KR910002693B1 - 면역 강화 - Google Patents

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바이오엔터프라이즈 프로프라이어터리 리밋티드
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Abstract

내용 없음.

Description

면역 강화
공격성병원체(박테리아성, 비루스성 또는 매개체)에 대해 동물을 보호하기 위하여 숙주내에서의 감염방어 면역반응을 유도하기 위함으로서 전체 유기체 또는 병원체의 서브유니트 같은 것으로 동물에 예방접종하는 것이 때로 권장된다. 그러한 항원성 공격에 대해 생성되는 면역반응은 면역강화용 약제 또는 보조약의 합동투여에 의해 때로 증가된다. 이들 약제의 가장 좋은 것은 저장형 보조약(완전 프로인드 보조액, 불완전 프로인드 보조액 및 몬타니드와 같은)이다. 이들 보조약은 항원주사후 단독 주사된 항원에 의해 함유되는 수준의 50 내지 100배까지 항체 반응을 증가시킬 수 있다.
완전 프로인드 보조액, 불완전 프로인드 보조액 및 몬타니드와 같은 보조약은 항원에 대한 면역반응을 크게 증진시킬 수 있지만 몇몇 결점이 있다. 주사형태로 항원과 사용되었을때 주사 부위에 커다란 반점이 때로 형성되고, 이 상황은 사람, 애완동물 또는 식용동물에의 사용에는 불만족스러운 경향이 있다. 게다가, 이들 보조약은 경구 또는 장내투여시 면역 강화용 약제와 같은 작용을 하지 못한다.
발명의 개시
본 발명은 화학적 또는 유전학적으로 면역원 또는 합텐(hapten)과 결합되었을때 복합체가 비경구, 장내 또는 경구 투여되는가의 여부에 관계없이 면역원 또는 합텐에 대한 숙주의 면역반응을 증진시킬 수 있는 분자종류에 관한 것이다. 더불어 그들의 사용은 주사부위에 커다란 반점의 형성을 유발하지 않는다.
이런 활성을 가지는 분자는 막단백질의 일반적 특성을 가진다고 규정될 수 있고 여기에 기술되는 실시예들은 막단백질, 보다 구체적으로는 그램 음성균(Gram-negative bacteria)의 외막 단백질의 특이한 형이다. 인용된 실시예는 특히 TraT 단백질, 혈청에 의해 죽을수 있는 이들 스트레인의 내성에 반응할 수 있는 대장균의 특정한 스트레인의 외막 단백질을 포함한다. 이 종류의 다른 단백질은 대장균 외막 단백질 OmpA 및 OmpF이다. TraT, OmpA 또는 OmpF(이하 담체라함)의 양이 생쥐의 근육내로 보조약없이 주사되면, BSA, 플라젤린 또는 약 IgG같은 가용성 단백질이 불완전 프로인드 보조액과 혼합된후 주사되었을때 유도되는 것과 비교할만한 항체 반응이 유도된다. 실제로, 이들 외막 단백질에 의해 유도되는 항체반응은 불완전 프로인드 보조액으로 애주베이션(adjuvation)에 의해 단지 최소 증가된 것만큼 높다.
또한, TraT 또는 OmpA의 경구 투여는 항-TraT(1/4098) 또는 항-OmpA(1/892) 혈청 항체의 중요한 타이터의 촉진을 유발한다는 것이 발견되었다.
유사하게 TraT를 함유하는 살모넬라 또는 대장균의 적당량(109-1010)을 외막에 공급하는 것은 또한 항-TraT 항체생성을 증진한다는 것이 발견되었다.
합텐(디니트로페놀,DNP), 펩티드(CSP) 또는 단백질(우혈청 알부민, BSA)의 OmpA 또는 TraT와의 공유 커플링(coupling) 또한 DNP, CSP 또는 BSA에 대한 면역반응을 증진하기 위해 작용한다.
첫번째 구체예에서, 본 발명은 담체분자와 커플된 면역원을 포함하는 복합제를 제공하는데, 그러한 담체분자는 복합체가 비경구, 장내 또는 경구 투여되는가의 여부에 관계없이 복합체가 숙주에 투여되었을때 증진되는 면역원에 대한 상기 숙주의 면역반응을 유발하고, 상기 면역원은 항원 또는 합텐의 어느 하나를 포함하고, 상기 담체분자는 원핵생물 또는 진핵생물 오리진의 막내재성 단백질을 포함한다.
바람직한 구체예에서 담체분자는 그램음성균의 외막 단백질이다.
상기 그램 음성균은 대장균 또는 살모넬라 종인 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는 담체분자는 TraT 단백질 또는 대장균 스트레인에 의해 생성되는 외막 단백질 OmpA 또는 OmpF이다.
본 발명의 바람직한 면역원으로는 CSP, 로타비루스 스트레인의 비루스 캡시드 단백질 VP7, 및 진핵세포의 단백질 민악티빈의 모두 또는 일부가 있다.
면역원-담체 복합체는 화학적 방법 : 예를들어 적당한 포합용 또는 결합용 시약의 사용에 의한 포합(conjugation) 및 : 변형 및/또는 담체 및/또는 면역원에 존재하는 작용기의 반응에 의해 형성될 수 있다.
