JPH09500537A

JPH09500537A - Ｂ型インフルエンザウイルス由来のタンパク質ｐ２の発現および精製方法

Info

Publication number: JPH09500537A
Application number: JP7505353A
Authority: JP
Inventors: タイ，ジョセフ・ワイ; プレン，ジェフリー・ケイ; ソッパー，トーマス・エス; リャン，シュー−メイ
Original assignee: ノース・アメリカン・バクシーン，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-07-23
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1997-01-21
Also published as: FI960308A0; EP0724455A1; AU698458B2; NO960255D0; BR9407144A; PL312700A1; FI960308A; US6153406A; PL181695B1; NO960255L; AU7514494A; CA2167808A1; WO1995003069A1; EP0724455A4; NZ271500A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、Ｂ型インフルエンザウイルス(ヘモフィルス・インフルエンザエ・タイプＢ)由来の外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質を発現する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｈib−Ｐ２タンパク質が大腸菌内で発現される総タンパク質の２％以上であることを特徴とするＢ型インフルエンザウイルス由来の外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を大腸菌内で発現する方法に関する。本発明はまた、Ｈib−Ｐ２タンパク質およびその融合タンパク質を精製および再生する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ型インフルエンザウイルス由来のタンパク質Ｐ２の発現および精製方法発明の背景発明の技術分野本発明は、組換えＤＮＡ技術、タンパク質発現およびワクチンの分野に属する。特に本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルス［ヘモフィルス・インフルエンザエ・タイプＢ］由来の外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)の発現方法に関する。本発明はまた、組換えタンパク質の精製および再生方法に関する。背景の情報アメリカ合衆国では、Ｂ型インフルエンザウイルスにより、４才以下の児童において細菌性髄膜炎およびその他の侵入性感染が発病している。数種のＢ型インフルエンザウイルス株由来のＰ２タンパク質が精製され、特徴が記載されている［マンソンらの「J.Clin.Invest.」,７２：６７７〜６８４(１９８３年)およびヴェイコンらの「J.Bacterio1.」,１６２：９１８〜９２４(１９８５年)］。１Ｈ型Ｐ２タンパク質をコードする構造遺伝子がクローン化され、該ＤＮＡ配列が決定されている［ハンセン,Ｅ.Ｊ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５６：２７０９〜２７１６(１９８８年１０月)；ハンセン,E.J.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：１１００〜１１０７(１９８９年４月)；およびマンソン・ジュニア,Ｒ.およびトラン・ジュニア,Ｒ.Ｗ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月 )］。組換えＰ２遺伝子がＲｄインフルエンザウイルス［ハンセン,Ｅ.Ｊ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５６：２７０９〜２７１６(１９８８年１０月)］および大腸菌［マンソン・ジュニア,Ｒ.およびトラン・ジュニア, Ｒ.Ｗ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月)］において発現されているけれども、マンソン［マンソン・ジュニア,Ｒ.およびトラン・ジュニア,Ｒ.Ｗ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月)］およびハンセン［ハンセン, Ｅ. Ｊ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５６：２７０９〜２７１６(１９８８年１０月)］によって示唆されたように、おそらく大腸菌内でのＰ２タンパク質の毒性により、大腸菌内における発現濃度は低い。本発明は、Ｈib− Ｐ２タンパク質が大腸菌内で発現される総タンパク質の２％以上であることを特徴とする大腸菌内でＨib−Ｐ２を発現する方法を提供する。発明の要約本発明の一般的な目的は、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の組換え外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質を大腸菌内で発現する方法を提供することである。本発明の特別の目的は、 (ａ)選択可能なマーカーおよび (i)成熟Ｐ２タンパク質および (ii)Ｔ７遺伝子のφ１０キャプシドタンパク質の１〜２２番のアミノ酸に融合した成熟Ｐ２タンパク質を含む融合タンパク質からなるグループから選択されたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによって大腸菌を形質転換し［ここで該遺伝子はＴ７プロモーターに機能的に結合する］；および (ｂ)該形質転換された大腸菌を、グルコースおよび選択剤を含むＬＢ培地中で約３０℃にて成長させる［ここで、生産された該タンパク質は大腸菌内で発現された総タンパク質の２％以上である］ことを特徴とする、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の組換え外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質を発現する方法を提供することである。また本発明の特別の目的は、上記方法にしたがって生産されたＢ型インフルエンザウイルスの外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質を精製し、再生する方法を提供することである。さらにまた本発明の特別の目的は、動物においてＢ型インフルエンザウイルスに対する保護抗体を誘発するための有効量で投与される、上記方法にしたがって生産されたＢ型インフルエンザウイルスの外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質、ならび医薬的に許容し得る希釈剤、担体または賦形剤にを含むワクチンを提供することである。本発明の他の特別の目的は、該外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質がヘモフィルスの莢膜多糖に複合している上記ワクチンを提供することである。本発明のさらに特別の目的は、上記方法にしたがって生産したＨib−Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質−ワクチンを動物に投与することを特徴とする動物における細菌性髄膜炎を予防する方法を提供することである。本発明の他の特別の目的は、上記外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質得ること；ヘモフィルス有機体由来の多糖を得ること；および該タンパク質を該多糖に複合させることを特徴とする多糖複合体を製造する方法を提供することである。本発明の他の特別の目的は、形質転換された大腸菌を溶解することにより、Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を封入体として放出させ；該封入体を緩衝液で洗浄することにより、混在する大腸菌細胞タンパク質を除去し；該封入体を変性剤の水性溶液中に再懸濁および溶解し；得られる溶液を界面活性剤で希釈し；および可溶化されたＰ２タンパク質あるいはその融合タンパク質をゲル濾過によって精製することを特徴とする上記外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を精製する方法を提供することである。本発明の他の特別の目的は、形質転換された大腸菌を溶解することにより、Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を封入体として放出させ；該封入体を緩衝液で洗浄することにより、混在する大腸菌細胞タンパク質を除去し；該封入体を変性剤の水性溶液中に再懸濁および溶解し；得られる溶液を界面活性剤で希釈し；および可溶化されたＰ２タンパク質あるいはその融合タンパク質をゲル濾過によって精製し；および該外層膜タンパク質Ｐ２が再生するまで該ゲル濾過生成物を高濃度のＮａＣｌおよびカルシウムイオンを含有する水性溶液中に約４℃ で貯蔵することを特徴とする上記外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を再生する方法を提供することである。本発明のさらなる目的および利点は、下記詳細な説明から明らかとなるであろう。簡単な記載および図面図１プラスミドｐＮＶ−３の誘導の動力学を示す電気泳動ゲル(クーマシーブルー染色８〜１６％直線勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Ｎovex製))。レーン１は分子量マーカーを示す：ホスホリラーゼｂ(９７.４ｋＤａ)、ウシ血清アルブミン(６６ｋＤａ)、卵白アルブミン(４５ｋＤａ)、炭酸デヒドラターゼ(３１ｋＤａ)、大豆トリプシンインヒビター(２１.５ｋＤａ)およびリゾチーム(１４.４ｋＤａ) 。レーン２および１４は精製ｒＨibポーリン（組換え体）の４μgサンブルを示す。レーン３〜１３は、培養物へＩＰＴＧを添加してから、０,１５,３０,４５, ６０,１２０,１８０,２４０,３００,３６０および４２０分後に除去された細胞から得られた大腸菌抽出物のサンプルを示す。各時点では、５mlの培養物を除去し、直ちに４℃に冷蔵した。次いで、遠心分離によって細胞を集め、−７５℃で貯蔵した。１５０μlのトリス−ＨＣｌ,ｐＨ＝８.０,５μＭ尿素,１％ＳＤＳ,３０mＭのＮａＣｌ,２,５％βメルカプトブタノールおよび０.０５％のブロムフェノールブルーを加えることによって全細胞抽出物を作成した。混合物を５分間沸騰させた後、次いでロード緩衝液でサンプルを１：１０に希釈し、１０μlの希釈サンプルをレーンにロードした。図２プラスミドｐＮＶ−６の誘導の動力学を示す電気泳動ゲル（クーマシーブルー染色８〜１６％直線勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Ｎovex製))。レーン１は分子量マーカーを示す：ホスホリラーゼｂ(９７.４ｋＤａ)、ウシ血清アルブミン( ６６ｋＤａ)、卵白アルブミン(４５ｋＤａ)、炭酸デヒドラターゼ(３１ｋＤａ) 、大豆トリプシンインヒビター(２１.５ｋＤａ)およびリゾチーム(１４.４ｋＤａ)。レーン２および１４は精製ｒＨibポーリンの４μgサンプルを示す。レーン３〜１３は、培養物へＩＰＴＧを添加してから、０,１５,３０,４５,６０,１２０,１８０,２４０,３００,３６０および４２０分後に除去された細胞から得られた大腸菌抽出物のサンプルを示す。各時点では、５mlの培養物を除去し、直ちに４℃に冷蔵した。次いで、遠心分離によって細胞を集め、−７５℃で貯蔵した。図１で記載したように、全細胞抽出物を作成した。図３および３ＡｒＨibポーリンのゲル濾過を示すグラフ。６ＭグアニジンＨＣｌで封入体を抽出し、実施例６で記載するように界面活性剤を添加した。混合物を遠心分離して幾らかの残留物質を除去し、１００mＭのトリス−ＨＣｌ,１０ mＭのＥＤＴＡ,１ＭのＮａＣｌおよび０.０５％の３,１４−Ｚwittergent,ｐＨ８.０で平衡化した１８０×２.５cmのＳ−３００カラムに供した。次いで、第２のバッチを２０mＭのＣａＣｌ₂を加えた同様の緩衝液に供した。各フラクションに対して２８０ｎｍにおける光学密度を測定した。矢印は分子量マーカー(Ｓigm a製)の溶離位置を示す：１＝ブルーデキストラン(２０００ｋＤａ)；２＝アルコール脱水素酵素(１５０ｋＤａ)；４＝ウシ血清アルブミン；および６＝チトクロームＣ(１２.４kＤa)。挿入はの見かけの分子量対溶離位置の半対数プロットを示す。３番は、ポーリンで処理されたカルシウムイオンの主要ピークの位置であり、一方、５番はポーリン非処理の主要ピークの位置である。図４Ａ〜４ＣｐＮＶ−１のＳalＩ−ＳalＩ断片のＤＮＡ配列。制限部位を下線で示す。該ＤＮＡの配列決定に用いた合成オリゴヌクレオチドを２重下線で示す。矢印は、配列決定反応の方向を示す。左矢印の配列は、該ＤＮＡ配列に相補的である。プラスミドの残りの部分はｐＵＣ１８と同一である。lacプロモーターは下流のＳalＩ部位に隣接している。図５Ａ〜５ＣｐＮＶ−２のＢamＨＩ−ＸhoＩ断片のＤＮＡ配列。融合配列をコードするｐＥＴ−１７ｂベクターの部分を太字で示す。制限部位を下線で示す。プラスミドの残りの部分はｐＥＴ−１７ｂと同一である。図６Ａ〜６ＣｐＮＶ−３のＮdeＩ−ＸhoＩ断片のＤＮＡ配列。制限部位を下線で示す。プラスミドの残りの部分はｐＥＴ−１７ｂと同一である。図７Ａ〜７ＣｐＮＶ−３のＮdeＩ−ＢamＨＩ断片のＤＮＡ配列。制限部位を下線で示す。プラスミドの残りの部分はｐＥＴ−１１ａと同一である。図８Ａおよび８Ｂ組換えＰ２を有するヘモフィルス・インフルエンザエ由来の天然の抗Ｐ２の免疫原性を示す電気泳動ゲル(パネルＡ)およびウエスタンブロット(パネルＢ)。パネルＡ：(クーマシーブルー染色,８〜１６％直線勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Ｎovex製))。レーン１は分子量マーカーを示す：ホスホリラーゼｂ(９７. ４ｋＤａ)、ウシ血清アルブミン(６６ｋＤａ)、卵白アルブミン(４５ｋＤａ)、炭酸デヒドラターゼ(３１ｋＤａ)、大豆トリプシンインヒビター(２１.５ｋＤａ )およびリゾチーム(１４.４ｋＤａ)。レーン３は精製組換えＢ型インフルエンザウイルスのポーリンの１μgサンプルを示す。レーン２、４、９、１２および１５はブランク。レーン５および６は、ＩＰＴＧによる誘導前および３時間後の大腸菌株ＢＬ２１を示す。レーン７および８は、誘導の前と後のＢＬ２１［ｐＮＶ −３］を示す。レーン１０および１１は、誘導の前と後のＢＬ２１(ＤＥ３)［ｐＮＶ−３］を示す。レーン１３および１４は、誘導の前と後のＢＬ２１(ＤＥ３) ［ｐＮＶ−６］を示す。ロードしたサンプルは図１で記載したように調製したパネルＢ：（パネルＡで示したものと同一の様式でロードしたゲルからのウエスタンブロット)。タンパク質をニトロセルロース膜(Ｎovex製)に転写した後、該膜を粉末ミルクでブロックする。次いで、Ｅagan株に相当するＨib株Ａ２由来の精製Ｐ２を構成成分とする複合ワクチンで免疫感作したウサギから生産したポリクローナル抗体および同じ有機体から単離された多糖を加えた。その後、アルカリフォスファターゼにカプリングさせたヤギ抗ウサギＩgＧも加えた。ポーリンバンドの視覚化は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート,ｐ− トルイジン塩(Ｓigma製)から放出されたホスフェートと反応するニトロブルーテトラゾリウム染料(Ｓigma製)を用いて行った[ブレイクらの「Analyt.Biochem.」, １３６：１７５−１７９(１９８４年)]。発明の詳細な記載本発明はＢ型インフルエンザウイルス由来の外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を発現する方法に関する。ひとつの具体例においては、本発明は、 (ａ)選択可能なマーカーおよび (i)成熟Ｐ２タンパク質および (ii)Ｔ７遺伝子のφ１０キャプシドタンパク質の１〜２２番のアミノ酸に融合した成熟Ｐ２タンパク質を含む融合タンパク質からなるグループから選択されたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによって大腸菌を形質転換し［ここで該遺伝子はＴ７プロモーターに機能的に結合する］；および (ｂ)該形質転換された大腸菌を、グルコースおよび選択剤を含むＬＢ培地中で約３０℃にて成長させる［ここで、生産された該タンパク質は大腸菌内で発現された総タンパク質の２％以上である］ことを特徴とする、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を発現する方法に関する。好ましい具体例においては、発現したＨib−Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質は、大腸菌内で発現した総タンパク質の約５％以上である。別の好ましい具体例においては、発現したＨib−Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質は、大腸菌内で発現した総タンパク質の約１０％以上である。さらに別の好ましい具体例においては、発現したＨib−Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質は、大腸菌内で発現した総タンパク質の約４０％以上である。別の好ましい具体例においては、該ベクターは、発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ(＋)またはｐＥＴ−９ａのＴ７プロモーターに機能的に結合したＨib-ｐ２遺伝子を含む。これらのプラスミドはすべて、Ｎovagen社(ウイスコンシン州マジソン、サイエンス・ドライブ５６５番)から市販されている。プラスミドｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−９ａおよびｐＥＴ−２４ａ−ｄ(＋)は配列中にＴ７プロモーター、リボソーム結合部位、構造遺伝子を挿入可能にする制限部位およびＴ７ターミネーター配列を含む。さらに、ｐＦＴ −１１ａは、Ｔ７プロモーターに融合したlacオペレーターおよびlacＩ遺伝子のコピーをもつ。本発明で用いたプラスミド構築物は、マンソン・ジュニア,Ｒ.およびトラン・ジュニア,Ｒ.Ｗ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月)で用いられたものとは異なり、予Ｐ２タンパク質および融合タンパク質が著しく高い生産率で得られる形質転換された大腸菌を、大腸菌が感受性をもつβ−ラクタム（たとえばカルボペニシリン)などの選択剤を含む培地中で成長させる。該ｐＦＴ発現ベクターは、形質転換された有機体に抗生物質抵抗性を付与する選択可能なマーカーを提供する。本発明に従って、Ｐ２ターミネーション配列を含むＰ２遺伝子から下流の外来性の３'部分を排除する。このように構築された該断片は、翻訳停止コドンの後約４０ｂｐで終了する。Ｔ７ポリメラーゼをコードする大腸菌株はいずれも、本発明に用いることができる。好ましい具体例においては、大腸菌株ＢＬ２１(ＤＥ３)ΔompＡを用いる。上述のプラスミドは、この株または野生型株ＢＬ２１(ＤＥ３)に導入して形質転換することができる。該株ＢＬ２１(ＤＥ３)ΔompＡは、バクテリオファージ λＤＥ３の溶原であり、誘発可能なlacＵＶ５プロモーターの制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。精製ポーリンタンパク質が混在し、かつ所望しない免疫副作用を生み出す可能性があるＯmpＡタンパク質が産生されないという理由から、大腸菌株ＢＬ２１(ＤＥ３)ΔompＡが好ましい。本発明の形質転換大腸菌を、グルコースおよびカルベニシリンを含むＬＢブロス中、約３０℃で、通気速度を遅くして(約１５０rpm)成長させ、誘導してもよい。これらの条件下で、高濃度のＰ２発現が得られた。Ｐ２を長期間、高濃度で発現させることは、大腸菌にとって有毒となる可能性がある。これまでに報告されているＨib−Ｐ２の最も高濃度の発現は、発現された総タンパク質の２％以下である［マンソン・ジュニア,Ｒ.およびトラン・ジュニア,Ｒ.Ｗ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月)］。驚くべきことに、本発明による大腸菌内でのＨib−Ｐ２タンパク質およびその融合タンパク質の発現を、クーマシーブルー染色後の電気泳動ゲルをデンシトメーターで測定したところ、約３５〜５０％に達している。別の好ましい具体例においては、本発明は、動物においてＢ型インフルエンザウイルスに対する保護抗体を誘発するための有効量で投与される、前記方法に従って生産されたＢ型インフルエンザウイルス由来の外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib −Ｐ２)あるいはその融合タンパク質ならびに医薬的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチンに関する。好ましい具体例においては、該動物は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジおよびニワトリからなるグループから選択される。別の好ましい具体例においては、該動物はヒトである。別の好ましい具体例においては、本発明は、外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質がヘモフィルス莢膜多糖(capsular polysaccharide：ＣＰ)に複合している上記ワクチンに関する。ヘモフィルスＣＰ類は、シュネルソンらの「 J.Exp.Med.」,１５２：３６１〜３７６(１９８０年)；マーバーグらの「J.Amer.C hem.Soc.」,１０８：５２８２(１９８６年)；ジェニングスらの「J.Immunol.」,１２７：１０１１〜１０１８(１９８１年)；およびビューバリらの「infect.Immun nol.」,４０：３９〜４５(１９８３年)［これらの文献はすべて本発明の参考文献である］の記載に従って製造または合成することができる。さらに好ましい具体例においては、本発明は、前記外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を生産し；ヘモフィルス由来のＣＰあるいはその断片を得；および外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を、ＣＰあるいはその断片に複合させることを特徴とする多糖複合体を生産する方法に関する。本発明複合体は、還元的アミノ化を行ってＣＰ断片の還元末端基をポーリンの第１アミノ基に反応させることによって製造してもよい。還元基は、選択的加水分解または特異的酸化的切断、あるいはこれらの組み合わせによって形成しうる。好ましくは、ジェニングスらの米国特許第４３５６１７０号［本発明の参考文献である］に記載の方法(過ヨウ化物を用いたＣＰの制御酸化、次いでポーリンタンパク質を用いた還元的アミノ化)によってＣＰをポーリンタンパク質に複合させる。本発明のワクチンは、投与経路によって変化する有効量にて投与されるＨib− Ｐ２タンパク質、融合タンパク質または複合ワクチンを特徴とする。皮下または筋肉内経路での投与が好ましいけれども、本発明のＨib−Ｐ２、融合タンパク質またはワクチンは、腹腔内または静脈内経路でも投与することができる。当業者であれば、いずれの特定の治療プロトコルに対しても、過度の実験を行うことなく、投与量を容易に決定しうるであろう。適当な用量はタンパク質２〜１０μg ／体重kgの範囲である。本発明のワクチンは、経口投与用としてはカプセル剤、液剤、懸濁剤またはエリキシル剤の形態で用いることができ、液剤または懸濁剤などの滅菌溶液の形態で用いてもよい。生理的食塩水、リン酸緩衝食塩水などの不活性担体のいずれを用いてもよく、あるいはＨib−Ｐ２タンパク質、融合タンパク質または複合ワクチンが適当な溶解特性をもつ担体も適当である。ワクチンは、一回投与用製剤または大規模予防接種プログラムに用い得る複数回投与用フラスコとして作成することができる。ワクチンの製造法および使用法の参考文献は、レミントンの「ファーマシューティカル・サイエンス」,マック・パブリッシング・コーポレイション,イーストン,ペンシルバニア州,オーソル編(１９８０年)；および「ニュー・トレンド・アンド・デベロップメント・イン・ワクチンズ」,ヴォラーら(編), ユニバーシティ・パーク・プレス,バルチモア,メリーランド州(１９７８年)である。さらに、本発明のＨib−Ｐ２タンパク質または複合ワクチンには、Ｐ２抗体の産生を増強するアジュバントが含まれてもよい。このようなアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)、ＭＤＰとして知られるジペプチド、サポニン、水酸化アルミニウムまたはリンパ球サイトカインなどの種々の油状製剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。フロイントアジュバントは、免疫原物質と混合された鉱物油と水のエマルジョンである。フロイントアジュバントは強力であるが、通常ヒトには投与しない。代わりに、ヒトの場合、水酸化アルミニウムのアジュバントを用いる。Ｈib−Ｐ２タンパク質、融合タンパク質または複合ワクチンは、該水酸化アルミニウム上に吸着され、注入後、そこからゆっくりと放出される。Ｈib−Ｐ２タンパク質、融合タンパク質または複合ワクチンを、フラートンらの米国特許第４２３５８７７号の記載に従ってリポソーム内カプセル剤にしてもよい。別の好ましい具体例においては、本発明は、前記方法に従って生産した外層膜タンパク質Ｐ２または複合ワクチンを、細菌性髄膜炎を予防するための有効量で動物に投与することを特徴とする動物における細菌性髄膜炎の予防方法に関する。さらに他の具体例においては、本発明は、形質転換された大腸菌を溶解することにより、Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を封入体として放出させ；該封入体を緩衝液で洗浄することにより、混在する大腸菌細胞タンパク質を除去し；該封入体を変性剤の水性溶液中に再懸濁および溶解し；得られる溶液を界面活性剤で希釈し；および可溶化されたＰ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を変性剤なしでゲル濾過することによって精製することを特徴とする上記外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を精製する方法に関する。溶解工程は、超音波処理、酵素分解、浸透ショック法またはマル・プレス(mul l press)を通すことなどの当業者に公知の方法に従って行う。封入体は、Ｐ２タンパク質あるいは融合タンパク質を含む封入体を可溶化することなく大腸菌細胞タンパク質を可溶化しうる緩衝液のいずれかで洗浄する。このような緩衝液としては、ＴＥＮ緩衝液（５０mＭトリスＨＣｌ,１mＭＥＤＴＡ ,１００mＭＮａＣｌ,ｐＨ８.０)が挙げられるが、これに限定されるものではない。Ｂicine、ＴricineおよびＨＥＰＥＳなどの他の緩衝液も使用しうる。本発明に用いる変性剤としては、２〜８Ｍ尿素または約２〜６ＭグアニジンＨＣｌが挙げられ、４〜８Ｍ尿素または約４〜６ＭグアニジンＨＣｌが好ましく、約８Ｍ尿素または約６ＭグアニジンＨＣｌが最も好ましい。可溶化されたＰ２タンパク質あるいは融合タンパク質を希釈するのに用いる界面活性剤としては、ＳＤＳおよびＣetavlon(Ａldrich製)などのイオン性界面活性剤；Ｔween、ＴritonＸ−１００およびオクチルグルコシドなどの非イオン性界面活性剤；および３,１４−ＺwittergentおよびＣhapsなどの両性イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。可溶化されたＰ２タンパク質あるいは融合タンパク質を、ゲル濾過法によって精製して高分子量物質と低分子量物質とを分離する。濾過マトリックスのタイプとしては、セファクリル−３００、セファロースＣＬ−６ＢおよびＢio−ＧelＡ −１.５ｍが挙げられるが、これらに限定されるものではない。可溶化タンパク質を希釈するのに用いた緩衝液でカラムを溶離する。次いでＰ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を含むフラクションをゲル電気泳動法により同定し、該フラクションを集め、透析し、濃縮する。最終的に、濃縮フラクションを高速Ｑセファロース高性能カラム(Ｐharmacia 製)に通すことによって、実質的に純粋な(＞９５％)Ｐ２タンパク質および融合タンパク質が得られる。他の具体例においては、本発明は、酵母Ｐichia発現系［スリークリシュナらの「J.Basic.Microbiol.」,２８：２６５〜２７８(１９８８年)］および古細菌発現系［ブラセイオおよびファイファーの「Proc.Acad.Natl.Sci.U.S.A.」,８７：６７７２〜６７７６(１９９０年)；クラインらの「J.Bacteriol.」,１７１：４９８７〜４９９１(１９８９年)］におけるＨib−Ｐ２の発現に関する。Ｐ２タンパク質遺伝子あるいは融合遺伝子の発現ベクターへのクローニングは、連結のための平滑末端または付着末端、適当な末端を得るための制限酵素による切断分解、適当な付着末端の充填、不要な結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および適当なリガーゼによる連結などの常套の技術を用いて行う。一般的なクローニング法についての参考文献は、サムブルックらの「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」第２版,コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨーク,コールド・スプリング・ハーバー・プレス(１９８９年)である。免疫学的に天然のタンパク質の特性をもつ構造を達成するために、本発明に従って発現したＨib−Ｐ２および融合タンパク質を正しく再生しなければならない。さらに他の具体例においては、本発明は、形質転換された大腸菌を溶解することにより、Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を封入体として放出させ；該封入体を緩衝液で洗浄することにより、混在する大腸菌細胞タンパク質を除去し；該封入体を変性剤の水性溶液中に再懸濁および溶解し［すなわち、外層膜タンパク質Ｐ２を高濃度の塩(２〜８Ｍ尿素または約２〜６ＭグアニジンＨＣｌが好ましい、４〜８Ｍ尿素または約４〜６ＭグアニジンＨＣｌがさらに好ましく、約８Ｍ尿素または約６ＭグアニジンＨＣｌが最も好ましい)に再懸濁および溶解し］；得られる溶液を界面活性剤(両性イオン剤、ＳＤＳまたはＴween−２０が好ましい)で希釈し；および外層膜タンパク質Ｐ２をゲル濾過によって精製し；および該外層膜タンパク質Ｐ２が再生するまで(０〜１０週間が好ましく、３週間が最も好ましい)、該ゲル濾過生成物を約１〜１５℃(約４℃が好ましい)で貯蔵することを特徴とする上記外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を再生する方法ゲル濾過工程で、高分子量物質と低分子量物質が分離され、３量体と単量体のポーリンになる。ゲル濾過工程後、ポーリンを溶液中に保持するには、初めに高濃度の塩(１〜４ＭＮａＣｌ)が必要である。ｒＨibポーリンが充分に集合するには、マグネシウムもしくはマンガンイオンではなくて、カルシウムイオン(１mＭ〜１ＭのＣａＣｌ₂が好ましく、約２０mＭのＣａＣｌ₂が最も好ましい)が必要である。この時点では、塩を除去するとポーリンが溶液から沈殿するので、ｒＨibポーリンは３量体であっても、コンホメーションは“天然”とはいえない。このことは、野生型のＨibポーリンでは起こらない。しかし、ポーリンを４℃で貯蔵するので、ゆっくりとしたコンホメーションの変化が起こり、ポーリンが沈殿することなく塩を除去しうるようになる。この時点でのタンパク質の純度は、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると約８０〜９０％である。次いでこの物質をイオン交換カラムに供し、塩勾配で溶離する。得られる物質の純度は９５％である。他の好ましい具体例においては、本発明は、上記方法に従って生産された実質的に純粋な再生Ｈib−Ｐ２に関する。実質的に純粋なタンパク質とは、たとえば、電気泳動などから明らかなように、インフルエンザウイルスのその他の細胞成分が概ね欠損しているタンパク質である。このような実質的に純粋なタンパク質の純度を、電気泳動ゲルをデンシトメーターで測定すると、＞９５％である。次の非制限的実施例において本発明をさらに詳しく説明する。実施例１Ｂ型インフルエンザウイルス由来の外層膜タンパク質Ｐ２のクローニング既に文献に記載されている方法[サムブルックらの「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」第２版,コールド・スプリング・ハーバ一,ニューヨーク,コールド・スプリング・ハーバー・プレス(１９８９年)]を用いて０．５gのＢ型インフルエンザウイルスのＥagan株から全ゲノムＤＮＡを単離した。次いでこのＤＮＡを、標準的ＰＣＲ条件を用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）における２つのＰ２特異的オリゴヌクレオチド用のテンプレートとして用いた［米国特許第４６８３１９５号；米国特許第４６８３２０２号；サイキらの「Science」,２３０：１３５０〜１３５４（１９８５年；イニスらの「ＰＣＲプロトコルズ：ア・ガイド・トウ・メソッド・アンド・アプリケーションズ」，アメリカン・プレシ・インコーポレイテッド，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）（これらの文献は本発明の参考文献である）］。５'側のＰ２特異的オリゴヌクレオチドは、ＡＴＧ（出発コドン）から４０ｂｐ５'であるように設計し、配列を配列番号１で示した。３'側のＰ２特異的オリゴヌクレオチドは、停止コドンから３００ｂｐ３'であるように設計し、配列を配列番号２で示した。両方のＰ２特異的オリゴヌクレオチドに、増幅した精製物のクローニングを促進するためのＳalＩ制限酵素部位を含めた。Ｐ２増幅反応に続いて、０.８％寒天ゲル上の電気泳動によって該増幅したＤＮＡを単離した。ゲルには１.４ｋｂのシングルバンドが現れた。このＤＮＡをゲルから精製し、３つの制限酵素（ＥcoＲＩ、ＤraＩおよびＰvuＩＩ）で切断したところ予測しうる大きさのバンドが得られた。次いで１.４ｋｂの断片をＳal Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＳalＩ切断ｐＵＣ１８に連結した［ヤニッシュ−ペロンらの「Gene」，３３：１０３〜１１９（１９８５年）］。連結混合物を用いて、コンピテント大腸菌株ＤＨ５αの形質転換を行った[サムブルックらの「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」第２版,コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨーク,コールド・スプリング・ハーバー・プレス(１９８９年)]。得られるコロニーを単離し、次いでミニプレップＤＮＡ群を製造して解析した。該ＤＮＡ群をＳalＩで切断して解析すると、２.７ｋｂのベクターバンドおよび１.４ｋｂの断片バンドが得られた。プラスミドｐＮＶ−１を生成する連結は、方向性はなかった。このことは、該ＤＮＡ挿入体が両方の方向において存在することを意味する。該挿入体の方向性を試験するために、ＭluＩおよびＮarＩの両方でプラスミドを切断した。得られるフラグメントのサイズは、挿入体がlacプロモーターと同じ方向性をもつか、あるいは反対の方向性をもつかを示す。プラスミドの数個の単離物に対して試験を行ったところ、すべてがlacプロモーターと反対の方向性をもつことがわかった。該プロモーターと同じ方向性をもつ挿入体は成長中に選択されなかったことが明らかである。このことは、ｒＨib−Ｐ２の発現が大腸菌にとって有害であることを示唆する。同様な結論にマンソンのグループ[マンソンおよびトランの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月 )]およびハンセンのグループ[ハンセン,Ｅ.Ｊ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５６：２７０９〜２７１６(１９８９年１０月)]が到達した。ＤＮＡ配列を解析するために、１.４ｋｂ断片を含むクローンを選択した。サンガー法［サンガーらの「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」，７４：５４６３（１９７７年）］を用いて、ひとつのクローンを試験し、ｐＮＶ−１が両方向に配列されていることを示した。プラスミドｐＮＶ−１はＨib株のＭinnＡについて公開されている配列と同一であることがわかった［マンソン・ジュニア,Ｒ.およびトラン・ジュニア,Ｒ.Ｗ.らの「インフェンクション・アンド・イムニティ」,５７：８８〜９４(１９８９年１月)。ここで用いた分子生物学的技術は、サムブルックらの「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」第２版,コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨーク,コールド・スプリング・ハーバー・プレス(１９８９年)およびオースベルらの「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」，Ｖol.１および２，ウイリー−リス，ニューヨーク州ニューヨーク(１９９２年)に記載されたものを用いた。これらの文献は本発明の参考文献である。実施例２外層膜タンパク質Ｐ２遺伝子を含む発現ベクターの構築Ｐ２の発現には、発現ベクターｐＥＴ−１７ｂ（Novagen pET システムマニュアル）を用いた。このプラスミドはファージＴ７φ１０遺伝子プロモーターを利用する。このプロモーターは大腸菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されず、したがって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが存在しないと、実質的な濃度のポーリンを生産しない。ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、lacＵＶ５プロモーターの制御下で要求されたポリメラーゼをコードする溶原性λファージを含む。ｐＥＴ −１７ｂ発現ベクターを用いて２つのタイプの組換えＰ２タンパク質を作成した。ひとつのタイプは、Ｎ末端にメチオニンを含有する成熟Ｐ２であった。２つめのタイプは、Ｎ末端にｐＥＴ−１７ｂベクターから誘導されるファージＴ７の遺伝子１０の２２個のアミノ酸をもつ成熟Ｐ２を含有する融合タンパク質（融合Ｐ２と称する）であった。該Ｐ２をｐＥＴ−１７ｂにクローニングするために、ＰＣＲを用いてオリジナルのＰ２遺伝子（ｐＮＶ−１）を修飾した。成熟Ｐ２を構築するために、成熟ポーリンがｐＥＴ−１７ｂのＮdeＩ部位にクローン化されるようにオリゴヌクレオチドを構築した。このように設計された該オリゴヌクレオチド配列を配列番号３で示した。融合Ｐ２を構築するために、成熟ポーリンがｐＥＴ−１７ｂのＢamＨＩ部位にクローン化されるようにオリゴヌクレオチドを構築した。したがって、Ｔ７タンパク質の主要なキャプシドタンパク質である融合Ｐ２が遺伝子１０に渡される。該オリゴヌクレオチド配列を配列番号４で示した。翻訳停止コドンから約４０ｂｐにＸhoＩ部位を導入することによって外来性の３'配列を除去した。このオリゴヌクレオチドは、ＸhoＩ部位が、ｐＥＴ−１７ｂのＸhoＩ部位にクローン化されるようにＸhoＩ部位を含むように設計した。該オリゴヌクレオチド配列を配列番号４で示した。ＰＣＲを用いて、ＮdeＩ部位を含む５'オリゴヌクレオチドおよびＸhoＩ部位を含む３'オリゴヌクレオチドで、全長Ｐ２（ｐＮＶ−１）から１.１ｋｂの断片を生産した。この断片をＮdeＩおよびＸhoＩで切断し、精製し、ＮdeＩ−ＸhoＩ切断したｐＥＴ−１７ｂに連結した。これによって、成熟Ｐ２構築が達成された（ｐＮＶ−３またはＮ−Ｘ）。同様に、ＰＣＲを用いて、ＢamＨＩ部位を含む５'オリゴヌクレオチドおよびＸhoＩ部位を含む３'オリゴヌクレオチドで、全長ｐＮＶ−１から１.１ｋｂの断片を生産した。この断片をＢamＨＩおよびＸhoＩで切断し、精製し、ＢamＨＩ− ＸhoＩ切断したｐＥＴ−１７ｂに連結した。これによって融合Ｐ２構築が達成された（ｐＮＶ−２またはＢ−Ｘ）。両方の構築物（ｐＮＶ−３およびｐＮＶ−２）を、Ｔ７ポリメラーゼが欠損している大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。多数のＤＨ５α形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。成熟Ｐ２構築物および融合Ｐ２構築物の両方は、それらの５'および３'末端においてクローニングジャンクションが正確であるのを確実にするように配列された。図１は、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＮＶ−３］のＩＰＴＧによる誘導の動力学を示す。非代謝性誘導物質の添加前に、存在するポーリンの重要なレベルがあることに留意せよ。これは、lacＵＶ５プロモーターが完全には抑制されないからである。ポーリンの濃度は急速に増加し、約３時間後に最大に達する。株ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるポーリンの発現は、なお有害である。これは、図１で観測された、ポーリンの重要な非誘導レベルによるものである。ポーリンを生産しないような欠失あるいは他の突然変異が選択されるので、この株は注意して扱わねばならない（使用するまで凍結し、３０℃で誘導せよ）。実施例３ｐＮＶ−６の構築プラスミドｐＥＴ−１１ａ（Novagen pETシステムマニュアル）はｐＥＴ−１７ｂと同じ発現シグナルをもつ。しかし、このプラスミドは、Ｔ７遺伝子φ１０プロモーターに隣接したlacオペレーターも含む。これは、lacリブレッサーの制御下のＴ７プロモーターを配置する。プラスミドｐＥＴ−１１ａは、lacリプレッサーをコードするlacＩ遺伝子の余分のコピーも含む。この構築からは実質的に、より低い非誘導レベルのポーリンが得られる。プラスミドｐＥＴ−１１ａに含まれる使用可能な制限部位の数は、ｐＥＴ−１７ｂよりも少ない。ｐＥＴ−１７ｂと同じ位置にＮdeＩ部位があり、したがって、Ｐ２遺伝子の５'末端に配列番号３のオリゴヌクレオチドを再利用しうる。しかし、利用可能なＸhoＩ部位はない。代わりに、配列番号６を用いてＢamＨＩ部位を組み入れる。ＰＣＲを用いて、オリゴヌクレオチド３および６で、全長Ｐ２（ｐＮＶ−１）から新規１.１ｋｂの断片を生産した。この断片をＮdeＩおよびＢamＨＩで切断し、精製し、ＮdeＩ−ＢamＨＩであらかじめ切断したｐＥＴ−１１ａに連結した。これによって第２の成熟Ｐ２構築が達成された（ｐＮＶ−６）。この構築物の５ '末端および３'末端の両方は、クローニングジャンクションが正確であるのを確実にするように配列された。図２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＮＶ−６］のＩＰＴＧによる誘導の動力学を示す。非誘導レベルのポーリンが、ｐＮＶ−３において観測されるよりも非常に低いことに留意せよ。最大レベルの誘導に到達するのに必要な時間ｐＮＶ−３の場合よりも僅かに長いが、３時間後、ポーリンのレベルはｐＮＶ−３に匹敵するようになる。ｐＮＶ−６において、より低い非誘導レベルのポーリンが見られるということは、このプラスミドが、プラスミドｐＮＶ−３よりも毒性のレベルが低いことを示し、従って、より安定であることを意味する。実施例４発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔompＡの構築大腸菌株ＤＭＥ５５８［Ｓ．ベンソンのコレクションから入手：シルハビーらの「エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョン」，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８６年）］ＢＲＥ５１［ブレマー，Ｅ．らの「FEMS Microbiol.Lett.」, ３３：１７３〜１７８（１９８６年）］およびＢＬ２１（ＤＥ３３）をＬＢ寒天平板上、３７℃で成長させた。Ｐ１形質導入：大腸菌株ＤＭＥ５５８のＰ１_vir溶解産物を用いて、完全なo mpＡ遺伝子が欠損した株［シルハビーらの「エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョン」，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８６年）］ＢＲＥ５１にテトラサイクリン耐性マーカーを形質導入した［ブレマー，Ｅ．らの「FEMS Microbiol.L ett.」,３３：１７３〜１７８（１９８６年）］。光学密度がおよそ０.６ＯＤ₆₀ _0nm ｎｉ達するまで、ompＡ遺伝子にきわめて接近しているテトラサイクリン耐性マーカーを含む株ＤＭＥ５５８を、ＬＢ培地中で成長させた。培養物１０mlおよび１×１０⁹ＰＦＵのＰ１_virを含有する溶液０.１mlに、１ミリリットルの１０分の１の０.５ＭＣａＣｌ₂を加えた。該培養物を３７℃で３時間インキュベートした。この時点で、細菌の細胞密度は目に見えて減少した。１ミリリットルの半分のクロロホルムを加え、該ファージ培養物を４℃で貯蔵した。通常、１〜２％の大腸菌染色体を各ファージにパッケージングしうるので、生産されたファージの数は、ompＡ遺伝子に隣接したテトラサイクリン耐性マーカーを含めて、細菌の宿主染色体全体をカバーする。次に、ompＡ遺伝子が欠損している株ＢＲＥ５１をＬＢ培地中、３７℃で一夜成長させた。一夜培養物を新鮮なＬＢで５０倍に希釈し、２時間成長させた。遠心分離によって細胞を除去し、ＭＣ塩に再懸濁させた。１ミリリットルの１０分の１の細菌細胞を、０.０５の上記ファージ溶解産物と混合し、室温で２０分間インキュベートした。その後、等量の１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、細菌細胞を１２.５μg／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ平板上に置いた。平板を３７℃ で一夜インキュベートした。テトラサイクリン耐性（１２μg／ml）形質導入体を後記ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析にて、ＯmpＡタンパク質の発現の欠損についてのスクリーニングを行った。抗生物質に耐性がある細菌は、ompＡ遺伝子がこの株から欠失したところに非常に近い染色体中の位置に取り込まれたテトラサイクリン耐性遺伝子をもつ。この特殊な株をＢＲＥ−Ｔ^Rと名づけた。次いで、上記と同じ方法を用いて、株ＢＲＥ−Ｔ^Rでファージ生産の第２ラウンドを行った。このファージ集団の典型には、テトラサイクリン耐性遺伝子とom pＡ欠失の両方が含まれている。次いで、これらのファージを集め、貯蔵した。次いでこれらのファージを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に感染させた。感染後、細菌はテトラサイクリン耐性マーカーを含んだ。それに加えて、テトラサイクリンを含むＬＢ平板上でompＡ欠失が選択される確率が高くなった。該平板上で成長した細菌のコロニーを、ＬＢ培地中で別々に成長させ、ＯmpＡタンパク質の存在について試験を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットでの抗体反応性によって判定したところ、実験用に選択されたこれらのコロニーのすべてにおいてＯmpＡタンパク質が欠損していた。該ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ブレイクおよびゴッチュリッチの「J.Exp.Med.」,１５９：４５２〜４６２（１９８４年）に記載されているレムリの方法［レムリ，Ｕ.Ｋ.の「Nature」,227：６８０〜６８５（１９７０年）］を応用して行った。最初にペーパーをメタノールに浸す以外は、トウビンらの方法［トウビン，Ｈ．らの「Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.」,７６：４３５０〜４３５４（１９７９年）］にしたがって、イムオビロン（Immuobioon）Ｐ［ミリポア・コーポレイション製、マサチューセッツ州ベッドフォード］への電気泳動をおこなった。ウエスタンブロットは、フォスファターゼ複合試薬でプローブした［ブレイク，Ｍ.Ｓ.らの「Analyt.Biochem.」,１３６：１７５〜１７９（１９８４年）］。実施例５外層膜タンパク質Ｐ２の発現成熟Ｐ２および融合Ｐ２構築物を用いて発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔompＡを形質転換した。形質転換平板を３０℃で培養した。これらの平板から両方のタイプのコロニーを単離して分析した。実質的にすべての形質転換物が所望のプラスミドＤＮＡを含んでいることがわかった。次いでクローンを含む各種の融合Ｐ２および成熟Ｐ２のタンパク質発現を分析した。クローンを誘導し、０．４％グルコースおよびアンピシリンの代わりに１１８μＭのカルベニシリンを含むＬＢ培地中で、通気速度１００〜１５０rpmで約３０℃にて成長させた。Ｐ２タンパク質の発現を、培養物の総大腸菌タンパク質の０.１mlを、８〜１６％勾配のＳＤＳゲル（図１および図２を参照）上をロードさせることによって分析した。実施例６外層膜タンパク質Ｐ２の精製および再生大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔompＡ［ｐＮＶ−３］をルリアブロス中で中央（ｍｉｄ）対数増殖期まで成長させた（６００nmにおけるＯＤ＝０.６）。次いでイソプロピルチオガラクトシドを加え（最終的に０.４mＭ）、細胞をさらに３時間３０℃で成長させた。次いで細胞を収穫し、数倍容のＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，０.２ＭのＮａＣｌ，１０mＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）で洗浄し、細胞ペーストを−７５℃で凍結貯蔵した。精製するために、約３gの細胞を解かし、９mlのＴＥＮ緩衝液に懸濁させた。リゾチーム(シグマ製，０.２５mg/ml)、次いでデオキシコレート（シグマ製，１ .３mg/ml）＋ＰＭＳＦ（シグマ製，１０μg/ml）を加え、混合物を室温で１時間緩やかに振とうした。この間に、細胞は溶解し、放出されたＤＮＡのため、溶液の粘度が上昇した。次いでＤＮアーゼ（シグマ製，２μg/ml）を加え、溶液を室温で１時間、再度混合した。次いで、ＳＡ−６００ローターにて、１５Ｋrpmで３０分間混合物を遠心分離し、上清を捨てた。次いで、ペレットを１０mlのＴＥＮ緩衝液に２回懸濁させ、上清を捨てた。次いで、ペレットを１０mlの８Ｍ尿素（ピアス製）／ＴＥＮ緩衝液に懸濁した。別法として、ペレットを１０mlの６Ｍグアニジン塩酸塩（シグマ製）／ＴＥＮ緩衝液に懸濁した。混合物を緩やかに撹拌して固まっている部分をほぐした。懸濁液を２０分間、あるいは均質な懸濁液が得られるまで超音波処理した。１０mlの１０％３,１４−両性イオン剤水溶液を加え、溶液を完全に混合した。溶液を再度１０分間の超音波処理に付した。残留不溶物を遠心分離によって除去した。次いで、この混合物を、１００mＭトリスＨＣｌ，１ＭのＮａＣｌ，１０mＭのＥＤＴＡ，２０mＭのＣａＣｌ₂および０．０５％の３，４−両性イオン剤，ｐＨ８.０で平衡化したセファクリル３００（ファルマシア製）の１８０×２.５cmカラムに狂した。流速は１ml/分に維持した。１０mlのフラクションを集めた。ゲル濾過中に、ポーリンは三量体に再生した。各フラクションのＯＤ_280nmを測定し、ポーリン含有フラクションをポーリン用ＳＤＳゲル電気泳動アッセイに付した。ポーリンを含有するフラクションを合わせ、４℃で３週間貯蔵した。４℃でインキュベート中に、コンフォメーションの変化が起こった。これは、塩濃度が上昇することなくタンパク質が溶液中に残るために必要であった。次いで、５０ mＭトリスＨＣｌ，２００mＭのＮａＣｌ，１０mＭのＥＤＴＡおよび０．０５％の３，４−両性イオン剤，ｐＨ８.０にて、合わせたフラクションを透析した。次いで、同じ緩衝液で平衡化したファースト・フロウＱ（ファルマシア製）カラム（２．５ｘcm）に、この物質を供した。次いで、結合しなかったタンパク質を出発緩衝液で溶出させた。次いで、カラムを０.２〜２.０ＭのＮａＣｌ勾配に供した。ポーリンは勾配の中心の直前に溶離した。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで検定し、最も純粋なフラクションを合わせ、０．０５％の３，１４−両性イオン剤を含むＴＥＮ緩衝液で透析した。実施例７酸化Ｈib莢膜多糖の天然インフルエンザウイルスＰ２タンパク質へのカップリング酸化Ｈib莢膜多糖(10.4mg)を、マンソンンらの「J.Clin.Investig.」,７２：６７７〜６８４（１９８３年）に記載の方法によって精製した天然ＨibＰ２タンパク質(３.１mg)に加え、５％オクチルグルコシドを含む０．２Ｍリン酸緩衝液０．２１mlに溶解した。多糖が溶解した後、水素化シアノホウ素ナトリウム(７m g)を加え、反応溶液を３７℃で４日間インキュベートした。次いで反応混合物を、０．０１％シメロサールを含有する０.１５Ｍの塩化ナトリウム溶液で希釈し、を用いるＢiogel Ａ−１.５ｍ（バイオーラド製）を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって分離した。空容量近くに溶離するシングルピークとして複合体（Ｈib−ＰＰ）が得られた。シアル酸およびタンパク質に体する複合体溶液の分析から、該複合体が４３重量％の多糖からなることが示された。Ｐ２タンパク質は複合体中４４％の収率で、多糖は１２％の収率で回収された。異なる実験におけるタンパク質の回収率は、通常５０〜８０％の範囲であり、多糖の回収率は９〜１３％である。実施例８天然のＨib−ＰＰ複合体を用いる免疫原性の研究免疫原性の研究を以下のように行った。Ｈib−ＰＰ複合体および同様の操作でカップリングさせて製造したＨibテタナストキソイド（Ｈib−ＴＴ）複合体の免疫原性を、７週齢のニュージーランドシロウサギにおいて検定した。該多糖複合体（１０μg）を０、７および１４日目に投与し、２８日目に血清を採集した。複合体は生理的食塩水溶液として投与した。多糖抗原に体する血清ＥＬＩＳＡ力価を下記の表１に示す。表１中の“ＰＰ”は、Ｂ型インフルエンザウイルスから精製された外層膜ポーリンタンパク質Ｐ２を表す。Ｅagan株と等価であるＨib株Ａ２から単離された天然のＰ２タンパク質に結合したＨib多糖を含む複合ワクチンによる、ウサギの免疫感作から生産したポリクローナル抗血清を用い、精製組換えＰ２および組換えＰ２を発現した大腸菌から誘導された溶解産物の両方についてウエスタンブロット分析を行った。ウエスタンブロットに用いた抗血清は、予めＥＬＩＳＡ分析を行って、抗多糖力価が８５００および抗Ｐ２力価が６００００であることが解っている。図８に示した結果から、Ｈib細菌から誘導された天然のＰ２タンパク質を含む複合ワクチンによる、ウサギの免疫感作から生産したポリクローナル抗血清が、ウエスタンブロットにおいて、組換えＰ２とよく反応することが示される。このことは、天然および組換えＰ２タンパク質の間に分割されたエピトープの存在を示す。高発現大腸菌系から精製された組換えＰ２は、以下の局面において、Ｂ型インフルエンザウイルスから精製された天然のＰ２と似ている。第１に、天然および組換えＰ２タンパク質の間に分割されたエピトープの存在を示すウエスタンブロットにおいて、インフルエンザウイルス由来の天然のＰ２に対する抗体は、高発現大腸菌系からの組換えＰ２とよく反応した。第２に、Ｐ２はポーリンである。他のグラム陰性菌のポーリンと類似して、Ｐ２は、３つの独立したポリペプチド鎖からなり、それらの天然の三量体コンフォメーションにおいて、細菌の外層膜に、親水性の電圧依存性チャンネルを形成する。精製された組換えＰ２は、Ｓuperose１２(ファルマシア製)を用いるゲル濾過クロマトグラフィーで示されるように三量体である。組換えＰ２は、分子量１２０ｋＤａに対応してカラムから溶出する。インフルエンザウイルス由来の天然のＰ２およびネイセリア・メニゲチジスのクラス２および３ポーリンなどの他の細菌ポーリンもまた類似したプロファイルで溶出した。再生されなかったＰ２は、可溶化されず、サイズカラムにおいてモノマーとして溶出した。図３に示すように、ＣａＣｌ₂の添加は、三量体コンフォメーションでのＰ２の再生を補助する。本明細書中に言及されたすべての文献は本発明の参考文献である。本発明を明確にし、理解を深める目的で、幾つかの特定の詳細により説明したが、本発明を考慮することにより変更および修飾を施し得ることは当業者には理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 7804−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ソッパー，トーマス・エスアメリカ合衆国20707メリーランド、ローレル、ゴーマン・アベニュー8216番アパートメント374 (72)発明者リャン，シュー−メイアメリカ合衆国20817メリーランド、ベセスダ、リバー・ロード6627番

Claims

【特許請求の範囲】１.(ａ)選択可能なマーカーおよび (i)成熟Ｐ２タンパク質および (ii)Ｔ７遺伝子のφ１０キャプシドタンパク質の１〜２２番のアミノ酸に融合した成熟Ｐ２タンパク質を含む融合タンパク質からなるグループから選択されたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによって大腸菌を形質転換し［ここで該遺伝子はＴ７プロモーターに機能的に結合する］；および (ｂ)該形質転換された大腸菌を、グルコースおよび選択剤を含むＬＢ培地中で約３０℃にて成長させる［ここで、生産されたタンパク質は大腸菌内で発現された総タンパク質の約２％以上である］ことを特徴とする、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の組換え外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)の大腸菌内での高濃度発現方法。２.該タンパク質(Ｈib-Ｐ２)が大腸菌内で発現された総タンパク質の約１０％以上である請求項１に記載の方法。３.該タンパク質(Ｈib−Ｐ２)が大腸菌内で発現された総タンパク質の約４０％以上である請求項１に記載の方法。４.該ベクターが、ｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ(＋ )およびｐＥＴ−９ａからなるグループから選択される請求項１に記載の方法。５.該ベクターが発現プラスミドｐＥＴ−１７ｂのＴ７プロモーターに機能的に結合したＨib-ｐ２遺伝子を含む請求項１に記載の方法。６.(ｃ)工程ｂで得られた大腸菌を溶解することにより、該タンパク質を封入体として放出させ； (ｄ)工程ｃで得られた封入体を緩衝液で洗浄することにより、混在する大腸菌細胞タンパク質を除去し； (ｅ)工程ｄで得られた封入体を変性剤の水性溶液中に再懸濁および溶解し； (ｆ)工程ｅで得られた溶液を界面活性剤で希釈し；および (ｇ)可溶化されたタンパク質をゲル濾過によって精製することを特徴とする請求項１に従って得られた外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を精製する方法。７.(ｃ)工程ｂで得られた大腸菌を溶解することにより、該タンパク質を封入体として放出させ； (ｄ)工程ｃで得られた封入体を緩衝液で洗浄することにより、混在する大腸菌細胞タンパク質を除去し； (ｅ)工程ｄで得られた封入体を変性剤の水性溶液中に再懸濁および溶解し； (ｆ)工程ｅで得られた溶液を界面活性剤で希釈し； (ｇ)可溶化されたタンパク質をゲル濾過によって精製し；および (ｈ)タンパク質が再生するまで該ゲル濾過生成物を高濃度のＮａＣｌおよびカルシウムイオンを含有する水性溶液中に約４℃で貯蔵することを特徴とする請求項１に従って得られた外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を再生する方法。８.請求項７に記載の方法に従って生産された実質的に純粋なＢ型インフルエンザウイルス由来の再生外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質。９.動物においてＢ型インフルエンザウイルスに対する保護抗体を誘発するための有効量で投与される、請求項７に記載の方法に従って生産されたＢ型インフルエンザウイルス由来の外層膜タンパク質Ｐ２(Ｈib−Ｐ２)あるいはその融合タンパク質、ならびに医薬的に許容し得る希釈剤、担体または賦形剤を含むワクチン。１０.該外層膜タンパク質Ｐ２がヘモフィルス莢膜多糖に複合している請求項９に記載のワクチン。１１.(ｉ)請求項７の記載の方法に従って外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を生産し； (ｊ)ヘモフィルス莢膜多糖を得；および (ｋ)工程ｉの外層膜タンパク質Ｐ２あるいはその融合タンパク質を、工程ｊの多糖に複合させることを特徴とするＰ２タンパク質またはＰ２タンパク質−多糖複合体を生産する方法。１２.請求項１の方法にしたがって生産したＨib−Ｐ２タンパク質あるいはその融合タンパク質を、細菌性髄膜炎を予防するための有効量で動物に投与することを特徴とする動物における細菌性髄膜炎の予防方法。１３.ベクターｐＮＶ−３。１４.ベクターｐＮＶ−２。１５.ベクターｐＮＶ−６。