PL182573B1

PL182573B1 - Sposób ekspresji białka porynowego meningokokowego grupy B błony zewnętrznej lub jego białka fuzyjnego w E.coli, szczepionka przeciw Neisseria meningitidis, szczep E.coli oraz komórka gospodarza szczepu BL21(DE3) ompA E.coli

Info

Publication number: PL182573B1
Application number: PL94312712A
Authority: PL
Inventors: Milan S. Blake; Joseph Y. Tai; Huilin L. Qi; Shu-Mei Liang; Lucjan J.J. Hronowski; Jeffrey K. Pullen
Original assignee: The Rock
Priority date: 1993-07-23
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 2002-01-31
Also published as: WO1995003413A1; EP0713530A1; EP0713530A4; US5439808A; NZ269996A; BR9407092A; FI960309A0; RU2181378C2; AU690570B2; US6013267A; CA2167677A1; US5879686A; NO960256D0; NO960256L; FI960309A; AU7371694A; JPH09500538A; PL312712A1

Abstract

1. Sposób ekspresji bialka porynowego meningokokowego grupy B blony zewnetrznej lub jego bialka fuzyjne- go w E. coli, znamienny tym, ze: (a) przeprowadza sie transformacje szczepu E. coli wektorem zawierajacym marker selekcyjny i gen ko- dujacy bialko wybrane z grupy obejmujacej; (i) dojrzale bialko porynowe i, (ii) bialko fuzyjne obejmujace dojrzale bialko porynowe przylaczone do aminokwasów od 1 do 22 bialka kapsydu kodowanego przez gen ø 10 faga T7, w którym gen polaczony jest operacyjnie z promotorem faga T7, (b) hoduje sie stransformowana E. coli w srodowisku hodowlanym zawierajacym czynnik selekcji i, (c) indukuje sie ekspresje bialka do zawartosci eksprymowanego bialka co najmniej 2% wszystkich bialek ulegajacych ekspresji w komórkach E. coli. 11. Szczepionka przeciw Neisseria meningitidis, znamienna tym, ze zawiera ponownie zwiniete bialko po- rynowe meningokokowe grupy B blony zewnetrznej lub jego bialko fuzyjne wraz z farmaceutycznie dopuszczal- nym rozcienczalnikiem, nosnikiem lub zaróbka, przy czym bialko obecne jest w ilosci od 2 do 100 µ g/kg wagi ciala. 13. Szczep E. coli bedacy szczepem BL21 (DE3) zawierajacym delecje genu ompA. 14. Komórka gospodarza szczepu BL21 (DE3) ?ompA E. coli, znamienna tym, ze zawiera wektor zawie- rajacy czasteczke DNA kodujaca proteine porynowa meningokokowa grupy B blony zewnetrznej lub jej prote- ine fuzyjna zwiazana funkcjonalnie z promotorem T7 tego wektora. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekspresji białka porynowego meningokokowego grupy B błony zewnętrznej lub jego białka fuzyjnego w E. coli, szczepionka przeciw Neisseria meningitidis, szczep E. coli oraz komórka gospodarza szczepu BL21 (DE3) ńompA E. coli.

Błony zewnętrzne gatunku Neisseria podobnie jak innych bakterii gram-ujemnych są błonami półprzepuszczalnymi, które umożliwiają swobodny dopływ i ujście substancji o małym ciężarze cząsteczkowym do i z przestrzeni periplazmatycznej tych bakterii, lecz spowalniają cząsteczki o większym wymiarze (Heasley F.A., i in., „Reconstitution and characterization of the N. gonorrhoeae outer membranę permeability barrier” w: Genetics and Immunobiology of Neisseria gonorrhoeae, Danielsson and Normark, red., University of Umea, Umea, str. 12-15 (1980); Douglas, J.T., i in., FEMS Microbiol. Lett 12:305-309 (1981)).

Jednym z mechanizmów, dzięki którym to się dokonuje jest włączenie w ramach tych błon protein, które łącznie nazywa się porynami. Proteiny te składają się z trzech identycznych łańcuchów polipeptydowych (Jones, R.B., i in., Infect. Immun. 30:773-780 (1980); McDade, Jr. and Johnston, J. Bacteriol. 141:1183-1191 (1980)) i w ich rodzimej konformacji, tworzą wypełnione wodą, zależne od napięcia kanały w ramach błony zewnętrznej bakterii lub innych błon, do których je wprowadzono (Lynch E.C. i in., Biophys. J. 41:62 (1983); Lynch, E.C. i in., Biophys. J. 45:104-107 (1984); Young, J.D.E. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3831-3835 (1983); Mauro, A„ i in., Proc., Acad. Sci. USA 85: 1071-1075 (1988); Young J.D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:150-154 (1986). Ze względu na względną

182 573 obfitość tych protein w ramach błony zewnętrznej, te antygeny protein również użyto do pogrupowania Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis na szereg serotypów dla celów epidemiologicznych (Frasch, C.E. i in., Rev. Infect. Dis. 7:504-510 (1985); Knapp J.S. i in., „Overview of epidemiological and clinical applications of auxotype/serovar classification of Neisseria gonorrhoeae, „The Pathogenic Neisseriae, Schoolnik G.K., red, American Society for Microbiology, Washington pp. 6-12 (1985)). Do chwili obecnej wiele spośród tych protein zarówno z gonokoków jak i meningokoków oczyszczono (Heckels J.E., J.Gen. Microbiol. 99:333-341 (1977); James, Heckels, J. Immunol. Meth. 42:223-228 (1981); Judd R.C., Anal. Biochem. 173:307-316 (1988); Blake, Gotschlich, Infect. Immun. 36:277-283 (1982); Wetzler, L.M., i in., J. Exp. Med. 168:1883-1897 (1988), i klonowano oraz sekwencjonowano (Gotschlich E.C. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8135-8139 (1987); McGuiness B., i in., J. Exp. Med. 171:1871-1882 (1990); Carbonetti, Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088 (1987); Feavers I.M., i in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992); Murakami K. i in., Infect. Immun. 57:2318-2323 (1989); Wolff, Stern, FEMS Microbiol. Lett. 83; 179-186 (1991); Ward M.J. i in., FEMS Microbiol. Lett. 73:283-289 (1992).

Proteiny porynowe początkowo współwyodrębniono z lipopolisacharydami. W konsekwencji, proteiny porynowe nazwano „proteinami zasocjowanymi z endotoksyną” (Bjomson i in., Infect. Immun. 56:1602-1607 (1988)). Z badań poryn dzikiego typu wiadomo, że pełnego zgromadzenia i oligomeryzacji nie osiąga się, o ile LPS z odpowiadającego temu szczepowi bakteryjnemu nie jest obecne w otoczeniu proteiny (Holzenburg i in., Biochemistry 28:4187-4193 (1989); SeniNikaido, J. Biol. Chem. 266:11295-11300(1991)).

Poryny meningokokowe dzielą się na trzy główne klasy, które w dotychczasowej literaturze były znane jako klasy 1, 2 oraz 3 (Frasch C.E., i in., Rev. Infect. Dis. 7:504-510 (1985)). Każdy badany meningokok zawierał jeden z aleli bądź dla genu poryny klasy 2 lub genu poryny klasy 3 lecz nie obydwu (Feavers I. M., in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)); Murakami K., i in., Infect. Immun. 57:2318-2323 (1989)). Obecność lub nieobecność genu klasy 1 wydaje się opcjonalne. Podobnie wszystkie badane gonokoki zawierają jedynie jeden gen poryny o podobieństwach bądź do aleli klasy 2 lub klasy 3 (Gotschlich E.C., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8135-8139 (1987); Carbonetti i Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088 (1987)). Wydaje się, że N gonorrhoeae zupełnie nie mająalleli klasy 1. Dane z genów, które dotąd sekwencjonowano sugerowałyby, że wszystkie proteiny porynowe dwoinek gram-ujemnych wykazują co najmniej 70% homologię względem siebie z pewnymi odmianami zasadniczego schematu. (Feavers I.M. i in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)). Sugeruje się, że sporo odmian stwierdzonych między tymi proteinami porynowymi dwoinek gram-ujemnych wynika z ciśnień immunologicznych powodowanych przez inwazję tych patogennych organizmów do jego naturalnego gospodarza, człowieka. Jednak, bardzo mało wiadomo na temat tego, jak zmiany w sekwencji proteiny pory nowej wpływają na funkcjonalną aktywność tych protein.

Poprzednio doniesiono, że wyodrębnione poryny gonokokowe typu alleli klasy 2 zachowują się elektrofizycznie nieco różnie od wyodrębnionych poryn gonokokowych typu klasy 3 w badaniach podwójnej warstwy tłuszczowej względem ich selektywności jonowej i zależności od napięcia (Lynch E.C., i in., Biophys. J. 41:62 (1983); Lynch E.C., i in., Biophys. J. 45:104-107 (1984)). Ponadto, zdolność różnych poryn do wchodzenia w te podwójne warstwy lipidowe z nienaruszonych żywych bakterii wydaje się korelować nie tylko z typem poryny lecz również z gatunkiem dwoinki gram-ujemnej, z których je uzyskano (Lynch E. C. i in., Biophys. J., 45:104-107 (1984)). Wydaje się, że co najmniej pewne z tych atrybutów funkcjonalnych można by powiązać z różnymi polami w obrębie sekwencji proteinowej poryny. Jednym takim polem funkcjonalnym, uprzednio zidentyfikowanym w całej w całej klasie gonokokowych protein typu klasy 2, jest miejsce rozszczepiania chymotrypsyny. Po trawieniu chymotrypsyną, ta klasa poryn cechuje się brakiem zdolności do odpowiadania na potencjał napięcia i zamknięcie. Poryny gonokokowe typu klasy 3, jak również poryny meningokokowe nie mają tej sekwencji i nie podlegają zatem rozszczepianiu chymotrypsyną, lecz nie

182 573 mniej odpowiadają przez zamykanie na przyłożony potencjał napięcia (Greco F., „The formation of channels in lipid bilayers by gonococcal major outer membranę protein”, dysertacja, The Rockefeller University, New York (1981); Greco F., i in., Fed. Proc. 39: 1813 (1980)).

Głównym utrudnieniem takich badań jest zdolność łatwego manipulowania genami porynowymi za pomocą nowoczesnych technik molekularnych i otrzymania wystarczająco oczyszczonej proteiny dla przeprowadzenia biofizycznej charakterystyki tych zmienionych protein porynowych. Wcześnie rozpoznano, że klonowane geny poryny dwoinek gram-ujemnych, w przypadku ekspresji w Escherischia coli były letalne dla gospodarza E. coli “Carbonetti i Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088 (1987); Carbonetti N.H. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845 (1988); Barlow, A. K., i. in. Infect. Immun. 55:2734-2740 (1987)). Zatem, wiele z tych genów klonowano i sekwencjonowano jako części całego genu lub umieszczono w plazmidach o małej ilości kopii pod ścisłą kontrolą ekspresji “Carbonetti N. H., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845 (1988)). W tych warunkach, nawet gdy cały gen poryny uległ ekspresji, bardzo mało proteiny nagromadziło się, która mogłaby być dalej oczyszczona i przetwarzana w celu charakterystyki.

Innym sposobem rozwiązania tego problemu, któremu towarzyszył umiarkowany sukces, jest klonowanie genów porynowych w plazmidzie o małej liczbie kopii i o ściśle kontrolowanej ekspresji, wprowadzenie modyfikacji do genu poryny, a następnie powtórne wprowadzenie zmodyfikowanej sekwencji z powrotem do Neisseria “Carbonetti N. H., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845 (1988)). Jednak, to również wiązało się z problemami wskutek złożonego układu restrykcyjnej endonukleazy obecnej w Neisseria, w szczególności w gonokokkach (Davies, J.K., Clin. Microbiol. Rev. 2:S78-S82 (1989)).

Niniejszy wynalazek jest ukierunkowany na przezwyciężenia tych trudności. Sekwencja DNA protein dojrzałej poryny np. klasy 2 i klasy 3, jak również ich fuzji, może być wzmocniona przy użyciu chromosomu bakterii meningonokokowych jako szablonu reakcji PCR. Wzmocnione sekwencje poryny poddano ligacji i klonowaniu do wektora ekspresji zawierającego promotor T7. Szczep E. coli BL21 lizogenny dla fagu lambda DE3 (Studier i Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113-130 (1986)), zmodyfikowany, by wyeliminować gen ompA, wybrano jako gospodarza ekspresji dla plazmidu pET-17b zawierającego gen poryny. Po wywołaniu, duże ilości meningokokowych protein purynowych nagromadziły się w E. coli bez jakichkolwiek efektów letalnych na bakterię gospodarza. Ekspresjonowane meningokokowe proteiny porynowe wyekstrahowano i poddano obróbce za pomocą standardowych procedur i ostatecznie oczyszczono za pomocą chromatografii sit molekularnych i chromatografii jonowymiennej. Z profilu proteinowego chromatografii sit molekularnych wynika, że rekombinacyjne poryny meningokokowe wymywały się z kolumny jako trimery. Aby się upewnić, że nie wprowadzono żadnych artefaktów PCR do genów poryny meningokokowej, by umożliwić taką wysokiego poziomu ekspresję, określono sekwencję wstawionego genu PorB. Próby inhibitowania ELISA użyto do dania dalszego dowodu, że ekspresjonowane rekombinantowe proteiny poryny były renaturowane do ich naturalnej konformacji antygenowej i trimerowej.

Streszczenie wynalazku. Wykazano, że poryny z różnych szczepów i gatunków dwoinek gram-ujemnych wykazują różnice zarówno w pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej i charakterystyce biochemicznej, jak obserwuje się w próbach funkcjonalnych. Bliższe zbadanie tego jak zmiany w pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej cząsteczek Neisseria porin korelują z tymi obserwowanymi zmianami biofizycznymi zostało utrudnione przez zdolność do łatwego manipulowania klonowanymi genami poryn za pomocą współczesnych technik molekularnych, a następnie otrzymania dostatecznej ilości ekspresj onowanej modyfikowanej proteiny porynowej i zastosowania do tego biofizycznych prób czynnościowych. W niniejszym wynalazku, gen kodujący dojrzałą proteinę PorB, bez promotora i sekwencji sygnałowej, sklonowano w plazmidzie ekspresji pET-17b i transformowano w E. coli. Po indukowaniu, wytworzono duże ilości proteiny PorB.

Następnie ekspresjonowaną proteinę porynową manipulowano, by regenerować jej rodzimą budowę w postaci trimeru, a następnie oczyszczono. Otrzymano wystarczającą ilość

182 573 oczyszczonej rekombinacyjnej proteiny porynowej dla dalszej charakterystyki antygennej i biofizycznej. Zatem, to stanowi etap, na którym charakterystykę biofizyczną tych protein porynowych dwoinek gram-ujemnych można zbadać bardziej szczegółowo.

Ogólnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu ekspresji meningokokowej proteiny porynowej grupy B, zwłaszcza protein porynowych klasy 2 i klasy 3.

Szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu ekspresji meningokokowej proteiny porynowej klasy 2 lub 3 grupy B w E. coli obejmującego: (a) transformowanie do szczepu E. coli wektora obejmującego wybieralny marker i gen kodujący proteinę wybraną z grupy składającej się z: (i) proteiny dojrzałej poryny, i (ii) proteiny fuzyjnej, która jest proteiną dojrzałej poryny po fuzji do aminokwasów 1 do 22 proteiny kapsydu 0 10 genu T7; w którym wspomniany gen jest usuwalnie połączony z promotorem T7; (b) wzrastanie transformowanego E. coli w ośrodku hodowli zawierającym czynnik selekcji, i (c) indukowanie ekspresji wspomnianej proteiny, by uzyskać E. coli zawierające wspomnianą proteinę; w którym tak ekspresjonowana proteina obejmuje więcej niż około 2% ogółu proteiny ekspresjonowanej w E. coli.

Innym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu oczyszczania i ponownego fałdowania meningokokowej proteiny porynowej grupy B i proteiny fuzyjnej wytworzonych według wyżej podanych sposobów.

Dalszym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie szczepionki obejmującej meningokokową proteinę porynową grupy B i proteinę fuzyjną wytworzone według wyżej podanych sposobów, w ilości skutecznej do wywołania ochronnych przeciwciał u zwierzęcia na Neisseria meningitidis; i farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, nośnik lub zaróbkę.

Innym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie wyżej opisanej szczepionki, w której wspomniana meningokokową proteina porynową grupy B lub proteina fuzyjna jest skoniugowana z polisacharydem torebkowym Neisseria meningitidis.

Dalszym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu zapobieżenia bakteryjnemu zapaleniu opon u zwierzęcia obejmującego podawanie zwierzęciu szczepionki z meningokokową proteiną porynową grupy B lub proteiną fuzyjną, wytworzonej według wyżej opisanych metod.

Dalszym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania koniugatu polisacharydowego obejmującego: otrzymanie wyżej opisanej meningokokowej proteiny porynowej grupy B lub proteiny fuzyjnej; otrzymanie polisacharydu z organizmu Neisseria meningitidis', oraz skoniugowanie meningokokowej proteiny porynowej grupy B lub proteiny fuzyjnej z polisacharydem.

Dalszym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu oczyszczania wyżej opisanej meningokokowej proteiny porynowej grupy B lub proteiny fuzyjnej; poddanie lizie transformowanego E. coli, by uwolnić meningokokową proteinę porynową grupy B lub proteinę fuzyjnąjako część nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych; przemywanie ciał inkluzyjnych buforem, by usunąć zanieczyszczające proteiny komórkowe E. coli. Powtórne utworzenie zawiesiny i rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w wodnym roztworze środka denaturującego; rozcieńczenie uzyskanego roztworu detergentem; oraz oczyszczenie solubilizowanej meningokokowej proteiny porynowej grupy B lub proteiny fuzyjnej za pomocą filtracji żelowej i chromatografii jonowymiennej.