그로써, 본 발명은 담체분자와 커플된 면역원을 포함하는 복합체의 제조방법을 제공하는데, 상기 담체분자는 원핵생물 또는 진핵생물 오리진의 막내재생 단백질(imp)이고, 상기 면역원은 항원 또는 합텐의 어느 하나를 포함하며, 담체분자는 복합체가 비경구, 장내 또는 경구투여 되는가의 여부에 관계없이 복합체의 숙주에 투여되었을때 증진되는 면역원에 대해 숙주의 면역반응을 유발하며, 상기 방법은 다음 단계의 하나 또는 그 이상을 포함한다 :
a) 상기 복합체를 형성하기 위한 연결된 면역원과 담체와의 반응 ; b) 화학적 연쇄를 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 제공하기 위한 면역원의 화학적변형, 및 상기 복합체를 형성하기 위한 변형된 면역원과 담체와의 반응 ; c) 화학적 연쇄를 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 제공하기 위한 담체의 화학적 변형 및 상기 복합체를 형성하기 위한 면역원과 담체와의 반응 ; d) 화학적 연쇄를 형성할수 있는 작용기를 제공하기 위한 면역원과 담체의 화학적인 변형, 및 상기 복합체를 형성하기 위한 변형된 면역원과 변형된 담체와의 반응 ; e) 면역원과 적어도 하나의 연결용 시약의 반응 및 상기 복합체를 형성하기 위한 면역원과 담체분자와의 반응 ; f) 담체와 적어도 하나의 연결용 시약의 반응 및 상기 복합체를 형성하기 위한 면역원과 연결된 담체와의 반응 ; g) 면역원 및 담체와 적어도 하나의 연결용 시약과의 반응 및 상기 복합체를 형성하기 위한 연결된 면역원과 연결된 담체와의 반응.
발명의 바람직한 방법은 :
i) 화학적 연쇄를 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 제공하기 위한 면역원의 화학적 변형 ; 및 ii) 상기 복합체를 형성하기 위한 변형된 면역원과 담체와의 반응을 포함한다.
연결용 시약은 이황화 결합을 포함하거나 산, 염기 또는 과요소산염에 의해 갈라질수 있다. 그러한 연결용 시약의 실례로는 N-(4-아지도페닐티오)프탈이미드, 4,4'-디티오비스페닐아지드, 디티오비스-(숙신이미딜 프로피오네이트), 디메틸-3,3'-디티오비스 프로피온이미데이트, 2HCl, 3,3'-디티오비스-(술포숙신이미딜 프로피오네이트), 에틸-4-아지오도페닐-1,4-디티오부티르이미데이트, HCI, N-숙신이미딜-(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트, 술포숙신이미딜-2-(m-아지도-0-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트, 술포숙신이미딜-2-(p-아지도살리실아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 술포숙신이미딜-(4-아지도페닐 디티오)-프로피오네이트, 및 2-이미노티올레인이 있다.
바람직한 교차 연결용 시약은 디숙신이미딜 타르트레이트 및 비스- 2-[-(숙신이미딜옥시카보닐옥시)-에틸]술폰이다.
적당하게도, 담체와 면역원의 연결은 담체와 면역원의 적당한 기의 커플링에 의해 이루어질수 있다.
면역원-담체 복합체는 화학적 포합, 예를들어, 적당한 포합용 또는 연결용 시약의 어느하나의 사용에 의해 형성되고, 바람직한 포합용 또는 연결용 시약으로는 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드, 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조산-n-히드록시숙신이미드에스테르, 또는 N,N1디 사이코헥실카보디이미드가 있다.
면역원과 담체분자 사이의 연쇄는 히브리드 단백질 분자의 제조에 의해 또한 만들어지고, 마치 면역원을 코드하는 DNA의 담체를 코드하는 DNA 서열로의 삽입 또는 첨가에 의한 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 것과 같다.
그러므로, 발명은 담체분자와 면역원의 상기 복합체의 제조방법을 제공하고, 제조방법은 히브리드 단백질 분자의 제조를 포함한다. 바람직한 방법에서 히브리드 단백질 분자는 면역원을 코드하는 DNA의 담체를 코드하는 DNA 서열로의 삽입 또는 첨가에 의한 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다.
발명은 또한 면역원의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열과 융합하는 원핵생물 또는 진핵생물 오리진의 막내재성 단백질의 적어도 일부는 코드하는 서열로 작용하는 DNA 서열을 포함하는 제1DNA 서열 ; 또는 상기 제1DNA 서열과 교잡하고 천연, 합성 및 반합성 공급원을 포함한 어떤 공급원으로부터도 얻어지는 제2DNA 서열 ; 단일 또는 다중 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 돌연변이에 의해 상기 제1DNA 서열과 관련된 DNA 서열 ; 또는 발현시, 전술한 히브리드 DNA 서열 및 삽입분의 발현시의 어느 코돈(codon)을 코드하는 폴리펩티드와 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 코돈의 서열을 포함하는 DNA 서열로 이루어지는 히브리드 DNA 서열을 제공한다.
발명의 바람직한 히브리드 DNA 서열은 최종의 TraT-(OmpF 또는 OmpA)히브리드 단백질이 숙주세포 표면에 이동,노출시키는 것과 같은 면역원의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열과 연결된 TraT, OmpF 또는 OmpA의 적어도 일부를 코드한다.
발명은 또한 이동가능한 프로모터(portable promoter)와 융합하는 발명의 히브리드 DNA 서열을 포함하는 융합된 유전자를 제공한다. 발명에 따르는 바람직한 프로모터는 박테리오파지 람다의 PL프로모터이다.
나아가, 발명을 발명에 따르는 히브리드 DNA 서열과 벡터 DNA를 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하는데 이중 벡터 DNA는 플라스미드, 박테리오파지, 비루스 DNA 또는 코스미드 DNA이다.
발명의 바람직한 재조합 DNA 분자로는 히브리드 DNA 서열과 활발하게 연결된 발현제어 서열이 있다.
발명에 따르는 특별히 바람직한 재조합 DNA 분자는 pBTA371, pBTA439, pBTA449, pBTA450 및 pBTA586이다. 발명에 따르는 히브리드 DNA 서열의 클로우닝 베히클내로의 도입을 포함하는 재조합 DNA 분자의 제조방법은 발명의 범위내에 있다.
발명은 또한 발현제어 서열의 클로우닝 베히클내로의 도입 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
발명은 또한 발명에 따르는 적어도 하나의 재조합 DNA 분자로 형질 전환된 숙주를 제공한다.
