PT892054E - Vacina de clostridium perfringens - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Vacina de Clostridium perfringens" O presente invento refere-se a derivados imunogénicos desintoxicados de toxina β de Clostridium perfringens, ADN que codifica tais derivados, bactérias de Clostridium perfringens incluindo ADN que codifica tais derivados, sistemas de expressão bacterianos Gram-positivos incluindo ADN que codifica tais derivados, sistemas de expressão bacterianos Gram-positivos não baseados em Clostridium perfringens que expressam toxina β de tipo selvagem, vacinas para combater Clostridium perfringens com base neles, métodos para a preparação de toxina β nativa de Clostridium perfringens, métodos para a preparação de derivados imunogénicos desintoxicados de toxina β de Clostridium perfringens e a métodos para a preparação de vacinas para combater Clostridium perfringens. Clostridium perfringens (também conhecida como C. welchii) é uma espécie do vasto género Clostridium. Todas as bactérias pertencentes a este género são bacilos Gram-positivos anaeróbicos formadores de esporos. A espécie C. perfringens pode ser subdividida em subespécies. Foram descritas cinco subespécies. Estas subespécies são em geral conhecidas como "tipo" A-E. Todas as subespécies produzem várias toxinas, tanto toxinas principais como secundárias. As quatro toxinas principais são as toxinas α, β, ser. Todos os tipos C. perfringens produzem a toxina α. A toxina β é produzida por C. perfringens dos tipos B e C. Além disso, uma gama de toxinas secundárias é produzida por todos os tipos de C. perfringens. É principalmente devido à presença de uma ou mais destas várias toxinas nos cinco tipos de C. perfringens, que todas as espécies C. perfringens são patogénicas.

Sabe-se que o tipo A é patogénico tanto para o homem como para porcos. O tipo B é principalmente patogénico para cordeiros, carneiros e cabras e causa "disenteria do cordeiro" e enterite hemorrágica. O tipo C é patogénico para o homem, carneiro, vitelo, cordeiro, porco e pássaros. É a causa de "ataque", enterite hemorrágica, enterite necrótica e enterotoxemia. 2 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Tal como supramencionado, sabe-se que tanto C. perfringens do tipo B como do tipo C produzem toxina β. Sabe-se que a toxina β desempenha um papel importante na patogénese de enterite necrótica tanto no homem como em animais. No homem, esta doença foi denominada doença de Pigbel (Johnson et al. : Lancet ii: 496-500, (1987)). Em animais, a enterite necrótica foi descrita em vitelos, cordeiros e porcos (Hauschild, A.H.W. em S. Kadis, T.C.Montie, (ed.) Microbial toxins, p. 159-188. Academic press, Inc, Nova Iorque (1971) e Willis, T.A. Anaerobic bacteriology: clinicai and laboratory practice, 3a ed. Butterworths, Londres (1977). A toxina β de Clostridium perfringens foi isolada em forma pura (Sakurai et al. , Infect. & Immun. 18 : 741-745 (1977), Sakurai et al., Toxicon 25: 1301-1310 (1987)). Ainda não se sabe muito sobre as propriedades biofísicas da toxina e portanto sobre o seu modo de acção. No entanto, devido ao facto de ter sido possível obtê-la numa forma purificada , foi demonstrada claramente a toxicidade da toxina β em animais. A toxicidade letal da toxina β purificada para, por exemplo, ratinhos e porquinhos-da-índia foi demonstrada por Sakurai et al. (Infect. & Immun. 21: 678-680 (1978), Sakurai et al., Toxicon 25: 1301-1310 (1987)).

Recentemente, foi elucidada a sequência de ácidos nucleicos da toxina β de Clostridium perfringens por Hunter et al. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)). A sequência de ácidos nucleicos revelou que o tamanho da proteína de toxina β é cerca de 35 kD.

Devido ao facto do papel da toxina β de Clostridium perfringens do tipo B e C em patogénese ser de grande importância, tem havido um grande esforço no desenvolvimento de imunidade contra esta toxina. A imunidade contra a toxina β é suficiente para proteger contra infecção por Clostridium perfringens do tipo B e tipo C. A única maneira de induzir imunidade contra a toxina β é administrar a toxina ao animal a ser protegido. É no entanto óbvio que a toxina deve ser administrada numa forma desintoxicada, dado que de outra forma a administração levaria a doença grave ou morte do animal a ser vacinado. 3 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

As vacinas baseadas em toxina β desintoxicada, também denominada toxóide β, já estavam disponíveis à volta de 1960 (por exemplo, Patente G.B. N° 901 433 e Patente U.S. N° 3 288 680).

Todas as vacinas actualmente disponíveis baseadas em toxina β inactivada de Clostridium perfringens apresentam contudo várias desvantagens importantes.

Em primeiro lugar, todas as vacinas baseadas em toxina β incluem toxina β desintoxicada quimicamente, principalmente desintoxicada com formalina, e demonstrou-se ao longo dos anos que é muito difícil padronizar estes processos de desintoxicação química.

Apresenta-se um exemplo de uma tal vacina anti-Clostridium baseada na desintoxicação com formalina de toxinas de Clostridium em pedido de Patente R.U. GB 2 030 51.

Os métodos químicos clássicos para a desintoxicação de proteínas apresentam a desvantagem de alterarem a estrutura global da proteína de uma maneira bastante aleatória. Como resultado, durante o processo de desintoxicação química, as propriedades imunogénicas da toxina β também diminuem rapidamente. Tal pode ser comprovado por exemplo nos gráficos 1 e 2:

Formalina vs título 100

o rH 3 •P Ή •P 10 1 _u Jf í ' « ! 1 · ' ; ; . / 1 ------Λ -[- 1 / / 1 / / 1 ^ í /' Λ __ 1 j ·*** - ^ a--c 1 a_ _c % de formalina 3% ?% 1% 0.5% 0,25% 30 Mg/ml 6 Mg/ml -*-1.2 Mg/ml 0.24 pg/ml

Gráfico 1 4 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ % de animais mortos nos grupos 100 m o +> Ô060

(0 •H § •H G cd <l> Ό <#> 40 20 0 3% 2%

0,25% % de formalina 30 pg/ml 6 pg/ml 1.2 pg/ml W\ 0.24 pg/m!

Gráfico 2 no gráfico 2 mostra-se que é necessário formalina, um composto de inactivação muito usualmente utilizado, a pelo menos 1% para desintoxicar a toxina β em determinadas condições padrão. No entanto, pode verificar-se nos gráficos 1 e 2 que o titulo de antigenicidade diminui drasticamente com uma quantidade crescente de formalina. Não é possível obter um título completo de nenhuma maneira, porque mesmo a menor quantidade de formalina necessária para desintoxicação (gráfico 2) já apresenta uma diminuição do título. Tal implica que existe apenas uma gama muito estreita, em que se pode obter tanto desintoxicação com um título razoável e consequentemente imunogenicidade. Dada esta gama muito estreita e o facto de existirem pelo menos três variáveis; tempo de desintoxicação, temperatura e concentração precisa de formalina, é evidente que é muito difícil produzir reprodutivelmente toxina β desintoxicada. É assim muito desejável uma outra abordagem para a desintoxicação de toxina β. Ainda não foi encontrada até agora nenhuma alternativa aceitável pela seguinte razão: o equilíbrio delicado entre um nível suficiente de desintoxicação e imunogenicidade remanescente implica uma estreita relação entre, por um lado, a estrutura da proteína e, por outro, as propriedades biológicas da proteína. Não 5 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ seria de esperar por isso que fosse possível alterar a estrutura da proteína e assim desintoxicar a proteína, sem ao mesmo tempo prejudicar significativamente as características imunogénicas da proteína.

Constitui um dos méritos do presente invento o facto de revelar pela primeira vez uma maneira de evitar o problema supramencionado: utilizando técnicas de manipulação genética, verificou-se surpreendentemente que podem ser mutadas regiões de aminoácidos específicas e relativamente extensas para proporcionar os derivados não tóxicos pretendidos da toxina β sem prejudicar significativamente as suas propriedades imunogénicas necessárias.

Assim, numa concretização, o invento refere-se aos derivados imunogénicos desintoxicados de toxina β de Clostridium perfringens ou um seu fragmento imunogénico, contendo pelo menos uma mutação na sua sequência de aminoácidos que não se encontra na toxina β de tipo selvagem, tal como definido nas reivindicações.

Entenda-se que um seu fragmento imunogénico é um fragmento que, embora não inclua a sequência de aminoácidos completa do derivado da toxina β, inclui ainda as regiões do derivado que são capazes de induzir uma resposta imunitária protectora no animal hospedeiro e inclui a mutação tal como definido nas reivindicações.

Entenda-se que uma mutação é uma alteração da sequência de aminoácidos do derivado de toxina β comparativamente à sequência de aminoácidos da toxina β de tipo selvagem. A mutação é uma substituição, deleção, inserção ou inversão, ou uma sua combinação. Uma mutação pode ser, por exemplo, de tal forma que um ou mais aminoácidos da toxina β são substituídos por outros aminoácidos, com diferentes características. Constitui uma substituição adequada, por exemplo, a substituição de um aminoácido carregado negativamente por um carregado positivamente, tal como a substituição de aspartato por lisina. Constitui outra substituição adequada o de um aminoácido aromático por um alifático: por exemplo, triptofano por glicina. É também 6 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ adequada a substituição de um aminoácido hidrófobo por um hidrófilo, tal como por exemplo isoleucina por aspartato.

Assim, o invento numa forma preferida refere-se a derivados de toxina β de acordo com o invento, em que pelo menos uma mutação é uma mutação de substituição. É evidente que fazem também parte do invento além da substituição, mutações que envolvem a inserção e/ou deleção de um ou mais aminoácidos que proporcionam derivados não tóxicos de toxina β, também capazes de induzir resposta imunológica. Assim, numa forma igualmente preferida, o invento refere-se a derivados de toxina β de acordo com o invento, em que pelo menos uma mutação é uma deleção ou inserção.

Quando se efectuam duas ou mais mutações, são igualmente possíveis combinações de mutações de substituição e deleção/inserção.

Considera-se que um derivado de toxina β é não tóxico se a sua LD5 0 (dose letal que mata 50% de todos os animais numa experiência) em ratinhos é pelo menos dez vezes maior do que a LD50 da toxina β nativa. A LD50 da toxina β nativa é de cerca de 0,15 pg/ratinho.

Tal como mencionado, um dos méritos do invento é o facto de, contrariamente ao que se assumia na arte, se ter verificado que é possível alterar geneticamente a sequência de aminoácidos da toxina β de modo a obter um toxóide não tóxico mas ainda imunogénico. No entanto, nem todas as mutações levarão aos derivados de toxina β não tóxicos mas ainda imunogénicos pretendidos. Assim, desenvolveu-se um ensaio para rastreio e selecção rápidos de mutantes que produzem um derivado não tóxico de toxina β que ainda é imunogénico. Este ensaio permite o rastreio de um elevado número de mutantes que produzem derivados de toxina β não tóxicos mas ainda imunogénicos. Este ensaio será revelado infra.

Também se verificou que as regiões que formam um domínio de transição entre partes neutras e hidrófilas da toxina β são adequadas como regiões alvo para introduzir mutações que 7 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ originam derivados não tóxicos de toxina β com as caracteristicas pretendidas.

Estas regiões podem ser facilmente investigadas por aplicação do algoritmo de Hopp-Woods à seguência da toxina β (Hopp e Woods; Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 3824-3828 (1981)).

Assim, numa forma mais preferida desta concretização, o invento refere-se a derivados de toxina β com uma mutação que está localizada num dominio de transição entre partes neutras e hidrófilas da toxina β.

As regiões que são muito adequadas como regiões alvo para mutações estão localizadas na posição 62, na posição 182, na posição 197, entre os aminoácidos números 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 relativamente á metionina líder do péptido e a região a jusante da única cisterna na posição de aminoácido 292.

Assim, numa forma ainda mais preferida, o invento refere-se a derivados de toxina β com uma mutação que está localizada em pelo menos uma das regiões na posição 62, 182, 197 e entre os aminoácidos números 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 e/ou a região a jusante da posição de aminoácido 292 relativamente à metionina líder do péptido.

Numa forma ainda mais preferida, as mutações localizam-se na posição 62, nas posições 80-82, nas posições 95-97, nas posições 101-103, na posição 145-147, na posição 182, na posição 197, na posição 287-291, na posição 295-299.

Podem preparar-se derivados não tóxicos de toxina β de acordo com o invento por substituição ou modificação química de aminoácidos na proteína.

Também podem ser preparados por introdução de mutações no gene que codifica a toxina β. Descrevem-se infra métodos para introduzir mutações em fragmentos de ADN. Os fragmentos de ADN mutados podem ser, por exemplo, clonados numa sequência de nucleótido tal como um plasmídeo de expressão adequado e subsequentemente expressos. 8 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Assim, noutra concretização, ο invento refere-se a sequências de nucleótidos incluindo um fragmento de ADN mutado que tem uma caracteristica de codificar um derivado imunogénico desintoxicado geneticamente de toxina β de Clostridium perfringens de acordo com o invento ou um seu fragmento imunogénico.

Tal como mencionado supra, numa forma preferida desta concretização o invento refere-se a derivados de toxina β com uma mutação localizada num domínio de transição entre partes neutras e hidrófilas da toxina β. Tal derivado de toxina β pode ser preparado por expressão de um fragmento de ADN que codifica tal derivado de toxina β.

Assim, numa forma preferida, o fragmento de ADN mutado que codifica os derivados da toxina β tem uma mutação em pelo menos uma região de ADN que codifica um domínio de transição entre partes neutras e hidrófilas dos derivados de toxina β.

Os derivados imunogénicos desintoxicados de toxina β de Clostridium perfringens de acordo com o invento podem, por exemplo, ser obtidos através de mutagénese aleatória do gene que codifica a toxina β. São conhecidas na arte muitas formas de induzir mutagénese aleatória, tal como por exemplo mutagénese induzida quimicamente utilizando agentes químicos mutagénicos, mutagénese por radiação UV ou radiação γ ou mutagénese aleatória utilizando tecnologia de ADN recombinante.

Também podem ser efectuadas mutações a nível do ADN em locais específicos: mutagénese dirigida ao local. Tal é efectuado com o auxílio de técnicas conhecidas de engenharia genética. Por exemplo, é possível utilizar enzimas de restrição para cortar fragmentos de ADN nas regiões alvo ou abrangendo as regiões alvo e substituir estes fragmentos por fragmentos sintéticos com uma sequência mutada. A mutagénese dirigida ao local é também uma técnica muito conveniente para introduzir mutações nas regiões alvo.

Caso a mutação se refira a uma mutação de substituição, o quadro de leitura permanecerá obviamente inalterado. É também 9 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ possível uma combinação de mutações de deleção e/ou inserção e mutações de substituição.

As técnicas de mutação de ADN descritas supra são bem conhecidas na arte e foram descritas, por exemplo, em Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989).

Constitui um sistema de expressão bacteriano adeguado para expressar os derivados de toxina β de acordo com o invento a própria bactéria Clostridium perfringens. O gene de toxina β nativo pode ser facilmente substituído pelo fragmento de ADN mutado que codifica os derivados de toxina β de acordo com o invento utilizando recombinação homóloga. A recombinação homóloga é uma técnica bem conhecida na arte. A bactéria de Clostridium perfringens recombinante assim obtida produz então o derivado imunogénico desintoxicado geneticamente de toxina β de Clostridium perfringens de acordo com o invento.

Assim, ainda em outra concretização, o invento refere-se a bactérias de Clostridium perfringens contendo uma sequência de nucleótidos com um fragmento de ADN mutado tal como descrito supra.

No entanto, surgem vários problemas adicionais durante o isolamento tanto de derivados tóxicos, como derivados não tóxicos alterados geneticamente de toxina β de Clostridium perfringens a partir de Clostridium perfringens. Antes de mais, a cultura de bactérias Clostridium é perigosa, do ponto de vista da saúde dos trabalhadores. A cultura de espécies Clostridium para a produção de toxina β deve ser efectuada em condições de alta segurança o que torna difícil a produção em larga escala.

Em segundo lugar, tal como mencionado anteriormente, são produzidas várias outras toxinas principais/secundárias conjuntamente com a toxina β. O isolamento e purificação da toxina β entre estas outras toxinas, tal como é por exemplo necessário para a produção de vacina, é difícil e demorada. 10 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Em terceiro lugar, as espécies Clostridium são bactérias formadoras de esporos. É necessário mas difícil eliminar todos os esporos da preparação de toxina β e ao mesmo tempo reter as características imunogénicas da toxina β, dado que estes esporos são altamente resistentes ao calor e a produtos químicos.

Assim, existe claramente uma necessidade de métodos para proporcionar toxina β isenta de outras toxinas de Clostridium e isenta de esporos de Clostridium.

Foram descritos anteriormente sistemas de expressão não Clostridium com base na bactéria Gram-negativa E. coli para a expressão de toxina β de Clostridium. Foram utilizados sistemas de E. coli por Hunter et ai. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) para a expressão do gene de toxina β. Apenas se verificou uma pequena banda correspondente à proteína de 34 kD esperada, enquanto que a maior parte da toxina β foi detectada sob formas multiméricas grandes de 118 kD. Steinporsdottir et ai. (FEMS Microbiology Letters 130: 273-278 (1995)) tentou expressar o gene de toxina β em E. coli como uma proteína de fusão fundida a glutationa S-transferase. Tal como Hunter, apenas detectaram toxina β não natural de alto peso molecular. Concluiu-se neste artigo, que a proteína produzida em E. coli tinha uma conformação diferente da toxina β nativa. Parece assim provável que outras proteínas codificadas por Clostridium desempenhem um papel adicional no enrolamento conformacional e excreção da toxina β nativa. Sabe-se que é este o caso para muitas outras proteínas bacterianas excretadas. Por este motivo, dado que tal como mencionado supra existe um equilíbrio delicado entre estrutura e imunogenicidade, não se pode esperar que a toxina β obtida de fontes diferentes de Clostridium perfringens e portanto numa forma não nativa constitua uma base eficaz para uma vacina, independentemente do sistema de expressão utilizado.

Flaxman, D.T. et ai., (Medicai Microbiology and Immunology 185:113/33 (1996)) mencionaram a expressão de toxina β monomérica em Bacillus subtilis. No entanto, eles não discutiram os processos de expressão que utilizaram e tão pouco mencionaram o enrolamento conformacional e consequentemente a imunogenicidade da toxina β assim expressa. 11 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Verificou-se agora surpreendentemente que a expressão do gene de toxina β nativo em bactérias Gram-positivas diferentes de Clostridium perfringens proporciona uma toxina β nativa com todas as caracteristicas e actividades biológicas e biofísicas da toxina β nativa tal como produzida em Clostridium perfringens, mas apresentando várias vantagens altamente desejáveis relativamente à toxina β produzida em Clostridium perfringens ou E. coli: a) não se encontra contaminada com esporos de Clostridium perfringens, b) é produzida isenta de lipopolissacáridos contaminantes, c) é produzida isenta de outras toxinas principais/secundárias de Clostridium e d) encontra-se na sua conformação nativa.

Uma toxina β assim obtida pode ser inactivada com formalina mais vantajosamente do que a toxina β obtida de Clostridium, dado que o único material biológico a ter em consideração durante a inactivação é a própria toxina β: não é preciso ter em conta esporos, lipopolissacáridos e outras toxinas principais/secundárias de Clostridium dado que se encontram ausentes.

Assim, ainda numa outra concretização, o invento refere-se a sistemas de expressão bacterianos Gram-positivos em que a bactéria Gram-positiva não é Clostridium perfringens, em que o referido sistema de expressão inclui o gene que codifica a toxina β de Clostridium perfringens de tipo selvagem. 0 gene de toxina β pode estar sob controlo do seu promotor nativo. Também pode ser colocado sob controlo de um promotor heterólogo. Tal promotor pode ser, por exemplo, o promotor Lac (Chang et ai., Nature 275: 615 (1978)) ou o promotor Trp (Goeddel et ai., N.A.R. 8: 4057 (1980)).

Tal promotor pode ser um promotor forte, levando a sobre-expressão da toxina β ou pode ser um promotor indutível. Ambos os tipos de promotores são conhecidos na arte.

Foram descritos vários sistemas de expressão de bactérias Gram-positivas e são conhecidos na arte vários plasmídeos de expressão versáteis para utilização em várias famílias de bactérias Gram-positivas. Como um exemplo, podem utilizar-se sistemas de expressão baseados em replicão de ρΑΜβΙ de uma 12 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ vasta gama de hospedeiros Gram-positivos de enterococos descrito por Simon e Chopin (Biochimie 70: 559-567 (1988)). Podem ser utilizados derivados deste plasmideo para expressão de genes heterólogos, por exemplo, em espécies Streptococcus, Lactobacillus e Bacillus.

Dentro do grupo de bactérias Gram-positivas não Clostridium, as bactérias cujo genoma tem um teor relativamente elevado de AT são mais adeguadas para clonagem e expressão de genes do género Clostridium. Assim, numa forma mais preferida, a bactéria Gram-positiva utilizada para a preparação da toxina β nativa ou do derivado de toxina β de acordo com o presente invento é seleccionada do grupo de Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus, Sarcina, Ruminococcus ou Listeria. É obviamente ainda mais vantajoso expressar um gene de toxina β mutada de acordo com o invento numa bactéria Gram-positiva diferente de Clostridium: nesse caso o tratamento de desintoxicação com formalina pode ser completamente omitido. O derivado não tóxico de toxina β assim obtido, além de se encontrar isento de esporos, isento de lipopolissacáridos, isento de outra toxinas principais/secundárias de Clostridium e encontrar-se numa forma nativa, apresenta a vantagem adicional de não ser tóxico por si só.

Assim, num forma mais preferida, o invento refere-se a um sistema de expressão bacteriano Gram-positivo, em que a referida bactéria Gram-positiva não é Clostridium perfringens, contendo uma sequência de nucleótidos que codifica um derivado do gene de toxina β de acordo com o invento ou um seu fragmento imunogénico.

Ainda outra concretização do presente invento, refere-se a vacinas para combater infecções por Clostridium perfringens, com base em derivados imunogénicos desintoxicados geneticamente de toxina β de Clostridium perfringens. Tais vacinas podem ser preparadas, por exemplo, por mistura de uma quantidade imunologicamente suficiente de derivados imunogénicos desintoxicados de toxina β de Clostridium perfringens de acordo com o invento e um transportador 13 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ fisiologicamente aceitável. Entenda-se que uma quantidade imunologicamente suficiente é a quantidade de toxina β de Clostridium perfringens imunogénica desintoxicada que é capaz de induzir uma resposta imunológica protectora num animal hospedeiro.

Assim, ainda outra concretização do invento refere-se a vacinas para combater infecção por Clostridium perfringens contendo um derivado de toxóide β de Clostridium perfringens de acordo com o invento ou um seu fragmento imunogénico e um transportador fisiologicamente aceitável.

Constitui um transportador fisiologicamente aceitável, por exemplo, água ou uma solução salina fisiológica.

Frequentemente, a vacina é misturada adicionalmente com estabilizantes, por exemplo para proteger de degradação polipéptidos com tendência a degradação, para melhorar o tempo de armazenagem da vacina ou para melhorar a eficácia de liofilização. Constituem estabilizantes úteis, por exemplo, SPGA (Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), hidratos de carbono, por exemplo, sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glucose, proteínas tais como albumina ou caseína ou seus produtos de degradação e tampões tais como fosfatos de metais alcalinos. É óbvio que estão abrangidos pelo presente invento outros meios para estabilizar a vacina por adição de compostos.

Opcionalmente, podem ser adicionados à vacina um ou mais compostos com actividade adjuvante. Os adjuvantes são estimuladores não específicos do sistema imunológico. Eles aumentam a resposta imunológica do hospedeiro aos imunogénios administrados. Assim, numa forma mais preferida, as vacinas de acordo com o presente invento contêm um adjuvante.

Constituem exemplos de adjuvantes conhecidos na arte o adjuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros em bloco não iónicos, dipéptidos de muramilo, ISCOM (complexos estimulantes imunológicos, conforme por exemplo Patente Europeia EP 109942), saponinas, óleo mineral, óleo vegetal e carbopol (um homopolímero). 14 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Constituem adjuvantes especialmente adequados para aplicação na mucosa, por exemplo, a toxina lábil ao calor de E. coli (LT) ou a toxina da cólera (CT).

Constituem outros adjuvantes adequados, por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou óxido de alumínio, emulsões de óleo (por exemplo Bayol F(R) ou Marcol 52(R), saponinas ou solubilizado de vitamina E. A vacina de acordo com o presente invento pode ser mantida armazenada utilizando métodos conhecidos na arte para armazenar vacinas vivas. A armazenagem pode ser por exemplo efectuada a temperatura negativas.

Também é conhecida a liofilização e é um método adequado para a conservação de vacinas. A liofilização tem a vantagem de estabilizar a vacina de modo que pode ser mantida armazenada a temperaturas bem mais altas do que as necessárias para manter lotes não liofilizados. A vacina de acordo com o presente invento pode ser liofilizada muito eficazmente, especialmente quando é misturada com estabilizantes como os supramencionados antes de liofilização. A vacina pode ser administrada a todos os hospedeiros sensíveis a infecção por Clostridium perfringens do tipo B ou C, tal como o homem, cordeiros, ovelhas, cabras, porcos, aves e vitelos. A vacina pode ser administrada logo ao um dia de idade, mas também pode ser administrada em qualquer altura posterior.

As doses de vacina são de preferência entre 1 e 100 pg do derivado por animal, dependendo parcialmente do tamanho do animal. Por exemplo, para porcos constitui uma dose muito adequada a gama entre 20 e 80 pg.

Embora, em princípio, possam ser utilizadas todas as vias de administração comuns, a vacina é administrada de preferência por via intraperitoneal, intranasal, intramuscular, subcutânea, oral ou intradérmica. 15 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Ainda outra concretização do invento refere-se a uma via alternativa de preparar uma vacina para combater infecções por Clostridium perfringens. Podem ser utilizadas como transportadores do gene de toxina β mutado de acordo com o invento, como descrito supra, bactérias e vírus vivos atenuados ou não patogénicos com um humano ou animal sensível a Clostridium perfringens tipo B ou C como hospedeiro. Estas denominadas vacinas de transportador recombinante vivo podem ser administradas em segurança com um transportador fisiologicamente aceitável: comportam-se como não patogénios e expressam um derivado não tóxico da toxina β. As vacinas baseadas em transportadores recombinantes vivos têm a vantagem de produzirem ou apresentarem derivados da toxina β de Clostridium perfringens directamente no hospedeiro.

Os animais vacinados com tais vírus ou bactérias recombinantes produzirão uma resposta imunogénica não só contra os imunogénios do vector, mas também contra as partes imunogénicas do(s) polipéptido(s) para os quais o código genético é clonado adicionalmente para o transportador recombinante. Tal tem a vantagem de, por administração de tal transportador recombinante, se conseguir protecção contra duas ou mais doenças. São actualmente conhecidos na arte muitos vírus e bactérias recombinantes vivos.

Constituem bactérias transportadoras recombinantes vivas adequadas, por exemplo, a espécie Salmonella e a espécie E. coli. Os vírus frequentemente utilizados na arte como transportadores recombinantes vivos são adenovírus, retrovírus, vírus vaccinia e vírus herpes. É também adequado como um vírus transportador aplicável oralmente específico, o parvovírus porcino. Outro vírus que é útil como vírus transportador recombinante vivo para transportar o gene que codifica o toxóide β é o vírus herpes vírus da pseudo-raiva (PRV) (por exemplo, tal como descrito em Patente Europeia N° 606.437). Tal PRV transportando o gene de toxóide β protegeria porcos contra tanto infecção por PRV, como por Clostridium perfringens tipo C.

Assim, são também parte do invento vacinas para combater infecções por Clostridium perfringens que incluem um organismo 16 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ transportador recombinante vivo transportando o gene de toxina β mutado de acordo com o invento. É evidente que a toxina β nativa é um importante, se não o mais importante, factor de virulência em Clostridium perfringens.

Assim, uma estirpe de Clostridium na qual o gene de toxina β nativo é substituído por um gene de toxina β mutante de acordo com o invento tal como descrito supra perdeu portanto um factor de virulência importante. Tal estirpe pode ser utilizada como uma vacina atenuada viva, dado que a toxina β não é produzida na sua forma tóxica mas sob a forma de um derivado não tóxico. A vantagem de tal vacina atenuada viva é que produz uma forma de toxina β não tóxica mas ainda imunogénica e, além disso, tem todos os outros antigénios imunogénicos da estirpe de Clostridium perfringens nativa.

Assim, as vacinas contendo uma estirpe de Clostridium perfringens atenuada viva em que o gene da toxina β nativo é substituído por um gene de toxina β mutado de acordo com o invento são também incluídas neste invento.

Encontram-se também abrangidas pelo invento vacinas que contêm, além de um derivado de toxina β de acordo com o invento, imunogénios de outros patogénios. Tal permite vacinar contra várias doenças numa etapa de administração de vacina.

Numa forma mais preferida desta concretização, a vacina de acordo com o presente invento inclui imunogénios adicionais, seleccionados do grupo que consiste de Actinobacillus pleuropneumoniae, vírus da pseudo-raiva, vírus Influenza porcina, Parvovírus porcino, vírus da gastroenterite transmissível, rotavírus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, espécie Salmonella, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis e bactérias do tipo Helicobacter. O presente invento também se refere a métodos para a preparação de toxina β de Clostridium perfringens nativa, cujos métodos se baseiam na expressão de uma sequência de nucleótidos incluindo um fragmento de ADN que codifica a 17 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ referida toxina β em bactérias Gram-positivas diferentes de Clostridium perfringens.

Alem disso, o invento apresenta métodos para a preparaçao de derivados não tóxicos de toxina β de Clostridium perfringens de acordo com o invento. Estes métodos baseiam-se na expressão de sequências fragmento de ADN que codifica bactéria Gram-positiva.

Igualmente, o invento preparação de uma vacina Clostridium perfringens. Tais misturar um derivado de toxina acordo com o invento e um aceitável. de nucleótidos incluindo um um derivado de toxina β, numa proporciona métodos para a para combater infecção por métodos incluem, por exemplo, β de Clostridium perfringens de transportador fisiologicamente EXEMPLO 1:

Construção de plasmideos de expressão pKS90, pTREXlA, pTREX7 e pTREX14. O plasmideo pKS90 é um plasmideo de elevado número de cópias (40-80 por célula) com replicação teta Gram-positivo baseado no plasmideo pTREXl, que por sua vez é um derivado do plasmideo pIL253 previamente publicado. pIL253 incorpora o replicão pAMblde vasta gama de hospedeiros Gram-positivos (Simon, D., e A. Chopin. 1988. Construction of a vector plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis. Biochimie. 70: 59-567.) e é não mobilizável pelo factor de sexo L lactis. pIL253 está também isento da função tra que é necessária para a transferência ou mobilização eficaz por plasmideos parentais de conjugação, exemplificados por pIL501. O replicão pAMbl de enterococos foi previamente transferido para várias espécies incluindo espécies Streptococcus, Lactobacillus e Bacillus, bem como Clostridium acetobutylicum, (Gibson, E.M., N.M. Chace, S.B. London e J. London. 1979. J. Bacteriol. 137: 614-619. LeBlanc, D.J., R.J. Hawley, L.N. Lee e E.J. St. Martin. 1978. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75:3484-3487. Oul-tram, J.D., e M. Young. 1985. FEMS Micro. Lett. 27: 129-134.) indicando a utilidade potencial numa vasta gama de hospedeiros. Embora 18 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ pTREXl (e pTREXIA) represente um vector de transcrição constitutivo básico, o derivado pKS90 utiliza acoplamento de tradução para uma região de iniciação de tradução de lactococos de modo a aumentar o nivel de expressão. Os detalhes de construção de pKS90 e do seu parente próximo pTREXl são apresentados infra. pTREXl:

Criou-se um fragmento de ADN artificial contendo uma suposta sequência de estabilização de ARN, uma região de iniciação de tradução (TIR), um local de clonagem múltipla para inserção dos genes alvo e um terminador de transcrição por hibridação de 2 oligonucleótidos complementares e extensão com ADN-polimerase Tfl. Os oligonucleótidos sentido e anti-sentido continham os locais de reconhecimento para Nhel e BamHI nas suas extremidades 5' respectivamente para facilitar clonagem. Este fragmento foi clonado entre os locais Xbal e BamHI em pUC19NT7, um derivado de pUC19 que contém a cassete de expressão T7 de pLETl (Wells, J.M., P.W. Wilson e R.W.F. Le Page. 1993. J. Appl. Bact. 74:629-636.) clonada entre os locais EcoRI e HindIII. A construção resultante foi denominada pUCLEX. A cassete de expressão completa de pUCLEX foi então removida por corte com HindIII e tornaram-se as extremidades planas seguido por corte com EcoRI antes de clonagem para locais EcoRI e Saci (planos) de pIL253 para gerar o vector pTREX. A suposta sequência de estabilização de ARN e TIR foram derivadas da sequência de bacteriófago T7 de Escherichia coli e modificadas numa posição de nucleótido para melhorar a complementaridade do motivo de Shine Dalgamo (SD) ao ARN 16s de ribossoma de Lactococcus lactis. Clonou-se um promotor de cromossoma MG1363 de Lactococcus lactis denominado PI entre os locais EcoRI e BglII presentes na cassete de expressão, criando pTREXl. Este promotor tinha sido previamente isolado utilizando o vector sonda de promotor pSB292 e caracterizado por extensão de iniciador e análise de sequência de ADN (Nick. R. Waterfield, R.W.F. Le Page, P.W. Wilson e J.M. Wells. Gene. 165. 1995. 9-15.). O fragmento de promotor foi amplificado por PCR utilizando a ADN-polimerase Vent. O fragmento de PCR inclui todas as sequências de ADN a montante do promotor clonado e até 15 bases a 3' do local de iniciação de transcrição. A sequência de Shine-Dalgarno (SD) presente a 19 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ jusante do local de iniciação de transcrição deste promotor foi excluída deliberadamente do fragmento de promotor amplificado por PCR para evitar iniciação de tradução em locais diferentes do codão de iniciação indicado na cassete de expressão. Foram também criados dois vectores semelhantes denominados pTREX7 e pTREX14 utilizando os promotores mais fracos P7 e P14, clonados entre os locais EcoRI e BglII em vez de PI. Os iniciadores de PCR utilizados para criar estes fragmentos de promotor encontram-se ilustrados na figura l.d. O plasmídeo pTREXIA representa uma alternativa a pTREXl, na qual o cassete de expressão ligada por Xbal é substituída por um fragmento de cassete de expressão T7 Xbal-Spel de pET3A. Assim, a sequência SD não é optimizada para Lactococcus. Na figura 1 ilustram-se a sequência pTREXIA completa e esquemas ilustrativos da cassete de expressão. pKS90: O plasmídeo pKS90 é um derivado de pTREXl, que embora utilize o mesmo promotor de transcrição Pl, apresenta uma TIR modificada contendo a SD e os primeiros 20 codões de gene resolvase, Pll, derivado de cromossoma de lactococos (Nick. R. Waterfield, R. W. F. Le Page, P.W. Wilson e J.M. Wells. Gene. 165. 1995. 9-15.). Tal foi conseguido por clonagem de uma sequência de ADN artificial, contendo a nova TIR, entre os locais BglII e BamHI de pTREXl. Na figura 2 apresentam-se as sequências de oligonucleótidos utilizadas neste procedimento. Através de selecção cuidadosa da sequência de iniciação de PCR, pode acoplar-se por tradução um gene alvo derivado por PCR a este TIR, que demonstrou aumentar o nível de expressão comparativamente ao obtido com o plasmídeo parental pTREXl. Apresentam-se na figura 2, a sequência pKS90 completa e um esquema ilustrativo da cassete de expressão.

Construção de estirpes recombinantes de Lactococcus lactis que excretam toxina beta activa: O ADN pJF2000 (tal como fornecido por J. Frey, Institute for veterinary bacteriology, Universidade de Berna, CH-3012 Berna, Suíça) incluindo um gene que codifica a toxina β tal como publicado por Hunter et al. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) foi electroporado para E. coli SURE. Isolou-se o 20 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ ADN de plasmídeo de seis transformantes independentes, examinou-se por digestão por restrição e reuniu-se. Armazenaram-se estas estirpes a -70 °C em glicerol a 15%. O gene cpb com região de iniciação de tradução associada (e haste-ansa que estabiliza ARN a montante) foi excisado desta preparação conjunta de ADN de plasmídeo por digestão com Xbal/BamHI ou Smal/BamHI. Ligaram-se os fragmentos de gene cpb purificados em locais de clonagem múltiplos dos vectores de expressão pTREXIA, pTREXl4 e pTREX7, que promovem níveis elevados, médios e baixos de expressão constitutiva, respectivamente. O fragmento de cpb com terminações Xbal/BamHI foi ligado a pTREXIANEW digerido com Xbal/BamHI, enquanto que o fragmento cpb com terminações Smal/BamHI foi ligado a ADN de pTREXl4 e pTREX7 (extremidades lisas) BamHI/BglII. Estas construções foram electroporadas com sucesso na estirpe especialmente incapacitada de Lactococcus lactis pep5- acmA-, que não contém uma peptidase codificada cromossomicamente, pep5, que permite que o organismo utilize péptidos libertados de caseína. Além disso, também não contém uma autolisina acmA associada a parede celular. No entanto, qualquer outra estirpe de Lactococcus lactis é adequada para este objectivo. Identificaram-se dez isolados correctos de cada tipo utilizando análise de digestão de restrição e foram armazenados a -70°C em glicerol a 15%. Estes tipos de estirpe denominam-se L. lactis pep5- acmA- [pTREXIAcpb] , L. lactis pep5- acmA- [pTREX14cpb] e L. lactis pep5-acmA- [pTREX7cpb]. Além disso, o gene cpb foi amplificado por PCR utilizando ADN-polimerase Vent e oligonucleótidos com terminações BamHI do plasmídeo pJF2000. Este produto de PCR foi clonado para o local BamHI do vector de acoplamento TIR pKS90.

Resolveu-se a proteína total extraída de células a meio da fase exponencial e sobrenadante utilizando SDS-PAGE antes de transferir para filtros de nitrocelulose. Estes filtros foram sondados com anticorpos para Cpb, tanto monoclonais como policlonais, utilizando toxina beta purificada com MAB (anticorpo monoclonal) como um controlo. Detectou-se um único produto de proteína com o tamanho correcto (aproximadamente 30 kDA) nos sobrenadantes de cultura das quatro estirpes, por hibridação de “Western" e coloração de géis de SDS com azul de Coomasie. A quantidade de toxina beta excretada por cada estirpe foi consistente com a força relativa dos promotores 21 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ nos vectores de expressão utilizados. Não se pôde detectar qualquer toxina intracelular, o que sugere que a sequência de exportação de Clostridium funciona eficazmente em Lactococcus. Demonstrou-se que os sobrenadantes filtrados do expressor pTREXIA, L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p3—1/5] e do expressor pKS90 L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p5-123] contêm toxina activa, proporcionando um controlo positivo para a toxina beta recombinante.

Os genes cpb mutantes.

Os genes cpb mutantes foram criados por construção do gene in vitro utilizando fragmentos de PCR amplificados por ADN-polimerase Vent a partir do gene molde cpb original (clonado de C. perfringens tipo C) presente no plasmideo pJF2000 (tal como fornecido por J. Frey) . Na figura 3 apresentam-se os iniciadores utilizados nesta construção e um exemplo do procedimento de construção utilizado. A inclusão de locais BamHI nas extremidades 5' dos iniciadores de PCR terminais cpbF2 e cpbR permitiu que estes mutantes fossem clonados para o local BamHI do plasmideo de expressão pKS90 (consultar supra) . A escolha dos iniciadores de PCR que incorporam um local BamHI a uma distância adequada do codão de iniciação ATG de cpb, permitiu que os genes cpb mutantes fossem acoplados por tradução ao TIR de Pll em pKS90. Este método foi utilizado para gerar uma série de estirpes de expressão mutantes. As sequências exactas destes genes mutantes (após clonagem para pKS90) foram determinadas por sequenciação automática com redundância de 3-4 vezes, que confirmou tanto as sequências dos genes como a localização nos plasmídeos de expressão. A clonagem dos genes mutantes nestes vectores permitiu a excreção do produto génico para o sobrenadante de cultura em virtude do líder de exportação N-terminal do cpb nativo. O sobrenadante de cultura foi esterilizado por filtração e utilizado directamente em bioensaios animais. 22 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Construção Mutação pMl-4 DgoDK -► AsoAA pMl-10 DsoDK -► AqqAA Yl82 -► Hi82 pM2 T95GF —► D95DD pM3-3 K101KE -► A101AA T19 7 -> Ai 9 7 pM3-69 K101KE -> A101AA pM4-3 P145KN —> D145ED pM4-18 Ve2 162 P145KN —> D145ED pM6-l (pM6-5) (pM6-7) C292 ->· A292 pM6-16 C292 -» A292 A+292NWNGA pM7-15 E287RER -► Q287QQQ

Tabela 1: construções de genes mutantes

Estirpes de expressão mutantes:

Os plasmídeos de expressão de toxóide baseados em pKS90 são propagados na estirpe hospedeira especialmente incapacitada de lactococos, L. lactis MG1363 pep5- acmA-, mas também podem ser utilizadas outras estirpes de lactococos. Esta estirpe representa uma estirpe curada de profagos e plasmídeos que é altamente auxotrófica e incapaz de sobreviver no ambiente de leite natural. Além disso cresce a uma velocidade mais baixa do que outras estirpes de lactococos.

Representam-se na tabela 1 estirpes de expressão não tóxicas construídas como indicado supra. Nesta tabela, indica-se quais os aminoácidos mutados e onde se localizam as mutações.

As estirpes de expressão de toxóide pode ser cultivadas em meio M17 (Difco número de catálogo 1856-17) suplementado com glicose a 0,5% p/v e eritromicina a 5 g/ml. Não é necessário arejamento e de facto preferem-se condições anóxicas embora 23 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ não sejam essenciais. A temperatura óptima de cultura é de 30 °C. Demonstrou-se que as várias proteínas toxóides produzidas por todas estas estirpes se acumulam no meio de cultura a níveis inferiores a 5 g/ml. A análise por hibridação de "Western" utilizando tanto anticorpos monoclonais como policlonais confirmou que é excretado para o sobrenadante o monómero de proteína do tamanho correcto por todas as estirpes de expressor denominadas listadas supra. A sequenciação do terminal N de um exemplo de proteína mutante, M4(4-3), confirmou que o péptido líder é clivado correctamente durante a exportação do citoplasma de lactococos.

Protocolo para mutagénese aleatória do gene cpJb: A mistura reaccional de PCR típica é a seguinte:

Tris-HCl 10 mM (pH 8,7 a 25°C) KC1 50 mM, albumina de soro bovina a 5 pg/ml Iniciadores de PCR cada um 0,5 μΜ (cpbf2: 5'-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3') (SEQ ID NO: 3) (cpbR: 5'-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3') (SEQ ID NO: 4)

MgCl2 4 mM MnCl2 0,5 mM dNTP obrigatório 3,4 mM e outros 3 dNTP 0,2 mM (a concentração de dNTP pode estar na gama de 0,1 a 10 mM) ADN molde 600 pM (clone de cpb pJF2000 ou outro derivado de cpb) 2U de ADN-polimerase Taq

As condições do ciclo térmico foram as seguintes (94°C durante 30 segundos, 50°C durante 60 segundos, 72°C durante 180 segundos) 30 ciclos, seguido por incubação a 72°C durante 600 segundos.

Esta reacção foi efectuada utilizando cada um dos 4 dNTP como nucleótido obrigatório e seguidamente recolhidos conjuntamente. Tal proporciona uma mistura aleatória de substituições adequada. Os fragmentos de PCR recolhidos conjuntamente foram então digeridos com BamHI e ligados em pKS90 digerido com BamHI. Esta mistura de ligação foi transformada para Lactococus lactis MG1363. Cultivaram-se os 24 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ transformantes em cultura líquida e os sobrenadantes filtrados foram ensaiados no ensaio de toxina beta in vitro descrito no exemplo 3. EXEMPLO 2:

Cultura de Lactococcus lactis:

Cultivou-se L. lactis que produz o gene de toxina β modificada em meio M17 (por exemplo, Difco número de catálogo 1856-17), suplementado com glicose a 0,5% p/v e eritromicina a 5 pg/ml. Não é necessário arejamento, são preferíveis condições anóxicas embora não sejam essenciais. A temperatura óptima de cultura é de 30°C. A adição de glicose é necessária durante o crescimento exponencial.

Preparações de antlgénio:

Separou-se o sobrenadante de cultura das células através de centrifugação. Após filtração estéril do sobrenadante, precipitaram-se os derivados com sulfato de amónio (0,3 g/g). Ressuspendeu-se o precipitado em PBS. Alternativamente, o sobrenadante de cultura pode ser concentrado num filtro <10 000 Da.

Letalidade em ratinhos:

Os derivados de toxina β produzidos em L. lactis foram inicialmente ensaiados por injecção do sobrenadante de cultura filtrado estéril, intraperitonealmente, 0,5 ml em ratinhos NRMI pesando aproximadamente 20 g. Os derivados pM 6-1, 6-5 e 6-7 foram letais a um nível semelhante ao da toxina nativa. Os derivados pM 6-1, 6-5 e 6-7 foram modificados nas posições de aminoácidos Cys292 ->· Ala292 . 25 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Derivado Mortos/total (aproximadamente em pg/ml) Sobrenadante filtrado estéril Sobrenadante concentrado com (NH4)2S04. pM 1-4 0/5 (5 μg/ml) 2/2 (20 μg/ml) pM 1-10 0/5 (5 pg/ml) 2/2 (20 μg/ml) pM 2 0/5 (1 pg/ml) 1/2 (~4 μg/ml) pM 3-3 0/5 (5 pg/ml) 1/2 (30 μg/ml) pM 3-64 0/5 (5 pg/ml) 2/2 (30 μg/ml) pM 4-3 0/5 (5 pg/ml) 1/2 (30 μg/ml) pM 4-18 0/5 (1,5 pg/ml) 0/2 (30 μg/ml) pM 6-1 5/5 (0,5 pg/ml) 2/2 (50 pg/ml) pM 6-5 5/5 (0,5 pg/ml) 2/2 (50 pg/ml) pM 6-7 5/5 (5 pg/ml) 2/2 (50 pg/ml) pM 6-16 0/5 (5 pg/ml) 0/2 (50 pg/ml) pM 7-15 0/5 (5 pg/ml) 2/2 (40 pg/ml)

Tabela 2: Ensaio de letalidade em ratinhos

Em experiências subsequentes, os sobrenadantes contendo os derivados foram precipitados com sulfato de amónio. Cada sedimento contendo derivado foi ressuspenso em PBS num volume lOx menor. Cada derivado foi injectado intraperitonealmente em ratinhos. Os derivados pM 1-4, pM 1-10, pM 3-69 e pM 7-15 são todos não tóxicos a níveis em que a toxina de tipo selvagem é letal. Só se tornam tóxicos a concentrações muito elevadas: 20-40 pg/ml. Os derivados pM 4-18 e pM 6-16 são também não tóxicos a níveis em que a toxina de tipo selvagem é letal. Estes não são tóxicos mesmo a concentrações mais elevadas: 30-50 pg/ml. Os restantes 3 derivados pM 2, pM 3-3 e pM 4-3 são ligeiramente tóxicos. (O LD5q da toxina de tipo selvagem é 0,15 pg/ratinho). Consultar também a tabela 2.

Dermonecrose em porquinhos-da-índia:

Depilaram-se porquinhos-da-índia albinos de nossa criação, 300 g, numa área de 4 x 8 cm em ambos os lados. Injectou-se intradermicamente 0,2 ml de extracto em 4 locais de cada lado do animal. Os animais foram examinados após 24, 48 e 72 horas 26 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ e a lesão nos locais de injecção foi avaliada. Necrose óbvia no local de injecção (++++), eritema grave (+++), eritema (+++), vermelhidão (+), sem reacção (0).

Os derivados pM 1-4, 1-10, 3-3, 4-3, 6-16 e 7-15 não são dermonecróticos mesmo a concentrações muito elevadas.

Os derivados pM 6-1, 6-5 e 6-7 foram dermonecróticos a um nível de 5 pg/ml. Não foram dermonecróticos a 0,5 pg/ml. Após concentração, o derivado pM 3-69 tornou-se dermonecrótico em dosagens de 6 pg/ml, que corresponde a pelo menos 60x menos dermonecrótico do que a toxina nativa. O derivado pM 4-18 tem um potencial dermonecrótico 15x menor do que a toxina nativa. 0 derivado pM 2 não apresentou qualquer acção dermonecrótica nas concentrações ensaiadas de 1 yg/ml e 2 pg/ml respectivamente. Assim, pM2 é pelo menos 20x menos tóxico do que a toxina nativa.

Consultar também a tabela 3.

Preparação da vacina:

As preparações de antigénio foram adjuvadas com adjuvante incompleto de Freund (50%) ou Alhydrogen (20%), respectivamente. 27 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Derivado Sobrenadante filtrado estéril Sobrenadante concentrado com (NH4) 2SO4 1-4 0 (5 μg/ml) 0 (10 μg/ml) 0 (4 μρ/ιηΐ) 1-10 0 (5 μg/ml) 0 (10 μρ/ηιΐ) 0 (4 μρ/ιηΐ) 2 0 d μρ/ιηΐ) 0 (2 μρ/ιηΐ) ( + ) d μρ/ιηΐ) 3-3 0 (5 μρ/ιηΐ) 0 (15 μg/ml) 0 (6 μg/ml) 3-69 0 (5 μρ/ιηΐ) +++ (15 μg/ml) ++ (6 μg/ml) 4-3 0 (5 μρ/ιηΐ) 0 (5 μg/ml) 0 (5 μg/ml) 4-18 0 (1,5 μρ/ιηΐ) (+) (15 μg/ml) 0 (6 μg/ml) 6-1 + + + + (5 μρ/ιηΐ) n. d. 0 (0,5 μρ/ιηΐ) 6-5 + + + + (5 μρ/ιηΐ) n. d. 0 (0,5 μρ/ιηΐ) 6-7 ++++ (5 μg/ml) ++++ (10 μg/ml) ++ (2,5 μg/ml) 6-16 0 (0,5 μg/ml) 0 (25 μg/ml) 0 (20 μg/ml) 7-15 0 (5 μg/ml) 0 (20 μg/ml) 0 (5 μg/ml) 0 (8 μρ/ιηΐ) CpC β +++ (0, 1 μρ/ml) Ο sem reacção + vermelhidão ++ eritema +++ eritema grave ++++ necrose óbvia no local de injecção

CpC β toxina β de Clostridium perfringens tipo C

Tabela 3: dermonecrose em porcos.

Imunização de porcos: O derivado 3-69 foi preparado numa concentração de aproximadamente 40 pg/ml e adjuvado a uma concentração final 28 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ de 20 pg/ml. Administrou-se intramuscularmente aos porcos 2 ml com intervalos de 2 semanas. Obtiveram-se amostras de sangue antes da primeira vacinação, antes da segunda vacinação e 2 semanas após a segunda vacinação. Observaram-se os porcos relativamente a efeitos secundários 24 h após a primeira vacinação. Não se observaram guaisguer efeitos secundários. EXEMPLO 3:

Ensaio de rastreio rápido para a detecção de derivados não tóxicos de toxina β obtidos de genes de toxina β mutados aleatoriamente:

Procedimento para ensaio de células BT:

Transferiu-se uma cultura de células BT tratadas com tripsina (células de turbinado de bovino), l,5xl05 células/ml, em meio Eagles com soro de vitelo a 5%, para uma placa de microtitulação de 96 poços, 100 μΐ/poço. Incubaram-se as placas durante 24 horas a 37°C e CO2 a 3%. Diluiram-se amostras de toxina β a serem ensaiadas em PBS pH 7,0 a 20°C em placas de diluição. O meio foi rejeitado cuidadosamente das células e aplicaram-se 100 μΐ de diluições de toxina β por poço. As células foram então incubadas durante 30 min. a 37°C e CO2 a 3%. As amostras foram rejeitadas cuidadosamente e adicionou-se meio Eagles fresco com soro de vitelo a 5% amornado a 37°C. As células foram incubadas durante três dias em condições idênticas às descritas supra. Seguidamente rejeitou-se o meio das placas de microtitulação e adicionou-se solução de coloração Giemsa a 5 μΐ/poço. Após 10 minutos, rejeitou-se o agente de coloração e lavou-se a placa 3x com água e deixou-se em repouso durante pelo menos 20 minutos para secagem.

Verificaram-se todos os poços relativamente à presença de células multinucleadas e irregularidades na monocamada. A ausência destes sinais num poço especifico é indicativa da presença nesse poço de um derivado não tóxico de toxina β. Estes derivados de toxina β gue provaram ser não tóxicos foram ensaiados relativamente à sua imunogenicidade no ensaio ELISA semi-quantitativo descrito infra. 29 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ ELISA semi-quantitativo:

Purificaram-se anticorpos altamente específicos desenvolvidos contra toxina β de Clostridium perfringens nativa em coelhos numa coluna de proteína A e revestiram-se placas de ELISA com aproximadamente 2 pg/ml destes anticorpos específicos. Adicionaram-se os sobrenadantes contendo os derivados de toxina β às placas em diluições de 3 vezes. Após incubação durante 1 hora, utilizaram-se para detecção anticorpos policlonais de coelho antitoxina Ο.ρ.β conjugados com peroxidase de rábano.

Os derivados de toxina β que reagiram no ELISA para um título não menor do que 1000 vezes inferior a toxina β nativa foram considerados os derivados de toxina β não tóxicos mas ainda imunogénicos pretendidos de acordo com o invento. EXEMPLO 4:

Experiências de vacinação em porcos.

Preparação da vacina. 0 derivado pM 1-4 foi produzido por Lactococcus lactis estirpe pM 1-4. Após fermentação, removeram-se as células por centrifugação (lOOOOOxg durante 35 min.). Seguidamente, adicionou-se 0,31 g de sulfato de amónio a cada g de sobrenadante. Colocou-se a mistura a 4°C durante 3 horas para precipitação. Após centrifugação a lOOOOOxg durante 45 min. dissolveu-se o precipitado em 1/30 do volume original e dialisou-se contra PBS. O teor final do derivado pM 1-4 foi quantificado por SDS-PAGE relativamente a padrões de BSA. Finalmente, misturou-se a solução de derivado com Diluvac Forte® numa razão de 1:1. A concentração final de pM 1-4 na vacina foi de 80 pg/ml.

Vacinação

Utilizaram-se cinco porcos de 5 semanas de idade. Os porcos foram vacinados com 2 ml intramuscularmente nos dias 0 e 21. 30 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Observações Ο estado geral dos animais foi registado durante as três horas iniciais após vacinação de acordo com a seguinte escala: 0 = sem sintomas 1 = levemente deprimido, pêlo áspero (durante menos de 1 hora) 2 = deprimido, tremuras (menos de 1 hora) 3 = deprimido, tremuras, deitado e quantidade de água bebida limitada (menos de 1 hora) 4 = vómitos, depressão grave (menos de 1 hora) 5 = deprimido durante mais de uma hora e não come a próxima ração

Amostragem de sangue e determinação de títulos

Obtiveram-se amostras de sangue antes da primeira vacinação (dia 0), antes da segunda vacinação (dia 21) e duas semanas após a segunda vacinação (dia 35) e analisou-se para anticorpos antitoxina β por ELISA competitivo. Sucintamente, revestiu-se uma placa de ELISA com anticorpo monoclonal desenvolvido contra toxina β nativa. Deixaram-se reagir diluições em série dos soros com uma concentração fixa da toxina β numa placa independente. Transferiram-se as misturas de soros contendo toxina e anticorpos para a placa revestida com Mab e determinaram-se os teores de toxina β nativa. Calcularam-se os títulos como 50% de inibição de toxina β não inibida relativamente ao padrão 1959 de antitoxina da OMS.

Resultados:

Observações

Os porcos não apresentaram qualquer reacção clínica devida a qualquer das vacinações. Consultar a tabela 4.

Serologia

Um porco (N° 52) respondeu à primeira vacinação. Após a segunda vacinação todos os quatro porcos seroconverteram-se e a média de título de antitoxina β foi de 66 i.u. medidos em ELISA. Os títulos individuais apresentam-se na tabela 4. 31 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Tabela 4: Resposta de anticorpos antitoxina β em porcos A resposta de anticorpos antitoxina β em porcos medida em ELISA em i.u. e pontuação do ensaio para toxicidade não específica.

Porco N° . Soros pré-imunes (i.u.) Após a primeira vacinação (i.u.) Após a segunda vacinação (i.u.) Pontuação de toxicidade não especifica 51 0 0 159,6 0 52 0 2,4 55,1 0 53 0 0 32,2 0 54 0 0 17,3 0

Conclusão

Todos os porcos responderam a vacinação com toxina β modificada geneticamente por produção de anticorpos antitoxina β inibidores de toxina β.

Legendas das figuras:

Figura l.a: estrutura de plasmídeo pTREXIANEW. A sequência de codificação do marcador de resistência a antibiótico MLS apresenta-se numa caixa a sombreado. Ori pAMBl: origem de replicação do plasmídeo pAMBl, MLS: macrólidos, lincosamindas, gene de resistência a antibiótico estreptogramina Β. A estrutura da cassete de expressão clonada entre os locais EcoRI e Saci plano de pIL253 apresenta-se infra. Apresentam-se as diferentes regiões funcionais da cassete como caixas a tracejado. Indicam-se locais de restrição únicos. SD: sequência de Shine-Dalgarno complementar a ARNr 16S de L. lactis, ATG: codão de iniciação de tradução servido por SD.

Figura l.b: a sequência pTREXIA completa, incluindo posições de enzimas de restrição. (SEQ ID NO: 27)

Figura l.c: características da cassete de expressão pTREXl altamente semelhante. (SEQ ID NO: 26) 32 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ

Figura l.d: oligonucleótidos utilizados para criar os fragmentos de promotor derivados por PCR utilizados em pTREX7, pTREX-14 e pTREX-ΙΑ (apresentados 5'-3') (SEQ ID NO: 19, 20, 23, 24, 21, 22)

Figura 2.a: o vector de acoplamento TIR pKS90, representação esquemática da cassete de expressão pKS90.

Figura 2.b: a sequência pKS90 completa, incluindo posições de enzimas de restrição. (SEQ ID NO: 25)

Figura 2.c: oligonucleótidos utilizados para criar a sequência de ADN artificial que forma a região TIR de pKS90. (SEQ ID NO: 28, 1)

Figura 3.a: iniciadores utilizados na construção dos mutantes Ορβ. (SEQ ID NO: 7, 6, 9, 8, 11, 10, 13, 12, 14, 16, 15, 18, 17, 2, 4, 3.)

Figura 3.b: exemplo do procedimento de construção tal como utilizado para Ορβ Ml.

Figura 4: Sequência de aminoácidos de toxina β de Clostridium perfringens. (SEQ ID NO: 5)

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL

(i) REQUERENTE (A) NOME: Akzo Nobel N. V. (B) RUA: Velperweg 76 (C) CIDADE: Arnhem (E) PAÍS: Holanda

(F) CÓDIGO POSTAL: 6824 BM (G) TELEFONE: 04 12 666379 (H) TELEFAX: 04 12 650592 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Vacina de Clostridium Perfringens (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 28

(iv) FORMATO LEGÍVEL POR COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC de IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão #1.30 (EPO) 33 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 86 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GAAGATCTGA TCATTTGGAT CCTCCTTGAG TTGAAACTCG TGCGTATCCT ATTTTCATTT 60 TTTTCTCCTT CATTTTAAAG ATCTTC 86 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: GGAGGATCCA AATGAATGAT ATAGGTAAAA CTACTACT 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GGAGGATCCA AATGAAGAAA AAATTTATTT CATTAGTTAT AG 42 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 34 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: ATGGATCCGT CTAAATAGCT GTTACTTTGT GAG 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GCTAGTTTTT GTTGTAATTT GTTATTTGGG AATTTTATTT TGGGTATTGG TAGTCGAGAT 60 TTTA 64 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: AGATGAATAT GCAGCAGCGA TAAATCT 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: GAAATGACAA CTTTAATAAA CTTA 24 35 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: TGAAGACATA TCATCATCTA AGTTTAT 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: AAAAAAGAAG ATGTTATAAA AAAATAC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10 ATCTGCTGCT GCTGAAGACA TAAATCC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 36 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 GTTATAAAAA AATACAATTT GCAT 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12 AGAAATTGTA TCTTCATCAA TACTATC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13 CAAAAAACTG TATCCAATAC AATG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14 24

TTATACATTT GGGGTATCAA AAGC 37 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15 ATAATAAGCG TTTCTTTCAC G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16 CTTAATTGGA ATGGTGCTAA CTGG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17 ACAGTTTTGT TGCTGCTGCA TTTTAAC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 38 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18 TATTATCTTA ATTGGAATGG TGCT 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19 GAAGATCTCT AGCTTTGAGC TGTAATAGA 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20 CGGAATTCAG TTGAACTACT TTTTTTAGTT TTA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21 33

GAAGATCTGA TACTTGTATT ATAACATATC TAC 39 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22 CGGAATTCGA TTAAGTCATC TTACCTCTTT 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23 GAAGATCTGT AATGTTTCGC AACTCTACTA T 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24 CGGAATTCAG GACTAATTGA TGAAACTTTT CT 32 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5217 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 40 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25: GAATTCGATT AAGTCATCTT ACCTCTTTTA TTAGT I I l"l T CTTATAATCT AATGATAACA 60 TTTTTATAAT TAATCTATAA ACCATATCCC TCTTTGGAAT CAAAATTTAT TATCTACTCC 120 TTTGTAGATA TGTTATAATA CAAGTATCAG ATCTTTAAAA TGAAGGAGAA AAAAATGAAA 180 ATAGGATACG CACGAGTTTC AACTCAAGGA GGATCCAAAT GATCAGATCC GGCTGCTAAC 240 AAAGCCCGAA AGGAAGCTGA GTTGGCTGCT GCCACCGCTG AGCAATAACT AGCATAACCC 300 CTTGGGGCCT CTAAACGGGT CTTGAGGGGT TTTTTGCTGA AAGGAGGAAC TATATCCGGA 360 TGACCTGCAG GCAAGCTCTA GAATCGATAC GATTTTGAAG TGGCAACAGA TAAAAAAAAG 420 CAGTTTAAAA TTGTTGCTGA ACTTTTAAAA CAAGCAAATA CAATCATTGT CGCAACAGAT 480 AGCGACAGAG AAGGCGAAAA CATTGCCTGG TCGATCATTC ATAAAGCAAA TGCCTTTTCT 540 AAAGATAAAA CGTATAAAAG ACTATGGATC AATAGTTTAG AAAAAGATGT GATCCGTAGC 600 GGTTTTCAAA ATTTGCAACC AGGAATGAAT TACTATCCCT TTTATCAAGA AGCGCAAAAG 660 AAAAACGAAA TGATACACCA ATCAGTGCAA AAAAAGATAT AATGGGAGAT AAGACGGTTC 720 GTGTTCGTGC TGACTTGCAC CATATCATAA AAATCGAAAC AGCAAAGAAT GGCGGAAACG 780 TAAAAGAAGT TATGGAAATA AGACTTAGAA GCAAACTTAA GAGTGTGTTG ATAGTGCAGT 840 ATCTTAAAAT TTTGTATAAT AGGAATTGAA GTTAAATTAG ATGCTAAAAA TTTGTAATTA 900 41 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ AGAAGGAGTG ATTACATGAA CAAAAATATA AAATATTCTC AAAACTTTTT AACGAGTGAA 960 AAAGTACTCA ACGAAATAAT AAAACAATTG AATTTAAAAG AAACCGATAC CGTTTACGAA 1020 ATTGGAACAG GTAAAGGGCA TTTAACGACG AAACTGGCTA AAATAAGTAA ACAGGTAACG 1080 TCTATTGAAT TAGACAGTCA TCTATTCAAC TTATCGTCAG ΑΑΑΑΑΤΤΑΑΑ ACTGAATACT 1140 CGTGTCACTT TAATTCACCA AGATATTCTA CAGTTTCAAT TCCCTAACAA ACAGAGGTAT 1200 AAAATTGTTG GGAGTATTCC TTACCATTTA AGCACACAAA ΤΤΑΤΤΑΑΑΑΑ AGTGGTTTTT 1260 GAAAGCCATG CGTCTGACAT CTATCTGATT GTTGAAGAAG GATTCTACAA GCGTACCTTG 1320 GATATTCACC GAACACTAGG GTTGCTCTTG CACACTCAAG TCTCGATTCA GCAATTGCTT 1380 AAGCTGCCAG CGGAATGCTT TCATCCTAAA CCAAAAGTAA ACAGTGTCTT AATAAAACTT 1440 ACCCGCCATA CCACAGATGT TCCAGATAAA TATTGGAAGC TATATACGTA CTTTGTTTCA 1500 AAATGGGTCA ATCGAGAATA TCGTCAACTG TTTACTAAAA ATCAGTTTCA TCAAGCAATG 1560 AAACACGCCA AAGTAAACAA TTTAAGTACC GTTACTTATG AGCAAGTATT GTCTATTTTT 1620 AATAGTTATC ΤΑΤΤΑΤΠΆΑ CGGGAGGAAA TAATTCTATG AGTCGCTTTT GTAAATTTGG 1680 AAAGTTACAC GTTACTAAAG GGAATGTAGA ΤΑΑΑΤΤΑΤΤΑ GGTATACTAC TGACAGCTTC 1740 CAAGGAGCTA AAGAGGTCCC TAGCGCTCTT ATCATGGGGA AGCTCGGATC ATATGCAÁGA 1800 CAAAATAAAC TCGCAACAGC ACTTGGAGAA ATGGGACGAA TCGAGAAAAC CCTCTTTACG 1860 CTGGATTACA TATCTAATAA AGCCGTAAGG AGACGGGTTC AAAAAGGTTT AAATAAAGGA 1920 GAAGCAATCA ATGCATTAGC TAGAACTATA TTTTTTGGAC AACGTGGAGA ATTTAGAGAA 1980 42 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ CGTGCTCTCC AAGACCAGTT ACAAAGAGCT AGTGCACTAA ACATAATTAT TAACGCTATA 2040 AGTGTGTGGA ACACTGTATA TATGGAAAAA GCCGTAGAAG AATTAAAAGC AAGAGGAGAA 2100 TTTAGAGAAG ATTTAATGCC ATATGCGTGG CCGTTAGGAT GGGAACATAT CAATTTTCTT 2160 GGAGAATACA AATTTGAAGG ATTACATGAC ACTGGGCAAA TGAATTTACG TCCTTTACGT 2220 ATAAAAGAGC CGTTTTATTC TTAATATAAC GGCTCTTTTT ATAGAAAAAA TCCTTAGCGT 2280 GGTTTTTTTC CGAAATGCTG GCGGTACCCC AAGAATTAGA AATGAGTAGA TCAAATTATT 2340 CACGAATAGA ATCAGGAAAA TCAGATCCAA CCATAAAAAC ACTAGAACAA ATTGCAAAGT 2400 TAACTAACTC AACGCTAGTA GTGGATTTAA TCCCAAATGA GCCAACAGAA CCAGAGCCAG 2460 AAACAGAATC AGAACAAGTA ACATTGGATT TAGAAATGGA AGAAGAAAAA AGCAATGACT 2520 TCGTGTGAAT AATGCACGAA ATCGTTGCTT ΑΓΤΤΊ I III1 AAAAGCGGTATACTAGATAT 2580 AACGAAACAA CGAACTGAAT AGAAACGAAA AAAGAGCCAT GACACATTTA TAAAATGTTT 2640 GACGACATTT TATAAATGCA TAGCCCGATA AGATTGCCAA ACCAACGCTT ATCAGTTAGT 2700 CAGATGAACT CTTCCCTCGT AAGAAGTTAT TTAATTAACT TTGTTTGAAG ACGGTATATA 2760 ACCGTACTAT CATTATATAG GGAAATCAGA GAGTTTTCAA GTATCTAAGC TACTGAATTT 2820 AAGAATTGTT AAGCAATCAA TCGGAAATCG TTTGATTGCT TTTTTTGTAT TCATTTATAG 2880 AAGGTGGAGT TTGTATGAAT CATGATGAAT GTAAAACTTA ΤΑΤΑΑΑΑΑΑΤ AGTTTATTGG 2940 AGATAAGAAA ATTAGCAAAT ATCTATACAC TAGAAACGTT TAAGAAAGAG TTAGAAAAGA 3000 GAAATATCTA CTTAGAAACA AAATCAGATA AGTATTTTTC TTCGGAGGGG GAAGATTATA 3060 TATATAAGTT AATAGAAAAT AACAAAATAA TTTATTCGAT TAGTGGAAAA AAATTGACTT 3120 43 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ ATAAAGGAAA ΑΑΑΑΤΟΤΠΤ TCAAAACATG CAATATTGAA ACAGTTGAAT GAAAAAGCAA 3180 ACCAAGTTAA TTAAACAACC TATTTTATAG GATTTATAGG AAAGGAGAAC AGCTGAATGA 3240 ATATCCCTTT TGTTGTAGAA ACTGTGCTTC ATGACGGCTT GTTAAAGTAC ΑΑΑΤΤΤΑΑΑΑ 3300 ATAGTAAAAT TCGCTCAATC ACTACCAAGC CAGGTAAAAG CAAAGGGGCT ATTTTTGCGT 3360 ATCGCTCAAA ATCAAGCATG ATTGGCGGTC GTGGTGTTGT TCTGACTTCC GAGGAAGCGA 3420 TTCAAGAAAA TCAAGATACA TTTACACATT GGACACCCAA CGTTTATCGT TATGGAACGT 3480 ATGCAGACGA AAACCGTTCA TACACGAAAG GACATTCTGA AAACAATTTA AGACAAATCA 3540 ATACCTTCTT TATTGATTTT GATATTCACA CGGCAAAAGA AACTATTTCA GCAAGCGATA 3600 TTTTAACAAC CGCTATTGAT TTAGGTTTTA TGCCTACTAT GATTATCAAA TCTGATAAAG 3660 GTTATCAAGC ATATTTTGTT TTAGAAACGC CAGTCTATGT GACTTCAAAA TCAGAATTTA 3720 AATCTGTCAA AGCAGCCAAA ATAATTTCGC AAAATATCCG AGAATATTTT GGAAAGTCTT 3780 TGCCAGTTGA TCTAACGTGT AATCATTTTG GTATTGCTCG CATACCAAGA ACGGACAATG 3840 TAGAATTTTT TGATCCTAAT TACCGTTATT CTTTCAAAGA ATGGCAAGAT TGGTCTTTCA 3900 AACAAACAGA TAATAAGGGC TTTACTCGTT CAAGTCTAAC GGTTTTAAGC GGTACAGAAG 3960 GCAAAAAACA AGTAGATGAA CCCTGGTTTA ATCTCTTATT GCACGAAACG AAATTTTCAG 4020 GAGAAAAGGG TTTAATAGGG CGTAATAACG TCATGTTTAC CCTCTCTTTA GCCTACTTTA 4080 GTTCAGGCTA TTCAATCGAA ACGTGCGAAT ATAATATGTT TGAGTTTAAT AATCGATTAG 4140 ATCAACCCTT AGAAGAAAAA GAAGTAATCA AAATTGTTAG AAGTGCCTAT TCAGAAAACT 4200 44 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ ATCAAGGGGC TAATAGGGAA TACATTACCA TTCTTTGCAA AGCTTGGGTA TCAAGTGATT 4260 TAACCAGTAA AGATTTATTT GTCCGTCAAG GGTGGTTTAA ATTCAAGAAA AAAAGAAGCG 4320 AACGTCAACG TGTTCATTTG TCAGAATGGA AAGAAGATTT AATGGCTTAT ATTAGCGAAA 4380 AAAGCGATGT ATACAAGCCT TATTTAGTGA CGACCAAAAA AGAGATTAGA GAAGTGCTAG 4440 GCATTCCTGA ACGGACATTA GATAAATTGC TGAAGGTACT GAAGGCGAAT CAGGAAATTT 4500 TCTTTAAGAT TAAACCAGGA AGAAATGGTG GCATTCAACT TGCTAGTGTT AAATCATTGT 4560 TGCTATCGAT CATTAAAGTA AAAAAAGAAG AAAAAGAAAG CTATATAAAG GCGCTGACAA 4620 ATTCTTTTGA CTTAGAGCAT ACATTCATTC AAGAGACTTT AAACAAGCTA GCAGAACGCC 4680 CTAAAACGGA CACACAACTC GATTTGTTTA GCTATGATAC AGGCTGAAAA TAAAACCCGC 4740 ACTATGCCAT TACATTTATA TCTATGATAC GTGTTTGTTT TTTCTTTGCT GTTTAGCGAA 4800 TGATTAGCAG AAATATACAG AGTAAGATTT ΤΑΑΤΤΑΑΤΤΑ TTAGGGGGAG AAGGAGAGAG 4860 TAGCCCGAAA ACTTTTAGTT GGCTTGGACT GAACGAAGTG AGGGAAAGGC TACTAAAACG 4920 TCGAGGGGCA GTGAGAGCGA AGCGAACACT TGATTTTTTA ATTTTCTATC TTTTATAGGT 4980 CATTAGAGTA TACTTATTTG TCCTATAAAC TATTTAGCAG CATAATAGAT TTA7TGAATA 5040 GGTCATTTAA GTTGAGCATA ΤΤAGAGGAGG AAAATCTTGG AGAAATATTT GAAGAACCCG 5100 ATTACATGGA TTGGATTAGT TCTTGTGGTT ACGTGGTTTT TAACTAAAAG TAGTGAATTT 5160 TTGATTTTTG GTGTGTGTGT CTTGTTGTTA GTATTTGCTA GTCAAAGTGA ΤΤΑΑΑΤΑ 5217 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5230 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 45 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: GAATTCGATT AAGTCATCTT ACCTCTTTTA TTAGTTTTTT CTTATAATCT AATGATAACA 60 TTTTTATAAT TAATCTATAA ACCATATCCC TCTTTGGAAT CAAAATTTAT TATCTACTCC 120 TTTGTAGATA TGTTATAATA CAAGTATCAG ATCTGGGAGA CCACAACGGT TTCCCACTAG 180 AAATAATTTT GTTTAACTTT AGAAAGGAGA TATACGCATG CAGGATATCT CTAGAATGGA 240 TCCGGCTGCT AACAAAGCCC GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG CTGAGCAATA 300 ACTAGCATAA CCCCTTGGGG CCTCTAAACG GGTCTTGAGG GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG 360 AACTATATCC GGATGACCTG CAGGCAAGCT CTAGAATCGA TACGATTTTG AAGTGGCAAC 420 AGATAAAAAA AAGCAGTTTA AAATTGTTGC TGAACTTTTA AAACAAGCAA ATACAATCAT 480 TGTCGCAACA GATAGCGACA GAGAAGGCGA AAACATTGCC TGGTCGATCA TTCATAAAGC S40 AAATGCCTTT TCTAAAGATA AAACGTATAA AAGACTATGG ATCAATAGTT TAGAAAAAGA 600 TGTGATCCGT AGCGGTTTTC AAAATTTGCA ACCAGGAATG AATTACTATC CCTTTTATCA 660 AGAAGCGCAA AAGAAAAACG AAATGATACA CCAATCAGTG CAAAAAAAGA TATAATGGGA 720 GATAAGACGG TTCGTGTTCG TGCTGACTTG CACCATATCA TAAAAATCGA AACAGCAAAG 780 46 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ AATGGCGGAA ACGTAAAAGA AGTTATGGAA ATAAGACTTA GAAGCAAACT TAAGAGTGTG 840 TTGATAGTGC AGTATCTTAA AATTTTGTAT AATAGGAATT GAAGTTAAAT TAGATGCTAA 900 AAATTTGTAA TTAAGAAGGA GTGATTACAT GAACAAAAAT ΑΤΑΑΑΑΤΑΤΤ CTCAAAACTT 960 TTTAACGAGT GAAAAAGTAC TCAACCAAAT AATAAAACAA TTGAATTTAA AAGAAACCGA 1020 TACCGTTTAC GAAATTGGAA CAGGTAAAGG GCATTTAACG ACGAAACTGG CTAAAATAAG 1080 TAAACAGGTA ACGTCTATTG AATTAGACAG TCATCTATTC AACTTATCGT CAGAAAAATT 1140 AAAACTGAAT ACTCGTGTCA CTTTAATTCA CCAAGATATT CTACAGTTTC AATTCCCTAA 1200 CAAACAGAGG TATAAAATTG TTGGGAGTAT TCCTTACCAT TTAAGCACAC ΑΑΑΤΤΑΤΤΑΑ 1260 AAAAGTGGTT TTTGAAAGCC ATGCGTCTGA CATCTATCTG ATTGTTGAAG AAGGATTCTA 1320 CAAGCGTACC TTGGATATTC ACCGAACACT AGGGTTGCTC TTGCACACTC AAGTCTCGAT 1380 TCAGCAATTG CTTAAGCTGC CAGCGGAATG CTTTCATCCT AAACCAAAAG TAAACAGTGT 1440 CTTAATAAAA CTTACCCGCC ATACCACAGA TGTTCCAGAT AAATATTGGA AGCTATATAC 1600 GTACTTTGTT TCAAAATGGG TCAATCGAGA ATATCGTCAA CTGTTTACTA AAAATCAGTT 1560 TCATCAAGCA ATGAAACACG CCAAAGTAAA CAATTTAAGT ACCGTTACTT ATGAGCAAGT 1620 ATTGTCTATT TTTAATAGTT ATCTATTATT TAACGGGAGG AAATAATTCT ATGAGTCGCT 1680 TTTGTAAATT TGGAAAGTTA CACGTTACTA AAGGGAATGT AGATAAATTA TTAGGTATAC 1740 TACTGACAGC TTCCAAGGAG CTAAAGAGGT CCCTAGCGCT CTTATCATGG GGAAGCTCGG 1800 ATCATATGCA AGACAAAATA AACTCGCAAC AGCACTTGGA GAAATGGGAC GAATCGAGAA 1860 47 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ AACCCTCTTT ACGCTGGATT ACATATCTAA TAAAGCCGTA AGGAGAC-GGG TTCAAAAAGG 1920 ΤΤΤΑΑΑΤΑΑΑ GGAGAAGCAA TCAATGCATT AGCTAGAACT ATATTTTTTG GACAACGTGG 1980 AGAATTTAGA GAACGTGCTC TCCAAGACCA GTTACAAAGA GCTAGTGCAC TAAACATAAT 2040 TATTAACGCT ATAAGTGTGT GGAACACTGT ATATATGGAA AAAGCCGTAG AAGAATTAAA 2100 AGCAAGAGGA GAATTTAGAG AAGATTTAAT GCCATATGCG TGGCCGTTAG GATGGGAACA 2160 TATCAATTTT CTTGGAGAAT ACAAATTTGA AGGATTACAT GACACTGGGC AAATGAATTT 2220 ACGTCCTTTA CGTATAAAAG AGCCGTTTTA TTCTTAATAT AACGGCTCTT TTTATAGAAA 2280 AAATCCTTAG CGTGGTTTTT TTCCGAAATG CTGGCGGTAC CCCAAGAATT AGAAATGAGT 2340 AGATCAAATT ATTCACGAAT AGAATCAGGA AAATCAGATC CAACCATAAA AACACTAGAA 2400 CAAATTGCAA AGTTAACTAA CTCAACGCTA GTAGTGGATT TAATCCCAAA TGAGCCAACA 2460 GAACCAGAGC CAGAAACAGA ATCAGAACAA GTAACATTGG ATTTAGAAAT GGAAGAAGAA 2520 AAAAGCAATG ACTTCGTGTG AATAATGCAC GAAATCGTTG CTTATTTTTT TTTAAAAGCG 2580 GTATACTAGA TATAACGAAA CAACGAACTG AATAGAAACG AAAAAAGAGC CATGACACAT 2640 TTATAAAATG TTTGACGACA ΤΤΤΤΑΤΑΑΑΤ GCATAGCCCG ATAAGATTGC CAAACCAACG 2700 CTTATCAGTT AGTCAGATGA ACTCTTCCCT CGTAAGAAGT ΤΑΤΤΤΑΑΤΤΑ ACTTTGTTTG 2760 AAGACGGTAT ATAACCGTAC TATCATTATA TAGGGAAATC AGAGAGTTTT CAAGTATCTA 2820 AGCTACTGAA TTTAAGAATT GTTAAGCAAT CAATCGGAAA TCGTTTGATT GCTTTTTTTG 2880 TATTCATTTA TAGAAGGTGG AGTTTGTATG AATCATGATG AATGTAAAAC ΤΤΑΤΑΤΑΑΑΑ 2940 AATAGTTTAT TGGAGATAAG AAAATTAGCA AATATCTATA CACTAGAAAC GTTTAAGAAA 3000 48 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ GAGTTAGAAA AGAGAAATAT CTACTTAGAA ACAAAATCAG ATAAGTATTT TTCTTCGGAG 3060 GGGGAAGATT ΑΤΑΤΑΤΑΤΑΑ GTTAATAGAA AATAACAAAA TAATTTATTC GATTAGTGGA 3120 AAAAAATTGA CTTATAAAGG AAAAAAATCT TTTTCAAAAC ATGCAATATT GAAACAGTTG 3160 AATGAAAAAG CAAACCAAGT TAATTAAACA ACCTATTTTA TAGGATTTAT AGGAAAGGAG 3240 AACAGCTGAA TGAATATCCC TTTTGTTGTA GAAACTGTGC TTCATGACGG CTTGTTAAAG 3300 TACAAATTTA AAAATAGTAA AATTCGCTCA ATCACTACCA AGCCAGGTAA AAGCAAAGGG 3360 GCTATTTTTG CGTATCGCTC AAAATCAAGC ATGATTGGCG GTCGTGGTGT TGTTCTGACT 3420 TCCGAGGAAG CGATTCAAGA AAATCAAGAT ACATTTACAC ATTGGACACC CAACGTTTAT 3480 CGTTATGGAA CGTATGCAGA CGAAAACCGT TCATACACGA AAGGACATTC TGAAAACAAT 3540 TTAAGACAAA TCAATACCTT CTTTATTGAT TTTGATATTC ACACGGCAAA AGAAACTATT 3600 TCAGCAAGCG ATATTTTAAC AACCGCTATT GATTTAGGTT TTATGCCTAC TATGATTATC 3660 AAATCTGATA AAGGTTATCA AGCATATTTT GTTTTAGAAA CGCCAGTCTA TGTGACTTCA 3720 AAATCAGAAT TTAAATCTGT CAAAGCAGCC ΑΑΑΑΤΑΑΤΤΤ CGCAAAATAT CCGAGAATAT 3780 TTTGGAAAGT CTTTGCCAGT TGATCTAACG TGTAATCATT TTGGTATTGC TCGCATACCA 3840 AGAACGGACA ATGTAGAATT TTTTGATCCT AATTACCGTT ATTCTTTCAA AGAATGGCAA 3900 GATTGGTCTT TCAAACAAAC AGATAATAAG GGCTTTACTC GTTCAAGTCT AACGGTTTTA 3960 AGCGGTACAG AAGGCAAAAA ACAAGTAGAT GAACCCTGGT TTAATCTCTT ATTGCACGAA 4020 ACGAAATTTT CAGGAGAAAA GGGTTTAATA GGGCGTAATA ACGTCATGTT TACCCTCTCT 4080 49 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ TTAGCCTACT TTAGTTCAGG CTATTCAATC GAAACGTGCG ΑΑΤΑΤΑΑΤΑΤ GTTTGAGTTT 4140 AATAATCGAT TAGATCAACC CTTAGAAGAA AAAGAAGTAA TCAAAATTGT TAGAAGTGCC 4200 TATTCAGAAA ACTATCAAGG GGCTAATAGG GAATACATTA CCATTCTTTG CAAAGCTTGG 4260 GTATCAAGTG ATTTAACCAG TAAAGATTTA TTTGTCCGTC AAGGGTGGTT TAAATTCAAG 4320 AAAAAAAGAA GCGAACGTCA ACGTGTTCAT TTGTCAGAAT GGAAAGAAGA TTTAATGGCT 4380 TATATTAGCG AAAAAAGCGA TGTATACAAG CCTTATTTAG TGACGACCAA AAAAGAGATT 4440 AGAGAAGTGC TAGGCATTCC TGAACGGACA TTAGATAAAT TGCTGAAGGT ACTGAAGGCG 4500 AATCAGGAAA TTTTCTTTAA GATTAAACCA GGAAGAAATG GTGGCATTCA ACTTGCTAGT 4560 GTTAAATCAT TGTTGCTATC GATCATTAAA GTAAAAAAAG AAGAAAAAGA AAGCTATATA 4620 AAGGCGCTGA CAAATTCTTT TGACTTAGAG CATACATTCA TTCAAGAGAC TTTAAACAAG 4680 CTAGCAGAAC GCCCTAAAAC GGACACACAA CTCGATTTGT TTAGCTATGA TACAGGCTGA 4740 AAATAAAACC CGCACTATGC CATTACATTT ATATCTATGA TACGTGTTTG ΤΤΤΠΤΟΤΤΤ 4Β00 GCTGTTTAGC GAATGATTAG CAGAAATATA CAGAGTAAGA ΤΤΤΤΑΑΤΤΑΑ TTATTAGGGG 4860 GAGAAGGAGA GAGTAGCCCG AAAACTTTTA GTTGGCTTGG ACTGAACGAA GTGAGGGAAA 4920 GGCTACTAAA ACGTCGAGGG GCAGTGAGAG CGAAGCGAAC ACTTGATTTT TTAATTTTCT 4980 ATCTTTTATA GGTCATTAGA GTATACTTAT TTGTCCTATA AACTATTTAG CAGCATAATA 5040 GATTTATTGA ATAGGTCATT TAAGTTGAGC ATATTAGAGG AGGAAAATCT TGGAGAAATA 5100 TTTGAAGAAC CCGATTACAT GGATTGGATT AGTTCTTGTG GTTACGTGGT TTTTAACTAA 5160 AAGTAGTGAA TTTTTGATTT TTGGTGTGTG TGTCTTGTTG TTAGTATTTG CTAGTCAAAG 5220 TGATTAAATA 5230 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5231 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 50 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: GAATTCGATT AAGTCATCTT ACCTCTTTTA TTAGTTTTTT CTTATAATCT AATGATAACA 60 TTTTTATAAT TAATCTATAA ACCATATCCC TCTTTGGAAT CAAAATTTAT TATCTACTCC 120 TTTGTAGATA TGTTATAATA CAAGTATCAG ATCTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC 180 9 TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATGGCTAGCA TGACTGGTGG 240 ACAGCAAATG GGTCGCGGAT CCGGCTGCTA ACAAAGCCCG AAAGGAAGCT GAGTTGGCTG 300 CTGCCACCGC TGAGCAATAA CTAGCATAAC CCCTTGGGGC CTCTAAACGG GTCTTGAGGG 360 GTTTT7TGCT GAAAGGAGGA ACTATATCCG ACTAGAATCG ATACGATTTT GAAGTGGCAA 420 CAGATAAAAA AAAGCAGTTT AAAATTGTTG CTGAACTTTT AAAACAAGCA AATACAATCA 460 TTGTCGCAAC AGATAGCGAC AGAGAAGGCG AAAACATTGC CTGGTCGATC ATTCATAAAG 540 CAAATGCCTT TTCTAAAGAT AAAACGTATA AAAGACTATG GATCAATAGT TTAGAAAAAG 600 51 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ ATGTGATCCG TAGCGGTTTT CAAAATTTGC AACCAGGAAT GAATTACTAT CCCTTTTATC 660 AAGAAGCGCA AAAGAAAAAC GAAATGATAC ACCAATCAGT GCAAAAAAAG ATATAATGGG 720 AGATAAGACG GTTCGTGTTC GTGCTGACTT GCACCATATC ATAAAAATCG AAACAGCAAA 780 GAATGGCGGA AACGTAAAAG AAGTTATGGA AATAAGACTT AGAAGCAAAC TTAAGAGTGT 840 GTTGATAGTG CAGTATCTTA AAATTTTGTA TAATAGGAAT TGAAGTTAAA TTAGATGCTA 900 AAAATTTGTA ATTAAGAAGG AGTGATTACA TGAACAAAAA ΤΑΤΑΑΑΑΤΑΤ TCTCAAAACT 960 TTTTAACGAG TGAAAAAGTA CTCAACCAAA TAATAAAACA ATTGAATTTA AAAGAAACCG 1020 ATACCGTTTA CGAAATTGGA ACAGGTAAAG GGCATTTAAC GACGAAACTG GCTAAAATAA 1080 GTAAACAGGT AACGTCTATT GAATTAGACA GTCATCTATT CAACTTATCG TCAGAAAAAT 1140 TAAAACTGAA TACTCGTGTC ACTTTAATTC ACCAAGATAT TCTACAGTTT CAATTCCCTA 1200 ACAAACAGAG GTATAAAATT GTTGGGAGTA TTCCmCCA TTTAAGCACA CAAATTATTA 1260 AAAAAGTGGT TTTTGAAAGC CATGCGTCTG ACATCTATCT GATTGTTGAA GAAGGATTCT 1320 ACAAGCGTAC CTTGGATATT CACCGAACAC TAGGGTTGCT CTTGCACACT CAAGTCTCGA 1360 TTCAGCAATT GCTTAAGCTG CCAGCGGAAT GCTTTCATCC TAAACCAAAA GTAAACAGTG 1440 TCTTAATAAA ACTTACCCGC CATACCACAG ATGTTCCAGA TAAATATTGG AAGCTATATA 1500 CGTACTTTGT TTCAAAATGG GTCAATCGAG AATATCGTCA ACTGTTTACT AAAAATCAGT 1560 TTCATCAAGC AATGAAACAC GCCAAAGTAA ACAATTTAAG TACCGTTACT TATGAGCAAG 1620 TATTGTCTAT TTTTAATAGT TATCTATTAT TTAACGGGAG GAAATAATTC TATGAGTCGC 1680 52 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ TTTTGTAAAT TTGGAAAGTT ACACGTTACT AAAGGGAATG TAGATAAATT ATTAGGTATA 1740 CTACTGACAG CTTCCAAGGA GCTAAAGAGG TCCCTAGCGC TCTTATCATG GGGAAGCTCG 1800 GATCATATGC AAGACAAAAT AAACTCGCAA CAGCACTTGG AGAAATGGGA CGAATCGAGA 1Β60 AAACCCTCTT TACGCTGGAT TACATATCTA ATAAAGCCGT AAGGAGACGG GTTCAAAAAG 1Θ20 GTTTAAATAA AGGAGAAGCA ATCAATGCAT TAGCTAGAAC ΤΑΤΑΤΤΤΤΤΤ GGACAACGTG 1980 GAGAATTTAG AGAACGTGCT CTCCAAGACC AGTTACAAAG AGCTAGTGCA CTAAAGATAA 2040 TTATTAACGC TATAAGTGTG TGGAACACTG TATATATGGA AAAAGCCGTA GAAGAATTAA 2100 AAGCAAGAGG AGAATTTAGA GAAGATTTAA TGCCATATGC GTGGCCGTTA GGATGGGAAC 2160 ATATCAATTT TCTTGGAGAA TACAAATTTG AAGGATTACA TGACACTGGG CAAATGAATT 2220 TACGTCCTTT ACGTATAAAA GAGCCGTTTT ATTCTTAATA TAACGGCTCT TTTTATAGAA 2280 AAAATCCTTA GCGTGGTTTT TTTCCGAAAT GCTGGCGGTA CCCCAAGAAT TAGAAATGAG 2340 TAGATCAAAT TATTCACGAA TAGAATCAGG AAAATCAGAT CCAACCATAA AAACACTAGA 2400 ACAAATTGCA AAGTTAACTA ACTCAACGCT AGTAGTGGAT TTAATCCCAA ATGAGCCAAC 2460 AGAACCAGAG CCAGAAACAG AATCAGAACA AGTAACATTG GATTTAGAAA TGGAAGAAGA 2520 AAAAAGCAAT GACTTCGTGT GAATAATGCA CGAAATCGTT GCTTATTTTT TTTTAAAAGC 2580 ΤΤΤΑΤΑΑΑΑΤ GTTTGACGAC ΑΤΤΤΤΑΤΑΑΑ TGCATAGCCC GATAAGATTG CCAAACCAAC 2700 GCTTATCAGT TAGTCAGATG AACTCTTCCC TCGTAAGAAG ΤΤΑΤΤΤΑΑΤΤ AACTTTGTTT 2760 GAAGACGGTA TATAACCGTA CTATCATTAT ATAGGGAAAT CAGAGAGTTT TCAAGTATCT 2820 53 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ AAGCTACTGA ATTTAAGAAT TGTTAAGCAA TCAATCGGAA ATCGTTTGAT TGCTTTTTTT 2880 GTATTCATTT ATAGAAGGTG GAGTTTGTAT GAATCATGAT GAATGTAAAA CTTATATAAA 2940 AAATAGTTTA TTGGAGATAA GAAAATTAGC AAATATCTAT ACACTAGAAA CGTTTAAGAA 3000 AGAGTTAGAA AAGAGAAATA TCTACTTAGA AACAAAATCA GATAAGTATT TTTCTTCGGA 3060 GGGGGAAGAT ΤΑΤΑΤΑΤΑΤΑ AGTTAATAGA AAATAACAAA ΑΤΑΑΤΤΤΑΤΓ CGATTAGTGG 3120 AAAAAAATTG ACTTATAAAG GAAAAAAATC I II I ICAAAA CATGCAATAT TGAAACAGTT 3180 GAATGAAAAA GCAAACCAAG TTAATTAAAC AACCTATTTT ATAGGATTTA TAGGAAAGGA 3240 GAACAGCTGA ATGAATATCC CTTTTGTTGT AGAAACTGTG CTTCATGACG GCTTGTTAAA 3300 GTACAAATTT AAAAATAGTA AAATTCGCTC AATCACTACC AAGCCAGGTA AAAGCAAAGG 3360 GGCTATTTTT GCGTATCGCT CAAAATCAAG CATGATTGGC GGTCGTGGTG TTGTTCTGAC 3420 TTCCGAGGAA GCGATTCAAG AAAATCAAGA TACATTTACA CATTGGACAC CCAACGTTTA 3480 TCGTTATGGA ACGTATGCAG ACGAAAACCG TTCATACACG AAAGGACATT CTGAAAACAA 3540 TTTAAGACAA ATCAATACCT TCTTTATTGA TTTTGATATT CACACGGCAA AAGAAACTAT 3600 TTCAGCAAGC GATATTTTAA CAACCGCTAT TGATTTAGGT TTTATGCCTA CTATGATTAT 3660 CAAATCTGAT AAAGGTTATC AAGCATATTT TGTTTTAGAA ACGCCAGTCT ATGTGACTTC 3720 AAAATCAGAA nTAAATCTG TCAAAGCAGC CAAAATAATT TCGCAAAATA TCCGAGAATA 3780 TTTTGGAAAG TCTTTGCCAG TTGATCTAAC GTGTAATCAT TTTGGTATTG CTCGCATACC 3840 AAGAACGGAC AATGTAGAAT TTTTTGATCC TAATTACCGT TATTCTTTCA AAGAATGGCA 3900 54 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ AGATTGGTCT TTCAAACAAA CAGATAATAA GGGCTTTACT CGTTCAAGTC TAACGGTTTT 3960 AAGCGGTACA GAAGGCAAAA AACAAGTAGA TGAACCCTGG TTTAATCTCT TATTGCACGA 4020 AACGAAATTT TCAGGAGAAA AGGGTTTAAT AGGGCGTAAT AACGTCATGT TTACCCTCTC 4080 TTTAGCCTAC TTTAGTTCAG GCTATTCAAT CGAAACGTGC GAATATAATA TGTTTGAGTT 4140 TAATAATCGA TTAGATCAAC CCTTAGAAGA AAAAGAAGTA ATCAAAATTG TTAGAAGTGC 4200 CTATTCAGAA AACTATCAAG GGGCTAATAG GGAATACATT ACCATTCTTT GCAAAGCTTG 4260 GGTATCAAGT GATTTAACCA GTAAAGATTT ATTTGTCCGT CAAGGGTGGT TTAAATTCAA 4320 GAAAAAAAGA AGCGAACGTC AACGTGTTCA TTTGTCAGAA TGGAAAGAAG ATTTAATGGC 4380 TTATATTAGC GAAAAAAGCG ATGTATACAA GCCTTATTTA GTGACGACCA AAAAAGAGAT 4440 TAGAGAAGTG CTAGGCATTC CTGAACGGAC ATTAGATAAA TTGCTGAAGG TACTGAAGGC 4500 GAATCAGGAA ATTTTCTTTA AGATTAAACC AGGAAGAAAT GGTGGCATTC AACTTGCTAG 4560 TGTTAAATCA TTGTTGCTAT CGATCATTAA AGTAAAAAAA GAAGAAAAAG AAAGCTATAT 4620 AAAQGCGCTG ACAAATTCTT TTGACTTAGA GCATACATTC ATTCAAGAGA CTTTAAACAA 4680 GCTAGCAGAA CGCCCTAAAA CGGACACACA ACTCGATTTG TTTAGCTATG ATACAGGCTG 4740 AAAATAAAAC CCGCACTATG CCATTACATT TATATCTATG ATACGTGTTT GTTTTTTCTT 4800 TGCTGTTTAG CGAATGATTA GCAGAAATAT ACAGAGTAAG ΑΤΤΤΤΑΑΤΤΑ ATTATTAGGG 4860 GGAGAAGGAG AGAGTAGCCC GAAAACTTTT AGTTGGCTTG GACTGAACGA AGTGAGGGAA 4920 AGGCTACTAA AACGTCGAGG GGCAGTGAGA GCGAAGCGAA CACTTGATTT TTTAATTTTC 4980 TATCTTTTAT AGGTCATTAG AGTATACTTA TTTGTCCTAT AAACTATTTA GCAGCATAAT 5040 AGATTTATTG AATAGGTCAT TTAAGTTGAG CATATTAGAG GAGGAAAATC TTGGAGAAAT 5100 ATTTGAAGAA CCCGATTACA TGGATTGGAT TAGTTCTTGT GGTTACGTGG TTTTTAACTA 5160 AAAGTAGTGA ΑΙΤΤΊIGATT TTTGGTGTGT GTGTCTTGTT GTTAGTATTT GCTAGTCAAA 5220 5231 GTGATTAAAT Α 55 ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 86 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28: GAAGATCTTT AAAATGAAGG AGAAAAAAAT GAAAATAGGA TACGCACGAG TTTCAACTCA 60 AGGAGGATCC AAATGATCAG ATCTTC 86

Lisboa,

Claims (14)

1. ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Derivado imunogénico desintoxicado de toxina β de Clostridium perfringens ou um seu fragmento imunogénico, caracterizado por transportar uma mutação localizada num domínio de transição entre partes neutras e hidrófilas da toxina β.
2. 2. Derivado imunogénico desintoxicado de toxina β de Clostridium perfringens ou um seu fragmento imunogénico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por transportar uma mutação localizada na posição 62, 182, 19 7 ou numa das regiões entre os aminoácidos número 80- 103, 145-147, 281- 291, 295-299 ou a jusante da posição de aminoácido 292 relativamente à metionina líder do péptido.
3. 3. Derivado de toxina β de Clostridium perfringens ou um seu fragmento imunogénico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela mutação ser localizada numa das regiões entre os aminoácidos número 80-82, 95-97, 101-103 ou 287-291.
4. 4. Sequência de nucleótidos incluindo um fragmento de ADN mutado, em que o referido fragmento de ADN mutado codifica uma toxina β de Clostridium perfringens imunogénica desintoxicada ou um seu fragmento imunogénico de acordo com as reivindicações 1-3.
5. 5. Bactéria de Clostridium perfringens incluindo uma sequência de nucleótidos de acordo com a reivindicação 4.
6. 6. Sistema de expressão baseado numa bactéria Gram-positiva, em que a referida bactéria Gram-positiva é uma espécie de Lactococcus incluindo uma sequência de nucleótidos de acordo com a reivindicação 4.
7. 7. Vacina para combater infecção por Clostridium perfringens, caracterizada por incluir um derivado de toxina β de Clostridium perfringens ou um seu fragmento imunogénico de acordo com as reivindicações 1-3 e um transportador fisiologicamente aceitável. ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ 2/3
8. 8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por incluir um adjuvante.
9. 9. Vacina para combater infecção por Clostridium perfringens, caracterizada por incluir um organismo transportador recombinante vivo, em que o referido organismo transportador transporta um fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 4.
10. 10. Vacina para combater infecção por Clostridium perfringens, caracterizada por incluir uma estirpe de Clostridium perfringens atenuada viva na qual o gene de toxina β nativo é substituído por uma sequência de nucleótidos de acordo com a reivindicação 4.
11. 11. Vacina de acordo com as reivindicações 7-10, caracterizada por incluir adicionalmente imunogénios de outros patogénios.
12. 12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por os referidos outros imunogénios de outros patogénios serem seleccionados do grupo que consiste em Actinobacillus pleuropneumoniae, vírus da pseudo-raiva, vírus influenza porcino, parvovírus porcino, vírus da gastroenterite transmissível, rotavírus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, espécies de Salmonella, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis e bactérias do tipo Helicobacter.
13. 13. Método para a preparação de derivados de toxina β de Clostridium perfringens de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizado por uma sequência de nucleótidos incluindo um fragmento de ADN que codifica um derivado de toxina β de acordo com a reivindicação 4 ser expresso numa bactéria da espécie Lactococcus.
14. 14. Método para a preparação de uma vacina para combater infecção por Clostridium perfringens, caracterizado por o referido método incluir a mistura de um derivado de toxina β ΕΡ Ο 892 054 /ΡΤ 3/3 de Clostridium perfringens de acordo com as reivindicações 1-3 e um transportador fisiologicamente aceitável. Lisboa,