Dalszym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu ponownego fałdowania wyżej opisanej meningokokowej proteiny porynowej grupy B lub proteiny fuzyjnej; poddanie lizie transformowanego E. coli, by uwolnić meningokokową proteinę porynową grupy B lub proteinę fuzyjnąjako część nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych; przemywanie ciał inkluzyjnych buforem, by usunąć zanieczyszczające proteiny komórkowe E. coli; Powtórne utworzenie zawiesiny i rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w wodnym roztworze środka denaturującego; rozcieńczenie uzyskanego roztworu detergentem; oraz oczyszczenie solubilizowanej menin

182 573 gokokowej proteiny porynowej grupy B lub proteiny fuzyjnej za pomocą filtracji żelowej uzyskując ponownie pofałdowaną proteinę w płynie wymywającym.

Dalszym szczególnym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie komórki gospodarza szczepu E. coli BL21 (DE3) AompA, która zawiera wektor obejmujący cząsteczkę DNA kodującą meningokokową proteinę porynową grupy B lub proteinę fuzyjną, przy czym cząsteczka DNA jest usuwalnie połączona z promotorem T7 wektora.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest dostarczenie szczepu E. coli BL21 (DE3) AompA.

Dalsze przedmioty i korzyści niniejszego wynalazku będą widoczne z poniższego opisu.

Figura 1: Schemat przedstawiający strategię sekwencj ono wania genu PorB. Produkt PCR opisany w przykładzie 1 (dział Materiały i metody) poddano ligacji w miejsce BamHIXhol plazmidu ekspresyjnego pET-17b. Sekwencjonowanie rozszerzenia początkowego dwuniciowego primera wykonano przy użyciu sekwencji oligonukleotydowych bezpośrednio w górę od miejsca BamHI i dokładnie w dół od miejsca Xhol w obrębie plazmidu pET-17b. Dodatkowe dane sekwencyjne uzyskano przez wykonanie licznych delecji na końcu 3' genu przy użyciu reakcji egzonukleaza III/nukleaza Mung bean. Po powtórnej ligacji i transformacji z powrotem do E.coli, wybrano szereg klonów wielkości insertu i następnie sekwencj onowano. To sekwencj onowanie było zawsze wykonywane do końca 3' genu przy użyciu primera oligonukleotydowego dokładnie w dół od miejsca Bpu 11021.

Figura 2: Elektroforeza żelu przedstawiająca produkty reakcji PCR (elektroforezę przeprowadzono w 1% agarozie przy użyciu bufora TAE).

Figura 3 (panele (a) i (b)): Panel (a): analiza SDS-PAGE lizatów całej komórki E. coli gospodarza plazmidu kontrolnego pET-17b bez insertów i klonu E. coli z plazmidem pET-17b zawierającego insert z otrzymanego produktu PCR opisanego w dziale Materiały i metody. Obydwie hodowle prowadzono do O.D. 0,6 przy 600 nm, dodano IPTG i inkubowano w 37°C przez 2 h. 1,5 ml każdej z hodowli wyjęto, odwirowano i osad bakteryjny rozpuszczono w 100 μΐ bufora preparatu SDS-PAGE. Pasek A pokazuje profil proteiny uzyskanej przy użyciu 10 μΐ z próbki kontrolnej, a paski Β (5μ1) i C (10μ1) przedstawiają profil proteiny gospodarza E. coli ekspresjonującego proteinę PorB. Panel (B): analiza Western biot lizatów całej komórki E. coli z plazmidem kontrolnym pET-17b bez insertu po 2 h indukowania przy użyciu IPTG, pasek A, 20μ1 i odpowiadający temu klon E. coli zawierający plazmid porB-pET-17b, pasek Β, 5μ1; pasek C, 10μ1 i pasek D, 20μΙ. Przeciwciało monoklonalne 4D11 użyto jako przeciwciało pierwotne, a Western biot rozwinięto jak opisano. W każdym przypadku użyto wstępnie wybarwionych standardów o niskim ciężarze cząsteczkowym z BRL.

Figura 4: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO. 1) i translowana sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO. 2) dojrzałego genu PorB klonowanego w plazmidzie ekspresji pET-17b. Dwa nukleotydy różniące się od poprzednio opublikowanego serotypu 15 PorB podkreślono.

Figura 5: Wykres przedstawiający profil wymywania kolumny Sephacryl S-300 dzikiego typu proteiny klasy 3 wyodrębnionej ze szczepu meningokokowego 8765 oraz rekombinacyjnej proteiny klasy 3 wytworzonej przez szczep E. coli BL21(DE3)-AompA mieszczący plazmid r3pET-17b [jest to typo - nie pojawia się ono w przykładach] monitorowany przez absorpcję przy 280 nm i analizę SDS-PAGE. Pustą objętość kolumny wskazano strzałką. Frakcje zawierające porynę meningokokową i porynę rekombinacyjną oznaczone przez SDS-PAGE zaznaczono słupkiem.

Figura 6: Wykres obrazujący wyniki prób inhibitowania ELISA pokazujących zdolność PorB homologicznego dzikiego typu (wt) do współzawodniczenia o reaktywne przeciwciała w sześciu ludzkich surowicach immunologicznych. Średnią arytmetyczną z prób inhibitowania przedstawiono linią pogrubioną.

182 573

Figura 7: Wykres obrazujący wyniki prób inhibitowania ELISA pokazujących zdolność PorB oczyszczonego rekombinacyjnego do współzawodniczenia o reaktywne przeciwciała w sześciu ludzkich surowicach immunologicznych. Średnią arytmetyczną z prób inhibitowania przedstawiono linią pogrubioną.

Figura 8: Wykres obrazujący porównanie dwóch powyższych średnich wyników inhibitowania uzyskanych dla proteiny PorB wt i rekombinacyjnej.

Figury 9A i 9B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO. 3) i translowana sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO. 4) dojrzałego genu poryny klasy II klonowanego w plazmidzie ekspresji pET-17b.

Figury 10A i 10B: Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO. 5) i translowana sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO. 6) genu poryny fiizyjnej klasy II klonowanego w plazmidzie ekspresji pET-17b

Figura 11 (panele A i B): Panel A przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pET-17b. Panel B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO. 7 oraz ŚEQ ID NO. 9) między miejscami BgUI oraz Xhol pET-17b. Sekwencja dostarczona przez plazmid jest zaznaczona normalnym drukiem, a sekwencja wstawiona przez produkt PCR - drukiem pogrubionym. Aminokwasy (SEQ ID NO. 8 oraz SEQ ID NO. 10) pochodzące z plazmidu zaznaczono normalnym drukiem, a aminokwasy z insertu - drukiem pogrubionym. Strzałki ograniczają obszar, gdzie sekwencja zaczyna oraz kończy się pokrywać z sekwencją na fig. 4.

W przeciwieństwie do protein porynowych E. coli i pewnych innych bakterii gram-ujemnych, stosunkowo mało wiadomo o tym jak zmiany w pierwotnej sekwencji poryn z Neisseria wpływają na ich selektywność jonową, zależność napięcia oraz inne funkcje biofizyczne. Ostatnio rozwiązano struktury krystalograficzne dwóch poryn E. coli, OmpF i PhoE z dokładnością do 2,4 A oraz 3,0 A, odpowiednio (Cowan S.W. i inni., Naturę 358:727-733 (1992)). Obydwie z tych poryn E. coli badano intensywnie wskutek ich niezwykłej trwałości oraz łatwości wykonywania molekularnych manipulacji genetycznych. Dane uzyskane dla genetyki tych dwóch poryn dobrze korelowały ze strukturą krystalograficzną. Choć w szeregu badaniach wykazano przy użyciu przeciwciał monoklonalnych dla selekcji poryn dwoinek gram-ujemnych, że topologia powierzchni Neisseria bardzo przypomina powierzchnię tych dwóch poryn E. coli (van der Ley, P.l i inn. Infect. Immun. 59: 2963-2971 (1991)), nie ma prawie wcale informacji na temat tego jak zmiany w sekwencjach aminokwasowych w poszczególnych obszarach poryn dwoinek gram-ujemnych wpływają na ich charakterystykę biofizyczną, takjak to wykonano dla poryn E. coli (Cowan S.W. i inn., Naturę 358:727-733 (1992)). Dwie główne trudności hamujące te badania to: (1) niezdolność do łatwego genetycznego manipulowania Neisseria za pomocą współczesnych technik molekularnych oraz (2) niezdolność do ekspresji wystarczających ilości poryn dwoinek gram-ujemnych w E. coli dla dalszego oczyszczania, by uzyskać dane charakterystyki biochemicznej i biologicznej. W istocie większość danych sekwencyjnych DNA poryn gonokokowych i meningokokowych uzyskano przez klonowanie nakładających się fragmentów genu poryny, a następnie rekonstrukcję informacji, by uzyskać całą sekwencję genu (Gotschlich E.C., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8135-8139 (1987); Murakami K., i in., Infect. Immun. 57:2318-2323 (1989)). Carbonetti i in. byli pierwszymi, którzy sklonowali cały gonokokowy gen poryny w E. coli przy użyciu plazmidu ściśle kontrolowanej ekspresji pT7-5. Wyniki tych badań pokazały, że gdy indukuje się gen poryny, nagromadza się bardzo mało proteiny porynowej i ekspresja tej proteiny jest letalna dla E. coli °Carbonetti i Sparling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9084-9088 (1987)). W dodatkowych badaniach, Carbonetti i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6841-6845 (1988)) wykazali, że zmiany w gonokokowym genie poryny mogą być wykonane w tym układzie, a następnie mogą być powtórnie wprowadzone do gonokoków. Jednak, łatwość z jaką można wykonać te manipulacje i otrzymać dosyć proteiny porynowej dla dalszej charakterystyki biochemicznej i biofizycznej wydaje się ograniczona. Feavers i in. opisali sposób wzmacniania za pomocą PCR genów poryny dwoinek gram-ujemnych z szerokiej różnorodności źródeł przy użyciu dwóch zsyntetyzowanych oligonukleotydów do wspólnych domen

182 573 przy końcach 5' oraz 3' genów poryny, odpowiednio (Feavers. I.M., i in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)). Oligonukleotydy skonstruowano w taki sposób, by wymusić wzmocniony DNA by był klonowany w plazmidach przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Bglll oraz Xhol.

Przy użyciu układu PCR wg Feaversa i in., wzmocniono sekwencję DNA proteiny dojrzałego PorB z serotypu 15 meningokokowego szczepu 8765 i poddano ją ligacji w miejscu BamHI-XhoI plazmidu pET-17b ekspresji T7. To umieściło sekwencję proteinową dojrzałego PorB w ramce bezpośrednio za promotorem T7 i 20 aminokwasami proteiny 0 10 włączając w to sekwencję prowadzącą. Po dodaniu IPTG do hodowli E. coli zawierające ten plazmid, duże ilości proteiny PorB nagromadziły się w obrębie bakterii. Pełne wyjaśnienie dlaczego ta konstrukcja była nie-letalna względem E. coli i ekspresj ono wała dużą ilość proteiny porynowej, wymaga dalszych badań. Jednak, jedną możliwą hitopezą jest, że przez zamianę sekwencji promotora dwoinek gram-ujemnych i sygnałowej z sekwencją T7 i 0 10, odpowiednio, produkt porynowy został skierowany raczej do cytoplazmy niż do błony zewnętrznej. Henning i współpracownicy podali, że gdy proteina E. coli OmpA i jej fragmenty są ekspresj ono wane, te produkty, które są w cytoplazmie są mniej toksyczne niż te skierowane w kierunku przestrzeni periplazmatycznej (Klose M., J. Biol., Chem. 263: 13291-13296 (1988); Klose M. i in., J. Biol. Chem. 263:13297-13302 (1988); Freudl R., i in., J. Mol. Biol. 205: 771-775 (1989)). Niezależnie od wyjaśnienia tego, gdy proteinę PorB ekspresjonowano, była ona łatwo wyodrębniona, oczyszczona i widocznie przekształciła się w trimery podobnie do rodzimej poryny. Wyniki danych inhibito wania ELI SA przy użyciu ludzkich surowic immunologicznych sugerują że proteina PorB otrzymana w ten sposób odzyskuje większość, o ile nie wszystko z antygenicznej charakterystyki dzikiego typu proteiny PorB oczyszczonej z meningokoków. Ten układ ekspresji umożliwia łatwą manipulację genu poryny dwoinek gram-ujemnych za pomocą współczesnych technik molekularnych. Ponadto, układ ten pozwala na uzyskanie dużych ilości czystej proteiny porynowej w celu charakterystyki. Ponadto, obecny układ ekspresji umożliwia, by geny z licznych szczepów Neisseria, zarówno gonokoków i meningokoków, były badane i charakteryzowane w podobny sposób.

Zatem niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ekspresji proteiny porynowej meningokokowej grupy B błony zewnętrznej, w szczególności protein porynowych klasy 2 i klasy 3.

W jednym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ekspresji proteiny porynowej meningokokowej grupy B błony zewnętrznej w E. coli obejmującego:

(a) transformowanie E. coli przez wektor zawierający wybieralny marker i gen kodujący proteinę wybraną z grupy obejmującej:

(i) dojrzała proteinę porynową i (ii) proteinę fuzyjną obejmującą dojrzałą proteinę porynową po jej fuzji z aminokwasami 1 do 20 lub 22 proteiny kapsydu 0 10 genu T7; w którym wspomniany gen jest usuwalnie połączony z promotorem T7;

(b) wzrastanie transformowanego E. coli w środku hodowli zawierającym czynnik selekcji, oraz (c) indukowanie ekspresji wspomnianej proteiny; w którym tak wytworzona proteina obejmuje więcej niż około 2% ogółu proteiny ekspresjonowanej w E. coli.

W korzystnym wykonaniu, proteina porynową meningokokowa grupy B lub proteina fuzyjna ekspresjonowana obejmuje więcej niż około 5% ogółu protein ekspresjonowanych w E. coli. W innym korzystnym wykonaniu, proteina porynową meningokokowa grupy B lub proteina fuzyjna ekspresjonowana obejmuje więcej niż około 10% ogółu protein ekspresjonowanych w E. coli. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, proteina porynową meningokokowa grupy B lub proteina fuzyjna ekspresjonowana obejmuje więcej niż około 30% ogółu protein ekspresj onowanych w E. coli.

Przykłady plazmidów zawierających indukowalny promotor T7 obejmuje plazmidy ekspresji pET-17b, pET-lla, pET-24a-d(+) i pET-9a, z których wszystkie są dostępne handlowo od Novagen (565 Science Drive, Madison, WI 53711). Te plazmidy obejmują sekwencyjnie,

182 573 promotor T7, ewentualnie operator lac, miejsce wiązania rybosomu, miejsca restrykcyjne, dla umożliwienia insercji genu strukturalnego i sekwencja terminatora T7. Zob. katalog Novagen, str. 36-43 (1993).

W korzystnym wykonaniu, stosuje się szczep E. coli BL21(DE3) AompA. Wyżej wspomniane plazmidy można transformować w ten szczep lub dzikiego typu szczep BL21(DE3). Szczep E. coli BL21 (DE3)-AompA jest korzystny ponieważ nie jest wytwarzana żadna proteina OmpA przez ten szczep, która mogłaby zanieczyszczać oczyszczoną proteinę porynową i tworzyć niepożądane immunogenne efekty uboczne.

Transformowane E. coli hoduje się w ośrodku zawierającym czynnik selekcji np. dowolny β-laktam, na który jest wrażliwe E. coli, taki jak ampicylina. Wektory ekspresji pET dostarczają wybieralne markery, które nadają antybiotykową odporność na transformowany organizm.

Wysokiego poziomu ekspresja proteiny purynowej meningokokowej grupy B może być toksyczna w E. coli. Zaskakująco, niniejszy wynalazek umożliwia E. coli ekspresję proteiny do poziomu co najmniej niemal 30% i tak wysoko jak>50% ogółu protein komórkowych.

W innym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy szczepionki zawierającej proteinę porynową meningokokową grupy B błony zewnętrznej lub jej proteinę fozyjną, wytworzonej według wyżej opisanych sposobów, łącznie z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką, w którym szczepionkę można podawać w ilości skutecznej, do wywołania ochronnych przeciwciał u zwierzęcia na Neisseria meningitidis. W korzystnym wykonaniu, zwierzę jest wybrane z grupy obejmującej: ludzi, bydło rogate, świnie, owce i kury. W innym korzystnym wykonaniu, zwierzęciem jest człowiek.

W innym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy wyżej opisanej szczepionki, w której proteina porynową meningokokową grupy B błony zewnętrznej lub jej proteina fiizyjna jest skoniugowana z polisacharydem torebkowym (CP) meningokokowym grupy B. Takie torebkowe polisacharydy można wytworzyć, jak opisano w Ashton F.E. i in., Microbial Pathog. 6:455-458 (1989); Jennings, H.J. i in., J. Immunol. 134:2651 (1985); Jennings H. J. i in., J. Immunol. 137:1708-1713 (1986); Jennings, H. J. i in., J. Immunol. 142:3585-3591 (1989); Jennings, H. J., „Capsular Połysaccharides as Vaccine Candidates” w Current Topics in Microbiology and Immunology, 150:105-107 (1990); treści każdej z tych pozycji są w pełni dołączone do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacze.

Korzystnie, CP jest wyodrębniany według: Frasch C.E., „Production and Control od Neisseria meningitidis Eaccines” w: Bacterial Vaccines, Alan R. Liss, Inc., str. 123-145 (1990), treść tej pozycji jest w pełni dołączona do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz, jak następuje: Wzrastanie organizmów w zmodyfikowanym ośrodku Franza 10 do 20 godzin.

zabicie wskutek działania ciepła 55°C, 10 minut Usuwanie inaktywowanych komórek przez odwirowanie.

dodanie Cetavlonu do 0,1% Wytrącenie CP z bulionu hodowli.

I dodanie chlorku wapnia do IM

Rozpuszczenie CP, a następnie odwirowanie, by usunąć szczątki komórkowe.

Φ dodać alkohol etylowy do 25%

Usunięcie wytrąconych kwasów nukleinowych przez odwirowanie.

Φ dodanie alkoholu etylowego do 80%

Wytrącenie nieoczyszczonego CP i usunięcie alkoholu.

Surowy CP jest następnie oczyszczany przez chromatografię filtracji żelowej po częściowej depolimeryzacji rozcieńczonym kwasem np. kwasem octowym, kwasem mrówkowym i kwasem trójfluorooctowym (0,01-0,5 N), by uzyskać mieszaninę polisacharydów o średnim ciężarze cząsteczkowym 12000-16000. Następnie CP jest N-deacetylowany przy użyciu borowodorku i N-propionylowane, by uzyskać N-Pr GBMP. Zatem CP, które może

182 573 być użyte w szczepionkach koniugatowych według niniejszego wynalazku może być fragmentami CP, N-deacytylowanym CP oraz jego fragmentami, jak również N-Pr CP i jego fragmentami, dopóki indukują one odporność czynną w przypadku użycia jako część koniugatu CP-proteina porynowa (patrz przykłady).

W dalszym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania koniugatu z polisacharydem obejmującego: otrzymanie wyżej opisanej proteiny porynowej meningokokowej grupy B błony zewnętrznej lub jej proteiny fiizyjnej; otrzymanie CP z organizmu Neisseria meningitidis; oraz skoniugowanie proteiny do CP.

Koniugaty według wynalazku można utworzyć przez poddanie reakcji redukujących grup końcowych CP z pierwszorzędowymi grupami aminowymi poryny przez aminowanie redukcyjne. Grupy redukujące można utworzyć przez selektywną hydrolizę lub specyficzne rozszczepienie utleniające lub kombinację tych obydwu. Korzystnie, CP jest skoniugowane z proteinąpoiynową według sposobu Jennigs i in., Opis patentowy USA nr 4356170, którego treść jest w pełni dołączona do niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz, który to sposób wiąże się z kontrolowanym utlenieniem CP nadjodanem po czym następuje redukcyjne aminowanie proteiną porynową.

Szczepionka według niniejszego wynalazku obejmuje proteinę porynową meningokokową grupy B, proteinę fuzyjnąlub szczepionkę w postaci koniugatu w ilości skutecznej zależnie od drogi podawania. Chociaż korzystne są podskórne lub domięśniowe drogi podawania, można proteinę porynową meningokokową grupy B, proteinę fuzyjną lub szczepionkę według niniejszego wynalazku podawać również drogą dootrzewnową lub dożylną. Specjalista z dziedziny techniki doceni, że ilości podawane w przypadku jakiegokolwiek szczególnego protokołu leczenia można łatwo określić bez nadmiernych doświadczeń. Można się spodziewać, że odpowiednie ilości będą się zawierać w zakresie od 2 mikrogramów proteiny na kg ciężaru ciała do 100 mikrogramów na kg ciężaru ciała.

Szczepionkę według niniejszego wynalazku można zastosować w takich formach jak: kapsułki, roztwory ciekłe, zawiesiny lub eliksiry dla podawania ustnego, lub sterylne formy ciekłe, takie jak roztwory lub zawiesiny. Dowolny inertny nośnik jest korzystnie stosowany, taki jak solanka, solanka buforowana fosforanem, lub dowolny taki nośnik, w którym proteina porynowa meningokokową grupy B, proteina fuzyjna lub szczepionka w postaci koniugatu mają odpowiednie właściwości odnośnie rozpuszczalności. Szczepionki mogą być w postaci preparatów o pojedynczej dawce lub w fiolkach wielodawkowych, które można użyć w programach masowych szczepień. Odnośnie sposobów wytwarzania i stosowania szczepionek odsyłaczem jest pozycja Remingtona Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (ed.) (1980); oraz New Trends and Developments in Vaccines, Voller i in., (red.), University Park Press, Baltimore, MD (1978).

Proteina porynowa meningokokową grupy B, proteina fuzyjna lub szczepionki koniugatów według niniejszego wynalazku mogą ponadto zawierać adiuwanty poprawiające wytwarzanie przeciwciał porynospecyficznych. Takie adjuwanty obejmują (lecz nie są do nich ograniczone) różne receptury oparte na oleju, takie jak pełny adjuwant Freunda °CFA), tyrozyna stearylowa (ST, patrz opis patentowy USA nr 4258029), dipeptyd znany jako MDP, saponina, wodorotlenek glinu, oraz cytokin limfatyczny.

Adiuwant Freunda jest emulsją oleju mineralnego i wody, który jest zmieszany z substancją immunogenną. Chociaż adiuwant Freunda ma dużą moc, zwykle nie jest podawany ludziom. Zamiast tego, adiuwant alum (wodorotlenek glinu) lub ST można użyć dla podawania człowiekowi. Proteina porynowa meningokokową grupy B lub szczepionka w postaci jej koniugatu może być zaabsorbowana na wodorotlenku glinu, z którego jest powoli uwalniana po iniekcji. Proteina porynowa meningokokową grupy B lub szczepionka w postaci koniugatu może być także według Fullertona, opis patentowy USA 4235877, wbudowana w obrębie liposomów.

182 573

W innym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zapobiegania bakteryjnemu zapaleniu opon u zwierzęcia, obejmującego podawanie zwierzęciu proteiny porynowej meningokokowej grupy B, proteiny fuzyjnej lub szczepionki w postaci koniugatu wytworzonych według sposobów opisanych w ilości skutecznej do zapobieżenia bakteryjnemu zapaleniu opon.

W dalszym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania wyżej opisanej proteiny porynowej lub proteiny fuzyjnej obejmującego: poddanie lizie transformowanego E. coli, aby uwolnić proteinę porynową meningokokową grupy B lub proteinę fuzyjnąjako część nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych; przemywanie ciał inkluzyjnych przy użyciu buforu, by usunąć zanieczyszczające proteiny komórkowe E. coli', powtórne przeprowadzenie w stan zawiesiny i rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w wodnym roztworze środka denaturującego; rozcieńczanie uzyskanego roztworu w detergencie; oraz oczyszczanie solubilizowanej proteiny porynowej meningokokowej grupy B przez filtrację żelową.

Etap poddawania lizie można wykonać według dowolnego sposobu znanego specjalistom w dziedzinie techniki np. przez sonizowanie, trawienie enzymem, wstrząs osmotyczny lub przez przepuszczenie przez prasę rozcierającą. Ciała inkluzyjne można przemywać dowolnym buforem zdolnym do solubilizacji protein komórkowych E. coli bez solubilizacji ciał inkluzyjnych zawierających proteinę porynową meningokokową grupy B. Takie bufory zawierają, lecz nie są organiczne do, bufor TEN (50 mM Tris HC1, ImM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8,9). Tricine, Bicine oraz HEPES.

Środki denaturujące, które mogą być użyte w praktyce wynalazku obejmują 2 do 8 M mocznika lub około 2 do 6 M guanidyny, HC1, korzystniej, 4 do 8 M mola mocznika lub 4 do 6 M guanidyny HC1, a zwłaszcza około 8 M mocznika lub około 6M guanidyny HC1).

Przykłady detergentów, które mogą być użyte, by rozcieńczyć solubilizowaną proteinę porynową grupy B obejmują lecz się do niej nie ograniczają detergenty jonowe takie jak SDS i cetavlon °Calbiochem); detergenty niejonowe, takie jak Tween, Triton X, Brij 35 oraz glukozyd oktylu, oraz detergenty - jony obojnacze, takie jak 3,14-Zwittergent, empigen BB i Champs.

Ostatecznie, solubilizowana proteinę porynową meningokokową grupy B błony zewnętrznej można oczyścić za pomocą filtracji żelowej, by oddzielić substancje o wysokim i niskim ciężarze cząsteczkowym. Rodzaje filtracji żelowej obejmują lecz nie są ograniczone do: Sephacryl-300, Sepharose CL-6B i Bio-Gel A-l,5 m. Kolumnę wymyto buforem stosowanym do rozcieńczenia solubilizowanej proteiny. Frakcje zawierające porynę lub jej fuzję można następnie było zidentyfikować przez elektroforezę żelową. Frakcje zebrano, dializowano i zatężono.

Ostatecznie, zasadniczo czystą (> 95%) proteinę porynową i proteinę fuzyjną można otrzymać przez przepuszczenie zatężonych frakcji przez wysokosprawną kolumnę Q Sepharose.

W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy ekspresji genu proteiny porynowej meningokokowej grupy B, który jest częścią wektorą który obejmuje promotor T7, który jest indukowalny. Jeśli promotor jest promotorem indukowalnym, szybkość transkrypcji wzrasta w odpowiedzi na czynnik indukujący. Promotor T7 jest indukowalny przez dodanie do ośrodka hodowli α-D-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG). Alternatywnie, można zastosować promotor Tac lub promotor wstrząsu cieplnego.

Korzystnie, gen proteiny porynowej meningokokowej grupy B jest ekspresjonowany z wektora ekspresji pET-17 lub wektora ekspresji pET-llą które to obydwa zawierają promotor T7.

Klonowanie genu proteiny porynowej meningokokowej grupy B lub genu fuzyjnego do wektora ekspresji można wykonać według konwencjonalnych technik, włączając w to: zakończone tępe i chwiejne końce do ligacji, trawienie enzymem restrykcyjnym, by uzyskać odpowiednie końce, odpowiednie wypełnianie kohezyjnych końców, działanie fosfatazą alkaliczną dla uniknięcia niepożądanego łączenia i ligację przy użyciu odpowiednich ligaz.

182 573

Odpowiednim odsyłaczem literaturowym odnośnie ogólnych metod klonowania jest: Sambrook i in., Molecular Cloning: A laboratory Manuał, 2nd ed., Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Proteinę porynową meningokokową grupy B i proteinę fuzyjną ekspresjonowane według niniejszego wynalazku należy odpowiednio ponownie pofałdować, aby uzyskać strukturę, która jest immunologicznie charakterystyczna dla rodzimej proteiny. W jeszcze innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ponownego pofałdowania wyżej opisanej proteiny błony zewnętrznej i proteiny fuzyjnej obejmującego: poddanie lizie transformowane E. coli, by uwolnić proteinę porynową meningokokową grupy B lub proteinę fuzyjną jako część nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych; przemywanie ciał buforem, by usunąć zanieczyszczające proteiny komórkowe E. coli', powtórne utworzone zawiesiny i rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w roztworze wodnym środka denaturującego; rozcieńczenie otrzymanego roztworu w detergencie; oraz oczyszczenie solubilizowanej proteiny porynowej meningokokowej grupy B lub proteiny fuzyjnej przez filtrację żelową, by uzyskać w eluencie ponownie pofałdowaną proteinę. Nieoczekiwanie odkryto, że pofałdowane trimerowe proteiny porynowe meningokokowej grupy B klasy 2 i klasy 3 oraz proteiny fuzyjne otrzymuje się bezpośrednio w eluencie z kolumny filtracji żelowej.

W innym korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy zasadniczo czystej ponownie pofałdowanej proteiny porynowej meningokokowej grupy B błony zewnętrznej i proteiny fuzyjnej wytworzonych według wyżej opisanych sposobów. Zasadniczo czysta proteina jest proteiną, w której zasadniczo nie ma innych komórkowych składników Neisseria meningitidis jak wykazano przez np. elektroforezę. Takie zasadniczo czyste proteiny mają czystość > 95%, jak zmierzono przez densytometrię na żelu elektroforetycznym po wy barwieniu błękitnym lub srebrem Coomassie. Następujące przykłady mają charakter ilustracyjny, lecz nie ograniczający, dla sposobu i kompozycji według niniejszego wynalazku. Inne odpowiednie modyfikacje i adaptacje rozmaitych stanów i parametrów normalnie spotykanych w tej dziedzinie techniki, które są oczywiste dla specjalistów z dziedziny techniki mieszczą się w ramach ducha i zakresu niniejszego wynalazku.

Przykład 1. Klonowanie proteiny porynowej klasy 3 z Neisseria meningitidis grupy B.

Materiały i metody

Organizmy: Szczep 8765 Neisseria meningitidis grupy B (B:15:P1, 3) otrzymano od dra Wendella Zollingera (Walter Reed Army Institute for Research) i wyhodowano na ośrodku agarowym uprzednio opisanym (Swanson J.L. Infect. Immun. 21:292-302 (1978)) w „candle extinction jar” w inkubatorze utrzymywanym w 30°C. Szczepy Escherischia coli DME558 (ze zbioru S. Bensona; Silhavy T. J. i in., „Experiments with Gene Fusions”, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y 1984), BRE51 (Bremer E. i in., FEMS Microbiol. Lett. 33:173-178 (1986)) oraz BL21(DE3) wyhodowano na płytkach agarowych LB w 37°C.

Transdukcja Pl: Lizat Pl vir szczepu E. coli DME558 zastosowano do transdukowania markera odporności na tetracyklinę do szczepu BRE51 (Bremer E., in., FEMS Microbiol. Lett. 33:173-178 (1986)), w którym cały gen ompA deletowano (Silhavy T. J. i in., Experiments with Gene Fusionds, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)). Szczep DME558, zawierający marker odporności na tetracyklinę w bezpośredniej bliskości z genem ompA, wyhodowano na ośrodku LB dopóki nie osiągnięto gęstości w przybliżeniu 0,6 OD przy 600 nm. Do 10 ml hodowli dodano jedną dziesiątą mililitra 0,5 M CaCl₂ i 0,1 ml roztworu zawierającego 1 x 109 PFU p 1 vir. Hodowlę inkubowano przez 3 h w 37°C. Po tym okresie czasu, gęstość komórki bakteryjnej widocznie się zmniejszyła. Dodano 0,5 ml chloroformu i hodowlę fagu przechowywano w 4°C. Ponieważ w typowym przypadku 1-2% chromosomu E. coli można upakować w każdym fagu, liczba wytworzonych fagów pokrywa cały chromosom gospodarza bakterii, włączając w to marker odporności na tetracyklinę blisko genu ompA.

182 573

Następnie szczep BRE51, w którym brak było genu ompA, wyhodowano przez noc w ośrodku LB w 37°C. Hodowlę prowadzoną przez noc rozcieńczono w stosunku 1:50 świeżym LB i hodowano przez 2 h. Komórki usunięto przez odwirowanie i powtórnie utworzono zawiesinę w solach MC. 0,1 ml komórek bakteryjnych zmieszano z 0,05 lizatu fagu opisanego powyżej i inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej. Następnie dodano równą objętość IM cytrynianu sodu i komórki bakteryjne wypłytkowano na płytkach LB zawierających 12,5 μg/ml tetracykliny. Płytki inkubowano przez noc w 37°C. Transduktanty odporne na tetracyklinę (12 μg/ml) skrinowano na brak ekspresji proteiny OmpA za pomocą analizy Western biot i SDS-PAGE, jak opisano poniżej. Bakterie odporne na antybiotyk mają gen odporności na tetracyklinę wintegrowany w chromosom bardzo blisko miejsca, gdzie gen ompA deletowano z tego szczepu. Jeden szczególny szczep określono BRE-TR.

Drugą serię wytwarzania fagu wykonano przy użyciu szczepu BRE-TR stosując ten sam sposób co wyżej opisany. Reprezentanci tej populacji fagu zawierają zarówno gen odporności na tetracyklinę i delecję OmpA. Te fagi następnie zebrano i przechowywano. Te fagi następnie użyto do infekowania E. coli BL21(DE3). Po infekcji bakterie zawierają marker odporności na tetracyklinę. Ponadto istnieje duże prawdopodobieństwo, że delecję OmpA wybrano na płytkach LB zawierających tetracyklinę.

Kolonie bakterii, które rosły na płytkach wyhodowano oddzielnie w ośrodki LB i zbadano na obecność proteiny OmpA. Z tych kolonii wybranych do badania, u wszystkich brakowało proteiny OmpA jak stwierdzono na podstawie reaktywności przeciwciała według SDS-PAGE Western biot.

SDS-PAGE i Western Biot: SDS-PAGE było odmianą metody Laemmli (Laemmli, U.K., Naturę 227:680-685 (1970) jak opisano uprzednio (Blake, Gotschlich, J. Exp. Med. 159:452-462 (1984)). Przeniesienie elektroforetyczne do Immobilonu P (Millipore Corp, MA) wykonano według metod Towbina i in., (Towbin, H., i in., Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 (1979)) z wyjątkiem tego, że bibułę najpierw zwilżono w metanolu. Próby Western biot wykonano przy użyciu reagentów skoniugowanych z fosfatazą (Blake M.S., i in., Analyt. Biochem. 136:175-179 (1984)).

Reakcja łańcuchowa polimerazy: Zastosowano metodę opisaną przez Feaversa i in., (Feavers I.M. i in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)) dla wzmocnienia genu kodującego PorB. Primery wybrane były primerami 33 (SeQ ID NO. 11) (GGG GTA GAT CTG CAG GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GCA GGC GT) i 34 (SEQ ID NO. 12) (GGG GGG GTG ACC CTC GAG TTA GAA TTT GTG ACG CAG ACC AAC) jak uprzednio opisano (Feavers I.M., i in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)). Ujmując to w skrócie, składniki reakcji były jak następuje: chromosomowy DNA meningokokowego szczepu 8765 (100 ng/μΐ), 1 μΐ; primery 5' i 3' (1 μΜ) po 2 μΐ; dNTP (roztwór 10 mM), po 4 μΐ; 10 X bufor reakcji PCR (100 mM Tris HC1, 500 mM KC1, pH 8,3), 10 μΐ; 25 mM MgĆl₂, 6 μΐ; podwójnie destylowane H₂O, 62 μΐ; oraz polimeraza Taq °Cetus Corp., 5υ/μ1), 1 μΐ. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze genetycznym GTC-2 (Precision Inst. Inc., Chicago, IL) podłączony z układem chłodzącym Lauda 4/K metanol/woda (Brinkman Instruments, Inc., Westbury, NY) ustawiono w 0°C. Termocykler zaprogramowano na cykl 30-krotny przez 94°C, 2 min; 40°C, 2 min; i 72°C, 3 min. Przy końcu tych 30 cykli, reakcję przedłużono w 72°C przez 3 min i ostatecznie utrzymywano w 4°C do gotowości do analizy na 1% żelu agarozowym w buforze TAE jak opisał Maniatis (Maniatis, T. i in., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Subklonowanie produktu PCR: Plazmid pET-17b (Novagen, Inc.) użyto do subklonowania i wytworzono przez podwójne wytrawianie plazmidu endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Xhol (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Wytrawione końce następnie defosforylowano przy użyciu fosfatazy alkalicznej z jelit jagnięcia (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Wytrawiony plazmid następnie zanalizowano na 1% żelu agarozowym, usunięto pocięty plazmid i oczyszczono przy użyciu zestawu GeneClean (BiolOl, La Jolla, CA). Produkt PCR wytworzono przez ekstrakcję fenolem-chloroformem, chloroformem i ostatecznie

182 573 oczyszczono przy użyciu GeneClean Kit (BiolOl). Produkt PCR wytrawiono endonukleazami restrykcyjnymi BgUI i Xhol (New England Biolab, Inc.). Następnie DNA wyekstrahowano fenolem-chloroformem, wytrącono przez dodanie 0,1 objętości 3M octanu sodu, 5 μΐ glikogenu (20 pg/μί), i 2,5 objętości etanolu. Po przemywaniu DNA 70% etanolem (obj./obj/), rozpuszczono je ponownie w buforze TE. Wytrawiony produkt PCR ligowano do podwójnie wytrawionego plazmidu pET-17b opisanego powyżej przy użyciu procedury standardowej ligazy T4 przez noc w 16°C (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1993)). Produkt ligacji następnie transformowano do opisanego powyżej BL21 (DE3)AompA, który uczyniono kompetentnym metodą Chunga i in., °Chung C.T., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2172-2175 (1989)). Transfbrmanty poddano selekcji na płytkach LB zawierających 50 pg/ml karbenicyliny i 12 pg/ml tetracykliny. Wybrano kilka transformant, hodowano przez 6 h w 30°C w LB zawierającym karbenicylinę i tetracyklinę, i ekspresję genu plazmidu indukowano przez dodanie IPTG. Temperaturę podniesiono do 37°C i hodowle kontynuowano przez dodatkowe 2 h. Komórki każdej hodowli zebrano przez odwirowanie, przygotowano lizaty całych komórek i zanalizowano przez SDS-PAGE i Western Biot przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (4D11), które reaguje z porynami dwoinek gram-ujemnych.

Analiza sekwencji nukleotydowej: Sekwencje nukleotydowe DNA klonowanego genu poryny klasy 3 określono metodą dideoksy przy użyciu zdenaturowanego dwuniciowego DNA plazmidu jako szablonu jak opisano w: “Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1993)). Zastosowano zestawy Seąuenase II (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) zgodnie z wytycznymi producenta. Trzy zsyntetyzowane primery oligonukleotydowe (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) użyto do tych reakcji. Jeden dla końca 5' (SEQ ID NO. 13), który składał się z 5' TCACGCTTGGTACCGAGCTC i dwa dla końca 3' (SEQ ID NO. 14) 5' TTTGTTAGCAGGCCGGATCTG (SEQ ID NO. 15) oraz 5' CTCAAGACCCGTTTAGAGGCC. Nakładające, zagnieżdżone delecje wykonano przez zlinearyzowanie DNA plazmidu za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Bpu 11021, a końce tępe przez dodanie Tio-dNTP i polimerazy Klenowa “Curent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1993)). Zlinearyzowany plazmid następnie rozszczepiono endonukleazą restrykcyjną Xholi i zastosowano zestaw do delecji exoll/nukleaza Mung bean do wykonania delecji 3' plazmidu (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) według instrukcji dostawcy. Mapę tej strategii podano na fig. 1.

Ekspresja i oczyszczenia produktu genu PorB: Przy użyciu końcówki sterylnej mikropipety, pojedynczą kolonię BL21 (DE3)-AomA zawierającego plazmid PorB-pET-17b wybrano i zaszczepiono do 10 ml bulionu LB zawierającego 50 pg/ml karbenicyliny. Hodowlę inkubowano przez noc w 30°C wstrząsając. Następnie 10 ml hodowli prowadzonej przez noc dodano sterylnie do 1 litra bulionu LB o tym samym stężeniu karbenicyliny i hodowlę kontynuowano w wytrząsanym inkubatorze w 37°C dopóki OD600 nie osiągnęło 0,6-1,0. Trzy ml roztworu macierzystego IPTG (100 mM) dodano do hodowli i hodowlę inkubowano przez dodatkowe 30 min. Następnie dodano rifampicynę (5,88 ml roztworu macierzystego; 34 mg/ml w metanolu) i hodowle kontynuowano przez dodatkowe 2 h. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 10000 obr./min w rotorze GS3 przez 10 min i zważono. Komórki starannie ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 3 ml bufora TEN (50 mM Tris HC1, 1 mM Tris HC1, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8,0) na gram mokrego ciężaru komórek. Do tego dodano 8 μΐ roztworu macierzystego PMSF (50 mM w bezwodnym metanolu) i 80 μΐ roztworu macierzystego lisozymu (10 mg/ml w wodzie) na gram mokrego ciężaru komórek. Tę mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 min. Podczas mieszania, dodano 4 mg deoksycholanu na gram mokrego ciężaru komórek. Mieszaninę umieszczono w łaźni wodnej 37°C i mieszano bagietką. Gdy mieszanina stała się lepka, dodano 20 μΐ roztworu macierzystego DNazy 1(1 mg/ml) na gram mokrego ciężaru komórek. Następnie mieszaninę usunięto z łaźni wodnej i pozostawiono w temperaturze pokojowej dopóki roztwór nie był już lepki. Następnie mieszaninę odwirowano przy 15000 obr./min w rotorze SS-34 przez 20 min w 40°C.

182 573

Osad zatrzymano i starannie przemyto dwukrotnie buforem TEN. Następnie osad ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w świeżo przyrządzonym buforze TEN zawierającym 0,1 mM PMSF i 8 M mocznika oraz sonizowano w sonizatorze łaźniowym (Het Systems Inc., Plainview., NY). Stężenie proteiny określono przy użyciu zestawu BCA (Pierce, Rockville, IL), a stężenie protein doprowadzono do mniej niż 10 mg/ml przy użyciu bufora TEN-mocznik. Następnie próbkę rozcieńczono 1:1 przy użyciu 10% (wag./obj.) Zwittergent 3,14 °CalBiochem, La Jolla, CA), sonikowano i załadowano na kolumnę Sephacryl S-300 z sitami molekularnymi. Kolumnę Sephacryl S-300 (2,5 cm x 200 cm) uprzednio zrównoważono przy użyciu 100 mM Tris HC1, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,05% Zwittergent 3,14 oraz 0,02% azydków, pH = 8,0; Szybkość przepływu przez kolumnę doprowadzono do 8 ml/h i zebrano frakcje 10 ml. OD280 każdej frakcji zmierzono i wykonano analizę SDS-PAGE wykonaną na frakcjach zawierających proteinę.

Próby inhibitowania ELISA: Płytki do mikromiareczkowania (Nunc Immuno Platę IIF, Nunc, Inc., Naperville, IL) sensytyzowano przez dodanie 0,1 ml na zagłębienie porB (2 mg/ml) oczyszczonego ze szczepu dzikiego typu 8765, w 0,1 M buforze węglanowym, pH 9,6 z 0,02% azydku. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto pięciokrotnie przy użyciu 0,9% NaCl, 0,05% Brij 35, 10 mM octanu sodowego pH 7,0, 0,02% azydku. Łudzicie surowice immunizowane wyhodowane na proteinie PorB klasy 3 typu 15 otrzymano od dr Phillipa O. Livingstona, Memorial-Sloan Kettering Cancer Center, New York, N.Y

Ludzkie surowice immunizowane rozcieńczono w PBS 0,5% Brij 35 i dodano do płytki i inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie umyto jak poprzednio i wtórne przeciwciało, przeciw- ludzkie skoniugowane z fosfatazą alkaliczną IgG z organizmu kozy (Tago Inc., Burlingame, CA), rozcieńczono w PBS-Brij, dodano do płytek i inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto jak poprzednio i dodano fosforan p-nitrofenylu (Sigma Phosphatase Substrate 104) (1 mg/ml) w 0,1 dietanoloaminy, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂,0,02% azydku, pH 9,8. Płytki inkubowano w 37°C przez 1 h i określono absorbancję przy 405 nm przy użyciu czytnika płytek do mikromiareczkowania (Physica, New York, NY). W zagłębieniach kontrolnych brakowało przeciwciała pierwotnego i/lub wtórnego.

Wykonano to, by otrzymać miano dla każdej ludzkiej surowicy, która dałaby odczyt pół-maksymalny w próbie ELISA. To miano dla każdej surowicy ludzkiej byłoby użyte przy inhibitowaniu ELISA. Płytka do mikromiareczkowania byłaby sensytyzowana oczyszczoną dzikiego typu proteiną PorB i przemyta jak poprzednio. W oddzielnej płytce do mikromiareczkowania (polipropylen V-96) (Nunc. Inc.), dodawano zmieniające się ilości oczyszczonej dzikiego typu proteiny PorB bądź oczyszczonej rekombinacyjnej proteiny PorB w całkowitej objętości 75 ml.

Surowice ludzkie rozcieńczono roztworem PBS-Brij, by podwoić ich pół-maksymalne miano i 75 ml dodano do każdego z zagłębień zawierających proteiny PorB lub rekombinacyjne PorB. Tę płytkę inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej i odwirowano w ochładzanej wirówce Sorvall RT6000, wyposażonej w nośniki płytek do mikromiareczkowania (Wilmington, DE) przy 3000 obr./min przez 10 min. Unikając dna V, wyjęto 100 ml z każdego zagłębienia i przeniesiono do sensytyzowanej i przemytej płytki do mikromiareczkowania ELISA. Płytki ELISA inkubowano przez dodatkowe 2 h, przemyto i dodano, jak przedtem, skoniugowane drugie przeciwciało. Następnie płytkę poddano obróbce i odczytano, jak opisano.

Obliczono i odczytano procent inhibitowania, jak opisano. Procent inhibitowania oblicza się następująco:

1-(wartość ELISA przy dodanej proteinie PorB lub rPor

X 100 (wartość ELISA bez dodanego porB)

182 573

Wyniki

Reakcja polimerazy łańcuchowej i subklonowanie: Opracowano sposób łatwego klonowania, manipulowania genetycznego i ewentualnie otrzymywania dosyć czystej proteiny porynowej z dowolnej liczby różnych genów poryny dwoinek gram-ujemnych dla dalszej charakteryzacji antygennej i biofizycznej. Pierwszym krokiem w kierunku tego celu było klonowanie genu poryny Neisseria. Przy użyciu techniki oryginalnie opisanej przez Feaversa i in., (Feavers I.M. i in, Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)), sekwencja DNA proteiny dojrzałej poryny z klasy 3, poryna serotypu 15 zostały wzmocnione przez użycie chromosomu meningokokowego szczepu 8765 jako szablonu dla reakcji PCR. Odpowiednie miejsca restrykcji endonukleazy zsyntetyzowano na końcach primerów oligonukelotydowych, takich, że w przypadku rozszczepienia, wzmocniona sekwencja dojrzałej poryny mogłaby być bezpośrednio związana i klonowana do wybranego plazmidu ekspresji. Po 30 cyklach, otrzymano produkty PCR pokazane na fig. 2. Ten główny produkt migrował między 900 bp oraz 1000 bp, co było zgodne z poprzednim badaniem (Feavers I.M., i in., Infect. Immun. 60:3620-3629 (1992)). Jednak nie stwierdzono produktu o wyższym ciężarze cząsteczkowym, pomimo że PCR prowadzono przy niskich wymaganiach co do odprężania (40°C; 50 mM KC1).

Aby móc wytwarzać duże ilości klonowanej proteiny porynowej, zastosowano układ ściśle kontrolowanej ekspresji (Studier i Moffatt, J. Mol. Bio. 189:113-130 (1986)), który jest dostępny handlowo przez Novagen Inc. Wzmocniony produkt PDE klonowano w miejscu BamHI-XhoI plazmidu pET-17b. Strategia ta umieszcza sekwencję DNA dla proteiny dojrzałej poryny w ramce bezpośrednio za promotorem T7, sekwencja DNA kodująca sekwencję prowadzącą 9 aminokwasów oraz 11 aminokwasów dojrzałej proteiny 0 10. Szczep E. coli Studiera BL21 lizogenny dla pochodnej lambda DE3 (Studier i Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113-130 (1986)) wybrano jako gospodarza ekspresji dla plazmidu pET-17b zawierającego gen poryny. Lecz ponieważ sądzono, że proteina OmpA pochodząca z gospodarza ekspresji E. coli, może‘mieć tendencję do współoczyszczania z ekspresjonowaną proteiną porynową meningokokową, wykonano modyfikację tego szczepu przez transdukcję PI, co wyeliminowało gen ompA z tego szczepu. Zatem po wytrawianiu endonukleazą restrykcyjną zarówno produktu PCR jak i wektora pET-17b i ligacji, produkt transformowano w BL21(DE3)-AompA i transformanty wybrano na odporność na ampicylinę i tetracyklinę. Z licznych kolonii obserwowanych na płytce do selekcji, 10 zebrano dla dalszej charakterystyki. Wszystkie dziesięć ekspresjonowanych dużych ilości proteiny, które migrowały przy przybliżonym ciężarze cząsteczkowym proteiny PorB, przy hodowli do fazy „log” indukowania IPTG. Lizaty całej komórki jednej takiej hodowli pokazano na fig. 3a. Analiza Western biot z przeciwciałem monoklonalnym 4D11 nasunęła sugestię, że proteina ekspresjonowana była proteiną PorB (fig. 3b). W przeciwieństwie do innych badań, gdy poryny dwoinek gram-ujemnych klonowano i ekspresjonowana w E. coli, komórki bakteryjne gospodarza nie wykazywały żadnych oznak efektów toksycznych i letalnych nawet po dodaniu IPTG. Komórki E. coli okazały się zdolne do życia i mogłyby być ponownie hodowane w dowolnym momencie w fazie ekspresji.

Analiza sekwencji nukleotydowej: Ilość PorB ekspresjonowanego w tych doświadczeniach była znacząco większa niż uprzednio obserwowano i okazało się, że brak niekorzystnego wpływu tej ekspresji na gospodarza E. coli. Aby się upewnić, że nie wprowadzono artefaktów PCR do meningokokowego genu poryny, by umożliwić taką wysoką ekspresję, całą fuję poryny 0 10 sekwencjonowano przez rozszerzenie dwuniciowego primera z plazmidu. Wyniki podano na fig. 4. Sekwencja nukleotydowa była identyczna z inną sekwencją genu PorB serotypu 15 meningokokowego, uprzednio podawaną przez Heckelsa i in. (Ward M.J. i in., FEMS Microbiol. Lett. 773:283-289 (1992)) z dwoma wyjątkami, które uwidoczniono. Każda z tych dwóch różnic nukleotydowych występuje w trzeciej pozycji kodonu i nie zmieniłaby sekwencji aminokwasowej ekspresjonowanej proteiny. Zatem, z sekwencji nukleotydowej nie wynikało,

182 573 że jest jakikolwiek artefakt lub mutacja PCR, które mogłyby odpowiadać za wysoką ekspresję proteiny i brak toksyczności w ramach E. coli. Ponadto, dane te sugerowałyby, że wyprodukowano prawdziwą proteinę PorB.

Oczyszczanie ekspresjonowanego produktu genu porB: Proteina PorB ekspresjonowana w E. coli była nierozpuszczalna w buforze TEN, co sugeruje, że w przypadku ekspresji, proteina PorB ukształtowała się w ciała inkluzyjne. Jednak, przemycie nierozpuszczalnej proteiny PorB buforem TEN usunęło większość protein zanieczyszczających E. coli. Proteina PorB mogła być następnie solubilizowana w świeżo w świeżo przygotowanym 8M moczniku i rozcieńczona detergentem Zwittergent 3,14. Wykonano końcowe oczyszczanie przy użyciu kolumny Sephacryl S-300 z sitami molekularnymi, która nie tylko usunęła mocznik lecz także pozostające zanieczyszczające proteiny. Większość proteiny PorB eluowała z kolumny mając pozorny ciężar cząsteczkowy trimerów podobnie jak PorB dzikiego typu. Porównawcze wzory eleucji PorB dzikiego typu i PorB ekspresjonowanego w E. coli przedstawiono na fig. 5. Należy zauważyć, że gdy stężenie proteiny PorB w 8M moczniku było w nadmiarze 10 mg/ml przed rozcieńczeniem detergentem Zwittergent, względne ilości proteiny PorB znalezionej w postaci trimerów spadły i okazały się agregatami wymywanymi przy pustej objętości. Jednak przy stężeniach proteiny poniżej 10 mg/ml w buforze mocznika, większość PorB wymywano w dokładnie takiej samej frakcji jak w przypadku PorB dzikiego typu. Przy użyciu przeciwciała monoklonalnego T7-Tag oraz analizy Western biot określono również, że 11 aminokwasów proteiny dojrzałego kapsydu T7 zachowano jako koniec amino. Całkowita wydajność proteiny porynowej meningokokowej z jednego litra E. coli wyniosła w przybliżeniu 50 mg.

Próby inhibitowania ELISA: Aby określić, czy oczyszczone trimerowe rekombinacyjne PorB ma podobną konformację antygenową w porównaniu do PorB wytworzonego w dzikiego typu meningokokowym szczepie 8765, surowice od sześciu pacjentów szczepionych dzikiego typu meningokokową proteiną PorB typu 15 użyto w próbach inhibitowania ELISA. W próbie inhibitowania, przeciwciała reaktywne wobec rodzimego PorB kompetytywnie inhibitowano różnymi ilościami oczyszczonego rekombinacyjnego PorB bądź homologicznego oczyszczonego PorB dzikiego typu. Wyniki inhibitowania homologicznym oczyszczonym PorB każdej z sześciu surowic ludzkich oraz średnie inhibitowanie tych surowic podano na fig. 6. Odpowiadające temu inhibitowanie tych surowic oczyszczonym rekombinacyjnym PorB podano na fig. 6b. Porównanie średniego inhibitowania z fig. 6 i 7 wykreślono na fig. 8. Dane sugerowałyby, że przeciwciała zawarte w surowicach tych sześciu pacjentów znalazły podobne epitopy zarówno na homologicznym oczyszczonym dzikiego typu PorB jak i na oczyszczonym rekombinacyjnym PorB. To dostarczyło dalszego dowodu, na to, że rekombinacyjny PorB odzyskał większość o ile nie wszystko ze swojej rodzimej konformacji stwierdzonej w dzikiego typu PorB.

Przykład 2. Klonowanie poryny klasy 2 ze szczepu BNCV M986 Neisseria meningitidis grupy B

Genomowe DNA wyodrębniono z około 0,5 g szczepu BNCV M986 Neisseria meningitidis grupy B (serotyp 2a) przy użyciu uprzednio opisanych metod (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał 2nd ed., Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). To DNA służyło za szablon dla dwóch szczególnych oligonukleotydów porynowych klasy 2 w standardowej reakcji PCR. Te oligonukleotydy pomyślano jako komplementarne do obszarów flank 5' oraz 3' i by zawierały miejsca restrykcyjne EcoRl dla ułatwienia klonowania fragmentu. Sekwencje oligonukleotydów były następujące: (SEQ ID NO. 16): 5' AGC GGC TTG GAA TTC CCG GCT GGC TTA AAT TTC 3' (SEQ ID NO. 17) oraz 5' CAA ACG AAT GAA TTC AAA TAA AAA AGC CTG 3'. Następnie wykorzystano reakcję łańcuchową polimerazy, by otrzymać porynę klasy 2. Warunki reakcji były następujące: Genomowy DNA BNCV M986 20 ng, dwa primery oligonukleotydowe opisane powyżej po 1 mM każdy, 200 mM każdego z dNTP, buforu reakcyjnego PCR (10 mM Tris HC1, 50 mM KC1, pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂ oraz 2,5 jednostki polimerazy Taq, uzupełnione do 100 ml wodą destylowaną. Następnie tę mieszaninę reakcyjną poddano 25 cyklom 95°C przez 1 min,

182 573

50°C przez 2 min i 72°C przez 1,5 min. Przy końcu okresu pracy cyklicznej, mieszaninę reakcyjną załadowano na 1% żel agarozowy i materiał elektroforezowano przez 2 h, po czym usunięto pasmo przy 1,3 kb i DNA odzyskano przy użyciu zestawu Gene Clean (Bio 101). Następnie DNA wytrawiano EcoRO, powtórnie oczyszczono i poddano ligacji do EcoRI wytrawionego pUC19 przy użyciu ligazy DNA T4. Mieszaninę ligacyjnąużyto do transformacji kompetentnego DH5a E. coli. Rekombinacyjne plazmidy wyselekcjonowano i sekwencjonowano. Stwierdzono, że insert miał sekwencję konsystentną z sekwencją poryny klasy 2. Zob. Murakami K. i in., Infect. Immun. 57:2318-2323 (1989).

Plazmid pET-17b (Novagen) użyto do ekspresji poryny klasy 2. Jak opisano poniżej, skonstruowano dwa plazmidy, które dostarczyły dwie różne proteiny. Jeden plazmid był pomyślany do wytworzenia dojrzałej poryny klasy 2, podczas gdy drugi plazmid - do wytworzenia poryny klasy 2 po jej fuzji do 20 aminokwasów z proteiny kapsydu 0 10 genu T7.

Konstruowanie dojrzałej poryny klasy 2

Dojrzałą porynę klasy 2 skonstruowano przez wzmocnienie konstruktu poryny klasy 2 pUC19 przy użyciu oligonukleotydów (SEQ ID NO. 18) 5' CCT GTT GCA GCA CAT ATG GAC GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GC 3' oraz (SEQ ID NO. 19). 5' CGA CAG GCT TTT TCT CGA GAC CAA TCT TTT CAG 3'. Strategia ta umożliwiła klonowanie wzmocnionej poryny klasy 2 w miejscach Ndel i Xhol plazmidu pET-17b, wytwarzając w ten sposób dojrzałą porynę klasy 2. Przeprowadzono standardowe PCR przy użyciu klasy 2 pUC19 jako szablonu oraz dwóch opisanych wyżej oligonukleotydów. Ta reakcja PCR dała produkt ol,l kb (analiza na 1,0% żelu agarozowym). DNA otrzymane z reakcji PCR oczyszczono za pomocą żelu i wytrawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i Xhol. Wytworzony DNA o 1,1 kb ponownie oczyszczono za pomocą żelu i ligowano przy użyciu ligazy T4 DNA do pET-17b wytrawionych Ndel i Xhol. Tę mieszaninę ligacyjną następnie użyto do transformowania kompetentnego DH5a E. coli. Kolonie zawierające insert 1,1 kb wybrano do dalszej analizy. DNA z klonów DH5a zanalizowano za pomocą map restrykcyjnych i sekwencjonowano węzły klonowania wybranych plazmidów. Po tej analizie, otrzymane DNA z klonów DH5a użyto do transformowania E. coli BL21(DE3)-AompA. Transformanty wyselekcjonowano do agaru LB zawierającego 100 mg/ml karbenicyliny. Kilka transformant skrinowano na ich zdolność do wytworzenia proteiny porynowej klasy 2. Dokonano tego przez hodowanie klonów w ciekłym ośrodku LB zawierającym 100 mg/ml karbenicyliny i 0,4% glukozy w 30°C do OD600 = 0,6, następnie indukując hodowle za pomocą IPTG (0,4 mM). Następnie komórki rozerwano i ekstrakt komórkowy zanalizowano za pomocą SDS-PAGE.

Przykład 3. Klonowanie i ekspresja dojrzałej poryny klasy 3 ze szczepu 8765 Neisseria meningitidis grupy B w E. coli

Genomowe DNA wyodrębniono z około 0,5 g szczepu 8765 Neisseria meningitidis przy użyciu uprzednio opisanych metod (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał 2nd ed., Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). To DNA służyło za szablon dla dwóch szczególnych oligonukleotydów porynowych klasy 3 w standardowej reakcji PCR.

Dojrzałą porynę klasy 3 skonstruowano przez wzmocnienie genomowego DNA z 8765 przy użyciu nukleotydów: (SEQ ID NO. 22) 5' GTT GCA GCA CAT ATG GAC GTT ACC CTG TAC GGC ACC 3' (SEQ ID NO. 23) oraz 5' GGG GGG ATG GAT CCA GAT TAG AAT TTG TGG CGC AGA CCG ACA CC 3'. Strategia ta umożliwiła klonowanie wzmocnionej poryny klasy 3 w miejscach Ndel i BamH plazmidu pET-24a(+), wytwarzając w ten sposób dojrzałą porynę klasy 3. Przeprowadzono standardowe PCR przy użyciu genomowego DNA wyodrębnionego z 8765 jako szablonu oraz dwóch opisanych wyżej oligonukleotydów.

Warunki reakcji były następujące: Genomowy DNA 8765 200 ng, dwa primery oligonukleotydowe opisane powyżej po 1 mM każdy, 200 mM każdego z dNTP, buforu reakcyjnego PCR (10 mM Tris HC1, 50 mM KC1, pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂ oraz 2,5 jednostki polimerazy Taq, uzupełnione do 100 ml wodą destylowaną. Następnie tę mieszaninę reakcyjną poddano 25 cyklom 95°C przez 1 min, 50°C przez 2 min i 72°C przez 1,5 min.

182 573

Ta reakcja PCR dała około 930 bp produktu (analiza na 1% żelu agarozowym). DNA otrzymane z reakcji PCR oczyszczono za pomocą żelu i wytrawiono enzymami restrykcyjnymi Ndel i BamHI. Produkt o 930 bp ponownie oczyszczono za pomocą żelu i poddano za pomocą ligazy T4 ligacji do pET-24a(+) wytrawionego Ndel i BamHI. Tę mieszaninę ligacyjną następnie użyto do transformowania kompetentnego DH5a E. coli. Kolonie zawierające insert 930 bp wybrano do dalszej analizy. DNA z klonów DH5a E. coli zanalizowano za pomocą map enzymów restrykcyjnych i sekwencjonowano węzły klonowania wybranych plazmidów. Po tej analizie, otrzymane DNA z klonów DH5a użyto do transformowania E. coli BL21(DE3) AompA. Transformanty wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 50 mg/ml kanamycyny. Kilka transformant skrinowano na ich zdolność do wytworzenia proteiny porynowej klasy 3. Dokonano tego przez hodowanie klonów w ciekłym ośrodku LB zawierającym 50 mg/ml kanamycyny i 0,4% glukozy w 30°C do OD600 = 0,6, następnie indukując hodowle za pomocą IPTG (1 mM). Następnie komórki rozerwano i ekstrakt komórkowy zanalizowano za pomocą SDS-PAGE.

Przykład 4. Oczyszczanie i powtórne fałdowanie rekombinacyjnej poryny klasy 2

Szczep E. coli BL21(DE3) AompA [pNV-5] hodowano do fazy „mid-log” (OD = 0,6 przy 600 nm) w bulionie Luria w 30°Ć. Następnie dodano IPTG (ostatecznie 0,4 mM) i komórki hodowano przez dalsze dwie godziny w 37°C. Następnie komórki zebrano i przemyto kilkoma objętościami bufora TEN (50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH = 8,0) i pastę komórkową przechowywając w stanie zamrożenia w - 75°C.

W celu oczyszczania wstępnie zważone komórki odtajano i utworzono ich zawiesinę w buforze TEN przy stosunku 1:15 (g/v). Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez rozrywacz komórek Stansted (Stansted fluid power Ltd.) przy 8000 psi. Otrzymany roztwór następnie odwirowywano przy 13000 obr./min przez 20 min i ciecz nad osadem odrzucono. Następnie osad dwukrotnie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze TEN zawierającym 0,5% deoksycholanu i ciecze nad osadem odrzucono. Następnie osad przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze TEN zawierającym 8 M demineralizowanego mocznika (klasa do elektroforezy) oraz 0,1 mM PMSF (3g/10 ml). Następnie zawiesinę sonizowano przez 10 min lub dopóki nie osiągnięto równomiernej zawiesiny. 10 ml 10% roztworu 3,14-zwittergen (Calbiochem) dodano i roztwór starannie zmieszano. Następnie roztwór ponownie sonizowano przez 10 min. Wszystkie resztkowe nierozpuszczalne substancje usunięto przez odwirowanie. Określono stężenie proteiny i stężenie proteiny doprowadzono do 2 mg/ml przy użyciu buforu 8M mocznik -10% zwittergen (stosunek 1:1).

Następnie tę mieszaninę wprowadzono na kolumnę Sephacryl S-300 (2,6 x 100 cm) zrównoważoną w 100 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM CaCl₂, 0,05% 3,14-zwittergen, 0,02% azydku sodu, pH = 8,0. Szybkość przepływu jest utrzymywana przy 1 ml/min. Zebrano frakcje po 10 ml. Poryna podczas filtracji żelowej ponownie składa się do trimeru. Dla każdej frakcji zmierzono OD = 280 nm i frakcje zawierające proteinę poddano próbie elektroforezy żelowej SDS na porynę. Frakcje zawierające porynę zebrano. Frakcje zebrane dializowano lub rozcieńczono 1:10 w 50 mM Tris HC1 pH = 8,0, 0,05% 3,14 zwittergen, 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl. Następnie otrzymany roztwór wprowadzono na wysokosprawną kolumnę Q sepharose (2,6 x 10 cm; Pharmacia) zrównoważoną w tym samym buforze. Porynę wymywano przy gradiencie liniowym 0,1 do 1 M NaCl.

Przykład 5. Oczyszczenie i fałdowanie rekombinacyjnej poryny klasy 3

Szczep E. coli BL21(DE3) AompA zawierający plazmid porB-pET-17b wyhodowano do fazy „mid-log” (OD = 0,6 przy 600 nm) w bulionie Luria w 30°C. Następnie dodano IPTG (ostatecznie 0,4 mM) i komórki hodowano przez dodatkowe dwie godziny w 37°C. Następnie komórki zebrano i przemyto kilkoma objętościami bufora TEN (50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH = 8,0) i pastę komórkową przechowując w stanie zamrożenia w -75°C. W celu oczyszczania około 3 gramy komórek odtajano i utworzono ich zawiesinę w 9 ml bufora TEN. Dodano lisozym (Sigma, 0,25 mg/ml), deoksycholan (Sigma, 1,3 mg/ml) oraz PMSF (Sigma, mg/ml), i mieszaninę delikatnie wstrząsano przez jedną godzinę w temperaturze

182 573 pokojowej. Podczas tego okresu czasu, komórki ulegają lizie i uwolniony DNA sprawia, że roztwór staje się bardzo lepki. Następnie jest dodawana DNaza (Sigma, 2 mg/ml) i roztwór ponownie jest mieszaniny przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie mieszanina jest wirowana przy 15 K obr/min w rotorze S-600 przez 30 minut, a ciecz nad osadem jest odrzucana. Następnie osad dwukrotnie przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 ml buforu TEN i ciecze nad osadem odrzucono. Osad ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 ml 8M mocznika (Pierce) w buforze TEN. Mieszaninę delikatnie mieszano, by zlikwidować zbrylenia. Następnie zawiesinę sonizowano przez 20 min lub dopóki nie osiągnięto równomiernej zawiesiny. 10 ml 10% roztworu 3,14-zwittergen (Calbiochem) dodano i roztwór starannie zmieszano. Następnie roztwór ponownie sonizowano przez 10 min. Wszystkie resztkowe nierozpuszczalne substancje usunięto przez odwirowanie. Określono stężenie proteiny i stężenie proteiny doprowadzono do 2 mg/ml przy użyciu buforu 8M mocznik - 10% zwittergen (stosunek 1:1).

Następnie tę mieszaninę wprowadzono na kolumnę Sephacryl S-300 (180 x 2,5 cm; Pharmacia) zrównoważoną w 100 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM CaCl₂, 0,05% 3,14-zwittergen, pH = 8,0. Szybkość przepływu jest utrzymywana przy 1 ml/min. Zebrano frakcje po 10 ml. Poryna podczas filtracji żelowej ponownie składa się do trimeru. Dla każdej frakcji zmierzono OD = 280 nm i frakcje zawierające proteinę poddano próbie elektroforezy żelowej SDS na porynę. Frakcje zawierające porynę zebrano.

Frakcje zebrane dializowano i zatężono 4-6 krotnie przy użyciu zatężacza Amicon z membraną PM 10 wobec buforu zawierającego 100 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,05% 3,14 zwittergen, pH = 8,0. Alternatywnie, zebrane frakcje są wytrącane przy użyciu 80% etanolu i powtórnie przeprowadzono w stan zawiesiny w wyżej wspomnianym buforze, 6 do 10 mg substancji wprowadzono następnie na kolumnę monoQ 10/10 (Pharmacia) zrównoważoną w tym samym buforze. Porynę wymywano przy gradiencie liniowym płytkim 0,1 do 0,6 M NaCl ze wzrostem 1,2% na min przez okres 50 min. Szybkość przepływu 1 ml/min. Pik zawierający porynę zebrano i dializowano wobec bufora TEN i 0,05% 3,14-zwittergen. Porynę można dalej oczyszczać inną chromatografią S-300.

Przykład 6. Oczyszczanie i modyfikacja chemiczna polisacharydów

Polisacharyd torebkowy Neisseria meningitidis grupy B, jak również z KI E. coli składa się z kwasu a(2-> 8) polisialowego (potocznie zwanego GBMP lub polisacharydem KI). Polisacharyd o wysokim ciężarze cząsteczkowym wyodrębniono z ośrodka wzrostu przez wytrącanie (zob. Frasch, C.E. „Production and Control of Neisseria meningitidis Vaccines” w: Bacterial Vaccines, Alan R. Liss, Inc., str. 123-145 (1990)) oczyszczono i zmodyfikowano chemicznie przed sprzężeniem do proteiny porynowej. Polisacharyd o wysokim ciężarze cząsteczkowym częściowo zdepolimeryzowano przy użyciu 0,1 M kwasu octowego (7 mg polisacharydu/ml), pH = 6,0 do 6,5 (70°C, 3 h), uzyskując polisacharyd o średnim ciężarze cząsteczkowym 12000-16000. Po oczyszczeniu chromatografią kolumnową z filtracją żelową (Superdex 200 prep grade, Pharmacia), polisacharyd N-deacetylowano w obecności NaBH4, a następnie N-propionylowano, jak opisali Jennings i in. (J. Immunol. 137:1808 (1986)), uzyskując N-Pr GBMP. Działanie NaIO4, następnie oczyszczanie na kolumnie z filtracją żelową dało utleniony N-Pr GBMP o średnim ciężarze cząsteczkowym 12000 daltonów.

Przykład 7. Sprzęganie utlenionego N-Pr GBMP z proteiną porynową meningokokową klasy 3 grupy Β (PP)

Utleniony N-Pr GBMP (9,5 mg) dodano do oczyszczonej proteiny purynowej klasy 3 (3,4 mg) rozpuszczonej w 0,21 ml 0,2 M buforu fosforanowego (pH 7,5), który również zawierał 10% glukozydu oktylu. Po rozpuszczeniu polisacharydu, dodano cyjanoborowodorek sodu (7 mg) i inkubowano roztwór reakcyjny w 37°C przez 4 dni. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono roztworem 0,15 M chlorku sodu zawierającym 0,01% timerosalu i rozdzielono za pomocą chromatografii kolumnowej z filtracją żelową przy użyciu Superdex 200 PG. Koniugat (N-Pr GBMP-PP) otrzymano jako pojedynczy pik wymywany blisko pustej objętości. Analiza roztworu koniugatu dla kwasu sialowego i proteiny wykazała, że koniugat składa się

182 573 w 43% wag. z polisacharydu. Proteinę porynową odzyskano w koniugacie z wydajnością 44%, a polisacharyd z wydajnością 12%. Odzyskiwanie protein w różnych doświadczeniach mieści się w zakresie 50-80%, polisacharydu - w zakresie 9-13%.

Przykład 8. Badania immunogenności

Immunogenności koniugatu N-Pr GBMP-PP oraz koniugatu N-Pr GBMP-toksoid tężca (N-Pr GBMP-TT), który wytworzono za pomocą podobnej procedury sprzęgania, badano u myszy (samic) Swiss Webster CFW 4-6 tygodniowych. Koniugat polisacharydu (2 mg) podano w dniach 1, 14 i 28 i surowice zebrano w dniu 38. Koniugaty podawano jako roztwory soli, zaadsorbowane na wodorotlenku glinu, lub zmieszane z tyrozyną stearylową. Miana ELISA surowic względem antygenu polisacharydu i miana bakteriobójcze względem N. meningitidis grupy B zestawiono w tabeli 1. Po opisaniu w pełni tego wynalazku, będzie obecnie zrozumiane przez specjalistów, że to samo można wykonać w ramach szerokiego i równoważnego zakresu warunków, receptur i innych parametrów bez wpływania na zakres wynalazku lub dowolnego z jego wykonań. Wszystkie patenty i publikacje cytowane w niniejszym zgłoszeniu są w pełni załączone do niniejszego tekstu jako odsyłacze.

Tabela 1

Miana ELISA i Bakteriobójcze grupy B Meningokokowej szczepionek w postaci koniugatów (A-Pr GBMP-Protein)

Szczepionka	Substancja pomocnicza	Miano ELISA	Miano bakteriobójcze
Ύ-Ρτ GBMP-TT	Roztwór soli	5 400	0
A1(OH)₃	13 000	0
ST¹	17 000	0
CFA²	40 000	800
?/-Pr GBMP-PP	Roztwór soli	20 000	500
Roztwór soli	22 000	150
Roztwór soli	39 000	960
A1(OH)₃	93 000	200
Al(OHh	160 000	>3 200
A1(OH)₃	130 000	1 200
ST	53 000	1 000
ST	29 000	1 700
ST	72	1 500
A-Pr GBMP	Roztwór soli	>100	0
Al (OH)j	>100	0
ST	>100	0
PP	Roztwór soli	>100	0
A1(OH)₃	>100	0
ST	660	0

'ST = Stearylo Tyrozyna ²CFA = Kompletny Adjuwant Freunda

182 573

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: The Rockefeller University

1230 York Avenue

New York, New York 10021 Stany Zjednoczone Ameryki

North American Vaccine, Inc.

12103 Indian Creek Court

Beltsville, Maryland 20705

Stany Zjednoczone Ameryki

WYNALAZCY: Blake, Milan B.

Tai, Joseph Y.

Qi, Huilin L.

Liang, Shu-Mei

Hronowski, Lucjan J.J.

Pullen, Jeffrey K.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Ekspresja wysokiego poziomu, oczyszczanie i ponowne fałdowanie protein porynowych grupy B błony zewnętrznej Neisseria meningitidis.

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 23 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRES: Sterne, Kesller, Goldstein & Fox (B) ULICA: 1100 New York Ave„ Suitę 600 (C) MIASTO: WASZYNGTON (D) STAN: D.C.

(E) KRAJ: USA (F) KOD: 20005-3934 (v) FORMA CZYTELNA KOMPUTEROWO:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent Release # 1.o, Wersja #1.25 (vi) DANE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

182 573 (A) NUMER ZGŁOSZENIA: zostanie przypisany (B) DATA ZGŁOSZENIA: w załączeniu (C) KLASYFIKACJA:

(Vii) DANE ZGŁOSZENIA Z PIERSZEŃSTWEM:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA.: US 08/096, 182 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 23 lipca 1993 (viii) ADWOKAT/AGENT INFORMACYJNY:

(A) NAZWISKO: Esmond, Robert W.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 32,893 (C) REFERENCJE/NUMER AKT: 1438.006PC00 (ix)INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (202) 371 - 2600 (B) TELEFAX: (202) 371 - 2540 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEO ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 930 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: obie (ix) WŁAŚCIWOŚCI:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 1.930 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR: 1:

182 573

TTG TAC GGT ACA ATT AAA GCA GGC GTA GAA ACT TCC CGC TCT GTA TTT4 8

Leu Tyr Gly Thr Ile Lys Ala Gly Val Glu Thr Ser Arg Ser ValPhe

1015

CAC CAG AAC GGC CAA GTT ACT GAA GTT ACA ACC GCT ACC GGC ATC GTT96

His Gin Asn Gly Gin Val Thr Glu Val Thr Thr Ala Thr Gly IleVal

2530

GAT TTG GGT TCG AAA ATC GGC TTC AAA GGC CAA GAA GAC CTC GGT AAC144

Abd Leu Gly Ser Lys Ile Gly Phe Lys Gly Gin Glu Aap Leu GlyAan * 35 4045

GGC CTG AAA GCC ATT TGO CAG GTT GAG CAA AAA GCA TCT ATC GCC GGT192

Gly Lau Lys Ala Ile Trp Gin Val Glu Gin Lys Ala Ser Ile AlaGly

5560

ACT GAC TCC GGT TGG GGC AAC CGC CAA TCC TTC ATC GGC TTG AAA GGC24 0

Thr Asp Ser Gly Trp Gly Aan Arg Gin Ser Phe Ile Gly Leu LysGly

70 7580

GGC TTC GGT AAA TTG CGC GTC GGT CGT TTG AAC AGC GTC CTG AAA GAC288

Gly Phe Gly Lys Leu Arg Val Gly Arg Leu Asn Ser Val Leu LysAsp

9095

ACC GGC GAC ATC AAT CCT TGG GAT AGC AAA AGC GAC TAT TTG GGT GTA33 6

Thr Gly Asp Ile Asn Pro Trp Asp Ser Lys Ser Asp Tyr Leu GlyVal

100 105110

AAC AAA ATT GCC GAA CCC GAG GCA CGC CTC ATT TCC GTA CGC TAC GAT3 64

Asn Lys Ile Ala Glu Pro Glu Ala Arg Leu Ile Ser Val Arg TyrΑβρ

115 120125

TCT CCC GAA TTT GCC GGC CTC AGC GGC AGC GTA CAA TAC GCG CTT AAC43 2

Ser Pro Glu Phe Ala Gly Leu Ser Gly Ser Val Gin Tyr Ala LeuAan

130 135140

GAC AAT GCA GGC AGA CAT AAC AGC GAA TCT TAC CAC GCC GGC TTC AAC480

Asp Asn Ala Gly Arg His Asn Ser Glu Ser Tyr His Ala Gly PheAsn

145 150 15S160

TAC AAA AAC GGT GGC TTC TTC GTG CAA TAT GGC GGT GCC TAT AAA AGA52 8

Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val Gin Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys Arg

165 170175

CAT CAT CAA GTG CAA GAG GGC TTG AAT ATT GAG AAA TAC CAG ATT CAC576

His His Gin Val Gin Glu Gly Leu Asn Ile Glu Lys Tyr Gin Ile His

180 185190

CGT TTG GTC AGC GGT TAC GAC AAT GAT GCC CTG TAC GCT TCC GTA GCC624

Arg Leu Val Ser Gly Tyr Asp Asn Asp Ala Leu Tyr Ala Ser Val Ala

195 200205

GTA CAG CAA CAA GAC GCG AAA CTG ACT GAT GCT TCC AAT TCG CAC AAC672

Val Gin Gin Gin Asp Ala Lys Leu Thr Αβρ Ala Ser Asn Ser His Asn

210 215220

TCT CAA ACC GAA GTT GCC GCT ACC TTG GCA TAC CGC TTC GGC AAC GTA720

Ser Gin Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg Phe Gly Asn Val

225 230 235240

ACG CCC CGA GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GGT TTG GTT GAT GAT768

Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Łya Gly Leu Val Asp Asp

245 250255

GCA GAC ATA GGC AAC GAA TAC GAC CAA GTG GTT GTC GGT GCG GAA TAC816

Ala Asp Ile Gly Asn Glu Tyr Asp Gin Val Val Val Gly Ala Glu Tyr

260 265270

182 573

GAC Asp

TTC Phe

TCC Ser 275

AAA CGC ACT

TCT GCC TTG GTT

TCT GCC GGT TGG

TTG Leu

CAA Gin

864

Lys Arg

Thr

Ser Ala 280

Leu

Val

ser Ala

Gly 285

Trp

GAA

GGC

AAA

GGC

GAA

AAC

AAA

TTC

GTA

GCG

ACT

GCC

GGC

GGT

GTT

GGT

912

G1U

Gly

Lys

Gly

Glu

Aen

Lys

Phe

Val

Ala

Thr

Ala

Gly

Val

Gly

290

295

300

930

CTG CGT CAC AAA TTC TAA

Leu Arg His Lys Phe 305 310 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NR: 2 :

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 309 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS.SEKWENCJI: SEQ ID NR:2:

Val Glu Thr Ser Arg ser Val phe 10 15

Val Thr Thr Ala Thr Gly Ile Val 25 30

Lys Gly Gin Glu Asp Leu Gly Asn 45

Glu Gin Lys Ala Ser Ile Ala Gly 60

Gin Ser Phe Ile Gly Leu Lys Gly 7580

Arg Leu Asn Ser Val Leu Lys Asp 9095

Ser Lys Ser Asp Tyr Leu Gly Val 105110

Arg Leu Ile Ser Val Arg Tyr Asp 125

Gly Ser Val Gin Tyr Ala Leu Asn 14 0

Glu Ser Tyr His Ala Gly Phe Asn 155160

Gin Tyr Gly Gly Ala Tyr Lys Arg 170175

Asn Ile Glu Lys Tyr Gin Ile His 185190

Asp Ala Leu Tyr Ala Ser Val Ala 205

Leu Tyr Gly Thr Ile Lys Ala Gly 15

His Gin Asn Gly Gin val Thr Glu 20

Asp Leu Gly Ser Lys Ile Gly Phe 3540

Gly Leu Lys Ala Ile Trp Gin Val 5055

Thr Asp Ser Gly Trp Gly Asn Arg €570

Gly Phe Gly Lys Leu Arg Val Gly 85

Thr Gly Asp Ile Asn Pro Trp Asp 100

Asn Lys Ile Ala Glu Pro Glu Ala 11S120 ser Pro Glu Phe Ala Gly Leu Ser 130135

Asp Asn Ala Gly Arg His Asn Ser 145150

Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Val 165

His His Gin Val Gin Glu Gly Leu 180

Arg Leu Val Ser Gly Tyr Asp Asn 195 200 val Gin Gin Gin Asp Ala Lys Leu Thr Asp Ala Ser Asn Ser His Asn 210 215 220

182 573

Ser Gin Thr Glu Val Ala Ala Thr Leu Ala Tyr Arg Phe Gly AsnVal

225 230 23S240

Thr Pro Arg Val ser Tyr Ala His Gly Phe Lys Gly.Leu Val AspAsp

245 250255

Ala Asp Ile Gly Asn Glu Tyr Aap Gin Val Val Val Gly Ala Glu Tyr 260 265270

Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Leu Val Ser Ala Gly Trp Leu Gin 275 280285

Glu Gly Lys Gly Glu Asn Lys Phe Val Ala Thr Ala Gly Gly Val Gly 290 295300

Leu Arg His Lys Ph®

305 (2) INFORMACJE DLA SEQ ID NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1029 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: obie (ix) WŁAŚCIWOŚCI:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 1.. 1029 (xi) OPIS'SEKWENCJI: SEQ ID NR:3:

ATG Met 1

GAC GTT

ACC TTG Thr Leu 5

TAC Tyr

GGT ACA ATT AAA GCA GGC GTA GAA

GTT Val 15

TCT Ser

48

Asp

val

Gly

Thr

Ile

Lys Ala 10

Gly

Val

Glu

CGC

GTA

AAA

GAT GCT

GGT

ACA

TAT

AAA

GCT CAA

GGC

GGA

AAA

TCT .

AAA

96

Arg

Val

Lys

Asp Ala 20

Gly

Thr

Tyr

Lys 25

Ala Gin

Gly Gly

Lys 30

Ser

Lys

ACT

GCA

ACC

CAA ATT

GCC

GAC

TTC

GGT

TCT AAA

ATC

GGT

TTC

AAA

GGT

144

Thr

Ala

Thr 35

Gin Ile

Ala

Asp

Phe 40

Gly

Ser Lys

Ile

Gly 45

Phe

Lys

Gly

CAA

GAA

GAC

CTC GGC

AAC

GGC

ATG

AAA

GCC ATT

TGG

CAG

TTG

GAA

CAA

192

Gin

Glu 50

Asp

Leu Gly

Asn

Gly 55

Met

Lys

Ala Ile

Trp eo

Gin

Leu

Glu

Gin

AAA

GCC

TCC

ATC GCC

GGC

ACT

AAC

AGC

GGC TGG

GGT

AAC

CGC

CAG

TCC

240

Lys 65

Ala

Ser

Ile Ala

Gly 70

Thr

Asn

Ser

Gly Trp 75

Gly

Asn

Arg

Gin

Ser 80

TTC

ATC

GGC

TTG AAA

GGC

TTC

GGT

ACC GTC

CGC

GCC

GGT

AAT

CTG

288

Phe

Ile

Gly

Leu Lys 85

Gly Gly

Phe

Gly

Thr Val 90

Arg

Ala

Gly

Asn 95

Leu

AAC

ACC

GTA

TTG AAA

GAC

AGC

GGC

GAC

AAC GTC

AAT

GCA

TGG

GAA

TCT

336

Asn

Thr

Val

Leu Lys 100

Asp

Ser

Gly

Asp 105

Asn Val

Asn

Ala

Trp 110

Glu

Ser

GGT

TCT

AAC

ACC GAA

GAT

GTA

CTG

GGA

CTG GGT

ACT

ATC

GGT

CGT

GTA

384

Gly

Ser

Asn 115

Thr Glu

Asp

Val

Leu 120

Gly

Leu Gly

Thr

Ile 125

Gly

Arg

Val

182 573

GAA AGC CGT GAA ATC TCC GTA CGC TAC GAC TCT CCC GTA TTT GCA GGC432

Glu Ser Arg Glu Ile Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Val Phe AlaGly

130 135140

TTC AGC GGC AGC GTA CAA TAC GTT CCG CGC GAT AAT GCG AAT GAT GTG48C

Phe Ser Gly Ser Val Gin Tyr Val pro Arg Asp Asn Ala Asn AspVal

145 150 155160

GAT AAA TAC AAA CAT ACG AAG TCC AGC CGT GAG TCT TAC CAC GCC GGT52 8

Asp Lys Tyr Lys His Thr Lys Ser Ser Arg Glu Ser Tyr His AlaGly

165 170175

CTG AAA TAC GAA AAT GCC GGT TTC TTC GGT CAA TAC GCA GGT TCT TTT576

Leu Lys Tyr Glu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gin Tyr Ala Gly SerPhe

180 185190

GCC AAA TAT GCT GAT TTG AAC ACT GAT GCA GAA CGT GTT GCA GTA AAT6 24

Ala Lys Tyr Ala Asp Leu Asn Thr Asp Ala Glu Arg Val Ala ValAsn

195 200205

ACT GCA AAT GCC CAT CCT GTT AAG GAT TAC CAA GTA CAC CGC GTA GTT672

Thr Ala Asn Ala Hie Pro Val Lys Asp Tyr Gin Val His Arg ValVal

210 215220

GCC GGT TAC GAT GCC AAT GAC CTG TAC GTT TCT GTT GCC GGT CAG TAT720

Ala Gly Tyr Asp Ala Asn Asp Leu Tyr Val Ser Val Ala Gly GinTyr

225 230 235240

GAA GCT GCT AAA AAC AAC GAG GTT GGT TCT ACC AAG GGT AAA AAA CAC768

Glu Ala Ala Lys Asn Asn Glu Val Gly Ser Thr Lys Gly Lys LysHis

245 250255

GAG CAA ACT CAA GTT GCC GCT ACT GCC GCT TAC CGT TTT GGC AAC GTA816

Glu Gin Thr Gin Val Ala Ala Thr Ala Ala Tyr Arg Phe Gly AsnVal

260 265270

ACG CCT CGC GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GCT AAA GTG AAT GGC864

Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala Hie Gly Phe Lys Ala Lys Val AsnGly

275 280285

GTG AAA GAC GCA AAT TAC CAA TAC GAC CAA GTT ATC GTT GGT GCC GAC912

Val Lys Asp Ala Asn Tyr Gin Tyr Asp Gin Val Ile Val Gly AlaAsp

290 295300

TAC GAC TTC TCC AAA CGC ACT TCC GCT CTG GTT TCT GCC GGT TGG TTG96C

Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala Lau Val Ser Ala Gly TrpLeu

305 310 315320

AAA CAA GGT AAA GGC GCG GGA AAA GTC GAA CAA ACT GCC AGC ATG GTT1008

Lys Gin Gly Lys Gly Ala Gly Lys Val Glu Gin Thr Ala Ser MetVal

325 330335

GGT CTG CGT CAC AAA TTC TAA1029

Gly Leu Arg His Lys Phe 340 (2) INFORMACJA DLA SEQ NR: 4 :

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 342 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:4:

182 573

Mat Asp Val Thr Leu Tyr Gly Thr Ile Lys Ala Gly Val Glu Val Ser 15 1015

Arg Val Lys Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Ala Gin Gly Gly Lys Ser Lye 20 2530

Thr Ala Thr Gin Ile Ala Asp Phe Gly Ser Lys Ile Gly Phe Lys Gly 35 4045

Gin Glu Asp Leu Gly Asn Gly Mec Lys Ala Ile Trp Gin Leu Glu Gin 50 5560

Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asn Ser Gly Trp Gly Aen Arg Gin Ser 65 70 7580

Phe Ile Gly Łeu Lys Gly Gly Phe Gly Thr Val Arg Ala Gly Asn Leu 85 9095

Aen Thr Val Leu Lys Asp Ser Gly Asp Asn Val Asn Ala Trp Glu Ser 100 105110

Gly Ser Asn Thr Glu Asp Val Leu Gly Leu Gly Thr Ile Gly Arg Val 115 120125

Glu Ser Arg Glu Ile Ser V&1 Arg Tyr Asp Ser Pro Val’Phe Ala Gly 130 135140

Phe Ser Gly Ser Val Gin Tyr Val Pro Arg Asp Asn Ala Asn AspVal

145 150 155160

Asp Lys Tyr Lys His Thr Lys Ser Ser Arg Glu Ser Tyr His AlaGly

165 170175

Leu Lys Tyr Glu Aen Ala Gly Phe Phe Gly Gin Tyr Ala Gly Ser Phe 1B0 185190

Ala Lys Tyr Ala Asp Leu Asn Thr Asp Ala Glu Arg Val Ala Val Asn 195 300205

Thr Ala Asn Ala Hle Pro Val Lys Asp Tyr Gin Val His Arg Val Val 310 215220

Ala 225	Gly Tyr	Asp	Ala Asn 230	Asp	Leu Tyr Val Ser Val 235	Ala	Gly	Gin	Tyr 240
Glu	Ala Ala	Lys	Asn Asn 245	Glu	Val Gly Ser Thr Lys 250	Gly	Lys	Lys 2S5	His
Glu	Gin Thr	Gin 260	Val Ala	Ala	Thr Ala Ala Tyr Arg 265	Phe	Gly 270	Asn	Val
Thr	Pro Arg 275	Val	Ser Tyr	Ala	His Gly Phe Lys Ala 280	Lys 285	Val	Asn	Gly
Val	Lys Asp 290	Ala	Aen Tyr	Gin 295	Tyr Asp Gin Val Ile 300	Val	Gly	Ala	Asp
Tyr 305	Asp Phe	Ser	Lys Arg 310	Thr	Ser Ala Leu Val Ser 315	Ala	Gly	Trp	Leu 320
Lys	Gin Gly	Lys	Gly Ala 325	Gly	Lys Val Glu Gin Thr 330	Ala	Ser	Met 335	Val

Gly Leu Arg His Lys Phe 340

182 573 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCHJI SEQ ID NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1092 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: obie (ix) WŁAŚCIWOŚCI:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 1..1092 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:5:

ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGG GAT TCA AGC TTG

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Ser Ser Leu

1015

GTA CCG AGC TCG GAT CCA GAC GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAAGCA

Val Pro Ser Ser Asp Pro Asp Val Thr Leu Tyr Gly Thr Ile LysAla

2530

GGC GTA GAA GTT TCT CGC GTA AAA GAT GCT GGT ACA TAT AAA GCTCAA

Gly Val Glu Val Ser Arg Val Lys Asp Ala Gly Thr Tyr Lys AlaGin

4045

GGC GGA AAA TCT AAA ACT GCA ACC CAA ATT GCC GAC TTC GGT TCTAAA

Gly Gly Lys Ser Lys Thr Ala Thr Gin Ile Ala Asp Phe Gly SerLys

5560

ATC GGT TTC AAA GGT CAA GAA GAC CTC GGC AAC GGC ATG AAA GCCATT

Ile Gly Phe Lys Gly Gin Glu Asp Leu Gly Asn Gly Met Lys AlaIle

70 7580

TGG CAG TTG GAA CAA AAA GCC TCC ATC GCC GGC ACT AAC AGC GGCTGG

Trp Gin Leu Glu Gin Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asn Ser GlyTrp

BS 9095

GGT AAC CGC CAG TCC TTC ATC GGC TTG AAA GGC CGC TTC GGT ACCGTC

Gly Asn Arg Gin Ser Phe Ile Gly Leu Lys Gly Gly Phe Gly ThrVal

100 105110

CGC GCC GGT AAT CTG AAC ACC GTA TTG AAA GAC AGC GGC GAC AACGTC

Arg Ala Gly Asn Leu Asn Thr Val Leu Lys Asp Ser Gly Asp AsnVal

115 120125

AAT GCA TGG GAA TCT GGT TCT AAC ACC GAA GAT GTA CTG GGA CTGGGT

Asn Ala Trp Glu Ser Gly Ser Asn Thr Glu Asp Val Leu Gly LeuGly

130 135140

ACT ATC GGT CGT GTA GAA AGC CGT GAA ATC TCC GTA CGC TAC GACTCT

Thr Ile Gly Arg Val Glu Ser Arg Glu Ile Ser Val Arg Tyr AspSer

145 150 155160

CCC GTA TTT GCA GGC TTC AGC GGC AGC GTA CAA TAC GTT CCG CGCGAT

Pro Val Phe Ala Gly Phe Ser Gly Ser Val Gin Tyr Val Pro ArgAsp

165 170175

AAT GCG AAT GAT GTG GAT AAA TAC AAA CAT ACG AAG TCC AGC CGTGAG

Asn Ala Asn Asp Val Asp Lys Tyr Lys His Thr Lys Ser ser ArgGlu

1B0 185190

TCT TAC CAC GCC GOT CTG AAA TAC GAA AAT GCC GGT TTC TTC GGTCAA

Ser Tyr His Ala Gly Leu Lys Tyr Glu Asn Ala Gly Phe Phe GlyGin

195 200205

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

182 573

TAC GCA GGT TCT TTT GCC

AAA TAT GCT GAT TTG AAC ACT GAT

GCA Ala

GAA Glu

6 7 2

Tyr Ala Gly

Ser

Phe

Ala

Lys 215

Tyr Ala

ASp

Leu

Asn 220

Thr

Asp

210

CGT

GTT

GCA

GTA

AAT

ACT

GGA

AAT

GCC

CAT

CCT

GTT

AAG

GAT

TAC

CAA

720

Arg 225

val

Ala

Val

Asn

Thr 230

Ala

Asn

Ala

His

Pro 235

Val

Lys

Asp

Tyr

Gin 240

GTA

CAC

CGC

GTA

GTT

GCC

GGT

TAC

GAT

GCC

AAT

GAC

CTG

TAC

GTT

TCT

7 6 8

Val

His

Arg

Val

Val 245

Ala

Gly

Tyr

Asp

Ala 250

Asn

Asp

Leu

Tyr

Val 255

Ser

GTT

GCC

GGT

CAG

TAT

GAA

GCT

AAA

AAC

GAG

GTT

GGT

TCT

ACC

816

val

Ala

Gly

Gin 260

Tyr

G1U

Ala

Lys 265

Asn

Glu

Val

Gly 270

Ser

Thr

AAG

GGT

AAA

CAC

GAG

CAA

ACT

CAA

GTT

GCC

GCT

ACT

GCC

GCT

TAC

864

Lys

Gly

Lye 275

Lys

His

Glu

Gin

Thr 280

Gin

Val

Ala

Thr 285

Ala

Tyr

CGT

TTT

GGC

AAC

GTA

ACG

CCT

CGC

GTT

TCT

TAC

GCC

CAC

GGC

TTC

AAA

912

Arg

Phe 290

Gly

Asn

Val

Thr

Pro 295

Arg

Val

Ser

Tyr

Ala 300

His

Gly

Phe

Lys

GCT

AAA

GTG

AAT

GGC

GTG

AAA

GAC

GCA

AAT

TAC

CAA

TAC

GAC

CAA

GTT

960

Ala 305

Lys

Val

Asn

Gly

Val 310

Lys

Asp

Ala

Asn

Tyr 315

Gin

Tyr

Asp

Gin

Val 320

ATC

GTT

GGT

GCC

GAC

TAC

GAC

TTC

TCC

AAA

CGC

ACT

TCC

GCT

CTG

GTT

1008

Ile

Val

Gly

Ala

Asp 325

Tyr

Asp

Phe

Ser

Lys 330

Arg

Thr

Ser

Ala

Leu 335

Val

TCT

GCC

GGT

TGG

TTG

AAA

CAA

GGT

AAA

GGC

GCG

GGA

AAA

GTC

GAA

CAA

1056

Ser ACT Thr

Ala ’ GCC ' Ala

Gly AGC Ser 335

Trp 340 ATG Met

Leu GTT Val

Lys GGT Gly

Gin CTG Leu

Gly CGT Arg 360

Lys 345 CAC His

Gly AAA Lys

Ala TTC Phe

Gly TAA

Lys

Val 350

Glu

Gin

1092

(2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:6:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 363 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:6:

Met 1

Ala

Ser

Met

Thr 5

Gly

Gin

Mat 10

Gly

Arg

Asp

Ser

Ser 15

Leu

Val

Pro

Ser

Ser 20

Asp

Pro

Asp

Val

Thr 25

Leu

Tyr

Gly

Thr

Ile 30

Lys

Ala

Gly

Val

Glu 35

Val

Ser

Arg

Val

Lys 40

Asp

Ala

Gly

Thr

Tyr 45

Lys

Ala

Gin

Gly

Gly 50

Lys

Sar

Lys

Thr

Ala 55

Thr

Gin

Ile

Ala

Asp 60

Phe

Gly

Ser

Lys

Ha Gly Phe Lye Gly Gin Glu Asp Leu Gly Asn Gly Met Lys Ala Ile

70 75 θθ

182 573

Trp Gin Leu Glu Gin Lys Ala Ser Ile Ala Gly Thr Asn Ser Gly Trp 85 »095

Gly Asn Arg Gin Ser Phe Ile Gly Leu Lys Gly Gly Phe Gly Thr Val 100 105110

Arg Ala Gly Asn Leu Asn Thr Val Leu Lys Asp Ser Gly Asp Asn Val 115 120125

Asn Ala Trp Glu Ser Gly Ser Asn Thr Glu Asp Val Leu Gly Leu Gly 130 135140

Thr Ile Gly Arg Val Glu ser Arg Glu Ile Ser Val Arg Tyr Aspser

145 ISO 155160

Pro val Phe Ala Gly Phe Ser Gly Ser Val Gin Tyr Val Pro ArgAsp

165 170175

Asn Ala Asn Aap Val Asp Lys Tyr Lys His Thr Lys Ser Ser Arg Glu 180 185190 ser Tyr His Ala Gly Leu Lys Tyr Glu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gin 195 200205

Tyr Ala Gly Ser Phe Ala Lys Tyr Ala Asp Leu Asn Thr Asp Ala Glu 210 315220

Arg Val Ala Val Asn Thr Ala Asn Ala His Pro Val Lys Asp TyrGin

225 230 235240

Val His Arg Val Val Ala Gly Tyr Asp Ala Asn Asp Leu Tyr ValSer

245 350255

Val Ala Gly Gin Tyr Glu Ala Ala Lys Asn Asn Glu Val Gly Ser Thr 260 265270

Lys Gly Lys Lys His Glu Gin Thr Gin Val Ala Ala Thr Ala Ala Tyr 275 280285

Arg Phe Gly Asn val Thr Pro Arg Val Ser Tyr Ala His Gly Phe Lys 290 295300

Ala Lys Val Asn Gly Val Lys Asp Ala Asn Tyr Gin Tyr Asp GinVal

305 310 315320

Ile Val Gly Ala Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Ala LeuVal

325 330335

Ser Ala Gly Trp Leu Lys Gin Gly Lys Gly Ala Gly Lys Val Glu Gin 340 345350

Thr Ala Ser Met Val Gly Leu Arg His Lys Phe 35536C (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 187 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: obie (ix) WŁAŚCIWOŚCI:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 101..187 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:7:

182 573

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTAAAGAAGG AGATATACAT ATG GCT AGC ATG ACT115

Met Ala Ser Met Thr 15

GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGG GAT TCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT163

Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Ser Ser Leu Val Pro Ser SerAsp

1520

CTG CAG GTT ACC TTG TAC GGT ACA187

Leu Gin Val Thr Leu Tyr Gly Thr (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:8:

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Ser Ser Leu 15 10 15

Val Pro Ser Ser Aep Leu Gin Val Thr Leu Tyr Gly Thr 20 25 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 pary zasad (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: obie (ix) WŁAŚCIWOŚCI: (A) NAZWA/KŁUĆZ: CDS (B) MIEJSCE: 1..24 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:9:

GTT GGT CTG CGT CAC AAA TTC TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG51

Val Gly Leu Arg Kis Lys Phe

CCC54 ( 2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:10:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa . (ii) TYP CZĄSTECZKI: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:10.

Val Gly Leu Arg Hia Lys Phe

5

182 573 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi> OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:11: GGGGTAGATC TGCAGGTTAC CTTGTACGGT ACATTAAAG CAGGCGT (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:12:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR: 12: GGGGGGGTGA CCCTCGAGTT AGAATTTGTG ACGCAGACCA AC (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:13:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:13:

TCAAGCTTGG TACCGAGCTC (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:14:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR: 14:

TTTGTTAGCA GCCGGATCTG (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:15:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza

182 573 (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:15: CTCAAGACCC GTTTAGAGGC C (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:16:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:16: AGCGGCTTGG AATTCCCGGC TGGCTTAAAT TTC (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:17:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:17: CAAACGAATG AATTCAAATA AAAAAGCCTG (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:18:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:18: CCTGTTGCAG CACATATGGA CGTTACCTTG TACGGTACAA TTAAAGC (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR: 19: CGACAGGCTT TTTCTCGAGA CCAATCTTTT CAG

182 573 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:20:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:20: CCTGTTGCAG CGGATCCAGA CGTTACCTTG TACGGTACAA TTAAAGC (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:21:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:21: CGACAGGCTT TTTCTCGAGA CCAATCTTTT CAG (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:22:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR:22: GTTGCAGCAC ATATGGACGT TACCCTGTAC GGCACC (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI ID NR:23:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NR:23: GGGGGGATGG ATCCAGATTA GAATTTGTGG CGCAGACCGA CACC

182 573

1.0 kb

0.5 kb

3.0 kb

2.0 kb

1.5 kb gasm fWJWK

FIG. 2

182 573

FIG. 3A

A B C D

21.5

14.3

FIG.3B

182 573 c c

TTG TAC GGT ACA ATT AAA GCA GGC GTA GAA ACT TCC CGC TCT GTA TTT48

Leu Tyr Gly Thr Ile Lys Ala Gly Vol Glu Thr Ser Arg Ser YalPhe

1015

CAC CAG AAC GGC CAA GTT ACT GAA GTT ACA ACC GCT ACC GGC ATC GTT96

His Gin Asn Gly Gin Yal Thr Glu Vol Thr Thr Ala Thr Gly IleVol

2530

GAT TTG GGT TCG AAA ATC GGC TTC AAA GGC CAA GAA GAC CTC GGT AAC144

Asp Leu Gly Ser Lys Ile Gly Phe Lys Gly Gin Glu Asp Leu GlyAsn

4045

GGC CTG AAA GCC ATT TGG CAG GTT GAG CAA AAA GCA TCT ATC GCC GGT192

Gly Leu Lys Ala Ile Trp Gin Yal Glu Gin Lys Ala Ser Ile AlaGly

5560

ACT GAC TCC GGT TGG GGC AAC CGC CAA TCC TTC ATC GGC TTG AAA GGC240

Thr Asp Ser Gly Trp Gly Asn Arg Gin Ser Phe Ile Gly Leu LysGly

70 7580

GGC TTC GGT AAA TTG CGC GTC GGT CGT TTG AAC AGC GTC CTG AAA GAC288

Gly Phe Gly Lys Leu Arg Yal Gly Arg Leu Asn Ser Yal Leu LysAsp

9095

ACC GGC GAC ATC AAT CCT TGG GAT AGC AAA AGC GAC TAT TTG GGT GTA336

Thr Gly Asp Ile Asn Pro Trp Asp Ser Lys Ser Asp Tyr Leu GlyVol

100 105Π0

AAC AAA ATT GCC GAA CCC GAG GCA CGC CTC ATT TCC GTA CGC TAC GAT384

Asn Lys Ile Ala Glu Pro Glu Ala Arg Leu Ile Ser Val Arg TyrAsp

115 120125

TCT CCC GAA TTT GCC GGC CTC AGC GGC AGC GTA CAA TAC GCG CTT AAC432

Ser Pro Glu Phe Alo Gly Leu Ser Gly Ser Yal Gin Tyr Alo LeuAsn

130 135140

GAC AAT GCA GGC AGA CAT AAC AGC GAA TCT TAC CAC GCC GGC TTC AAC480

Asp Asn Ala Gly Arg His Asn Ser Glu Ser Tyr His Alo Giy PheAsn

145 150 155160

FIG.4A

182 573

TAC AAA AAC GGT GGC TTC TTC GTG CAA TAT GGC GGT GCC TAT AAA AGA528

Tyr Lys Asn Gly Gly Phe Phe Yol Gin Tyr Gly Gly Ale Tyr lysArg

165 170175

CAT GAT CAA GTG CAA GAG GGC TTG AAT ATT GAG AAA TAC CAG ATT CAC576

His His Gin Vol Gin Glu Gly Leu Asn He Glu Lys Tyr Gin HeHis

180 185190

CGT TTG GTC AGC GGT TAC GAC AAT GAT GCC CTG TAC GCT TCC GTA GCC624

Arg Leu Yol Ser Gly Tyr Asp Asn Asp Alo Leu Tyr Ale Ser YolAle

195 200205

GTA CAG CAA CAA GAC GCG AAA CTG ACT GAT GCT TCC AAT TCG CAC AAC672

Vol Gin Gin Gin Asp Ale Lys Leu Thr Asp Ale Ser Asn Ser HisAsn

210 215220

TCT CAA ACC GAA GTT GCC GCT ACC TTG GCA TAC CGC TTC GGC AAC GTA720

Ser Gin Thr Glu Yol Alo Alo Thr Leu Alo Tyr Arg Phe Gly AsnYol

225 230 235240

ACG CCC CGA GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GGT TTG GTT GAT GAT768

Thr Pro Arg Vol Ser Tyr Alo His Gly Phe Lys Gly Leu VoI AspAsp

245 250255

GCA GAC ATA GGC AAC GAA TAC GAC CAA GTG GTT GTC GGT GCG GAA TAC816

Alo Asp He Gly Asn Glu Tyr Asp Gin Yol Yol Yol Gly Alo GluTyr

260 265270

GAC TTC TCC AAA CGC ACT TCT GCC TTG GTT TCT GCC GGT TGG TTG CAA864

Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Alo Leu Yol Ser Alo Gly Trp LeuGin

275 280285

GAA GGC AAA GGC GAA AAC AAA TTC GTA GCG ACT GCC GGC GGT GTT GGT912

Glu Gly Lys Gly Glu Asn Lys Phe Yol Alo Thr Alo Gly Gly VolGly

290 295300

CTG CGT CAC AAA TTC TAA

Leu Arg His Lys Phe 305310

930

FIG.4B

182 573

1.6

Α280 1.2

0.8

FRAKCJE 10 ml

FIG. 5

182 573

INHUBICJI

Θδδθοοοοοο oó

182 573

INHIBICJI

182 573

INHIBICJI

O

4J

O U 'CO 'CO

182 573

ATG GAC GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GCA GGC GTA GAA GTT TCT48

Met Asp Vol Thr Leu Tyr Gly Thr Ile Lys Alo Gly Vol Glu VolSer

1015

CGC GTA AAA GAT GCT GGT ACA TAT AAA GCT CAA GGC GGA AAA TCT AAA96

Arg Vol Lys Asp Alo Gly Thr Tyr Lys Alo Gin Gly Gly Lys SerLys

2530

ACT GCA ACC CAA ATT GCC GAC TTC GGT TCT AAA ATC GGT TTC AAA GGT144

Thr Alo Thr Gin Ile Alo Asp Phe Gly Ser Lys Ile Gly Phe LysGly

4045

CAA GAA GAC CTC GGC AAC GGC ATG AAA GCC ATT TGG CAG TTG GAA CAA192

Gin Glu Asp Leu Gly Asn Gly Met Lys Alo Ile Trp Gin Leu GluGin

5560

AAA GCC TCC ATC GCC GGC ACT AAC AGC GGC TGG GGT AAC CGC CAG TCC240

Lys Alo Ser Ile Alo Gly Thr Asn Ser Gly Trp Gly Asn Arg GinSer

70 7580

TTC ATC GGC TTG AAA GGC GGC TTC GGT ACC GTC CGC GCC GGT AAT CTG288

Phe Ile Gly Leu Lys Gly Gly Phe Gly Thr Vol Arg Alo Gly AsnLeu

9095

AAC ACC GTA TTG AAA GAC AGC GGC GAC AAC GTC AAT GCA TGG GAA TCT336

Asn Thr Vol Leu Lys Asp Ser Gly Asp Asn Vol Asn Alo Trp GluSer

100 105110

GGT TCT AAC ACC GAA GAT GTA CTG GGA CTG GGT ACT ATC GGT CGT GTA384

Gly Ser Asn Thr Glu Asp Vol Leu Gly Leu Gly Thr Ile Gly ArgVol

115 120125

GAA AGC CGT GAA ATC TCC GTA CGC TAC GAC TCT CCC GTA TTT GCA GGC432

Glu Ser Arg Glu Ile Ser Vol Arg Tyr Asp Ser Pro Vol Phe Alo Gly

130 135140

TTC AGC GGC AGC GTA CAA TAC GTT CCG CGC GAT AAT GCG AAT GAT GTG480

Phe Ser Gly Ser Vol Gin Tyr Vol Pro Arg Asp Asn Alo Asn Asp Vol

145 150 155160

FIG.9A

182 573

GAT AAA TAC AAA CAT ACG AAG TCC AGC CGT GAG TCT TAC CAC GCC GGT528

Asp Lys Tyr Lys His Thr Lys Ser Ser Arg Glu Ser Tyr His AloGly

165 170175

CTG AAA TAC GAA AAT GCC GGT TTC TTC GGT CAA TAC GCA GGT TCT TTT576

Leu Lys Tyr Glu Asn Alo Gly Phe Phe Gly Gin Tyr Alo Gly SerPhe

180 185190

GCC AAA TAT GCT GAT TTG AAC ACT GAT GCA GAA CGT GTT GCA GTA AAT624

Alo Lys Tyr Alo Asp Leu Asn Thr Asp Alo Glu Arg Vol Alo Vo!Asn

195 200205

ACT GCA AAT GCC CAT CCT GTT AAG GAT TAC CAA GTA CAC CGC GTA GTT672

Thr Alo Asn Alo His Pro Vol Lys Asp Tyr Gin Vol His Arg VolVo!

210 215220

GCC GGT TAC GAT GCC AAT GAC CTG TAC GTT TCT GTT GCC GGT CAG TAT720

Alo Gly Tyr Asp Alo Asn Asp Leu Tyr Vol Ser Vol Alo Gly GinTyr

225 230 235240

GAA GCT GCT AAA AAC AAC GAG GTT GGT TCT ACC AAG GGT AAA AAA CAC768

Glu Alo Alo Lys Asn Asn Glu Vol Gly Ser Thr Lys Gly Lys LysHis

245 250255

GAG CAA ACT CAA GTT GCC GCT ACT GCC GCT TAC CGT TTT GGC AAC GTA816

Glu Gin Thr Gin Vol Alo Alo Thr Alo Alo Tyr Arg Phe Gly AsnVol

260 265270

ACG CCT CGC GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA GCT AAA GTG AAT GGC864

Thr Pro Arg Vol Ser Tyr Alo His Gly Phe Lys Alo Lys Val AsnGly

275 280285

GTG AAA GAC GCA AAT TAC CAA TAC GAC CAA GTT ATC GTT GGT GCC GAC912

Vol Lys Asp Alo Asn Tyr Gin Tyr Asp Gin Vol ile Vol Gly AloAsp

290 295300

TAC GAC TTC TCC AAA CGC ACT TCC GCT CTG GTT TCT GCC GGT TGG TTG960

Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Alo Leu Vol Ser Alo Gly TrpLeu

305 310 315320

FIG.9B

182 573

AAA CAA GGT AAA CGC GCG GGA AAA GTC GAA CAA ACT GCC AGC ATG GTT Lys Gin Gly Lys Gly Alo Gly Lys Vol Glu Gin Thr Ala Ser Met VcI 325 330 335

GGT CTG CGT CAC AAA TTC TAA

Gly Leu Arg His Lys Phe

340

1008

1029

FIG.9C

182 573

ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGG GAT TCA AGC TTG48

Met Al o Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Ser SerLeu

1015

GTA CCG AGC TCG GAT CCA GAC GTT ACC TTG TAC GGT ACA ATT AAA GCA96

Vol Pro Ser Ser Asp Pro Asp Vol Thr Leu Tyr Gly Thr Ile LysAlo

2530

GGC GTA GAA GTT TCT CGC GTA AAA GAT GCT GGT ACA TAT AAA GCT CAA144

Gly VqI Glu Val Ser Arg Val Lys Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Ala Gin

4045

GGC GGA AAA TCT AAA ACT GCA ACC CAA ATT GCC GAC TTC GGT TCT AAA192

Gly Gly Lys Ser Lys Thr Alo Thr Gin Ile Alo Asp Phe Gly Ser Lys

5560

ATC GGT TTC AAA GGT CAA GAA GAC CTC GGC AAC GGC ATG AAA GCC ATT240

Ile Gly Phe Lys Gly Gin Glu Asp Leu Gly Asn Gly Met Lys Ala Ile

70 7580

TGG CAG TTG GAA CAA AAA GCC TCC ATC GCC GGC ACT AAC AGC GGC TGG288

Trp Gin Leu Glu Gin Lys Alo Ser Ile Ala Gly Thr Asn Ser Gly Trp

9095

GGT AAC CGC CAG TCC TTC ATC GGC TTG AAA GGC GGC TTC GGT ACC GTC336

Gly Asn Arg Gin Ser Phe Ile Gly Leu Lys Gly Gly Phe Gly ThrVcl

100 105110

CGC GCC GGT AAT CTG AAC ACC GTA TTG AAA GAC AGC GGC GAC AAC GTC384

Arg Alo Gly Asn Leu Asn Thr Val Leu Lys Asp Ser Gly Asp AsnVol

115 120125

AAT GCA TGG GAA TCT GGT TCT AAC ACC CAA GAT GTA CTG GGA CTG GGT432

Asn Alo Trp Glu Ser Gly Ser Asn Thr Glu Asp Vol Leu Gly LeuGly

130 135140

ACT ATC GGT CGT GTA GAA AGC CGT GAA ATC TCC GTA CGC TAC GAC TCT480

Thr He Gly Arg Vol Glu Ser Arg Glu Ile Ser Val Arg Tyr AspSer

145 150 155160

FIG.10A

182 573

CCC GTA TTT GCA GGC TTC AGC GGC AGC GTA CAA TAC GTT CCG CGC GAT528

Pro Vol Phe Alo Gly Phe Ser Gly Ser Vol Gin Tyr Vol Pro ArgAsp

165 170175

AAT GCG AAT GAT GTG GAT AAA TAC AAA CAT ACG AAG TCC AGC CG T GAG576

Asn Alo Asn Asp Vol Asp Lys Tyr Lys His Thr Lys Ser Ser ArgGlu

180 185190

TCT TAC CAC GCC GGT CTG AAA TAC GAA AAT GCC GGT TTC TTC GGT CAA624

Ser Tyr His Alo Gly Leu Lys Tyr Glu Asn Alo Gly Phe Phe GlyGin

195 200205

TAC GCA GGT TCT TTT GCC AAA TAT GCT GAT TTG AAC ACT GAT GCA GAA672

Tyr Alo Gly Ser Phe Ala Lys Tyr Ala Asp Leu Asn Thr Asp AloGlu

210 215220

CGT GTT GCA GTA AAT ACT GCA AAT GCC CAT CCT GTT AAG GAT TAC CAA720

Arg VaI Alo VoI Asn Thr Alo Asn Alo His Pro Vol Lys Asp TyrGin

225 230 235240

GTA CAC CGC GTA GTT GCC GGT TAC GAT GCC AAT GAC CTG TAC GTT TCT768

Vol His Arg Val Vol Alo Gly Tyr Asp Alo Asn Asp Leu Tyr VolSer

245 250255

GTT GCC GGT CAG TAT GAA GCT GCT AAA AAC AAC GAG GTT GGT TCT ACC816

VoI Alo Gly Gin Tyr Glu Alo Alo Lys Asn Asn Glu Vol Gly SerThr

260 265270

AAG GGT AAA AAA CAC GAG CAA ACT CAA GTT GCC GCT ACT GCC GCT TAC864

Lys Gly Lys Lys His Glu Gin Thr Gin Vol Ala Ala Thr Alo AloTyr

275 280285

CGT TTT GGC AAC GTA ACG CCT CGC GTT TCT TAC GCC CAC GGC TTC AAA912

Arg Phe Gly Asn Vol Thr Pro Arg Val Ser Tyr Alo His Gly PheLys

290 295300

GCT AAA GTG AAT GGC GTG AAA GAC GCA AAT TAC CAA TAC GAC CAA GTT960

Alo Lys Val Asn Gly Vol Lys Asp Alo Asn Tyr Gin Tyr Asp GinVol

305 310 315320

FIG. 10B

182 573

ATC GTT GGT GCC GAC TAC GAC TTC TCC AAA CGC ACT TCC GCT CTG GTT

Ile Vol Gly Alo Asp Tyr Asp Phe Ser Lys Arg Thr Ser Alo LeuVol

325 330335

TCT GCC GGT TGG TTG AAA CAA GGT AAA GGC GCG GGA AAA GTC GAACAA

Ser Ala Gly Trp Leu Lys Gin Gly Lys Gly Alu Gly Lys Vol GluGin

340 345350

ACT GCC AGC ATG GTT GGT CTG CGT CAC AAA TTCTAA

Thr Alo Ser Met Vol Gly Leu Arg His LysPhe

355360

1008

1056

1092

FIG.1OC

182 573

Xho 1(141)

Bgl 1(2431)

Hinc ί1(2852)

Sco 1(2791)

1(59)

Esp 1(82)

Fin 1(705)

Aal 11(3233)

Ssp 1(3115)

Pvu 1(2681)

CirlO 1(2391)

OBSZAR TRANSKRYPCJI/ EKSPRESJI T7 pET-17b (3M6bp)

Bom HI(205)

Ban 11(215)

Sac 1(215)

Kpn 1(221)

Hind 111(223)

Nhe 1(261)

Nde 1(268)

Xbo 1(306)

T7 stor 1(322)

Bgl 11(364)

Bal 1(389) •Dso 1(390)

Bpu10 1(524) Bsg 1(578)

Eco47 111(672)

AU 111(1418)

1(1188)

1(1189)

Esp3 1(1059) Tth 111(1163)

HgiE

AlwN 1(1834)

FIG.11A

BspG 1(944) Pvu 11 (1009)

182 573

Sgfil Xbol

AGATCTCCAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC 60 _ Nbol Nbel

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTAAAGAAGG AGATATACAT ATG GCT AGC ATG ACT 115

Met Al o Ser Met Thr

Hindlll Kpnl Sod (BomHl)

GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGG GAT TCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT 163 Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Ser Ser Leu Vol Pro Ser Ser Asp

1520

CTG CAG GTT ACC TTG TAC GGT ACA187

Leu Gin Val Thr Leu Tyr Gly Thr

--------------------------------------Xbo| GTT GGT CTG CGT CAC AAA TTC - TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG 51 Vol Gly Leu Arg His Lys Phe

5

CCC 54

FIG.11B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób ekspresji białka porynowego meningokokowego grupy B błony zewnętrznej lub jego białka fuzyjnego w E. coli, znamienny tym, że:

(a) przeprowadza się transformację szczepu E. coli wektorem zawierającym marker selekcyjny i gen kodujący białko wybrane z grupy obejmującej;

(i) dojrzałe białko porynowe i, (ii) białko fuzyjne obejmujące dojrzałe białko porynowe przyłączone do aminokwasów od 1 do 22 białka kapsydu kodowanego przez gen 0 10 faga T7, w którym gen połączony jest operacyjnie z promotorem faga T7, (b) hoduje się stransformowaną E. coli w środowisku hodowlanym zawierającym czynnik selekcji i, (c) indukuje się ekspresję białka do zawartości eksprymowanego białka co najmniej 2% wszystkich białek ulegających ekspresji w komórkach E. coli.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że indukuje się ekspresję dojrzałego białka porynowego klasy 2 grupy B.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że indukuje się ekspresję dojrzałego białka porynowego klasy 3 grupy B.
4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że indukuje się ekspresję białka do zawartości eksprymowanego białka co najmniej 30% wszystkich białek ulegających ekspresji w komórkach E. coli.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się transformację szczepu E. coli wektorem dobranym spośród grupy obejmującej pET-17b, pET-lla, pET-24a-d(+) i pET-9a.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dalsze etapy oczyszczania, w których (d) przeprowadza się lizę uzyskanych w etapie c) komórek E. coli i uwalnia się białko w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych, (e) przemywa się ciała inkluzyjne otrzymane w etapie d) buforem rozpuszczającym białka komórkowe E. coli, w którym nie są rozpuszczalne ciała inkluzyjne, korzystnie TEN (50mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH = 8,0), EDTA, NaCl, Bicyną, Tricyną lub HEPES, i usuwa się zanieczyszczające białka komórkowe E. coli.

(f) zawiesza się i rozpuszcza ciała inkluzyjne otrzymane w etapie e) w wodnym roztworze środka denaturującego, korzystnie guanidyny lub mocznika, (g) rozcieńcza się roztwór uzyskany w etapie f) detergentem rozcieńczającym rozpuszczone białko P2 lub białko fuzyjne, korzystnie detergentem jonowym, niejonowym lub amfoterycznym i (h) oczyszcza się białko przez filtrację żelową i chromatografię jonowymienną.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie (h) przepuszcza się rozcieńczony roztwór otrzymany w etapie g) przez żelową kolumnę filtracyjną do otrzymania sfałdowanej proteiny o wykształconej strukturze trzeciorzędowej.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że rozcieńcza się roztwór uzyskany w etapie f) detergentem rozcieńczającym rozpuszczone białko P2 lub białko fuzyjne, korzystnie detergentem amfoterycznym, do stężenia białka mniejszego niż 10 mg/ml.

182 573
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że:

i) otrzymuje się polisacharyd otoczkowy Neisseria meningitidis i

j) przeprowadza się koniugację białka błony zewnętrznej P2 lub białka fuzyjnego z polisacharydem otoczkowym.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że przeprowadza się koniugację białka o sekwencji aminokwasowej oznaczonej w liście sekwencji nr 2.
11. Szczepionka przeciw Neisseria meningitidis, znamienna tym, że zawiera ponownie zwinięte białko porynowe meningokokowe grupy B błony zewnętrznej lub jego białko fuzyjne wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub zaróbką, przy czym białko obecne jest w ilości od 2 do 100 pg/kg wagi ciała.
12. Szczepionka według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera białko porynowe sprzężone z polisacharydem otoczkowym Neisseria meningitidis.
13. Szczep E. coli będący szczepem BL21 (DE3) zawierającym delecję genu ompA.
14. Komórka gospodarza szczepu BL21 (DE3) ΔοιηρΑ E. coli, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą proteinę porynową meningokokową grupy B błony zewnętrznej lub jej proteinę fuzyjną związaną funkcjonalnie z promotorem T7 tego wektora.
15. Komórka gospodarza według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą dojrzałą meningokokową proteinę porynową klasy 2 grupy B.
16. Komórka gospodarza według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą dojrzałą meningokokową proteinę porynową klasy 3 grupy B.
17. Komórka gospodarza według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą białko o sekwencji aminokwasowej oznaczonej w liście sekwencji nr 2.
18. Komórka gospodarza według zastrz. 14, znamienna tym, że jako wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą proteinę porynową meningokokową grupy B błony zewnętrznej lub jej proteinę fuzyjną związaną funkcjonalnie z promotorem T7 tego wektora zawiera wektor pET-17b.

* * *