KR100510906B1 - 악티노 바실러스 플루로뉴모니아종의 약독화 생박테리아 - Google Patents

악티노 바실러스 플루로뉴모니아종의 약독화 생박테리아 Download PDF

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Abstract

본 발명은 작용성의 ApxIV 독소를 생성할 수 없도록 apxIV 유전자에 돌연변이를 가진 악티노바실러스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 속의 약독화 생 박테리아에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 박테리아를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또 본 발명은 이 박테리아를 함유하는 백신 및 이 백신의 제조 방법도 포함한다. 또한, 본 발명은 ApxIV 독소를 함유하는 서브유니트 백신, 이 백신의 생산 방법 및 악티노바실러스 플루로뉴모니아 속의 박테리아 감염에 대하여 동물을 보호하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 apxIV 유전자의 프로모터에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염을 선택적으로 확인할 수 있는 확인 시험 및 악티노바실러스 플루로뉴모니아 야생 균주와 백신 균주를 각각 구별하는 확인 시험에 관한 것이다.

Description

악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 약독화 생 박테리아
본 발명은 독소 암호 유전자에 돌연변이가 있는 악티노바실러스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 속의 약독화 생 박테리아, 이 박테리아의 제조 방법, 이 박테리아를 함유하는 백신, 이 백신의 제조 방법, 독소를 함유하는 백신, 이 백신의 생산 방법 및 악티노바실러스 플루로뉴모니아 속의 박테리아 감염에 대한 동물을 보호하는 방법에 관한 것이다.
악티노바실러스 속에 속하는 박테리아는 모두 소위 RTX-독소(RTX는 독소내에서의 반복을 나타냄)를 생산한다. 이러한 RTX-독소의 존재는 그 악티노바실러스 박테리아의 주요한 병원성 특징이다.
RTX-독소는 브라운 등(Braun et al., Critical Rev. in Microbiol. 18(2): 115-158(1991))에 의해 심층 검토된 바 있다. 또, 그람 음성 균주들의 RTX-독소는 웰츠 알.악티노바실러스 [Molecular Microbiology 5/3:521-528(1991)] 및 웰츠 등[Inf.Agents and Disease 4:254-272(1995)]에 의해 검토되었다.
알려진 모든 RTX-독소는 몇가지 세포독성 또는 세포용해 활성을 나타낸다. 하지만, 독소와 아실화의 차이에 따라 표적-세포 특이성 및 숙주 특이성이 달라진다[McWhinney et al.: J.Bact. 174:291-297(1992) 및 Hackett et al.; J.Biol.Chem. 270:20250-20253(1995)]. 표적 세포의 차이에 따라, RTX 독소과에 속하는 다양한 독소들이 알려져 있는데, 그 예로는 헤모리신, 세포용해소 또는 세포 독소가 있다. 악티노바실러스 속에는 다수의 여러 종이 있는데, 그 예로는 특히 악티노바실러스 플루로뉴모니아, 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(A.actinomycetemcomitans), 악티노바실러스 수스(A.suis), 악티노바실러스 로시(A.rossi), 악티노바실러스 에쿨리(A.equuli) 및 악티노바실러스 리그니에레시(A.lignieresii) 등이 있다.
악티노바실러스 플루로뉴모니아는 돼지, 말, 소 및 인간의 적혈구에 대해, 토끼와 돼지의 호중구에 대해, 그리고 돼지의 폐포 대식세포에 대해 세포독성/세포용해성인 혈청형 의존적 RTX 독소를 생산한다[Rosendal et al.; Am.J.Vet.Res. 49:1053-1058(1988), Maudsley J.R. 및 Kadis S; Can.J.Microbiol. 32:801-805(1986), Frey, J. 및 Nicolet.J; Inf. & Imm. 56:2570-2575(1988), Bendixon et al.; Inf. & Imm. 33:673-676(1981), Kamp, E.M. 및 van Leengoed, L.A.M.G.; J.Clin. Microbiol. 27:1187-1191(1989)].
돼지의 악티노바실러스 감염은 어린 돼지들에 대한 급성 치사율과 성숙한 돼지의 체중 증가로 인하여 양돈업에 막대한 경제적 손실을 일으킨다.
그람 음성 박테리아에 있어서 RTX 독소의 합성, 활성화 및 운반과 관련있는 오페론의 유전자 기구는 최근 쿠테, 제이.지.[Coote,J.G., FEMS Microbiology reviews 88:137-162(1992)]에 의해 검토된 바 있다. 특히 프레이는 박테리아 단백질 독소중에 있어서 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 공지된 3종의 RTX-독소에 대하여 검토하였다[Zbl Bakt.Suppl. 24, p.322-, Freer et al.(Eds.), Gustaf Fischer, Stuttgart, Jena, New York, 1994].
악티노바실러스 플루로뉴모니아에 존재하는 이러한 종류의 RTX-오페론은 4가지 유전자, 즉 실제 독소-유전자(A), 활성인자-유전자(C) 및 주변 매체로 독소를 분비하는데 관여하는 단백질을 암호하는 2종의 유전자(B 및 D)를 포함한다. 독소-유전자(A)의 1차 해독 생성물은 비독성 단백질로서, 이들의 독성 작용은 활성인자-유전자(C) 생성물에 의해 활성화된다.
최근까지 전술한 유전자 기구를 모두 갖추거나 또는 적어도 독소-유전자(A)와 활성인자-유전자(C)를 가진 3종의 RTX-독소만이 악티노바실러스 종내에 존재하는 것으로 추정되었다.
이들 3종의 RTX-독소, ApxI, Apx-II 및 Apx-III은 각각 뛰어난 용혈 활성(ApxI), 약한(mild) 용혈 활성(Apx-II) 또는 대식세포-세포독성 활성(Apx-III)을 가지고 있다.
이와 같이 다양한 독성 활성은 혈청형에 따라 임의적으로 분류된다. 여기에는 4종의 아군이 있다:
아군 A, ApxI 및 Apx-II를 생산하며, 혈청형 1,5,9 및 11을 나타냄,
아군 B, Apx-II 및 Apx-III을 생산하며, 혈청형 2,3,4,6 및 8을 나타냄,
아군 C, ApxI만을 생산하며, 혈청형 10을 나타냄,
아군 D, Apx-II만을 생산하며, 혈청형 7 및 12를 나타냄.
ApxI, Apx-II 및 Apx-III은 모두 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염에 대한 보편적인 백신들에 필요한 필수 성분들인 바, 적어도 ApxI, Apx-II 및 Apx-III을 함유하지 않는 백신은 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형에 대하여 보호 활성을 나타내지 못할 것이라고 알려져 있다. 또한, 최소한 1종의 특정 혈청형의 Apx-독소를 함유하지 않는 백신은 그 단일 혈청형에 대한 보조 활성을 유도하지 못할 것이다.
독성을 상실한 악티노바실러스 플루로뉴모니아 유래의 시험관내 합성된 RTX-독소를 주성분으로 한 서브유니트 백신은 종래 개시된 바 있으며, 예컨대 유럽 특허 제0354628호에서는 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 헤모리신과 세포독소를 주성분으로 한 서브유니트 백신을 개시하고 있고, 유럽 특허 제0.453.024호에서는 헤모리신, 세포독소 및 외부 막 단백질을 주성분으로 한 악티노바실러스 플루로뉴모니아 서브유니트 백신을 개시하고 있다.
하지만, 일반적으로 서브유니트 백신에는 4가지 주요 단점이 있다.
1. 면역계를 적절하게 자극하기 위하여 다량의 항원 물질을 필요로 한다는 점.
2. 일반적으로, B-세포 면역성만이 자극 유발된다는 점.
3. 몇몇 예방 항원들은 단지 생체내에서만 자극 유발되므로, 서브유니트 백신으로는 존재할 수 없다는 점.
4. 병원성 생 박테리아가, 보호작용에 매우 중요하며 이에 따라 효과적인 서브유니트 백신에 함유되는 많은 중요한 면역원성 분자, 예컨대 외부 막 단백질 및 캡슐 다당류를 가지고 있다는 점.
상기 1 및 2에 기술한 명백한 문제점 외에도, 특히 4번째 문제점은 효과적인 서브유니트 백신의 제조를 어렵게 한다.
이러한 점에 대해서는 예컨대 전술한 유럽 특허 제0.453.024호에 개시된 4종의 다른 서브유니트(3종의 RTX-독소와 외부 막 단백질)가 한 백신에 혼합되어 있는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 서브유니트 백신을 예로 들 수 있다.
파스퇴렐라시에(Pasteurellaceae) 감염에 대한 서브유니트 백신의 단점을 해소하는데에는 약독화 생 백신이 매우 바람직할 것이다.
약독화 생 백신은 다음과 같은 이점을 갖고 있다.
1. 이 백신은 저용량으로 투여할 수 있다는 점(자가 복제성임).
2. 천연형/야생형 감염과 매우 유사하다는 점.
3. 가능성있는 면역학적으로 중요한 항원을 모두 동시에 함유한다는 점.
이와 같은 명백한 이점에도 불구하고, 악티노바실러스 플루로뉴모니아를 주성분으로 한 생백신은 본 발명 이전에 시판된 바 없다. 그 이유는 다음과 같은 패러독스 때문이다: 전술한 바와 같이, ApxI, Apx-II 및 Apx-III은 모두 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염에 대한 보편적 백신의 필수 성분이다. 따라서, 생백신은 이러한 3가지 RTX-독소를 생산해야만 한다. 하지만 이러한 3종류의 RTX-독소는 모든 악티노바실러스 종에 존재하는 강한 독성 인자이다[예컨대, Coote, J.G.;FEMS Microbiology reviews 88: 137-162(1992), Tascon et al.; Mol.Microbiol. 14: 207-216(1994), Jansen et al.; Inf. & Imm. 63:27-37(1995)].
