＤＨ５αクローンからのＤＮＡを制限酵素マッピングにより分析し、選択したプラスミドのクローニング結合部の配列を決定した。この分析後、大腸菌ＤＨ５αクローンから得られたＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ΔｏｍｐＡを形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ−寒天上で形質転換体を選択した。幾つかの形質転換体を、クラス３ポーリンタンパク質を生成する能力についてスクリーニングした。このことは、クローンを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび０.４％グルコースを含有するＬＢ液体培地中、３０℃にてＯＤ₆₀₀＝０.６まで増殖させ、ついでＩＰＴＧ（１ｍＭ）で培養液を誘発することにより行った。ついで、菌体を破砕し、菌体抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。実施例４．組換えクラス２ポーリンの精製および再生大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡ［ｐＮＶ−５］をルリアブロス中、３０ ℃にて対数中期まで（６００ｎｍにおけるＯＤ＝０.６）増殖させる。ついで、ＩＰＴＧ（最終０.４ｍＭ）を加え、菌体を３７℃にてさらに２時間増殖させる。ついで、菌体を回収し、幾つかの容量のＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０.２ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝８.０）で洗浄し、菌体ペーストを−７５℃にて凍結貯蔵した。精製のため、前以て重量を計測した菌体を解糖し、ＴＥＮ緩衝液中に１：１５の比率（ｇ／ｖ）で懸濁させる。この懸濁液をスタンステッド（Ｓtansted）セルディスラプター（スタンステッド・フルーイッド・パワー（Ｓtansted fluid power Ｌtd.））中に８,０００ｐｓｉにて２回通す。ついで、得られた溶液を１３,０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄する。ついで、ペレットを０.５％デオキシコール酸塩を含有するＴＥＮ緩衝液中に２回懸濁し、上澄み液を廃棄する。ついで、ペレットを８Ｍの脱イオン化尿素（電気泳動グレード）および０.１ｍＭＰＭＳＦ（３ｇ／１０ｍｌ）を含有するＴＥＮ緩衝液中に懸濁する。この懸濁液を１０分間、または均質な懸濁液が得られるまで超音波処理する。３,１４−ツビッタージェン（カルバイオケム）の１０％水溶液（１０ｍｌ）を加え、溶液を充分に混合する。この溶液を再び１０分間超音波処理する。残留する不溶性の物質をすべて遠心分離により除去する。タンパク質濃度を測定し、８Ｍ尿素−１０％ツビッタージェン緩衝液（１：１比）でタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌに調節する。ついで、この混合物を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＣａＣｌ₂、０.０５％３,１４−ツビッタージェン、０. ０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ＝８.０中で平衡化したセファクリルＳ−３００の２.６×１００ｃｍカラムに適用する。流速は１ｍｌ／分に維持する。１０ｍｌのフラクションを回収する。ポーリンはゲル濾過の間に３量体に再生する。各フラクションのＯＤ＝２８０ｎｍを測定し、タンパク質を含有するフラクションをポーリンのためのＳＤＳゲル電気泳動アッセイに供する。ポーリンを含有するフラクションをプールする。プールしたフラクションを透析するか、または５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ＝８.０、０.０５％３,１４−ツビッタージェン、５ｍＭＥＤＴＡ、０.１ＭＮａＣｌ中に１：１０に希釈する。ついで、得られた溶液を、同緩衝液中で平衡化した２.６×１０ｃｍＱセファロース高速カラム（ファルマシア）に適用する。ポーリンは０.１〜１ＭＮａＣｌの直線勾配で溶出する。実施例５．組換えクラス３ポーリンの精製および再生ｐｏｒＢ−ｐＥＴ−１７ｂプラスミドを含有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３） ΔｏｍｐＡをルリアブロス中、３０℃にて対数中期まで（６００ｎｍにおけるＯＤ＝０.６）増殖させる。ついで、ＩＰＴＧを加え（最終０.４ｍＭ）、菌体を３７℃にてさらに２時間増殖させる。