적당한 숙주는 대장균 및 살모넬라 종이다.
바람직한 형질전환체는 ATCC 67331(KCTC 8327 P) (또는 CCTCC 87026으로 표시)이다.
또한 발명의 범위내에 숙주를 형질전환시키는 과정이 포함되어 있는데 그 과정은 숙주내로 발명에 따르는 재조합 DNA 분자의 도입단계를 포함한다.
추가의 구체예에서 발명은 액성 및 점막항체 반응을 유도하기 위한 숙주로의 비경구조사 또는 경구 또는 장내투여에 대해 채택된 담체와 면역원의 복합체를 제공한다.
발명의 범위내에 숙주에의 비경구, 장내 및 경구투여를 위해 채택된 형태로 담체와 면역원의 복합체의 제조방법이 포함되고 이 방법은 복합체의 제조와 그것의 약리적으로 수용가능한 희석액에의 첨가를 포함한다.
바람직하게도 발명은 면역시스템을 나타내기 위해 박테리아 세포표면에 노출되어 있는 발명에 따르는 히브리드 단백질을 포함하는 전체 세균 세포백신을 제공한다. 전세포 백신은 살아있는 또는 죽은 전세포 경구백신일 수 있다. 또는 히브리드 단백질은 세포막 또는 세포구성성분으로부터 정제될수 있고 비경구, 장내 또는 경구 투여되는 서브 유니트 백신으로 사용된다.
발명은 또한 적어도 하나의 면역원과 원핵생물 또는 진핵생물 오리진의 imp의 적어도 일부를 포함하는 담체를 포함하는 히브리드 단백질의 생합성에 대한 유전정보로 미생물의 제조방법을 제공하는데, 그러한 최종 히브리드 펩티드는 숙주 세포 표면에 노출되고 이 방법은 필요한 유전정보를 운반하는 미생물 배양을 포함한다. 미생물이 서브 유니트 백신을 제공하기 위해 사용될때는 방법은 부수적으로 세포막 또는 세포 구성성분으로부터의 히브리드 단백질의 정제를 포함한다.
발명을 수행하기 위한 최선의 형태
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예을 예시하고, 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 면역원과 결합되었을때 복합체가 비경구, 장내 또는 경구투여되는가의 여부에 관계 없이 면역원에 대한 숙주의 면역 반응을 증진시킬 수 있는 분자 종류에 관한 것이다.
[스트레인의 기탁]
대장균 스트레인인 ATCC 67331을 미합중국 메릴랜드주 20852, 락빌리, 파크로운 드라이브 12301에 있는 아메리카 타입 컬춰 콜렉션에 1987년 3월 2일에 기탁하였다(수리번호 KCTC 8327P하에 1987년 12월 21일에 한국 과학기술원(KAIST)에 기탁하였다).
제1도는 보조약에 의한 면역반응의 변형
토끼에 TraT(제1a도), BSA단독(제1b도) 또는 다양한 보조약을 결합하여 근육내 주사하였다. TraT와 BSA는 F.I.A.(
Figure kpo00002
-
Figure kpo00003
) ; 몬타니드888(●-●), 알히드로겔(□-□) ; 염수(X-X)와 혼합되었다(제 1a+1b 도). 생성된 항체반응의 식염수로 주사된 TraT와의 비교(X-X), OmpA와의 비교(■-■) 및 OmpF와의 비교(○-○)가 제 1c 도에 나타나 있다.
제2도는 TraT와 OmpA의 커플링에 의한 DNP 및 BSA에 대한 항체반응의 촉진.
다니트로페닐레이트로되어 제조된 TraT(+-+), OmpA(X-X) 및 BSA(▼-▼)가 주사후의 항-담체를 자극하는 그들의 활성(제2a도) 및 항-DNA 항체반응(제 2b 도)에 대해 비교되었다. TraT에 대한 항체반응(●-●) 및 OmpA 단독 주사에 대한 항체반응(■-■)이 또한 측정되었다. 유사하게 BSA가 식염수로 주사되고(○-○), FIA에 혼합(▼-▼)되거나 TraT에 공유 포함(▽-▽) 또는 OmpA에 공유 포함(□-□)되고 항-BSA 반응이 측정되었다(제 2c 도). 이들 포합체에 대한 항-TraT 및 항-OmpA는 제 2a 도에 나타난다. imp의 면역강화 활성은 BSA가 TraT와 공유연결되어 주사되었을때(▽-▽) 또는 OmpA와 공유연결되어 주사되었을때(□-□), BSA가 TraT와 혼합되었을때(▲-▲) 또는 OmpA와 혼합되었을 때 (■-■) 또는 BSA가 TraT로 부터 분리된 곳에 주사되었을때(
Figure kpo00004
-
Figure kpo00005
) 또는 OmpA로 부터 분리된 곳에 주사되었을때(●-●) 조사되었다(제2d도).
제3a도는 플라스미드와 pBTA449, pBTA439 및 pBTA371의 구조를 나타낸다.
제3b도는 TraT와 TraT-VP7 융합단백질의 발현에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴을 나타낸다.
제3c도는 TraT(레인 1), TraT-VP7(레인 3) 및 콘트롤(레인 2)를 발현하는 표지된 대장균의 세포 표면의 자동방사선 사진을 나타낸다. 세포는125I와 락토페록시다제로 표지되었다.
제4a도는 플라스미드 pBTA450 및 pBTA586의 구조를 나타낸다.
제4b도는 pBTA586으로 부터 발현되는 TraT 민악티빈 히브리드 단백질(TraTMIN)의 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 나타낸다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
약어(제 3 도 및 4 도) : ~에 대한 내성 ; 암피실린
Apr: 클로르암페닐콜 cmr: 염화 제 2 수은
Hg+: 테트라사이클린 Tc : VP7 구조유전자
VP7 : TraT 구조유전자 TraT : TraT VP7 유전자 융합
TraT-VP7 : 람다 박테리오파지 PL프로모터 영역, PL: 제한효소
A1,AluI : A,AvaI : D,DraI : B, BamHI : E,EcorI : N,NdeI : Pv.PvuII : Rv,EcoRV : Ss,SspI
TraT,OmpA 및 OmpF의 단리
대장균(플라스미드 pBTA439를 함유하는 BTA1352스트레인)을 발효기에서 MEB 배지에서 30℃에서 배양하였다. 42℃에서 TraT의 열유도를 2시간한후 세포를 수확하였다. 박테리아를 아미콘 DCIOLA 농축기에서 0.1μ중공섬유 카트리지를 사용하여 2리터로 농축하였다. 그후 세포를 10리터의 증류수로 세척하고 800㎖로 재농축하였다. 농축물로 부터 박테리아 슬러리를 제거하고 외막 단백질(TraT, OmpA 및 OmpF)을 200㎖의 1M 아세트산나트륨완충액 pH 2.5, 이어서 40% 에탄올에 10% 세트리미드(sigma)와 1M CaCl2가 들어있는 용액 1리터의 첨가에 의해 세포로부터 추출하였다. 추출은 박테리아가 원심분리(17,000×g,20분)에 의해 제거된후, 실온(RT)에서 밤새도록 진행되었다.
TraT 및 OmpF가 에탄올의 50%까지의 첨가 및 원심분리(40000×g,10분)에 의해 상징액으로부터 침전되었다. 다시 OmpF는 에탄올의 80%까지의 첨가에 의해 최종 상징액으로부터 침전되었다.
이온교환 크로마토그라피
OmpF 및 TraT를 함유하는 50% 에탄올 펠릿을 0.5% 쯔비터젠트(Zwittergent)를 함유하는 20mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0에 재현탁시키고, 0.1% 쯔비터젠트를 함유하는 20mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0으로 앞서 평형화 시킨 5×50㎝의 DEAE 세파로오스(Pharmacia Fine Chemicals) 컬럼상에 걸었다. TraT는 컬럼을 통과해 흐르고, 결합된 OmpF는 평형완충액에서 0 내지 1.0M NaCl의 선구배를 사용하여 컬럼으로 부터 용리하였다. 분급을 라엠리 방법(Laemmli, U.K.NATURE(LOND)227 ; 680 1970 ; Salit et al., J. Exp. Med. 151 ; 716. 1980)의 변형을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하고 단리된 TraT 또는 OmpF를 함유하는 분급을 한곳에 모아 에탄올 침전에 의해 농축시켰다.
세파크릴 S-300 크로마토그래피
OmpA를 함유하는 80% 에탄올 펠릿을 1% SDS를 함유하는 20mM Tris.HCl, pH 8.8에 재현탁시켰다. 분급을 모으고 SDS-PAGE로 분석하고 OmpA를 함유하는 분급을 한곳에 모아 에탄올 침전에 의해 농축시켰다.
상기 방법에 의해 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 시험되고 Tsai C.M.과 Frasch, C.E. 방법(Anal, Biochem 119 : 115(1982))에 의해 은염색하였을때 유리 LPS임을 발견하였다.
담체의 디니트로페닐레이션(Dinitrophenylation)
TraT,OmpA 및 OmpF를 Little과 Eisen의 방법 "면역학 및 면역화학의 방법"(E.D.Williams, CA와 Chase, M.W.) 제 1 권, 페이지 128, 아카데믹 출판사, N.Y.(1967)에 따라 디니트로페닐 레이트화 하였다. 단지, 담체(0.1M carb/bicarb 완충액, pH 9.5)만이 RT에서 밤새도록 0.1M DNFB 용액(아세톤의)과 반응하였다. 단백질을 그후 커플링 완충액에 대해 광범위하게 투석하였다.
글루타르 알데히드 커플링
우청 알부민(BSA) (Sigma Chemical Co. St. Louis, Miss. 로부터 얻음)을 아브라메우스등의 두단계 글루타르 알데히드 방법(1978)을 사용하여 TraT, OmpA 및 OmpF와 커플시켰다. 단지, BSA가 0.2% 글루타르알데히드와 R.T.에서 2시간동안 반응하였다. 단백질을 그후 carb/bicarb 완충액, pH 9.5에 대해 밤새도록 투석하고 이어서 BSA : omp의 몰비가 1 : 1로 omp를 첨가하고 RT에서 24시간동안 반응시켰다. 마지막으로 에탄올아민(Sigma)을 최종농도 0.1M(1hr,RT)이 될때까지 첨가하고, 이어서 0.1M carb/bicarb 완충액, pH 9.5에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다.
항원투여
1. 토끼
뉴질랜드 백색토끼(2 내지 2.5㎏)에 0.5㎖의 멸균 생리식염수중의 항원으로 근육내 주사하였다. 주사는 0일과 36일에 행하였다. 주마다 토끼귀의 세로 정맥에서 채혈하여 TraT, OmpA, BSA 또는 DNP- 양 IgG를 피복항원으로 사용하여 표준 ELISA에 의해 항체 타이터를 측정하였다.
2. 생쥐
암컷 C57BL/6J 생쥐(18 내지 22그램)을 동물공급센타(Porth, 웨스턴 오스트레일리아)로부터 얻었다. 모든 생쥐를 항원의 경구 또는 근육내(i.m.)투여에 앞서 3 내지 4시간 동안 굶겼다. 생쥐에 항원을 0.1M 카브/비카보네이트 완충액, pH 9.5의 0.5㎖내에 적당한 농도로 특별히 제조된 공급 바늘을 사용하여 공급하였다. 0.1㎖의 멸균 생리염수내의 항원과 같은 양을 좌측 뒷다리에 근육내 주사하였다. 경구 또는 근육내로 항원을 받아들인 다섯마리 생쥐군에 0일과 14일에 두배의 항원을 투여하였다. 14일과 21일에 후방 궤도 플렉서스로부터 혈액 샘플을 취하였다(대략 0.5㎖). 그후 생쥐의 목을 잘라죽인후 장기(gut) 세척을 다음방법으로 소장에 대해 수행하였다. 소장을 조심스럽게 떼어낸후 소량의 세척용 완충액(1.0㎖의 30mM Tris.HCl, pH 8.8 0.9% NaCl, 50mM EDTA에 1.0% 트윈 20이 첨가되어 있음)을 끝이 무딘 공급 바늘을 경유하여 장기의 관장에 도입하였다. 조심스럽게 장을 반죽한 후 내용물을 집게손가락과 엄지손가락으로 짜냈다. 그렇게 얻어진 세척 장기를 즉시 부스러기를 제거하기위해 원심 분리하고 검정할때까지 -20℃에 보관하였다. 혈액 샘플은 혈청의 제거 및 -20℃에서의 저장전에 4℃에서 응고되었다.
효소 연결된 이뮤노조벤트(immunosorbent) 검정(ELISA)
항체 타이터의 측정을 위한 ELISA는 러셀-죤스등에 의해(J.Exp.Med 160 : 1467, (1984)) 앞서 기술된 바와같이 수행되었다. 타이터는 항혈청 희석에 상당하게 나타났고 이것은 37℃에서 45분후에 ELISA 0.5를 기록했다.
[실시예 2]
막내재성 단백질에 대한 항체 반응상의 보조약의 효과 imp가 근육내 주사되었을때 셀프 애주벤트(self adjuvanting) 분자로서 작용하는 잠재력이 있는가를 시험하였다. TraT(제 1a 도, X-X) 또는 BSA(제 1b 도, X-X)를 단독으로 주사하였을때 생성되는 항체 타이터를 TraT(제 1a 도) 또는 BSA(제 1b 도)를 다수의 보조약과 혼합하여 주사하였을때 생성되는 것과 비교하였다.
식염수중의 TraT의 근육내 투여는, 면역성을 주는 약제에 대한 혈청 항체의 높은 타이터를 재빨리 유도한다(제 1a 도). 실제적으로 식염수중의 TraT에 의해 생성된 타이터는 단지 몬타니드 또는 FIA 같은 보조약의 이 항원의 주사에 의한 4 내지 8배의 인자에 의해 증가될 수 있다(제 1a 도). 이것은 가용성 항원 BSA에 의해 생성되는 반응과는 정반대이다.
이 경우 빈약한 항체 반응이 식염수중의 투여된 항원에 대해 생성되었지만, FIA 또는 몬타니드의 항원의 주사에 의해서는 60 내지 100배로 현저하였다.
유사하게 식염수 단독중의 OmpA 및 OmpF의 주사가 또한 높은 혈청 항체 타이터를 유도하였다. 실제로, 놀랄만큼 유사한 항체 타이터가 100㎍의 TraT, OmpA 및 OmpF의 주사에 의해 유도되었다(제 1c).
[실시예 3]
면역원-imp 복합체의 애주벤팅 능력의 시험 TraT와 OmpA의 항-합텐(DNP) 및 항-단백질(BSA) 반응을 늘리기 위한 능력에 대해 시험하였다.
두개의 imp를 디니트로플루오로벤젠을 사용하여 DNP와 치환하였거나(실시예 1참조) BSA와 글루타르알데히드 교차 연결(실시예 1 참조) 한후 근육내 주사하였다.
DNP또는 BSA의 각 TraT 또는 OmpA와의 커플링은 항-imp 반응의 생성에 거의 영향을 미치지 못하였다.(제 2a 도, 제 1c 도 비교). 그러나 imp의 디니트로페닐레이션은 항-DNP 반응을 염수에 주사되었을때 DNP-BSA에 대해 나타내는 반응보다 약 4 내지 16배 높게 증가시켰다(제 2b).
유사하게 항-BSA 반응은 BSA가 FIA에 투여되었을때 크게 증가되었다(제 2c 도). TraT 또는 OmpA의 항-BSA 반응에 대한 면역강화효과는 BSA가 imp와 공유연결되어 있을때 가장 컸다.
실제로 imp로 부터 떨어져 있는 곳에 BSA를 주사하는 것은 BSA에 대한 제 2 반응을 떨어 뜨린다(제 2d 도 및 제 2c 도 비교).
[실시예 4]
TraT에 대한 면역반응상의 투여량의 효과
근육내 또는 온스당 투여된 TraT의 투여량의 증가 효과가 생쥐에서 시험되었다.
다섯마리 생쥐군이 TraT의 증가하는 투여량으로 근육내 주사 또는 경구 공급에 의해 면역성을 부여받았다. 생쥐는 0일과 14일에 투여 받았다. 21일에 생쥐를 죽여 세척된 장기를 얻었다. 항체 타이터는 ELISA에 의해 증가되었다.
표 1 에서 보는 바와같이 경구 또는 비경구 투여된 TraT의 증가하는 투여량은 혈청 항-TraT 항체 반응에서 투여량에 의존하는 증가를 유도하였다.
그러나 비경구 투여가 경구투여보다 훨씬 보다 효과적이었다.
[표 1]
Figure kpo00006
[실시예 5]
항-DNP 반응에 대해 담체로서 작용하는 imp의 능력에 대한 합텐 밀도의 시험
TraT, OmpA 및 OmpF를 실시예 1에서 기술한 바와같이 DNP : imp의 상이한 비율로 치환하였다. 다섯마리 생쥐군에 0일과 14일에 DNP : 담체 복합체를 50㎍ 근육내 주사하였다. 21일에 생쥐를 죽여 항체 타이터를 ELISA로 측정하였다.
DNP의 담체에 대한 치환 비율이 0.5 : 1에서 4 : 1로 증가함에 따라 항-합텐 반응도 상당히 증가하였다. 10 : 1 보다 큰 치환은 항-합텐 반응의 감소를 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00007
[실시예 6]
TraT 커플링에 의한 항-CSP 반응의 생성
다음 서열 : NH2Cys(Asn Pro Asn Ala)4의 피.팔시파룸(P.falciparum)의 서컴스포로조이트 단백질(circumsporozoite protein, CSP) 항원으로부터 유도된 합성 펩티드를 합성하고 펩티드 항원에 대한 TraT의 보조효과를 시험하기 위해 TraT를 포함하기 위해 사용하였다.
CSP 항원을 글루타르 알데히드 또는 말레이미드 벤조산 n-히드록시 숙신 이미드 에스테르(MBS)의 어느 하나를 사용하여 TraT와 커플시켰다. 이 방법으로 제조한 포합체를 a) 토끼에 0일 ; 28일에 주사하고 38일에 죽이거나, 또는 b) 다섯마리 생쥐군에 0일과 14일에 주사하고 21일에 죽였다. 항체 타이터를 앞서 기술한 바와같이 측정하였다.
글루타르알데히드 또는 MBS를 사용하여 TraT와 커플된 CSP 항원으로 토끼 또는 생쥐에 면역성을 부여하는 것은 항원이 BSA와 커플되어 몬타니드로 주사되었을때 나타나는 것과 비교할 만한 항-CSP 반응의 촉진을 유발하였다.
[표 3]
Figure kpo00008
[실시예 7]
TraT-면역원 단백질 복합체의 유전적 구조
TraT 단백질을 코드하는 유전자는 R 플라스미드 R100(또는 R6-5) 상에 위치하고 이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 결정되어있다(Ogata et al,J.Bacteriol 151 ; 819-827).
TraT는 동시에 세포 표면에 드러나고 내부구조인 펩티드 글라칸과 결합되어 있는 외막에 위치한 올리고머 리포단백질이다. 이러한 사실을 이용하여 다중복사 플라스미드 pBR329안에 TraT를 함유하는 R100 플라스미드 6.0kbEcoRI 단편을 초기 클로우닝함으로써 플라스미드 벡터를 만들었다(제 3a 도). 추가의 원하지 않는 3kb BamHI 단편의 삭제와 EcpRV 영역에 M13 mp8의 작은 블런티드 엔드 HaeⅢ 단편에 삽입에 의한 비활성화가 pBRA449를 만들었다. 이 벡터 플라스미드는 직접 TraT를 합성하는 천연 TraT 프로모터를 함유한다.
TraT(또는 연속적으로 만들어진 TraT-히브리드 단백질)의 발현은 강한 람다 박테리오파지 PL프로모터로 약한 TraT 천연 프로모터를 대신함으로써 커질 수 있다(예를들면, 제 3a 도의 플라스미드 pBTA439 또는 제 4 도의 pBTA586).
TraT 유전자는 외래 DNA 서열이 삽입될 수 있는 EcoRV 부위(pBTA449에 독특함)를 포함하고 TraT와 코드된 외래 단백질간의 융합은 곧바로 세포 표면에 전달되어 세포 표면에서 외래 단백질 단편의 노출을 유발한다.
한 실시예에서 비루스 캡시드 단백질(VP7)에 대한 유전자를 TraT-VP7 히브리드 단백질을 형성하기 위해 사용하였다. VP7은 로타비루스의 구조단백질이고 정제된 VP7 단백질에 대해 유발된 항체는 세포배양에서 비루스 감염성을 효과적으로 중성화 한다(Dyall-Smith etal 1985 In Infectious Diarrhoea in the young ed.S.Tzipori). 그로써 적당하게 발현된 형태의 VP7 단백질은 로타비우스 백신에 포함되는 제 1 후로타비루스 NCDV VP7 유전자의 AIuI PVu Ⅱ 제한단편을 플라스미드 pBTA449의 EcoRV 부위로 클로운하였고 연속적으로 PL프로모터로 과잉 발현시켰다(제 3a 도의 pBTA371). 발현에 대해 플라스미드 pBTA371을 열에 부서지기 쉬운 람다의 CI 리프레서를 함유하는 대장균 K-12 스트레인 N4830(Joyce etal PNAS80, 1830-1834 1983)을 형질 전환하기 위해 사용하였다. pBTA371로 형질전환된 세포를 MEB배지(Mott et al PNAS82,88-92 1985)에서 100㎍/㎖의 암피실린으로 30℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 MEB 배지로 희석하고 30℃에서 OD600이 1.0이 될때까지 배양한후 예온한 (65℃)MEB 배지를 동량 42℃의 형액에 첨가하였다. 세포를 42℃에서 4시간 배양한후 수확하고 TraT-VP7 히브리드 단백질의 유도에 대해 시험하였다. 대장균 N4830에서 높은 수준의 TraT-VP7 단백질 복합체 발현(10 내지 15% 총 세포 단백질 또는 세포당 500,000 복사체 보다 많음)을 관찰하였다. 이 복합체의 상당부분이 외막분급에 나타났다(제 3b 도, 3c 도).
또 다른 실시예에서 TraT 단백질을 코드하는 서열의 일부와 모두 또는 일부의 원핵생물 단백질 민악티빈을 코드하는 서열의 히브리드인 단백질을 제조하는 방법을 다음과 같다.
제 4 도에 도시된 플라스미드 pBTA440을 SspI과 DraI으로 소화시켜 1110bp 단편을 아가로오스 겔로부터 단리하였다. 이 단편을 EcoRV로 소화시킨 벡터 pBTA449와 연결반응시켜 pBTA450을 만들었다. pBTA450을 AvaI으로 소화시켜 정제한 2800bp 단편을 AvaI으로 소화시킨 플라스미드 pLK57과 반응시켜 플라스미드 pBTA586을 만들었다.
이것은 민악티빈을 코드하는 서열을 람다 PL프로모터의 제어하에 놓이게 하고 TraT 유전자의 처음 80 아미노산을 코드하는 서열과 융합하여 그중 처음 20이 신호서열과 치환하여 대장균의 외막에 히브리드가 나타나는 결과를 유발한다. 이 신호서열은 외막으로의 수송중에 잘려지고, 그것이 TraT 단백질이 정상적인 위치이다.
플라스미드 pBTA586이 N4830 같은 적당한 숙주로 형질 전환되었을때, 그리고 상기 기술된 바와같이 온도 이동으로 유도되었을때 TraT-민악티빈 히브리드 단백질은 제4b도에 나타난 바와같이 외막 분급에 나타난다.
[실시예 8]
외막에 TraT를 발현하는 스트레인의 경구 공급
암컷 C57B1/65 생쥐(20 내지 25g)에 그들의 외막에 TraT를 발현하는 109내지 1010의 박테리아(대장균 또는 S.typ himurium의 gaIE 돌연변이)를 공급하였다. 콘트롤에는 TraT 단백질이 없는 동일한 스트레인을 공급하였다. 일주일 후 생쥐를 죽여서 항-TraT 타이터를 앞에서 대략 설명한 것과 같이 측정하였다.
결과를 표 4에 상호 항체 타이터와 10마리 생쥐의 평균치로 나타내었다.
[표 4]
Figure kpo00009
산업상 이용성
본 발명은 사람, 애완동물 및 식용동물에 사용하기 위한 백신의 제조에 유용하고, 경구 또는 비경구 투여의 항원에 대한 반응 강화에 일반적으로 유용하다.

Claims (39)

  1. 면역원에 커플링된 담체분자로 이루어진 복합체의 제조에 대한 화학적 방법에 의해 담체분자와 면역원의 커플링으로 이루어진 방법에 있어서, 상기 담체분자는 상기 복합체가 비경구, 장내 또는 경구 투여되는가의 여부에 관계없이 상기 복합체가 숙주에 투여되었을때 상기 면역원에 대한 상기 숙주의 면역 반응의 증진을 유발하고, 상기 면역원은 항원 또는 합텐으로 구성되는 군에서 선택되고 상기 담체분자는 그램 음성균의 TraT 또는 OmpA 또는 OmpF 단백질로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 그램 음성균은 대장균 또는 살모넬라 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 막단백질은 TraT인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항, 제3항 또는 5항 중 어느 하나에 있어서, 면역원은 CSP, CSP 합성펩티드 NH2Cys(Asn Pro Asn Ala)4, 로타 비루스로부터의 비루스 캡시드 단백질 VP7, 단백질 민악티빈과 민악티빈에 유일한 단백질 민악티빈의 부분으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 커플링은 포합용 또는 연결용 시약의 어느 하나의 사용으로 이루어진 화학적 포합에 의하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포합용 또는 연결용 시약은 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드, 글루타르 알데히드, m-말레이미도 벤조산 n-히드록시 숙신이미드 에스테르 또는 N,N1디사이코헥실 카보디이미드인 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 연결용 시약은 이황화 결합을 함유하거나 산, 염기 또는 과요소산염에 의해 갈라지기 쉬운 것을 특징으로 하는 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 연결용 시약은 N-(4-아지도페닐티오)프탈이미드, 4,4'-디티오비스페닐아지드, 디티오비스-(숙신이미딜프로피오네이트), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트 2HCl, 3,3'-디티오비스-(술포숙신이미딜프로피오네이트), 에틸-4-이지도페닐-1,4-디티오부티르이미데이트, HCl, N-숙신이미딜-(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트, 술포숙신이미딜-2-(m-아지도-0-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트, 술포숙신이미딜-2-(p-아지도살리실아미도)-에틸-1,3' 디티오프로피오네이트, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 술포숙신이미딜-(4-아지도페닐디티오)프로피오네이트, 2-이미노티올레인 디숙신이미딜 타르트레이트 및 비스-[2-(숙신이미딜옥시카르보닐옥시)-에틸]술폰으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 다음 단계의 하나 또는 그 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법 : a) 상기 복합체를 형성하기 위한 담체와 면역원의 반응 ; b) 화학적 연쇄를 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 제공하기 위한 면역원의 화학적인 변형 및 상기 복합체를 형성하기 위한 변형된 면역원과 담체와의 반응 ; c) 화학적 연쇄를 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 제공하기 위한 담체의 화학적 변형 및 상기 복합체를 형성하기 위한 면역원과 변형된 담체와의 반응 ; d) 화학적 연쇄를 형성할수 있는 작용기를 제공하기 위한 면역원 및 담체의 화학적인 변형 및 상기 복합체를 형성하기 위한 변형된 면역원과 변형된 담체와의 반응 ; e) 면역원과 적어도 하나의 연결용 시약의 반응 및 상기 복합체를 형성하기 위한 연결된 면역원과 담체분자와의 반응 ; f) 담체와 적어도 하나의 연결용 시약의 반응 및 상기 복합체를 형성하기 위한 면역원과 연결된 담체와의 반응 ; g) 면역원 및 담체와 적어도 하나의 연결용 시약의 반응 및 상기 복합체를 형성하기 위한 연결된 면역원과 연결된 담체와의 반응.
  10. 제9항에 있어서 (i) 화학적 연쇄를 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 제공하기 위한 면역원의 화학적 변형 ; 및 (ii) 상기 복합체를 형성하기 위한 변형된 면역원과 담체와의 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 면역원에 커플링된 담체분자로 이루어진 복합체의 제조에 대한 담체분자와 면역원의 유전자적 결합으로 이루어진 방법에 있어서, 상기 담체분자는 상기 복합체가 비경구, 장내 또는 경구 투여되는가의 여부에 관계없이 상기 복합체가 숙주에 투여되었을때 상기 면역원에 대한 상기 숙주의 면역반응의 증진을 유발하고, 상기 면역원은 항원 또는 합텐으로 구성되는 군에서 선택되고 상기 담체분자는 그램 음성균의 TraT, OmpA 또는 OmpF 단백질의 전부 또는 일부인 것을 특징으로 하는 복합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 복합체는 히브리드 단백질 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 히브리드 단백질 분자가 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 재조합 DNA 기술은 담체를 코드화하는 DNA 서열에 면역원을 코드화하는 DNA를 삽입 또는 첨가하는 것을 특징으로 하는 히브리드 DNA 서열의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 히브리드 DNA 서열은 면역원과 융합하는 그램 음성균의 TraT, OmpA 또는 OmpF 단백질의 전부 또는 일부로 이루어지는 담체분자로 이루어지는 복합체를 코드화하는 서열로 이루어진 제1DNA 서열 ; 또는 천연, 합성 및 반합성 공급원을 포함하는 모든 공급원으로부터 얻어지는, 상기 제1DNA 서열과 교잡하는 제2DNA 서열 ; 단일 또는 다중 염기 치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 돌연변이에 의해 상기 제1DNA 서열과 관련된 DNA 서열 ; 또는 발현시, 어느 하나의 전술한 히브리드 DNA 서열 및 삽입분의 코돈의 발현시 코드화된 폴리펩티드와 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화하는 코돈의 서열을 포함하는 DNA 서열로 이루어지고, 상기 담체분자는 상기 면역원에 대한 숙주의 면역반응의 증진을 유발하며, 그러한 상기 증진은 상기 복합체가 비경구, 장내 또는 경구 투여되는가의 여부에 관계없이 상기 숙주에 투여되었을때 발생하고 상기 면역원은 항원 또는 합텐으로 구성된 군에서 선택되는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 히브리드 DNA 서열은 면역원과 융합하는 TraT의 적어도 일부를 코드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항 또는 16항에 있어서, 상기 히브리드 DNA 서열은 숙주세포의 표면에 이동되고 표면상에 노출될 수 있는 TraT, OmpF 또는 OmpA 히브리드 단백질을 코드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 히브리드 DNA 서열이 이동 가능한 프로모터와 융합하여 융합된 유전자를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 이동가능한 프로모터는 박테리오파지 λ의 PL프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제14항에 히브리드 DNA 서열 또는 제 18 항의 융합된 유전자를 벡터 DNA에 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자의 제조방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 벡터 DNA는 플라스미드, 박테리오파지, 비루스 또는 코스미드 오리진의 것임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 재조합 DNA 분자 pBTA371, pBTA439, pBTA449, pBTA450 또는 pBTA586인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 발현제어 서열의 벡터 DNA로의 도입을 부수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 약학적 허용 희석액으로 혼합되어 숙주에 비경구, 경구 또는 장내 투여를 위한 제1항에 의해 생성되는 복합체로 이루어진 조성물의 제조방법에 있어서, 복합체를 제조하고 그것을 약학적 수용 가능한 희석액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 4 항에 있어서, 면역원은 CSP인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제9항 또는 제10항에 있어서, 면역원은 CSP, CSP 합성펩티드 NH2Cys(Asn Pro Asn Ala)4, 로타 비루스로부터의 비루스 캡시드 단백질 VP7, 단백질 민악티빈과 민악티빈에 유일한 단백질 민악티빈의 부분으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 면역원이 CSP인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제11항에 있어서, 면역원은 CSP, CSP 합성펩티드 NH2Cys(Asn Pro Asn Ala)4, 로타 비루스로부터의 비루스 캡시드 단백질 VP7, 단백질 민악티빈과 민악티빈에 유일한 민악티빈의 부분으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 면역원이 CSP인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제23항에 있어서, 발현제어 서열이 히브리드 DNA 서열과 활발하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 숙주의 형질전환에 있어서, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항 및 제30항 중 어느 하나에 의해 생성된 재조합 DNA 분자를 숙주에 삽입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 숙주가 대장균 또는 살모넬라종인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 히브리드 단백질이 미생물의 표면상에 노출되는 히브리드 단백질을 생합성하는 유전정보를 가진 미생물의 제조와 필수적인 유전정보를 운반하는 미생물을 배양함에 있어서, 상기 담체는 그램 음성균의 TraT, OmpA 또는 OmpF 단백질의 전부 또는 일부이고 상기 면역원은 항원 또는 합텐으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물 제조방법.
  34. 제33항에 있어서, 면역원은 CSP, CSP 합성펩티드 NH2Cys(Asn Pro Asn Ala)4, 로타 비루스로부터의 비루스 캡시드 단백질 VP7, 단백질 민악티빈과 민악티빈에 유일한 민악티빈의 부분으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역원이 CSP인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 서브유니트 백신에 있어서, 제33항의 방법으로 생성되는 미생물의 세포막 또는 세포 구성성분으로부터 제 12 항의 히브리드 단백질을 정제하는 것을 특징으로 하는 서브유니트 백신의 제조방법.
  37. 전체 박테리아 세포 백신에 있어서, 박테리아 세포 표면상에 노출되어 면역시스템에 제공되는 제12항의 히브리드 단백질로 이루어지고, 히브리드 단백질의 발현에 적당한 조건하에서 제33항의 방법에 의해 생성되는 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 전체 박테리아 세포 백신의 제조방법.
  38. 제37항에 있어서, 백신은 살아있거나 죽은 전체 세포 경구 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 약학적 허용 희석액으로 혼합되어 숙주에 비경구, 경구 또는 장내 투여를 위한 제 11 항에 의해 생성되는 복합체로 이루어진 조성물의 제조방법에 있어서, 복합체를 제조하고 그것을 약리학적 수용 가능한 희석액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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