App 생 균주의 독성을 약독화하기 위한 RTX-독소의 결실은 기술적으로 실현 가능하지만, 다음과 같은 딜레마에 대한 해결책을 제공하지는 못한다. 즉 RTX-음성 균주는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 야생 균주들의 용혈/세포독성 활성에 대하여 숙주내에서 더 이상 면역성을 유도하지 못하므로 약독화 생 백신 균주로서 사용될 수 없을 것이다.
하지만, 면역성 유도에는 주요 역할을 하지만, 면역성을 증강시키는데 있어서 주요 역할은 ApxI, Apx-II 및 Apx-III보다 적으며, 따라서 본질적으로는 결실될 수 있는 독성 인자는 현재 알려진 바 없다.
따라서, 독성을 초래하며, 변화되었을 때 약독화 App 균주로 만드는 App 게놈상의 일정 부위를 지니는 것이 매우 바람직하겠지만, 반면 동시에, 이 일정 부위는 면역성을 자극 유발하는데에는 효과적으로 이용될 수 있으나 백신의 관점에서는 없어도 되는 것이다. 하지만, 현재까지 이러한 부위들에 대해서는 알려진 바가 없다. 더욱이, 이러한 부위가 특정 혈청형에 제한되지 않고 모든 App 균주에 일반적으로 제공되는 것이 매우 바람직할 것이다. 따라서, 이러한 부위는, 그 부위를 제거하므로써 상이한 모든 혈청형들을 약독화시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 제1 목적은 혈청형에 관계없이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주에 일반적으로 존재하는 전술한 약독화 부위를 제공하는 것이다.
최근에 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 혈청형 1 균주에서 신규 유전자가 발견되었다(Thesis T.J. Anderson Nov. 1995). 이 유전자는 공지의 악티노바실러스 ApxI, Apx-II 및 Apx-III 유전자와 유사하지는 않지만, 나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)에 속하는 박테리아로부터 알려진 RTX-독소 유전자와 유사하며, 이러한 이유로 RTX-유전자 apxIV라고 명명되었다. 하지만, 이 유전자는 전술한 바와 같은 악티노바실러스 과의 다양한 종들에 존재하는 공지된 3종의 RTX-독소 유전자 apxI, apx-II 및 apx-III과는 거의 모든 면에서 상이하다. 무엇보다도, 게놈 구성이 전혀 다르다. 두 번째로는, 공지의 Apx-독소들에서 발견되는 활성인자-기작이 전혀 없다. 세 번째로는, 상기 유전자 또는 이 유전자의 가능한 유전자 생성물에 기인하는 특이적인 생체내 용혈 또는 세포독성 활성이 전혀 나타나지 않는다.
놀랍게도, 본 발명자들은 상기 유전자가 공지된 3종의 RTX-유전자와는 완전 대조적으로 혈청형에 관계없이 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 모든 박테리아에 존재한다는 것을 발견하였다. 이것은 실시예 6과 7에 기술된 모든 혈청형의 악티노바실러스 플루로뉴모니아에서 얻은 DNA의 제한 단편과, apxIV 암호 서열을 함유하는 프로브를 하이브리드화하여 확인하였다. 예상치도 못하게, 본 발명자들은 apxIV 결실 돌연변이주가 생육성이지만, 이 돌연변이주의 apxIV-함유 모균주와 비교해 볼 때 보다 적은 독성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 따라서, 유전자 생성물인 ApxIV 독소가 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주의 독성 인자임을 확인하였다. 이러한 결과는 지금까지 독성에 영향을 줄 것으로 예측된 인자들 이외에는 생체내 유전자 생성물에 의하여 나타나는 영향들은 전혀 없다는 예상치 못한 것이었다. 사실, 지금까지는 상기 유전자가 생체내적 또는 생체외적으로 악티노바실러스 플루로뉴모니아 중에서 발현된다는 증거는 전혀 없었다. 따라서, 본 발명의 이점중 하나는
1. apxIV 유전자가 혈청형에 관계없이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 존재하고,
2. apxIV 유전자 생성물이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형중에서 독성 인자이며,
3. apxIV 유전자에 결실이 있는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주는 생육성을 유지하지만 이 균주의 면역원성에는 큰 손실을 주지 않고 감소된 독성을 나타낸다는 것을 발견하였다는 것이다.
결과적으로, 본 발명은 처음으로 기능성 ApxIV 독소를 생산하지 않는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 약독화된 생 박테리아를 제공한다.
작용성 ApxIV 독소는 야생형 박테리아에서 발현되는 것과 같은 ApxIV 독소의 모든 특징을 가지며, 야생형 수준으로 발현되는 단백질인 것으로 간주된다. 따라서, 비기능성 ApxIV 독소는 야생형 박테리아에서 발현되는 것과 같은 ApxIV 독소의 일부 또는 모든 특징이 결실되어 있고(또는) ApxIV 독소의 야생형 효과를 얻기에는 불충분한 농도로 발현된다.
ApxIV 독소 생산의 불능은 예컨대 ApxIV 독소를 암호하는 암호 서열의 변형에 의한 것일 수 있다. 또한, 예컨대 프로모터 영역과 같은 apxIV 유전자의 전사와 관련있는 것으로 알려진 영역이 변형된 결과이거나, 또는 리보솜 결합 부위와 같은 해독 관련 영역이 변화된 결과일 수 있다.
apxIV 유전자의 전체 구조는 도 1에 도시하였다.
이 도면에서 ApxIV 독소의 특징인 직접 반복 영역은 빗금친 박스로 나타낸 반면, ApxIV 특이적이고 글리신-풍부한 노나펩티드 영역은 흑색 화살표로 나타내었다. 반복 영역은 ApxIV의 C 말단 부분에서 발견된다. 이러한 특징들은 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형에서 나타났다. 서열 1 내지 4에는 2종의 혈청형을 가진 핵산 서열과 아미노산 서열을 나타내었다. 서열 1은 App 혈청형 1이 가진 apxIV 유전자의 핵산 서열, 서열 2는 혈청형 1 ApxIV 독소에 부합되는 아미노산 서열, 서열 3은 App 혈청형 3의 apxIV 유전자의 뉴클레오티드 서열, 그리고 서열 4는 혈청형 3 ApxIV 독소에 부합되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 2는 각각의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형이 가진 Apx-독소들 간의 아미노산 수준에서, 특히 N-말단의 650 아미노산에서의 매우 높은 보존율을 나타낸 것이다. 또한, 이것은 apxIV 유전자의 명백한 특징이다. 도 1을 통해서는 혈청형에 따라 독소의 C-말단 부분에 있는 반복 서열의 수가 다양하게 나타날 수 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 다양성은 각종 혈청형에서 얻은 유전자와 이로부터 암호된 독소의 크기에 차이가 있기 때문이다.
심지어는 동일한 혈청형에 속하는 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 여러 분리물에서 분리된 apxIV 유전자간에도 핵산 서열에 약간의 변화가 있을 수 있다. 이것은 모든 유기체중에 존재하는 것으로 당해 기술분야에 알려진 자연적 변화 때문이다. 즉, 폴리펩티드의 기능은 변화되지 않으면서, apxIV 유전자에 의해 암호된 ApxIV 독소의 일부 아미노산은 다른 혈청형의 ApxIV 독소의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대, 특정 부위에 Asp를 함유하는 폴리펩티드 및 그 대응 부위에 Asn을 함유하는 변이체는 동일 성질을 가진다. 한 아미노산이 기능적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 이 공정은 기능적 치환이라고도 한다. 이러한 경우에 변이 단백질은 기능적 변이체라고 한다. 변화의 또다른 원인은 유전자 코드의 축퇴 현상 때문이다. 간단히 말하면, 예컨대 아미노산 글루탐산은 GAT와 GAA에 의해 암호된다. 이 현상은 Met와 Trp를 제외한 모든 아미노산들에서 나타난다. 따라서, 예컨대 본 발명에서 제시된 혈청형 1의 ApxIV 독소는 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 동일한 폴리펩티드 또는 기능적으로 동일한 폴리펩티드를 제공하는 다양한 다른 서열들에 의해 암호될 수 있다는 것은 자명한 것이다. 따라서, 본 발명에는 ApxIV 독소와 비교할만한 작용성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 변이 apxIV 서열도 포함된다.
본 발명에 기재된 약독화 생 박테리아는 여러 가지 방법으로 얻을 수 있다. 이러한 박테리아를 얻을 수 있는 한가지 방법은 야생형 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테리아를 염기 유사체와 같은 돌연변이화제로 처리하거나, 자외선 처리 또는 온도 처리 등과 같은 고전적 방법으로 처리하는 것이다. 기능성 ApxIV 독소를 생산하지 않는 균주는 항-ApxIV 독소 항체를 유도하지 않거나 그 항체 유도성이 보다 적으므로, 따라서 동물 테스트로 쉽게 선별할 수 있다. 이 때 필요한 항혈청은 하기 실시예 3에 기술된 바와 같이 얻을 수 있다. 다른 처리 방법은 재조합 DNA 기법을 사용하여 ApxIV 독소를 암호하는 유전자내에 충분히 정의된 돌연변이를 만드는 것이다. 이러한 돌연변이는 삽입, 결실, 한 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 치환 또는 이의 조합에 의해 일어날 수 있되, 단 돌연변이된 유전자는 작용성 ApxIV 독소를 더 이상 암호하지 못한다. 작용성 ApxIV 독소를 더 이상 암호하지 못하는 균주를 얻는 데에는 특히 오픈 리딩 프레임내에 프레임-이동을 일으키는 돌연변이 또는 오픈 리딩 프레임내에 종지 코돈을 첨가하는 돌연변이가 매우 적합하다는 것을 쉽게 알 수 있다. 이러한 돌연변이는 예컨대 클론테크에서 시판하는 Transformer(등록 상표명) 키트를 사용하여 시험관내 부위 지시성 돌연변이로 수행될 수 있다. 또한, 제한 효소로 상기 유전자를 절단한 후, 엔도뉴클레아제 처리 및 재결찰 처리와 같은 다양한 다른 표준 재조합 DNA 기법을 동일하게 사용할 수 있다.
따라서, 이러한 양태의 본 발명의 바람직한 형태는 ApxIV 독소를 암호하는 유전자에 돌연변이를 포함하는 약독화 생 박테리아이다.
apxIV 유전자의 단편이나, 또는 심지어 그 전체 유전자의 결실이나, 또는 이종 DNA 단편의 삽입을 포함하는 충분히 정의된 돌연변이는 고전적 방법으로 유도된 돌연변이와 비교해 볼 때 야생형 상태로 복귀하지 않는다는 이점을 갖고 있다.
따라서, 이러한 양태의 본 발명에 속하는 보다 바람직한 형태는 ApxIV 독소를 암호하는 유전자가 삽입 및/또는 결실을 포함하는 약독화 생 박테리아이다.
오늘날 돼지에게 다량의 백신을 제공하는데 있어서, 여러 백신을 혼합 투여하는 방법이 바람직한 것이 분명한데, 그 이유는 단지 백신화 비용을 감소시킬 수 있기 때문이다. 따라서, 기타 다른 병원성 미생물이나 비루스중에서 선택된 항원을 암호하는 이종 유전자에 대한 재조합 운반체로서 약독화 생 백신 균주를 사용하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 재조합 운반체의 투여시의 이점은 이러한 운반체를 투여한 후 면역성이 2가지 이상의 질환에 대하여 동시에 유도된다는 점이다. 본 발명에 따른 약독화 생 박테리아는 이종 유전자에 대해 매우 적합한 운반체인데, 그 이유는 ApxIV 독소를 암호하는 유전자가 상기 이종 유전자의 삽입 부위로서 이용될 수 있기 때문이다. 삽입 부위로서 apxIV 유전자를 이용한 경우의 이점은 동시에 apxIV 유전자를 불활성화시키고 새로 도입된 이종 유전자를 동종의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 유전자와 함께 발현시킬 수 있다는 것이다. 이러한 재조합 운반체의 작제는 동종 재조합과 같은 표준 분자생물학 기법을 사용하여 통상적으로 실시할 수 있다. 따라서, 보다 바람직한 양태로서 본 발명은 작용성 ApxIV 독소를 생산하지 않고, apxIV 유전자에 삽입된 이종 유전자를 가진 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 약독화 생 박테리아를 제공한다. 이러한 이종 유전자는 전술한 바와 같이, 예컨대 기타 다른 병원성 미생물 또는 비루스에서 선택된 항원을 암호하는 유전자일 수 있다. 또다른 방법은 인터루킨이나 인터페론과 같은 면역계 자극과 관련있는 단백질을 암호하는 유전자를 삽입하는 것이다.
본 발명의 보다 더 바람직한 양태에 있어서, 이종 유전자는 돼지 번식 호흡증(PRRS) 비루스, 가성광견병 비루스, 돼지 인플루엔자 비루스, 돼지 파르보비루스, 전달성 위장염 비루스, 로타비루스, 에세리히아 콜리(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 파스퇴렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 헤모필러스 파라수스(Haemophilus parasuis) 및 스트렙토코커스 수스(Streptococcus suis)로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상의 항원을 암호한다.
하지만, 재조한 운반체중에 존재하는 이종 유전자를 발현하는데에는 상당한 단점이 있는데, 즉 몇가지 종류의 단백질들은 이종 박테리아에서 발현되는 경우 독성을 나타낸다고 알려져 있다. 따라서, 이러한 단백질을 암호하는 유전자는 이종 운반체에 절대로 도입시킬 수 없으며, 성공적으로 형성된 재조합체라도 사실상 특정 양의 이종 유전자가 발현되면 그 결과로서 사멸할 것이다. 한가지 실례를 들어보면, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 P2 단백질은 이.콜리중에서 간단하게 발현될 수 없다[Munson et al., Infect.& Immun. 57:88-94(1989)]. 본 발명의 목적중 하나는 이러한 단점을 나타내지 않는 재조합 생 운반체를 제공하는 것이다. 또한, apxIV 유전자가 생체내에서는 효과적으로 발현되지만(실시예 5 참조) 시험관내에서는 발현되지 않는다는 것(실시예 4 참조)이 놀랍게도 발견하였다. 이 발견은 시험관내에서 증식된 악티노바실러스 플루로뉴모니아 배양물에 있어서 ApxIV 독소의 존재를 확인하지 못했기 때문에 알 수 있었다. 이것은 ApxIV 발현이 악티노바실러스 플루로뉴모니아가 증식된 환경에 따라 일어나거나 일어나지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 특징은 공지된 생 재조합 운반체와 비교하여 예상치 못한 이점을 제공하는데, 즉 이종 유전자의 발현이 apxIV 프로모터의 조절하에 놓이게 되면, 이러한 조건하에서 외래유전자는 발현되지 않기 때문에 본 발명에 개시된 약독화된 생 악티노바실러스 플루로뉴모니아 운반체는 삽입된 이종 유전자에 관계없이 시험관내에서 고밀도로 증식될 수 있다. 다수의 박테리아를 숙주에 투여하면, 이종 유전자의 발현이 개시되어, 복제시 어느 시점에서 또는 박테리아의 사멸후 어느 시점에서 숙주의 면역계에서도 허용될 것이다. 발현되는 이종 유전자는 예컨대 apxIV 유전자의 암호 서열을 이종 유전자의 암호 영역으로 치환시키므로써 apxIV 프로모터에 기능적으로 결합될 수 있다. 또한, 전체 apxIV 유전자를 치환시킬 필요는 없으며, ApxIV의 ATG 코돈을, 종지 코돈을 비롯한 이종 유전자의 암호 영역으로 치환시키는 것만으로도 충분하다. 또한, 융합 작제물을 제조하여 apxIV 프로모터의 영항하에 이종 유전자를 발현시키는 것도 가능하다. 이러한 작제는 apxⅣ 리딩 프레임이 apxIV ATG 코돈의 다운스트림에 있도록 프레임을 유지하는 방식으로 상기 이종 유전자를 삽입하므로써 제조할 수 있다.
"apxIV 프로모터에 기능적으로 결합된" 이란 용어는 이종 유전자의 전사가 apxIV 프로모터에서 개시된다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명에는 apxIV 프로모터에 기능적으로 결합되는 삽입된 이종 유전자의 각 위치도 포함된다는 것은 자명한 것이다.
즉, 이러한 양태의 가장 바람직한 형태는 apxIV 유전자의 프로모터 영역에 기능적으로 결합된 이종 유전자를 운반하는 본 발명에 개시된 약독화된 생 박테리아이다.
천연의 apxIV 프로모터가 시험관내에서는 작동하지 않고 생체내에서는 작동하는 전환성 프로모터라는 놀라운 발견으로 인하여 이 프로모터를 이것의 천연 숙주내에서 그리고 다른 박테리아에서는 이종 프로모터로서 작용하는 다능성 발현 기구로서 사용할 수 있게 되었다. 다른 박테리아에서 이종 프로모터로 사용하는 경우에, 상기 프로모터를 함유하는 DNA는 그 숙주에서 분리된 후, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 이외의 다른 박테리아로 전이될 수 있다. 현재 실행가능한 또다른 방법은 다른 유전자의 발현을 각각 조절하는 apxIV 프로모터의 여러 복사체를 클로닝하는 것이다. 이것은 숙주 박테리아 악티노바실러스 플루로뉴모니아에서 이루어질 수 있으나, 상기 다중 복사체의 클로닝 원리는 다른 박테리아에도 똑같이 적용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 프로모터는 다른 병원성 미생물이나 비루스중에서 선택된 항원을 암호하는 1종 이상의 이종 유전자의 선택적 생체내 발현 인자로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 인터루킨, 종양 괴사 인자 또는 인터페론과 같은 시토킨을 암호하는 이종 DNA 서열의 발현에 사용할 수 있다. 여러 가지 시토킨, 예컨대 인터페론은 면역 조절제로서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 유전 정보를 apxIV 프로모터의 조절하에 발현하는 것이 유리할 것이다. 또한, 본 발명의 또다른 양태는 apxIV 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 함유하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 천연 상태에서 apxIV 유전자의 발현을 조절하는 전환가능한 프로모터는 서열 5의 위치 451 내지 1132 사이에 존재하는 DNA 단편에 위치하는 것으로 발견되었다. 하지만, 프로모터 인자에 필수적인 것은 아닌 상기 DNA 단편의 일부가 이 단편내에 반드시 존재할 필요가 없다는 것은 명백한 것이다. 따라서, 프로모터 활성을 보유하는 상기 DNA 단편의 보다 짧은 단편들도 이종 유전자의 발현에 똑같이 적합하다. 이러한 양태의 보다 더 바람직한 형태는 서열 5에 기재된 위치 451 내지 1132의 DNA 단편이나 프로모터 활성을 갖는 이의 준단편을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
박테리아 프로모터는 모두 2개의 콘센서스 영역, 소위 -10 영역 및 -35 영역을 갖고 있다. 이 콘센서스 영역들의 인접 서열은 어느정도 프로모터의 효능에 영향을 미칠 수 있지만, -35와 ATG 코돈 간의 DNA 단편을 포함하는 프로모터 영역의 부분만을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이 DNA 단편은 서열 5의 위치 617과 위치 641 사이에 위치한다. 따라서, 이러한 양태의 보다 바람직한 형태로서, 본 발명은 서열 5의 위치 617과 위치 641 사이의 DNA 단편을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 서브유니트 백신 성분으로서 ApxIV 독소를 제공한다.
서브유니트 백신은 가능하게는 공지된 3종의 Apx-독소를 포함할 것이다. 이것은 전술한 바와 같다. 하지만, ApxIV 독소는 전술한 바와 같이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 존재한다는 것이 예기치않게 발견되었으므로, 혈청형에 관계없이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 각 균주에 의해 생성되는 ApxIV 독소에 대하여 방어 작용을 하는 ApxIV 독소 유발성 중화 항체를 서브유니트 백신의 성분으로서 더 함유하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 또다른 양태는 정제된 ApxIV 독소를 함유하는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 박테리아에 의한 감염에 대하여 동물을 보호하는 서브유니트 백신에 관한 것이다. 이 ApxIV 독소는 단독으로 투여하거나 또는 전술한 독소 ApxI, Apx-II 및 Apx-III중 어느 한 성분이나 그 모든 성분과의 조합물 및/또는 예컨대 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 외부 막 단백질(OMP)과의 조합물로 투여할 수 있다. 이러한 백신은 면역 응답을 유도하기에 충분한 양의 ApxIV 독소와 약학적 허용성 담체를 혼합하여 용이하게 제조할 수 있다. ApxIV 독소의 생산은 적합한 발현 벡터에 apxIV 유전자를 도입하고, 이 유전자를 발현시킨 뒤, 독소를 분리하여 생산할 수 있다. 많은 다능성 발현계, 예컨대 박테리아 발현계, 바큘로비루스 발현계 및 포유류 세포 발현계등이 당해 기술분야에 알려져 있다. 실시에 3에는 이.콜리내에서 상기 유전자를 발현시켜 ApxIV 독소를 얻는 방법이 기술되어 있다.
본 발명의 또다른 양태는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 박테리아로의 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 전술한 바와 같은 약독화 생 박테리아를 함유하는 약독화 생 백신에 관한 것이다. 이 백신은 약독화 생 박테리아를 약학적 허용성 담체와 혼합하므로써 얻을 수 있다. 이 백신은 본 발명에 개시된 면역원적 유효량 이상의 약독화 생 박테리아를 함유한다. 면역원적 유효량이란 백신접종 순간에 투여된 약독화 생 박테리아의 양이 RTX-독소 생산 박테리아의 독성 형태에 대하여 효과적인 면역 응답을 숙주내에서 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 투여되기에 유용한 투여량은 백신접종되는 동물의 연령, 체중, 투여방식 및 백신접종으로 보조하고자 하는 병원균의 종류에 따라 달라질 것이다. 백신은 면역 응답반응을 자극하기에 충분한 임의 투여량의 박테리아를 함유할 수 있다. 예컨대 103 내지 1010 박테리아 범위의 투여량이 매우 적합한 투여량이다.
약학적 허용성 담체는 물과 같은 단순한 물질일 수 있으나, 또한 예컨대 박테리아를 증식시켰던 배양액을 포함할 수도 있다. 또다른 적합한 담체는 예컨대 생리학적 염 농도의 용액이다. 본 발명에 유용한 약학적 허용성 담체 또는 희석제의 예로는 SPGA, 탄수화물(예컨대, 소르비톨, 만니톨, 전분, 슈크로스, 글루코스, 덱스트란), 알부민이나 카제인과 같은 단백질, 소 혈청이나 탈지분유와 같은 단백질 함유 제제 및 완충액(예, 인산염 완충액)과 같은 안정화제를 포함한다.
선택적으로, 백신에는 보조 활성을 갖는 1종 이상의 화합물을 첨가할 수 있다, 면역보강제는 면역계의 비특이적인 자극물질이다. 면역보강제는 침입 병원균에 대한 숙주의 면역 응답 반응을 증강시킨다. 당해 기술분야에 공지된 면역보강제의 예로는 프로인트 완전 및 불완전 보조제, 비타민 E, 비이온성 블록 중합체, 뮤라밀 디펩티드, ISCOM(면역 자극 복합체, 예컨대 유럽 특허 EP109942호 참조), 사포닌, 광유, 식물유 및 Carbopol(단독중합체)을 포함한다. 특히 점액 투여용으로서 적합한 면역보강제는 예컨대 이.콜리 열불안정성 독소(LT) 또는 콜레라 독소(CT)가 있다.
다른 적합한 보조제는 예컨대 수산화 알루미늄, 인산염 또는 산화물, 오일 유탁액[예, Bayol F(등록상표명), Marcol 52(등록상표명)], 사포닌 또는 비타민-E 가용화물이 있다.
따라서, 본 발명의 백신은 바람직한 형태로서 보조제를 포함하는 것이다.
동물에 투여하기 위한 본원에 기술된 바에 따른 백신은 특히 비강내, 피내, 경피적, 연무질 또는 근육내로 투여할 수 있다.
서브유니트와 생물체를 저장하는 방법에는 여러 가지 방법이 있다. 예컨대, 가장 잘 알려진 방법은 냉장고중에서 저장하는 방법이다. 또한, 글리세롤을 함유하는 완충액중에서 -70℃하에 저장하는 방법이 종종 사용된다. 또한, 박테리아는 액체 질소중에서 저장할 수 있다. 또다른 보존 방법으로 동결 건조가 있다. 동결 건조된 박테리아는 수년동안 저장하여 생육상태로 유지할 수 있다. 동결 건조된 박테리아의 저장 온도는 생육성에 역영향을 미치지 않는 한 0℃ 이상인 것이 적합하다. 동결 건조는 서브유니트 저장시에도 똑같이 사용할 수 있다.
동결 건조는 공지된 모든 표준 동결 건조 절차에 따라 실시할 수 있다. 선택적인 바람직한 첨가제로서, 예컨대 탈지 분유, 트레할로즈, 젤라틴 또는 소 혈청 알부민 등을 동결 건조 과정에 첨가할 수 있다. 따라서, 보다 바람직한 양태로서, 본 발명의 백신은 동결건조된 형태이다.
이러한 양태의 보다 더 바람직한 형태에 있어서, 백신은 다른 병원성 미생물 또는 비루스중에서 선택된 1종 이상의 항원을 더 포함한다. 이러한 백신은 본 발명에 개시된 약독화 생 박테리아와 전술한 바와 같은 약학적 허용성 담체에 다른 병원성 박테리아 또는 비루스 중에서 선택된 1종 이상의 항원을 첨가하여 얻을 수 있다. 물론, 1종 이상의 항원 뿐만 아니라 1종 이상의 전체 병원균 자체를 불활성 형태 또는 생체 형태로 첨가할 수도 있다. 또는, 전술한 바와 같은 공지의 재조합 DNA 기법을 사용하여 약독화 생 박테리아에 다른 병원성 미생물 또는 비루스 중에서 선택된 1종 이상의 항원을 암호하는 유전자 정보를 클로닝하여 얻을 수 있다. 이러한 백신은 물론 의학적 및 신체적 견지에서 볼때 각 병원균으로 여러 차례 백신접종하는 것보다 백신접종되는 동물에 스트레스를 덜 준다.
보다 바람직한 형태로서, 이러한 항원들은 돼지 번식 호흡증(PRRS) 비루스, 가성광견병 비루스, 돼지 인플루엔자 비루스, 돼지 가성광견병, 전파성 위장염 비루스, 로타비루스, 에스케리치아 콜리, 에리시펠로트릭스 류시오파티에, 파스퇴렐라 뮬토시다, 보르데텔라 브로치셉티카, 헤모필러스 파라수스 및 스트렙토코커스 수스로 구성된 군중에서 선택한다.
또한, 본 발명은 기능성 ApxIV 독소를 생산할 수 없는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 약독화 생 박테리아를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 apxIV 단백질을 암호하는 유전자에 돌연변이를 도입하는 방법을 포함한다. 이 방법에는 돌연변이제를 사용하는 고전적 돌연변이 기법과 apxIV 유전자 유래의 유전자 정보의 삽입, 치환 또는 결실에 대한 당해 기술분야에 공지된 재조합 DNA 기법을 사용할 수 있다.
바람직한 형태로서, 결실을 만들기 위하여 전술한 방법을 사용한다.
또한, 본 발명에 개시된 박테리아와 약학적 허용성 담체를 혼합하는 것을 포함하여 본 발명에 기재된 약독화된 생 백신을 제조하는 방법도 본 발명의 일부분이다.
또한, 서브유니트 백신의 제조방법도 본 발명의 영역에 속한다. 이 방법은 약학적 허용성 담체와 정제된 ApxIV 독소를 혼합하는 단계를 포함한다.
생 백신을 백신접종하는 분야에 일반적으로 알려진 또다른 문제점은 다음과 같다. 즉, 숙주 동물의 혈청에 특정 병원균에 대한 항체가 존재한다는 것은 숙주가 독성이나 약독화 형태의 병원균으로 감염되어 있다는 것을 나타낸다. 하지만, 생 백신 균주로 백신접종된 동물과 야생 감염된 동물을 구별하는 것은 불가능하다. 본 발명에 개시된 약독화된 생 악티노바실러스 플루로뉴모니아는 이러한 문제점에 대한 해결책을 다음과 같이 제공한다:
실시예 3에 기술된 바와 같이, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형 1의 apxIV 유전자를 분리하였고 이종 숙주 세포중에서 발현시켰다. 이 발현 생성물을 PAGE-겔 전기영동으로 처리한 다음 웨스턴 블로팅하였다. 이 블롯을 악티노바실러스 플루로뉴모니아로 의도적으로 감염시킨 돼지에서 얻은 회복기의 혈청 및 야생 균주의 혈청과 항온처리하였다. 그 결과, apxIV 유전자가 시험된 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 야생 균주중에서 생체내적으로 발현된다는 것을 발견하였다. 이것은 악티노바실러스 플루로뉴모니아로 감염시킨 돼지는 감염 균주의 혈청형과는 관계없이 항상 감염 균주에 대한 항체를 가지고 있을 것이라는 것을 암시한다.
본 발명에 개시된 약독화 생 박테리아는 apxIV 유전자 결실로 인하여 더 이상 ApxIV 독소를 만들 수 없다. 따라서, 본 발명에 개시된 약독화된 악티노바실러스 플루로뉴모니아 생균주로 백신접종된 동물은 그 혈청내에 ApxIV 독소에 대한 항체를 갖고 있지 않을 것이다.
따라서, 비교 테스트로서, 예컨대 ELISA 테스트에서 상기 혈청은 예컨대 ApxI, ApxII 및/또는 ApxIII과 같은 모든 면역원성 악티노바실러스 플루로뉴모니아 단백질과는 반응하지만, ApxIV와는 반응하지 않을 것이다. 하지만, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 야생 균주로 감염된 돼지에서 얻은 혈청은 ApxIV를 비롯한 모든 면역원성 악티노바실러스 플루로뉴모니아 단백질과 반응할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 약독화된 생 악티노바실러스 플루로뉴모니아는 매우 적합한 마커 백신, 즉 야생 균주와 구별될 수 있는 백신 균주인 것으로 판명되었다.
백신 균주와 야생 균주를 구별하기 위한 확인 시험은 정제 ApxIV 독소를 ELISA 평판의 웰 벽에 피복시킨 단순한 ELISA 시험일 수 있다. 시험 돼지에서 얻은 혈청과 항온처리한 다음, 예컨대 표지된 항-돼지 항체와 항온처리하면 ApxIV 독소에 대한 항체의 존재 유무를 확인할 수 있다.
또다른 진단 시험계의 예는 예컨대 시험 돼지의 혈청과 정제 ApxIV 독소를 포함하는 웨스턴 블롯을 항온처리한 다음 특정 항-ApxIV 항체를 검출하는 것이다. 따라서, 정제 ApxIV 독소를 함유하는 본 발명에 개시된 약독화 생 백신 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주를 포함하는 백신으로 백신접종된 돼지에서 얻은 혈청과 악티노바실러스 플루로뉴모니아 야생 균주로 감염된 돼지에서 얻은 혈청을 구별하기 위한 확인 시험 또한 본 발명에 영역에 포함된다.
돼지 건강 보호 협회에서 밝힌 또다른 문제점은 다음과 같다. 즉 돼지가 악티노바실러스 플루로뉴모니아 또는 악티노바실러스 수스로 감염되었는지, 또는 이 둘의 박테리아로 모두 감염되었는지를 신속하고 명확한 방법으로 확인하기가 어렵다는 것이다. 현재 악티노바실러스 수스를 특이적으로 검출하는 진단 시험은 유용한 것이 없다. 이 사실은 주로 악티노바실러스 플루로뉴모니아와 악티노바실러스 수스가 너무 많은 항원을 공유하기 때문이다. 일 예로서, 2종의 항원성이 큰 Apx-독소, 즉 ApxI 및 ApxII는 예컨대 악티노바실러스 수스내에서 보종성이 큰 동족체를 가지고 있다(Van Ostaayen et al., 공개 제출됨).
ApxI, ApxII 및 ApxIII 독소 또는 동족체를 암호하는 공지의 RTX-유전자는 악티노바실러스 플루로뉴모니아. 악티노바실러스 수스, 악티노바실러스 로시 및 악티노바실러스 에큘리와 같은 악티노바실러스 속에 속하는 거의 모든 구성원들에서 발견된다. 따라서, 본 발명자들은 처음에는 신규 RTX-독소 ApxIV도 악티노바실러스 속의 모든 구성원들에서 공통적인 것이라고 추정하였다. 하지만, 다시 한번 놀랍게도 공지의 3종의 RTX-유전자와는 대조적으로 돼지-병원성 악티노바실러스를 테스트한 후 상기 신규 RTX-유전자 apxIV가 돼지 병원균 악티노바실러스 플루로뉴모니아에만 존재한다는 것을 발견하였다. 이 유전자는 다른 모든 일반적인 돼지 병원균 악티노바실러스 종에는 존재하지 않았고, 또한 악티노바실러스 수스에도 존재하지 않았다. 실시예 6과 실시예 7을 참조하라.
따라서, 놀랍게도 돼지의 혈청에 ApxIV에 대한 항체가 존재한다는 것은 돼지가 악티노바실러스 수스나 임의의 다른 돼지-병원균 악티노바실러스 종으로 감염된 것이 아니라 악티노바실러스 플루로뉴모니아로 감염되었다는 신속하고 분명한 증거라는 것을 알게 되었다.
또한, 본 발명은 ApxIV 에 대한 항체의 존재 유무를 기초로 한 확인 시험을 제공하며, 이에 따라서 악티노바실러스 수스에 의한 감염과 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 의한 감염을 특이적으로 구별할 수 있는 판별 시험을 제공한다. 이 시험은, 예컨대 악티노바실러스 플루로뉴모니아와 악티노바실러스 수스내에 모두 존재하는 ApxI 및 ApxII 독소와 정제 ApxIV 독소를 별도의 웰에 포함하는 ELISA 시험일 수 있다. 악티노바실러스 수스 감염 동물에서 얻은 혈청은 ApxI 및 ApxII를 포함하는 웰과만 반응하는 반면, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염 동물은 또한 정제 ApxIV 독소를 포함하는 웰과도 반응할 것이다.
실시예 1
악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형 1의 apxIV 유전자의 클로닝 및 분석
표준 분자 생물학적 절차(플라스미드 DNA 분리, 제한효소 분해, 아가로스 겔 전기영동, 서던 블롯팅, 결찰, 형질전환, 전기침투)는 다른 표시가 없는 한 실질적으로 샘브룩 등(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 또는 아우수벨 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1987)에 기술된 바와 같이 실시하였다. PCR은 실질적으로 인니스 등(PCR protocols, A guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego, 1990)에 기술된 바와 같이 실시하였다. 염색체 DNA 분리는 피쳐 등(Lett.Appl.Microbiol., 8:151-156, 1989)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 대조 균주(혈청형 1, 균주 4074; 혈청형 2, 균주 S1536; 혈청형 3, S1421; 혈청형 4, M62; 혈청형 5a, K17; 혈청형 5b, L20; 혈청형 6, femφ; 혈청형 7, WF83; 혈청형 8, 405; 혈청형 9, CVI13261; 혈청형 10, 13039, 혈청형 11, 56153 및 혈청형 12, 8329)의 기원은 프레이와 니콜렛(J.Clin.Microbiol., 28;232-236, 1990)에 기술되어 있다. 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형 3 균주 HV114는 야생 분리물[즉, 문헌(Beck et al., J.Clin.Micrbiol., 32;2749-2754, 1994)에서 시험된 혈청형 3 균주들중의 하나]이다. 사용된 다른 악티노바실러스 균주는 악티노바실러스 로시, ATCC 27072; 악티노바실러스 에큘리, ATCC 19392; 악티노바실러스 수스, ATCC 15558이다. 또한, 파스퇴렐라 헤모리티카 타입 1 균주 ATCC 14003도 사용하였다.
사용된 이.콜리 숙주 균주는 다음과 같다: XL1-블루(Stratagene, La Yolla, Ca; 유전자형: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac[F'proAB lacIqZDM15 Tn10(Tetr)]) 및 HMS174(DE3)(AMS Biotechnology Ltd, Switzerland; 유전자형: F- recA(rK12-mK12+)rifr IDE3).
티.제이.앤더슨(University of Guelph, 1995)의 이론으로부터 얻은 예비 서열 데이터를 기초로 하여, APXIVA-1L(5'-TGGCACTGACGGTGATGA-3') 및 APXIVA-1R(5'-GGCCATCGACTCAACCAT-3')로 표시한 2개의 프라이머를 합성하였다. 이 프라이머들은 주형으로서 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형 3 균주 HV114 및 혈청형 1 대조 균주 4074 유래의 염색체 DNA와 함께 PCR 증폭에 사용하였다. 이 2가지 균주를 사용하여 442 bp의 단편을 증폭시켰다. 혈청형 3 염색체 DNA 에서 유래된 단편은 디곡시제닌-11-dUTP(뵈링거 맨하임)로 제조자의 프로토콜에 따라 표지화시켰다(이 단편은 프로브 APXIVA로 표시하였다, 도 4 참조). 이와 같이 표지된 프로브를 사용하여 균주 4074에서 얻은 ClaI 분해된 염색체 DNA를 함유하는 서던 블롯과 하이브리드하였다. 이 프로브는 약 8.0kb의 단편과 하이브리드하였다. 혈청형 1 균주 4074에서 얻은 apxIV 유전자는 ClaI 분해된 염색체 DNA를 ClaI 분해된 pBluescript II SK-(Stratagene USA)에 결찰시켜 분리하였다. 이.콜리 균주 XL1-블루는 결찰 DNA로 형질전환시켰고, 이어서 암피실린 100㎎/㎖을 함유하는 LB 평판상에서 형질전환체를 선별하였다. 이 평판의 니트로셀룰로스 레플리카를 APXIVA 프로브와 콜로니 하이브리드하여 apxIV 를 갖고 있는 클론을 선별하였다. 따라서, pROK7로 표시한 플라스미드를 분리하였는데, 이는 약 8kb의 ClaI 삽입체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. ClaI 삽입체의 처음 6736 bp를 서열분석하였고(서열 1), 4971 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임이 예상된 크기인 약 186kD의 1657 아미노산 잔기(서열 2)의 단백질을 암호하는 것으로 확인되었다. 이 유전자를 apxIV_var1로 표시하였다(도 3 참조).
실시예 2
악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형 3의 apxIV 유전자의 클로닝 및 분석
표지된 프로브 APXIVA(실시예 1에 기술)를 사용하여 균주 HV114에서 얻은 ClaI 분해된 염색체 DNA 함유 서던 블롯과 하이브리드하였다. 이 프로브는 약 7.0kb 단편과 하이브리드하였다. 이와 같이 분리된 HV114 유래의 염색체 DNA는 ClaI으로 분해하고, ClaI 분해된 pBluescript II SK-(Stratagene USA)와 결찰시켰다. 이와 같이 결찰된 DNA를 사용하여 이.콜리 균주 XL-1블루를 형질전환시키고, 암피실린 100 ㎎/㎖을 첨가한 LB 평판상에서 형질전환체를 선별하였다. 이 평판의 니트로셀룰로스 레플리카를 APXIVA 프로브와 콜로니 하이브리드하여 apxIV를 함유하는 클론을 선별하였다. 따라서, pROK5로 표시한 플라스미드를 분리하였고, 이것은 약 7kb의 ClaI 삽입체를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이 삽입체를 서열 분석하였다(서열 3). 예상된 크기인 약 154 kD을 갖는 1382 아미노산 잔기의 단백질(서열 4)을 암호하는 4146 bp의 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. 이 유전자는 apxIV_var3으로 표시하였다(도 3 참조).
실시예 3
이.콜리내에서 ApxIV_var3-폴리히스티딘 융합 단백질의 발현
플라스미드 pROK5로부터, BamHI 부위(서열 3의 뉴클레오티드 2747번)에서 개시하여 apxIV 유전자의 다운스트림에 있는 삽입체의 말단의 ClaI 부위까지의 apxIV 유전자의 3' 말단을 포함하는 결실 클론을 제조하였다. 이 플라스미드를 pROK1로 표시하였다. 올리고뉴클레오티드 APXIVAHIS1-L(5'-AGCCATATGGGCGATTTAAATTTCAG-3') 및 APXIVAHIS1-R(5'-TATGGATCCTCCGTGCTTCTGAGC-3') 및 주형으로서 플라스미드 pROK1 유래의 DNA를 사용하여, 각각 5' 및 3' 말단에 NdeI 및 BamHI 제한 부위가 인접해 있는 apxIV_var3(서열 3)의 bp 3520 내지 5643의 영역을 함유하는 2.1kb의 DNA 단편을 증폭시켰다(도 4 참조). NdeI/BamHI 분해된 PCR 단편을 이와 동일한 효소로 절단한 발현 벡터 pETHIS-1에 클로닝한 후, pJFFapxIV6/10his-1이라 표시한 플라스미드를 얻었다. 플라스미드 pETHIS-1은 다중 클로닝 부위가 전개되어 있고 히스티딘 10량체를 암호하는 영역이 삽입되어 있는 pET14b(Novagen Inc., 미국 위스콘신 매디신에 소재)의 유도체이다. 결과적으로, pJFFapxIV6/10his-1 플라스미드는 히스티딘 6량체, 이어서 서열 4의 아미노산 잔기 653 내지 1360, 그 다음 히스티딘 10량체를 암호하는 해독 융합체를 T7 프로머터의 조절하에 포함한다. 이 플라스미드를 pLysS를 가진 이.콜리 균주 HMS 174(DE3)로 전이시켰는데, 이것은 IPTG 유도성 T7 RNA 폴리머라제 유전자 및 안정성 증가를 위한 T7 리소자임 유전자를 포함한다. 이 균주를 클로람페니콜 25 ㎎/㎖ 및 암피실린 100 ㎎/㎖을 첨가한 LB 배지에서 OD650이 0.5까지 되도록 증식시키고 10 mM 농도의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드로 유도하였다. IPTG를 첨가한 후, 세포를 37℃에서 2.5 시간동안 항온배양하고, 이 세포를 원심분리하여 수거한 다음, 80kD의 예상 크기를 갖는 융합 단백질을 봉입체 형태로 분리하였다. 이 봉입체를 6M 구아니딘 염산염, 300 mM NaCl 및 50 mM NaH2PO4(pH 8.0)의 용액중에 용해시키고 80kD 융합 단백질을 Ni2+ 킬레이트화된 컬럼(Qiagen AG, Basel)을 사용하여 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)(Schmitt et al., Molecular Biology Reports 18; 223-230, 1993)로 더 정제하였다. 컬럼으로부터 pH 5.0에서 정제 단백질이 용출되었다. 분획을 모아서 300 mM NaCl 및 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 용액에 대하여 투석하였다. 1 부피의 완전 프로인트 보조제(Difoc Labs, 미국 마이애미 디트로이트 소재)와 혼합한 폴리히스티딘 융합 생성물 500㎎으로 토끼를 면역시켰다. 동일량의 추가 항원자극 투여량을 불완전 프로인트 보조제와 혼합하여 3주 후에 투여하였다. 추가 항원자극 4주후에, 토끼로부터 채혈하여 혈청 522-409라고 표시한 항-ApXIV 독소 항체를 함유하는 고도면역 혈청을 얻었다.
실시예 4
시험관내에서 증식시킨 악티노바실러스 플루로뉴모니아에서의 apxIV 유전자 발현
혈청형 1에 속하는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 대조 균주를 b-NAD 10 ㎎/㎖이 보강된 콜럼비아 브로쓰에서 증식시켜 전술한 바와 같이 수거하였다(Beck et al., J.Clin.Microbiol., 32:2749-2754, 1994). 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Laemmli, Nature 227:680-685, 1970)으로 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIVA-폴리히스티딘 융합 단백질을 함유하는 레인에 인접한 부위에서 농축 배양 상청액을 분리하고 웨스턴 블롯팅 절차(Towbin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354, 1979)로 처리하였다. 이 웨스턴 블롯을 Beck 등(J.Clin.Microbiol., 32:2749-2754, 1994)에 의해 기술된 바와 같이 항-ApxIA 및 항-ApxIIA 모노클노널 항체 및 항-ApxIV 혈청 522-409(실시예 3 참조)와 반응시켰다. 혈청형 1의 분리된 RTX 독소 분획은 분명하게 ApxIA 및 ApxIIA를 함유하고 있었다. ApxIVA의 존재는 확인할 수 없었다(도 5 참조).
실시예 5
감염동안 생체내에서의 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 apxIV 유전자 발현
80 kD 폴리히스티딘-ApxIV_var3 융합 단백질(실시예 3 참조)을 함유하는 폴리아크릴아미드 겔을 니트로셀룰로스 막으로 전이시켰다. 이 막을 스트립으로 나누어 혈청형 1에 대한 회복기의 야생 혈청(100배 희석물)이나, 또는 혈청형 1 대조균주(Frey and Nicolet, Vet.Microbiol., 28; 61-73, 1991)로 실험적으로 감염시킨 돼지 혈청과 반응시켰다. 반응을 가시화하기 위하여 토끼 IgG에 대한 알칼리성 포스파타제-표지된 접합체(Kirkegaard Perry Inc., Gaithersburg, Md.) 및 NBT(4-니트로블루테트라졸륨 클로라이드)와 BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-포스페이트)발색제를 사용하였다(도 6 참조). 혈청형 1 야생 혈청 뿐만 아니라 실험적으로 감염시킨 돼지 유래의 혈청은 80 kD 폴리히스티딘-ApxIV_var3 단백질과 반응하였다. 이것은 사실상 ApxIV 단백질이 발현되며, 항원성이고, 돼지의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염동안 항-ApxIV 독소 항체를 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 6
서던 블롯에 의한 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형내의 apxIV 유전자의 존재 및 비-플루로뉴모니아 악티노바실러스 균주내의 apxIV 유전자의 부재
여러종의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형과 관련 박테리아중의 apxIV 유전자의 존재를 연구하기 위하여, 3종의 프로브를 만들었다(도 4 참조). 프로브 APXIVA는 실시예 1에 기술하였다. 프로브 APXIVA2는 BamHI 및 NruI 부위 사이에 2015 bp DNA 단편을 함유하고 있다. 758 bp의 프로브 APPIVA1은 올리고 APPIV1-L(5'-GGGACAGTGGCTCAATTAAG-3') 및 APPIV1-R(5'-AGCTGTAAACTCCACCAACG-3')을 사용하여 PCR 증폭으로 만들었다. 모든 프로브는 디곡시제닌-11-dUTP(뵈링거 맨하임)으로 제조자의 프로토콜에 따라 표지하고, 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 대조 균주와 HV114 야생 균주, 악티노바실러스 수스(ATCC 15558), 악티노바실러스 로시(ATCC 27072) 및 악티노바실러스 에큘리(ATCC 19392)의 ClaI 분해된 염색체 DNA를 함유하는 서던 블롯과 하이브리드하였다. 3종의 프로브는 모두 유사하게 반응하였다(APXIVA2 프로브에 의한 결과에 대해서는 도 7을 참조). 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주들은 반응하는 반면, 악티노바실러스 수스, 악티노바실러스 에큘리 및 악티노바실러스 로시 균주와는 하이브리드화가 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 7
PCR 증폭에 의한 악티노바실러스 플루로뉴모니아 및 관련 균주중의 apxIV 유전자의 존재
여러종의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형, 기타 다른 악티노바실러스 종 및 피.헤모리티카 유래의 염색체 DNA 50 ng을 주형으로서 사용하고, 프라이머 APXIVA-1L(5'-TGGCACTGACGGTGATGA-3') 및 APXIVA-1R(5'-GGCCATCGACTCAACCAT-3')를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 그 생성물을 아가로스 겔로 분석한 후, 442 bp의 예상 크기를 가진 생성물을 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 샘플에서 관찰하였으나, 다른 악티노바실러스 종에서는 전혀 관찰하지 못했다(도 8). 이것은 실시예 6의 결과 이외에도 PCR을 사용하여 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 다른 악티노바실러스 종을 구별할수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8
ApxIV-var1 폴리히스티딘 융합 단백질의 과잉발현
주형으로서 플라스미드 pROK-7(실시예 1 참조)을 사용하고 PCR 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 APX4/II5-L(5'-CGCCATATGACAAAATTAACTATGCAAG) 및 APX4II6-R(5'-CGCGAATTCAGCGACACAAGAGATAT)을 사용하여 PCR 단편을 증폭시켰다. 이 단편의 충분량을 제한 효소 NdeI 및 EcoRI 으로 분해시키고, 발현 벡터 pETHIS-1에 클로닝한 다음, 실시예 3에서 전술한 바와 같은 동일 효소로 분해하였다. 이에 따라 생성된 플라스미드 pJFFApxIVA1Hisl로부터, 실시예 3에 기재한 바와 같이 이.콜리중에서 1841 아미노산 잔기를 가진 206 kD 폴리히스티딘 융합 단백질(PAGE에서 측정한 MW)을 과잉발현시켰다. 이 단백질은 서열 5에 기재된 바와 같이 핵산 1132에서부터 6546까지의 암호 영역에서 암호되었다. 이 단백질의 아미노산 서열은 서열 6에 나타내었다. 이 생성물은 웨스턴 블롯에서 특이적 항-ApxIV 혈청 522-409(실시예 3에 기술된 바와 같은 항혈청)와 반응하는 것으로 나타났다.
실시예 9
APP 항원 투여에 대한 ApxIV 백신접종에 의한 마우스 보조
혈청형 1 대조 균주 4074 게놈 물질에서 2가지 모두 유래되는 실시예 8에 기재한 206 kD 폴리히스티딘-ApxIV 융합 단백질과 이에 비교되는 108 kD 폴리히스티딘-ApxIA 융합 단백질을 실시예 3에 기술된 바와 같이 과잉발현시켰다. 유도된 이.콜리 세포의 세포 펠릿은 PBS 완충액(완충액 6㎖중에 세포 펠릿 1g)에 재현탁시키고 얼음상에서 45초동안 2회 초음파처리하여 세포를 분해시켰다. 22,000 x g로 20분동안 4℃하에 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 얻어지는 펠릿은 3M 우레아(pH 6.3) 용액으로 세척하였다. 이것을 22,000 x g로 20분동안 원심분리하여 우레아를 제거하고, 얻어진 펠릿을 6M 구아니디늄 HCl(pH 8.0)에 용해시켰다. PAGE 겔에 의한 농도측정후 특정 단백질 함량으로 단백질 샘플을 표준화하였다. 샘플을 PBS로 희석하고 오일 보조제와 배합하였다.
15 마리의 마우스로 이루어진 3군에 대하여 각각 ApxIV 항원(36.3㎍), ApxIV 항원(36.3㎍) 또는 보조제 단독물을 복강내 항원주입하여 면역화시켰다. 이 때, 백신은 0.4㎖ 부피로 투여하였다. 1차 백신 접종한 후 24일째, 각 마우스 군을 7 마리와 8마리의 마우스로 구성된 2군으로 나누어 상기 항원량의 1/2을 추가 항원주입하였다. 추가 항원주입으로서, 7마리 마우스 군에 대해서는 0.2 ㎖ 부피의 항원을 복강내 주사하였고, 8마리 마우스 군에 대해서는 각각 뒷다리에 0.1㎖의 항원을 근육내로 백신접종하였다. 추가 항원 주입 후 13일째, 마우스에 전염성이 강한 혈청형 1 균주 1.5 ×108 cfu를 복강내 항원투여하였다.
실시예 10
ApxIV의 기공 형성능
ApxIV를 발현하는 새로 유도된 이.콜리 세포를 문헌(Maier et al., Infect.Immun., 64;4415-4423(1996)]에 기술된 바와 같이 인조 지질 이중층중의 포어형성 시험용 단백질원으로서 사용하였다. 흑색 지질 이중층 실험에 사용된 방법은 종래 개시된 바 있다[Benz et al.; Biochem.Biophys.Acta 511:305-319(1978)]. 막은 n-데칸에 용해시킨 1% 아소렉틴 용액(미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마 제품인 대두 렉틴 타입 IV-S)으로부터 제조하였다. 이 막을 따라 10배 염구배를 형성[Benz et al.; Biochem.Biophys.Acta 551:238-247(1979)]시킨 지 5내지 10분 후, 카이들레이 610C 전위계를 사용하여 영점 전류 막 전위를 측정하였다. ApxIV의 존재는 0.5% 콜레스테롤의 존재하에 기공을 고빈도로 형성시켰고, 평균 단일 통로 콘덕턴스(G)는 4 nS였다. 이 결과는 ApxIV가 인조 이중층에 포어를 유도하고, 이에 따라 진핵 세포에 대해 독성을 나타내며, 따라서 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 독성 인자라는 것을 나타낸다.
도면 설명
도 1은 ApxIVAvar1과 ApxIVAvar3(var는 혈청형을 나타냄)을 비교한 것으로, C-말단 끝에서 관찰되는 여러 특징들을 그래픽으로 도시한 것이다. 빗금친 박스는 ApxIVA의 직접적인 반복 영역을 나타낸 것이다. 굵은 수직 막대는 글리신이 풍부한 노나펩티드의 위치를 나타내고, DNA 폴리머라제 B 군 표시는 흑색 삼각형으로 나타내었다. 아미노산 서열 YSDSANSKK는 ApxIVAvar3 유전자내에 존재하는 스페이서 서열을 나타낸다. 또한 이 도면에는 ApxIVAvar3에는 결실되어 있는 ApxIVAvar1의 서열 분절도 나타내었다.
도 2는 ApxIVAvar1 및 ApxIVAvar3의 직접 반복 1(A), 직접 반복 2(B) 및 직접 반복 3(C)의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 직접 반복 서열 1, 2 및 3의 각각의 복사체는 문자로 표지하여 서열 비교를 위하여 구별하였다. 변이 잔기들은 굵은 문자로 나타내었다.
도 3은 pBLac7(Thesis of T.J.Anderson University of Guelph, 1995), pROK7 및 pROK5의 부분 제한 지도. 여러 오픈 리딩 프레임(ORF)을 화살표로 표시하였다. pROK7에 표시된 lacZ의 중절된 화살표는 이 유전자중 서열분석된 부분적인 서열을 나타낸 것이다. 잠재성 rho-독립적 전사 종지인자도 표시하였다(W). 잠재성 전사 개시 부위는 삼각형으로 표시하였다. 제한 부위 : A = Asp700; B = BamHI; C = ClaI; E = EcoRV; Ec = EcoRI; H = HindIII; N = NruI; Nd = NdeI; Nh = NheI; P = PstI; S = SpeI; Sm = SmaI.
도 4는 apxIVAvar3 유전자 지도상의 여러 올리고뉴클레오티드와 프로브의 위치를 도시한 것이다.
도 5는 시험관내 배양된 혈청형 1 대조 균주 4074에서의 ApxIV 발현을 도시한 것이다. 패널 A는 항-ApxIA 모노클로널 항체와 반응시킨 것이고, 패널 B는 항-ApxIIA 모노클로널 항체와, 패널 C는 항-ApxIVA 혈청 522-409와 반응시킨 것이다. 레인 1은 ApxIA-폴리히스티딘 융합 단백질을 포함하고, 레인 2는 ApxIIA-폴리히스티딘 융합 단백질을, 레인 3은 균주 4074 농축된 배양 상청액을, 레인 4는 ApxIVA 폴리히스티딘 융합 단백질을 포함한다.
도 6은 혈청형 1의 대조 균주로 실험실적으로 감염시킨 돼지 유래의 혈청(레인 1) 또는 혈청형 1 야생 균주로 감염된 돼지 유래의 혈청(레인 2 내지 4)과 80 kD 폴리히스티딘-ApxIV 융합 단백질의 반응성을 나타내는 면역블롯 결과이다. 양성(+) 대조군으로서, 혈청 522-409를 사용하였고, 음성 대조군(-)으로서 ApxI 및 ApxII에 대한 폴리클로널 토끼 혈청(Frey et al., Infect. Immun., 57; 2050-2056, 1989)을 1000배 희석물로 사용하였다.
도 7은 프로브 APXIVA2와 하이브리드시킨 ClaI 분해된 게놈 DNA의 서던 블롯이다. 레인 1 내지 13: 악티노바실러스 플루로뉴모니아 대조 균주; 1: 혈청형 1; 2: 혈청형 2; 3: 혈청형 3; 4: 혈청형 4; 5: 혈청형 5a; 6: 혈청형 5b; 7: 혈청형 6; 8: 혈청형 7; 9: 혈청형 8; 10: 혈청형 9; 11: 혈청형 10; 12: 혈청형 11; 13: 혈청형 12; 14: HV114 야생 균주; 15: 악티노바실러스 수스(ATCC 15558); 16: 악티노바실러스 로시(ATCC 27072); 17: 악티노바실러스 에큘리(ATCC 19392). 왼쪽에 분자량 크기 마커를 나타내었다(kb).
도 8은 프라이머 APXIVA-1L 및 APXIVA-1R을 사용한 apxIV의 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다. 레인 표시: 레인 1 내지 13은 혈청형 1,2,3,4,5a,5b,6,7,8,9,10,11 및 12 각각의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 대조 균주를 함유한다; 레인 14: 균주 HV114; 레인 15: 악티노바실러스 수스 ATCC 15558; 레인 16: 악티노바실러스 로시 ATCC 27072; 레인 17: 악티노바실러스 에큘리 ATCC 49392; 레인 18: 악티노바실러스 리그니에레시 ATCC 49236; 레인 19: 피.헤모리티카 타입 1 ATCC 14003. 왼쪽에 분자량 크기 마커(kb)를 표시하였다.
본 발명의 이점중 하나는
1. apxIV 유전자가 혈청형에 관계없이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 존재하고,
2. apxIV 유전자 생성물이 모든 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형중에서 독성 인자이며,
3. apxIV 유전자에 결실이 있는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주는 생육성을 유지 하지만 이 균주의 면역원성에는 큰 손실을 주지 않고 감소된 독성을 나타낸다는 것이다.
서열목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인
(A) 성명 : 악조 노벨 엔.브이.
(B) 스트리드 : 벨페르베그 76
(C) 도시 : 아르넴
(E) 국가 : 네덜란드
(F) 우편번호(ZIP) : 6824 비엠
(ii) 발명의 명칭 : 약독화 생 악티노바실러스 플루로뉴모니아
(iii) 서열의 수 : 4
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6736 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA(게놈)
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 악티노바실러스 플루로뉴모니아
(B) 주명 : 4074(혈청형 1 대조 균주)
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 :pROK7
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 :1576..6549
(D) 기타 정보 : 코돈_개시 = 1576
/기능 = "RTX 독소"
/생성물 = "ApxIV_var1"
/유전자 = "apxIV_var1"
/수 = 1
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1a]
[서열 1b]
[서열 1c]
[서열 1d]
[서열 1e]
[서열 1f]
[서열 1g]
[서열 1h]
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1658 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 2 :
[서열 2a]
[서열 2b]
[서열 2c]
[서열 2d]
[서열 2e]
[서열 2f]
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 7004 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA(게놈)
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 악티노바실러스 플루로뉴모니아
(B) 주명 : HV114(혈청형 3 야생 균주)
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 : pROK5
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 1566..5714
(D) 기타 정보 : /코돈_개시 = 1566
/기능 = "RTX 독소"
/생성물 = "ApxIV_var3"
/유전자 = "apxIV_var3"
/수 = 1
(xi) 서열 번호 3:
[서열 3a]
[서열 3b]
[서열 3c]
[서열 3d]
[서열 3e]
[서열 3f]
[서열 3g]
[서열 3h]
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1383 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 4:
[서열 4a]
[서열 4b]
[서열 4c]
[서열 4d]
[서열 4e]
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
추정 서열 : 아니오
(A) 길이 : 6736 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : DNA(게놈)
(iii) iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 악티노바실러스 플루로뉴모니아
(B) 주명 : 4074(혈청형 1 대조 균주)
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 : pROK7
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 1132..6549
(C) 동정 방법 : 실험적
(D0 기타 정보 : /코돈_개시= 1132
/기능 = "RTX 독소"
/생성물 = "ApxIV"
/증명 = 실험적
/유전자 = "ApxIV_v1"
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 639..1178
(D) 기타 정보 : /코돈_개시 = 639
/기능 = "불명"
/생성물 = "ORF1"
/유전자 = "orf1"
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 1..453
(D) 기타 정보 : /부분
/생성물 = "Met-G"
/유전자 = "mrp"
/표준_명 = "mrp"
/라벨 = mrp
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : -10_시그널
(B) 존재위치 : 617..623
(D) 기타 정보 : /표준_명 = "-10"
/라벨 = -10_s
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : -35_시그널
(B) 존재위치 : 594..599
(D) 기타 정보 : /표준_명 = "-35_s"
/라벨 = -35_s
(ix) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : 프로모터
(B) 존재위치 : 454..1131
(D) 기타 정보 : /기능 = "프로모터"
/표준_명 = "프로모터 ApxIV"
/라벨 = 프로모터
(xi) 서열 번호 5:
[서열 5a]
[서열 5b]
[서열 5c]
[서열 5d]
[서열 5e]
[서열 5f]
[서열 5g]
[서열 5h]
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 151 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 6:
[서열 6a]
[서열 6b]
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1806 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 :직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 7:
[서열 7a]
[서열 7b]
[서열 7c]
[서열 7d]
[서열 7e]
[서열 7f]
도 1은 ApxIVvar1과 ApxIVvar3(var는 혈청형을 나타냄)을 비교한 것으로, C-말단 끝에서 관찰되는 여러 특징들을 그래픽으로 도시한 것이다.
도 2는 ApxIVvar1 및 ApxIVvar3의 직접 반복 1(A), 직접 반복 2(B) 및 직접 반복 3(C)의 아미노산 서열을 정렬한 것이다.
도 3은 pBLac7(Thesis of T.J. Anderson University of Guelph, 1995), pROK7 및 pROK5의 부분 제한 지도.
도 4는 apxIVvar3 유전자 지도상의 여러 올리고뉴클레오티드와 프로브의 위치를 도시한 것이다.
도 5는 시험관내 배양된 혈청형 1 대조 균주 4074에서의 ApxIV 발현을 도시한 것이다.
도 6은 혈청형 1 의 대조 균주로 실험실적으로 감염시킨 돼지 유래의 혈청(레인 1) 또는 혈청형 1 야생 균주로 감염된 돼지 유래의 혈청(레인 2 내지 4)과 80kD 폴리히스티딘-ApxIV 융합 단백질의 반응성을 나타내는 면역블롯 결과이다.
도 7은 프로브 APXIVA2와 하이브리드시킨 ClaI 분해된 게놈 DNA의 서던 블롯이다.
도 8은 프라이머 APXIVA-1L 및 APXIVA-1R을 사용한 apxIV의 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다.

Claims (21)

  1. 작용성 ApxIV 독소를 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 약독화 생 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, ApxIV 독소를 암호하는 유전자가 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
  3. 제2항에 있어서, 돌연변이가 삽입 및/또는 결실인 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
  4. 제3항에 있어서, 삽입이 이종 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
  5. 제4항에 있어서, 이종 유전자가 돼지 번식 호흡증(PRRS) 비루스, 가성광견병 비루스, 돼지 인플루엔자 비루스, 돼지 파르보비루스, 전달성 위장염 비루스, 로타 비루스, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 파스퇴렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 헤모필러스 파라수스(Haemophilus parasuis) 및 스트렙토코커스 수스(Streptococcus suis)로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상의 항원을 암호하는 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 이종 유전자가 apxIV 유전자의 프로모터 영역에 기능적으로 결합된 것을 특징으로 하는 약독화 생 박테리아.
  7. apxIV 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 함유하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 5의 위치 617 내지 641을 가지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  8. apxIV 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 함유하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 5의 위치 451 내지 1132의 DNA 단편을 가지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  9. 정제된 ApxIV 독소와 약학적 허용성 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 박테리아에 의한 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 서브유니트 백신.
  10. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 기재된 약독화 생 박테리아 및 약학적 허용성 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 박테리아에 의한 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 약독화 생 백신.
  11. 제9항에 있어서, 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  12. 제9항에 있어서, 백신이 동결건조 형태인 것을 특징으로 하는 백신.
  13. 제9항에 있어서, 돼지 병원성 미생물 또는 비루스중에서 선택된 1종 이상의 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  14. 제13항에 있어서, 돼지 번식 호흡증(PRRS) 비루스, 가성광견병 비루스, 돼지 인플루엔자 비루스, 돼지 파르보비루스, 전달성 위장염 비루스, 로타비루스, 에스케리치아 콜리, 에리시펠로트릭스 류시오파티에, 파스퇴렐라 뮬토시다, 보르데텔라 브론치셉티카, 헤모필러스 파라수스 및 스트렙토코커스 수스로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상의 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  15. 제9항에 기재된 백신을 투여하는 것을 포함하여, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염에 대하여 인간을 제외한 감수성 동물을 보호하는 방법.
  16. apxIV 단백질을 암호하는 유전자에 돌연변이를 부가하는 것을 특징으로 하여, 기능성 ApxIV 독소를 생산하지 않는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 종의 약독화 생 박테리아를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 돌연변이가 결실 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 기재된 박테리아와 약학적 허용성 담체를 혼합하는 것을 포함하여, 제10항에 기재된 약독화 생 백신을 제조하는 방법.
  19. 정제된 ApxIV 독소와 약학적 허용성 담체를 혼합하는 것을 포함하여, 제9항에 기재된 백신을 제조하는 방법.
  20. 제1항에 기재된 약독화 생 백신 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주를 포함하는 백신으로 백신접종된 돼지에서 얻은 혈청과 악티노바실러스 플루로뉴모니아 야생 균주로 감염된 돼지에서 얻은 혈청을 판별하기 위한 확인 시험방법으로서, 상기 시험방법은 혈청내에서 ApxIV에 대한 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것에 기초하며, 정제된 ApxIV 독소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 돼지의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염과 돼지의 악티노바실러스 수스 감염을 판별하기 위한 확인 시험방법으로서, 상기 시험 방법은 혈청내에서 ApxIV에 대한 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것에 기초하며, 정제된 ApxIV 독소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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