ついで、菌体を回収し、幾つかの容量のＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０.２ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）で洗浄し、菌体ペーストを−７５℃にて凍結貯蔵した。精製のため、約３ｇの菌体を解糖し、９ｍｌのＴＥＮ緩衝液中に懸濁させる。リゾチーム（シグマ、０.２５ｍｇ／ｍｌ）を加え、デオキシコール酸塩（シグマ、１.３ｍｇ／ｍｌ）およびＰＭＳＦ（シグマ、μｇ／ｍｌ）を加え、混合物を室温にて１時間穏やかに震盪する。この時間の間に菌体は溶解し、放出されたＤＮＡによって溶液は非常に粘稠となる。ついで、ＤＮアーゼを加え（シグマ、２μｇ／ｍｌ）、溶液を再び室温にて１時間混合する。ついで、混合物をＳ−６００ローター中で１５Ｋｒｐｍにて３０分間遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄する。ついで、ペレットを１０ｍｌのＴＥＮ緩衝液中に２回懸濁し、上澄み液を廃棄する。ついで、ペレットをＴＥＮ緩衝液中の８Ｍ尿素（ピアス）（１０ｍｌ）中に懸濁する。この混合物を穏やかに撹拌し、塊をすべて破壊する。この懸濁液を２０分間、または均質な懸濁液が得られるまで超音波処理する。３,１４−ツビッタージェン（カルバイオケム）の１０％水溶液（１０ｍｌ）を加え、溶液を充分に混合する。この溶液を再び１０分間超音波処理する。残留する不溶性の物質をすべて遠心分離により除去する。タンパク質濃度を測定し、８Ｍ尿素−１０％ツビッタージェン緩衝液（１：１比）でタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌに調節する。ついで、この混合物を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＣａＣｌ₂、０.０５％３,１４−ツビッタージェン、ｐＨ＝８.０中で平衡化したセファクリルＳ−３００の１８０×２.５ｃｍカラムに適用する。流速は１ｍｌ／分に維持する。１０ｍｌのフラクションを回収する。ポーリンはゲル濾過の間に３量体に再生する。各フラクションのＯＤ₂₈₀ｎｍを測定し、タンパク質を含有するフラクションをポーリンのためのＳＤＳゲル電気泳動アッセイに供する。ポーリンを含有するフラクションをプールする。プールしたフラクションを、ＰＭ１０膜を有するアミコン濃縮器を用い、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、０.１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０.０５％３, １４−ツビッタージェン、ｐＨ８.０を含有する緩衝液に対して透析し、４〜６倍に濃縮する。別法として、プールしたフラクションを８０％エタノールで沈殿させ、上記緩衝液で再懸濁させる。ついで、６〜１０ｍｇの物質を同緩衝液で平衡化したモノＱ１０／１０カラム（ファルマシア）に適用する。１分間当たり１ .２％増加させながら浅い（shalow）０.１〜０.６ＭＮａＣｌ勾配からポーリンを５０分間かけて溶出する。流速は１ｍｌ／分である。ポーリンを含有するピークを回収し、ＴＥＮ緩衝液および０.０５％３,１４−ツビッタージェンに対して透析する。ポーリンは他のＳ−３００クロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。実施例６．多糖の精製および化学的修飾グループＢナイセリア・メニンギチジスおよび大腸菌Ｋ１の両者の莢膜多糖は、α（２→８）ポリシアル酸からなる（一般に、ＧＢＭＰまたはＫ１多糖と呼ばれる）。沈殿によって増殖培地から単離した高分子量多糖を（フラッシュら、Ｂ acterial Ｖaccines、アラン・アール・リス（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、１２３〜１４５頁（１９９０）中、「ナイセリア・メニンギチジスワクチンの製造および調節（Ｐroduction and Ｃontrol of Ｎeisseria meningitidis Ｖaccines）」参照）、ポーリンタンパク質にカップリングさせる前に精製し、化学的に修飾した。この高分子量多糖を０.１Ｍ酢酸（７ｍｇ多糖／ｍｌ；ｐＨ＝６.０〜６. ５）で部分的に脱重合して（７０℃、３時間）平均分子量が１２,０００〜１６, ０００の多糖を得た。ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（スーパーデックス（Ｓuperdex）２００調製グレード、ファルマシア）により精製した後、ＮａＢＨ₄ の存在下で多糖をＮ−脱アセチル化し、ついでイェニングス（Ｊennings）らの記載（Ｊ.Ｉmmunol.１３７：１８０８（１９８６）に従ってＮ−プロピオニル化してＮ−ＰｒＧＢＭＰを得た。ＮａＩＯ₄で処理した後にゲル濾過カラム精製して、平均分子量１２,０００ダルトンの酸化Ｎ−ＰｒＧＢＭＰを得た。実施例７．酸化Ｎ−ＰｒＧＢＭＰのグループＢ髄膜炎菌クラス３ポーリンタンパク質（ＰＰ）へのカップリング酸化Ｎ−ＰｒＧＢＭＰ（９.５ｍｇ）を、０.２１ｍｌの０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）（１０％オクチルグルコシドをも含有）中に溶解した精製クラス３ポーリンタンパク質（３.４ｍｇ）に加えた。多糖が溶解した後、水素化シアノホウ素ナトリウム（７ｍｇ）を加え、反応溶液を３７℃にて４日間インキュベートした。この反応混合物を０.０１％チメロサールを含有する０.１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で希釈し、スーパーデックス２００ＰＧを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより分離した。結合体（Ｎ−ＰｒＧＢＭＰ−ＰＰ）を、ボイド容量の近くで溶出する単一のピークとして得た。この結合体溶液をシアル酸およびタンパク質について分析したところ、該結合体は４３重量％の多糖からなることが示された。ポーリンタンパク質は該結合体中で４４％収率で回収され、多糖は１２％収率で回収された。種々の実験において、一般にタンパク質の回収は５０〜８０％の範囲で得られ、多糖の回収は９〜１３％の範囲で得られた。実施例８．免疫原性の研究上記Ｎ−ＰｒＧＢＭＰ−ＰＰ結合体の免疫原性、および同様のカップリング手順により調製したＮ−ＰｒＧＢＭＰ−破傷風トキソイド（Ｎ−ＰｒＧＢＭＰ −ＰＰ）結合体の免疫原性を、４〜６週齢の非近交系スイスウエブスターＣＦＷ雌マウスでアッセイした。多糖（２μｇ）−結合体を第１日、１４日、および２８日目に投与し、血清を第３８日目に採取した。結合体の投与は、食塩溶液として、水酸化アルミニウムに吸着させて、またはステアリルチロシンと混合して行った。多糖抗原に対する血清ＥＬＩＳＡ力価およびナイセリア・メニンギチジスグループＢに対する殺菌力価を表１にまとめて示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:36） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブレイク，ミラン・エスアメリカ合衆国10021ニューヨーク、ニューヨーク、イースト・シックスティサード・ストリート504番アパートメント30 ピー (72)発明者タイ，ジョセフ・ワイアメリカ合衆国19034ペンシルバニア、フォート・ワシントン、シナモン・ドライブ 1370番 (72)発明者クイ，ヒュイリン・エルアメリカ合衆国10028ニューヨーク、ニューヨーク、イースト・エイティファースト・アベニュー504番アパートメント５エム (72)発明者リャン，シュー−メイアメリカ合衆国20817メリーランド、ベセスダ、リバー・ロード6627番 (72)発明者ホロノウスキー，ルクジャン・ジェイ・ジェイアメリカ合衆国20723メリーランド、ローレル、ヒッチング・ポスト・レーン9160― エフ番 (72)発明者プレン，ジェフリー・ケイアメリカ合衆国21045メリーランド、コロンビア、ガーランド・レーン6928番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）選択可能なマーカーおよび（i）成熟ポーリンタンパク質、および（ii）Ｔ７遺伝子φ１０カプシドタンパク質のアミノ酸１〜２２に融合した成熟ポーリンタンパク質を含む融合タンパク質、よりなる群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで大腸菌を形質転換し、その際、該遺伝子は該Ｔ７プロモーターに機能的に連結しており、（ｂ）該形質転換した大腸菌を選択剤を含む培地中で培養し、ついで（ｃ）該タンパク質の発現を誘発させる、その際、発現された該タンパク質は該大腸菌中で発現された全タンパク質の２％以上を占めることを特徴とする、外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を大腸菌中で高レベルに発現する方法。２．該タンパク質が成熟グループＢクラス２ポーリンタンパク質である、請求項１に記載の方法。３．該タンパク質が成熟グループＢクラス３ポーリンタンパク質である、請求項１に記載の方法。４．該タンパク質が該大腸菌中で発現された全タンパク質の約３０％以上を占める、請求項１に記載の方法。５．該ベクターがｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）およびｐＥＴ−９ａよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。６．（ｄ）工程（ｃ）で得られた大腸菌を溶解して該タンパク質を不溶性の封入体として放出させ、（ｅ）工程（ｃ）で得られた不溶性の該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌の細胞性タンパク質を除去し、（ｆ）工程（ｅ）で得られた該封入体を変性剤の水溶液中に懸濁および溶解し、（ｇ）工程（ｆ）で得られた溶液を界面活性剤で希釈し、ついで（ｈ）該タンパク質をゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、請求項１に記載の方法で得られた外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質の精製方法。７．工程（ｇ）で得られた希釈溶液が１０ｍｇタンパク質／ｍｌ未満の濃度を有する、請求項６に記載の方法。８．（ｄ）工程（ｃ）で得られた大腸菌を溶解して該タンパク質を不溶性の封入体として放出させ、（ｅ）工程（ｃ）で得られた不溶性の該封入体を緩衝液で洗浄して混入する大腸菌の細胞性タンパク質を除去し、（ｆ）工程（ｅ）で得られた該封入体を変性剤の水溶液中に懸濁および溶解し、（ｇ）工程（ｆ）で得られた溶液を界面活性剤で希釈し、ついで（ｈ）工程（ｇ）で得られた該希釈溶液をゲル濾過カラムに通すことによって再生された３量体タンパク質を得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法で得られた外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパーク質の再生方法。９．工程（ｇ）で得られた希釈溶液が１０ｍｇタンパク質／ｍｌ未満の濃度を有する、請求項８に記載の方法。１０．請求項６に記載の方法によって製造された実質的に純粋な外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質。１１．成熟グループＢクラス２ポーリンタンパク質である、請求項１０に記載の実質的に純粋なタンパク質。１２．成熟グループＢクラス３ポーリンタンパク質である、請求項１０に記載の実質的に純粋なタンパク質。１３．請求項８に記載の方法によって製造された実質的に純粋な再生された外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質。１４．請求項１０または１３に記載の外膜髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を薬理学的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤とともに含み、その際、該タンパク質は動物においてナイセリア・メニンギチジスに対する保護抗体を産生させるに有効な量で含まれることを特徴とするワクチン。１５．該タンパク質がナイセリア・メニンギチジスの莢膜多糖に結合している、請求項１４に記載のワクチン。１６．（ｃ）請求項８に記載の方法に従って再生タンパク質を得、（ｄ）ナイセリア・メニンギチジスの莢膜多糖を得、ついで（ｅ）該タンパク質（ａ）を（ｂ）の多糖に結合させることを特徴とする、髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質または融合タンパク質−多糖結合体の製造方法。１７．該タンパク質が図４に示すアミノ酸配列を有する請求項１６に記載の方法。１８．請求項８に記載の方法に従って製造された髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質を細菌性髄膜炎を防御するに有効な量にて動物に投与することを特徴とする、動物において細菌性髄膜炎を防御する方法。１９．髄膜炎菌グループＢポーリンタンパク質またはその融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むベクター（該ＤＮＡ分子は該ベクターのＴ７プロモーターに機能的に連結している）を含有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡ宿主細胞。２０．該ＤＮＡ分子が成熟髄膜炎菌グループＢクラス２ポーリンタンパク質をコードする、請求項１９に記載の大腸菌株。２１．該ＤＮＡ分子が成熟髄膜炎菌グループＢクラス３ポーリンタンパク質をコードする、請求項１９に記載の大腸菌株。２２．該ＤＮＡ分子が図４に示すアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする、請求項１９に記載の大腸菌株。２３．該ベクターがｐＥＴ−１７ｂである請求項１９に記載の大腸菌株。２４．大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡ。