TWI241407B

TWI241407B - Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumoniae

Info

Publication number: TWI241407B
Application number: TW093112492A
Authority: TW
Inventors: Ruud Philip Antoon Mari Segers; Joachim Frey
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1998-07-28
Publication date: 2005-10-11
Also published as: CA2228719A1; ES2443094T3; TW200502384A; CN1198918C; TW593678B; BR9801397A; JPH10290695A; AU743165B2; AU6078198A; HU9800855D0; HUP9800855A3; KR19980081220A; US6013266A; KR100510906B1; NZ330159A; ZA982870B; HUP9800855A2; CN1202523A

Description

1241407 Π) 玖、發明說明【發明所屬之技術領域] 本發明關於在可編碼毒素的基因上有一突變的胸膜肺炎放躬囷（A c t i η 〇 b a c i 11 u s ρ 1 e u r 0 p n e u m 〇 n j a e )的減毒活菌，製造此種細菌的方法，含有此種細菌之疫苗，製造此種疫苗的方法’含有毒素的疫苗，製造此種疫苗的方法和用以保護動物抵抗胸膜肺炎放射菌感染的方法。【先前技術】屬於放射菌層的所有細菌都會製造所謂的RTX -毒素 (RTX再次代表毒素）。這些RTX -毒素促成這些細菌的病理性特徵。 RTX —毒素已被Braun等人廣泛地回顧（Critical Rev. in Microbiol. 18 (2) : 115 — 118 ( 1991))。在格蘭氏陰性菌株內的 RTX —毒素也已被 Welch，R.A ( Molecular Microbiology 5/ 3 : 521 — 528 ( 1991 ))和

Welch 等人(I n F. Agents and Disease 4 - 254— 272 ( 1 9 9 5 ))回顧。所有已知的RTX -毒素顯示一些種類的細胞毒性或細胞分解活性。然而標的細胞和宿主專一性的不同決定於毒素和醯化作用的差異（McWhinney et al·· J· Bact· 174: 291— 297 ( 1992)和 Hackett e t a 1.5 J. Biol Chem. 270: 2 0 2 5 0 — 2 0 2 5 3 ( 1 9 9 5 ))。由於標的細胞的不同，已知有各種的R T X -毒素家族，如溶血素、溶細胞素或細胞毒素 - 5- 1241407 ' (2) 放射菌層包含許多不同的菌種，特別是胸膜肺炎放射菌，伴放線放射菌（A · a c t i η 〇 m y c e t e m c 〇 m i t a n s )，緒放射菌（A . s u i s ) ， (A . r o s s i i ) 一種放射菌，馬駒放射菌 (A . e q u u 1 i )和李氏放射菌（A . 1 i g 11 i e r e s i i )。胸膜肺炎放射菌製造血淸型依賴的RTX -毒素，它們對豬、馬、牛和人類的紅血球、兔子和豬的嗜中性白血球和豬肺泡巨噬細胞具細胞毒性/細胞溶解性（Rosendel et al; An. J. Vet. Res. 49:1 053-1 058(1 988)5Moudsley J. R. and S; Can. J. Microbiol 32:801-805(1986). Frey. J. and Nicolet，J; Inf. & Imm. 56:2570-2575 ( 1 9 8 8 )，Bendixon e t a 1; Inf. & Imm. 33:673-676(1981)，K amp. E.M .and van Leengoed, L. A. M. G.; J. Clin. Microbiol. 27:1187-1191(1989))。豬隻感染放射菌會使年幼豬隻產生急性死亡率，降低年長動物的體重增加，因此造成豬隻業嚴重的經濟損失。在格蘭氏陰性菌中，參與RTX毒素合成，活化和運輸的操縱子基因構造最近已被Coote. J. G.回顧（FEMS Microbi】ogy reviews 88:137-162(1992))。Frey 曾專一性地回顧在胸膜肺炎放射菌中三種已知的 RTX -毒素（ Bacterial Protein Toxins, Zb 1 Bakt. Suppl. 24，p. 322-

Freer et al. (Eds)， Gustaf Fischer， Stuttgart, Jena, N e w Y o r k 5 ] 9 9 4。在胸膜肺炎放射菌，RTX -控縱子含有4種基因：確 (3) 1241407 實的毒素基因（A )、活化者基因（C )、和二種可編碼參與毒素分泌至周邊培養基的蛋白質的基因（B和D )。毒素基因（A )的初級轉譯產物是一種無毒性的蛋白質，其毒性活性的活化是藉由活化者基因（C )產物。直到最近才確認在胸膜肺炎放射菌中只有三種 RTX 毒素具有上述的基因構造，或至少有毒素基因（A)和活化者基因（C )。這三種RTX毒素，ΑρχΙ，ΑρχΙΙ分別具有顯著的溶血活性（ΑρχΙ )，輕微的溶血活性（Αρχ - II )或巨噬細胞細胞毒性活性（Αρχ — III )。各種毒性活性相當隨機地分布於血淸型。有四種亞群亞群A，包括血淸型第1，5，9和11型.，可產生 ΑρχΙ 和 Αρχ— I，亞群Β，包括血淸型第2，3，4，6和8型，可產生 Αρχ— II 和 Αρχ— III，亞群C’包括血淸型第10型，只產生ΑρχΙ，亞群D，包括血淸型第7和1 2型，只產生a ρ XI — 11 〇已知A ρ X — I，一 11和一 I丨丨是抵抗胸膜肺炎放射菌感染的普遍疫苗內必需的元素：一種疫苗並不包含至少Apx 〜I，一 II和一 III時，將無法提供保護抵抗所有的胸膜肺炎放射菌血淸型。同時，一種疫苗並不包含至少一種專一性血淸型的APX -毒素時，甚至將無法誘導保護作用以抵 1241407 (4) 抗單一的血淸型。以源自A. pleuropneumoniae體外合成的RTX-毒素爲基礎的亞單元疫苗，先前已被描述喪失它們的毒性’如於歐洲專利EP No 0.354.628所發表的亞單元疫苗是基於 A · p 1 e u r ο p n e u m ο n i a e的溶血素和細胞毒素’和於歐洲專利 EP No 0.453.024 所發表的 A. pleuropneumoniae 亞單元疫苗是基於溶血素，細胞毒素和外膜蛋白。然而，一般來說，亞單元疫苗有4個重要的缺點： •需要高量的抗原物質以適當地誘發免疫系統。 •通常只有B細胞免疫反應被誘發。 •許多保護性抗原只在體內被誘發，因此無法存在於亞單元之疫苗。 •活的病原性細菌有許多重要的免疫分子，如外膜蛋白質和莢膜多醣類，對於保護作用而言可能很重要，因此需包含在有效率的亞單元疫苗內。除了以上所提到的第1和2點很明顯的問題，特別是第4點。使得製造一有效率的亞單元疫苗是困難的。在歐洲專利 EP No 0.453.024所發表的 a. pleuropneumoniae亞單元疫苗，在一種疫苗中結合四種不同亞單兀（3種R T X -毒素和一種外膜蛋白質）。很明顯地，爲了克服抵抗巴期德氏菌感染所使用的亞單元疫苗所具有的缺點，一種減毒活菌疫苗是相當需要的〇減毒活菌疫苗有下列優點： -8- 1241407 (5) 它可給予低的劑量（它是自我複製）它模擬近於天然/野生型感染它同時提供所有可能的免疫重要抗原。然而，雖然它有顯著的優點，但在本發明之前並何基於胸膜肺炎放射菌的活疫苗在市場上可取得。爲了下列似是而非的理由：如先前所提，，Αρχ - II和- III都是普遍疫苗抵抗胸膜肺炎放射菌感染需的元素。因此活疫苗必需產生這三種RTX -毒素。這三種R T X -毒素在所有放射菌層中是強的毒力因子見如：Coote，J. G·; FEMS Microbiology reviews 88 1 62 ( 1 9 92)， Tascon et a 1. ; Mol. Microbiol. 14 2 1 6 ( 1 994). Jansen et al; InF.& Imm. 63:27-3 7(1995)) · 爲了減弱活的App菌株的毒力而使RTX —毒素在技術上相當容易做得，但它無法提供做爲一解決方此種RTX -陰性菌株無法做爲活的減毒活疫苗菌株，它們不再在宿主中誘發免疫作用抵抗胸膜肺炎放射菌菌株的溶血性/細胞毒性活性。毒力因子雖然對免疫作用的誘導很重要，但比起 ΑρχΙ，一 II和一 III在建立免疫作用上則扮演較不重，因此理論上可被刪除，然而目前並末知。因此在App基因組上急欲有一個位置是負責毒當修飾時會產生一減毒的App菌株，而同時它有可引發免疫作用。然而目前並未知有此一位置。而且急一位置是普遍存在於所有App菌株’而非限制在某無任 —I，所必然而 (參 *13 7-:207- 缺失法：因爲領域要色力，有效欲此些血 - 9- 1241407 (6) 淸型。因此此一位置將准許所有不同的血淸型藉由刪除此相同位置而被減毒。【發明內容】本發明的一個目標是提供此一減毒位置’其普遍存在所有胸膜肺炎放射菌株而不論它們的血淸型。最近，在胸膜肺炎放射菌株血淸型第1型發現一個新的基因（T. J. Anderson 的論文，NoV.1995)。雖然此基因並不相似已知的放射菌ΑρχΙ ’ 一 II和一 ΠΙ基因，但它相似於腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis )已知的 RTX —毒素基因，因此它被命名爲 RTX—基因 Ap xIV。然而此基因在所有槪念上與存在放射菌家族的各種菌種內的三種已知RTX—毒素基因 ΑρχΙ，一 II和—III都不同。首先，基因構造是完全不同。第二，並無發現與已知APX -毒素相同的活化者機制。第三，對於此基因來說並無專一的體內溶血性或細胞毒性活性，或它可能的基因產物。如今很驚訝地發現此基因，它與三種已知的R T X -基因完全不同’它存在於所有的胸膜肺炎放射菌種，不論它們的血淸型爲何。此項證據係利用含ApxIV編碼序列的探針與源自胸膜肺炎放射菌所有血淸型且經限制酶作用的 DN A片段雜交反應證實，並描述於實施例6和7。現今很意外地發現 A p X I V缺失突變種具有存活性，但與它們擁有ApxIV的母株相比則有較小的毒力。 -10- 1241407 (7) 因此，確定此基因產生一ApxIV毒素在所有的胸膜肺炎放射菌株內是一毒力因子。這是一意外的結論’因爲直到現在，沒有任何影響，除了在體內此基因產物可能影響毒性效率。事實上，直到現在，甚至無證據證實此基因在活體內或活體外的胸膜肺炎放射菌中以任何方式表現。因此本發明的一個價値是發現： • ApxIV基因存在於所有 A. pleuropneumoniae菌株，不論其血淸型爲何， • ApxIV基因產物在所有 A. pleuropiieumoniae血淸型內是一毒力因子， • A p X IV基因缺失的 A . p 1 e u 1· ο p n e u m ο n i a e菌株仍然可存活，但具有較低的毒力，卻不會損傷此菌株的免疫特性。因此，本發明提供首次不會製造功能性 ApxIV毒素的胸膜肺炎放射菌的減毒活菌。功能性Ap X I V毒素被認爲是一種具有如野生型細菌內表現的 A p X I V毒素的所有特徵的蛋白質，並且表現程度如野生型含量。因此，無功能性ApxIV毒素被認爲是一種缺少如野生型細菌內表現的 A p X IV毒素的一些或全部特徵的毒素，和/或其表現程度是不足以達到野生型 ApxIV毒素的效果。無法製造 ApxIV毒素可能是由於如：在可編碼 ApxIV毒素的編碼序列中有修飾反應。也可能如：在參與 ApxIV基因轉錄的已知區域中有修飾反應，如啓動者區域 -11 - (8) 1241407 ，或參與轉譯的區域如核糖體結合位置有修飾反 A p X I V基因的所有構造列於第1圖。在此圖中，ApxIV毒素將特徵的直接重覆區區塊表示，而 Ap xIV —專一的富含甘胺酸九胜三角形表示。此重覆區域是在ApxIV的C端部。這些特徵是存在於所有胸膜肺炎放射菌血淸型淸型的核酸序列和胺基酸序列是顯示在S E Q I D 。SEQ ID Nol顯示APP血淸型第1型的ApxIV 酸序列，SEQ ID No2顯示血淸型第1型ApxIV 配胺基酸序列。SEQ ID No3顯示 App血淸型| ApxIV基因的胺基酸序列，SEQ ID N〇4顯示血型 ApxIV毒素的相配胺基酸序列。第2圖顯示層次，各種胸膜肺炎放射菌血淸型的 APX毒素度保留’特別是在N -端6 5 0個胺基酸。這也是因的一個明顯特徵。從第1圖明顯看出，在毒素 @重覆區域數目可能出現變動現象，而其決定於此變動說明基因尺寸的不同和得自各種血淸型的的萎異。即使從相同血淸型，不同的胸膜肺炎放射菌分離得到的 ApxIV基因之間，在核酸序列上仍胃。這是由於在所有有機體中天然存在爲人所知 aJ能是由ApxIV基因編碼的ApxIV毒素內的一被其他血淸型的 ApxIV毒素所取代，而多胜肽不改變。例如，一多胜肽在某一位置含有Asp。應。域以橫線肽區域以份被發現。二種血 No. 1 - 4 基因的核毒素的相有3型的淸型第3 在胺基酸之間的局 ApxIV 基 C端部分血淸型。編碼毒素分離物所 * 些的變異。些胺基酸的功能並而在此相 -12 - 1241407 (9) 對應位置爲A s η的變異物仍具有相同特質。胺基相似的胺基酸取代的此種過程稱爲功能性取代，的變異蛋白質即稱爲功能性變異物。另一個造成的原因是基因密碼退化的現象。簡言之，它意謂酸榖胺酸由GAT和GAA二者所編碼。此現象存基酸，除了 M e t和T r p。因此，很明顯地，如本的血淸型第1型的ApxIV毒素除了可由SEQ ID 核苷酸序列編碼，也可由許多種其他序列編碼，與相同多胜肽的相同功能。因此，可編碼出與 ApxIV毒素功能相匹配的變異ApxIV序列屬於本發明範圍。如本發明的減毒活菌可藉由許多方法獲得。細菌的一種可能方法是利用傳統的方法如：使用物突變劑’紫外光或溫度處理野生型胸膜肺炎放法產生功能性ApxIV毒素或誘發較低程度抗一素抗體的菌株因此相當容易在動物試驗中被篩選抗血淸可利用實施例3所描述的方法獲取。另一編碼 ApxIV毒素的基因中送入限定好突變的方重組DNA技術。此種突變可以是嵌入，缺失，核苷酸或其組合式，唯一的條件是此突變基因不功能性ApxIV毒素。顯而易見地，在開放讀錄止密碼的突變或在開放讀錄產生一框構轉移的突適合做爲獲得不再編碼一功能性A p X I V毒素菌。此種突變可利用如Cl〇ntech公司的Transform 酸被功能在此例子變動現象如：胺基在所有胺發明提出 No : 1 的但仍具有的多胜肽獲得此種鹼基相似射菌。無 Ap XIV 毒。需要的個可以在法是使用取代一個可，τ扁碼一送入一終變是非常株的方法 e f ®套組 - 13- 1241407 do) 進行體外位置直接突變而製造。許多其他標準重組DNA 技術如利用限制酶消化基因，然後經內核酸酶處理和再連接作用，也可應用。因此’在一較佳的型式，本發明的具體實例關於減毒活菌，其中可編碼ApxIV毒素的基因含有一突變。當與一般導入的突變相比較，涉及 ApxIV基因片段或甚至全部基因的缺失，或異種D N A片段嵌入的限定突變有較好的優點，它們不會回復至野生型狀態。因此，在一更好的型式，本發明的具體實例關於減毒活囷’其中可編碼A p X I V毒素的基因含有一嵌入和/或缺失。現今對於豬隻都施予大量的疫苗，假如只基於降低疫苗花費的理由，則很明顯地，組合多種疫苗投予的方式是適宜的。因此，非常吸引人們使用減毒活菌疫苗做爲一含有異種基因的重組載體，此異種基因可編碼選自其他病原性微生物或病毒。投予此種重組載體的優點是：投予此一載體之後，同時可誘發抵抗二或更多種疾病的免疫力。根據本發明提供的減毒活菌非常適合做爲異種基因的載體，因爲可編碼ApxIV毒素的_因可做爲此異種基因的嵌入位置。使用ApxiV基因做爲—嵌入位置的優點是：Αρχΐν 被去活化的同時’新达入的骞種基因可與同種胸膜肺炎放射ffi基因一起表現。此種重粗載體的構築可使用常規的標準分子生物技術如同質重組作用實施。因此，在一更較佳的具體實例，本發明關於無法製造功能性Α ρ χί v毒素的 -14 - 1241407 (11) 胸膜肺炎放射菌的減毒活菌，其中在Αρχίν基因中嵌入一異種基因。此一異種基因可以是，如上述，如：可編碼进自其他病原性微生物或病毒抗原的基因。其他的可能性是欺入編碼參與引發免疫系統的蛋白質的基因，如編碼間白素或干擾素。本發明的更好形式是，可編碼一或更多種抗原的異種基因係選自下列構成族群：豬生殖性呼吸微候群（ Porcine Reproductive ReSpirat01.y sy n dr〇 me，prrs)病毒 ’假狂犬病毒（P s e u d o r a b i e s v i r u s )，豬流行感冒病毒（ Porcine Influenza virus )，豬小去氧核糖核酸病毒（ Porcine Parvovirus)，可傳染的胃腸病毒（Transmissible Gastroenteritis virus )，輪狀病毒（r 〇 t a v i r u s )，大腸桿菌，緒丹毒桿菌（Eyrsipelothrix rhusiopathiae)，多殺巴斯德氏菌（P a s t e u r e 11 a m u 11 o c i d a )，支氣管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica )，副緒嗜血菌（ H a e m p o h i 1 u s p a r a s υ i s )和豬鏈球菌(Streptococcus suis )° 然而，異種基因在重組載體中表現有嚴重的陷井：我們已知假如許多蛋白質在異種細菌中被表現，則它們是具毒性的。因此，編碼此蛋白的基因不可被送入異種載體’ 因爲成功的重組物將由於表現某些量的異種基因而導致永久地死亡。如流感嗜血菌（Haemophilus infUenZae )的 p2-蛋白質即無法在大腸桿菌（Munson et a1.，Infect. & Immiin. 5 7H94U 9 8 9 )。本發明的一個目標是提供一種不 -15- (12) 1241407 會有此缺點的重組活載體。我們意外地發現雖然 ApxIV 基因在體內可有效地表現（見實施例5 )，但它無法在體外表現（見實施例4 )。此結論是從ApxIV毒素無法在體外生長的胸膜肺炎放射菌培養物中出現而得到。此意指 ApxIV表現的啓動或關閉，決定於其胸膜肺炎放射菌生長的環境。此特性提供一超越已知活的重組載體的意外優點 :假如異種基因的表現是在ApxIV啓動者的控制下，根據本發明的減毒活胸膜肺炎放射菌載體在活體外可生長至高密度’無論其嵌入的異種基因爲何，因爲外來基因在這些條件下將不表現。投予許多細菌至宿主之後，異種基因的表現將開始’並且在細菌複製或死亡之後的某些時候，它對於宿主的免疫系統將變成有效的。被表現的異種基因可被功能性地連接至ApxIV啓動者，藉由如：異種基因的編碼區域取代ApxIV基因的編碼序列。並不需要取代整個ApxIV基因：以包括終止密碼的異種基因編碼區域取代ApxIV的ATG —密碼就足夠。也可能藉由製造一融合構築在ApxIV啓動者的影響下而表現一異種基因。它可f曰2中ApxIV ATG密碼的ApxIV讀錄下游嵌入一異種基因而製造。功k性連接至Αρχΐν啓動者〃意指異種基因的轉錄開始於ApxIV啓動者。不用說，功能性連接至Αρχίν啓動者的嵌入性異種基因之每一個位置都屬於本發明範圍。因此根據本發明關於減毒活菌的最好具體實例形式 -16- 1241407 (13) 是：它攜帶一異種基因並功能性連接至ApxIV基因的啓動考區域。令人驚訝地發現，天然的ApxIV啓動者是可開關的啓動者，它在體外是關閉，在體內是開啓，因此使此啓動者在其天然宿主和做爲在其它細菌內的異種啓動者二者中 ’都是一非常多方面的表現工具。當使用它做爲在其他細菌內的異種啓動者，含有啓動者的DNA可從其宿主中被分離並轉移至除了胸膜肺炎放射菌之外的其他細菌。目前可能的另一個選擇是選殖許多個ApxIV啓動者複本，每一個啓動者控制另一基因的表現。這可在胸膜肺炎放射菌宿主菌中執行但此多重複本的原則也可應用於其他細菌。如上述’啓動者可用於篩選在活體內可編碼選自其他病原性微生物或病毒的抗原的一或更多種異種基因。啓動者也可用於異種DNA序列的表現，此序列可編碼組織介素如間白素’腫瘤壞死因子或干擾素。許多的組織介素，如：千擾素已知扮演免疫調節者此項重要角色。因此，它可能有利於在ApxIV啓動的控制下表現此種基因資訊。因此，本發明的另一具體實例是關於含有啓動者控制 ApxIV基因表現的核苷酸序列。在天然狀況下控制 ApxIV基因表現的可轉換的啓動者，現在被發現位於S E Q ID N 〇 : 5的4 5 1 — 1 1 3 2之間的 DNA片段。很明顯地，此DNA片段的部分並不是啓動者必需兀素’並不需要存在於片段中。因此，仍保有啓動者活性的此D N A片段較短片段，也適合做爲異種基因的表 -17- 1241407 (14) 現。因此，此具體實例的更適宜型式是關於含有S e Q 1D N 〇 : 5的4 5 1 — 1 1 3 2之DN A片段或仍具有啓動者活性的亞片段的核苷酸序列。

所有細菌啓動者都有二個一致的區域，即所謂一 i 〇和- 3 5區域。雖然這些一致區域的側邊序列可能會某起延伸影響啓動者的效率，仍可只使用含有介於一 3 5和 ATG密碼之間DNA片段的啓動者區域部分。此DNA片段是位於SEQ ID No : 5的617 — 641位置之間。因此，在本發明更適宜的具體實例形式是關於含有SEQ ID No : 5 6 1 7 — 6 4 1位置的DN A片段的核苷酸序列。本發明也關於ApxIV毒素做爲一亞單元疫苗成分。

亞卓兀疫苗將大部分可能含有二種已知的Αρχ—毒素。此是如上述。因爲正如上述，我們很意外地發現ApxIV 毒素存在於所有胸膜肺炎放射菌血淸型，它是亞單元疫苗合意的額外成分，抵抗ApxIV毒素的中和性抗體的產生提供保護以抵抗每一和每個胸膜肺炎放射菌株（不論血淸型）所產生的 ApxIV毒素。因此，本發明的另一具體實例是關於用於保護動物抵ί几胸膜肺炎放射菌感染的亞單元疫苗，它包括純化的 ApxIV毒素。ApxIV毒素可單獨投予，或結合如上述的任何或所有的A p X I，- 11和一 111毒素和/或如：結合胸膜肺炎放射菌的外膜蛋白質（outer membrane proteins, Ο Μ P S )。此種疫苗相當容易製備，即混合足以誘發免疫反應的ApxIV毒素量，和一藥學可接受載體。ApxIV毒素的製造係利用送入ApxIV基因於一 -18- 1241407 (15) 適合的表現載體，基因表現和分離此毒素。本技藝中有許多已知的多方面表現系統，如細菌表現系統，巴氏病毒表現系統和哺乳類細胞表現系統。在實施例3描述如何在大腸桿菌內表現基因以得到Apx]V毒素。

本發明另一具體實例是關於含有如上述保護動物抵抗胸膜肺炎放射菌感染的減毒活菌的減毒疫苗。此種疫苗可藉由混合減毒活菌和一藥學可接受載體而得到。這些疫苗至少含有如本發明的免疫有效量減毒細菌。免疫有效意指在接種時，投予的減毒活菌量足以誘發宿主內對毒力型式的RTX毒素製造細菌的有效免疫反應。投予的有效劑量將取決於接種的動物、動物的年齡、體重，投予的形式和接種抵抗的病原菌種類。疫苗可能含有足以激發免疫反應的任何細菌劑量。界於1 〇3和1 〇5細菌範圍的劑量是如_· 非常適合的劑量。

藥學可接受載體可能是簡單如水，但它可能是如：含有培養細菌的培養液。另一適合的載體是如：生理食鹽濃度的溶液。本發明中有用的其他藥學可接受載體或稀釋液的實施例包括安定劑如 SPGA、醣類（如：山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、糊精）、蛋白質如白蛋白或酪蛋白、含蛋白質的試劑如牛血淸或脫脂牛乳和緩衝液 (如：磷酸鹽緩衝液）。具有佐劑活性的一或更多種化合物也可選擇性地加至疫苗，佐劑是免疫系統的非專一性刺激物。它們增強宿主對侵入病原菌的免疫反應。本技藝中已知的佐劑實施例是 -19 - 1241407 (16) F ι· e u n d s C o m p 1 e t e 和 I m c o m p 1 e t e 佐劑、維生素 E、非離子性阻塞聚合物、胞壁酸基二胜肽、ISCOMS (免疫刺激複合物、i m m ini 1 s t i m u 1 a t i n g c 〇 m p 1 e s e s，例如歐洲專利 E P 1 0 9 9 4 2 )、皂素、礦物油、植物油和C a r b ο p ο 1 (—種同聚合物）。佐劑，特別適合做爲黏膜應用的是如：大腸桿菌熱不穩定毒素（E. coli heat-labile toxin，LT)或霍亂毒素（Cholera toxin, CT)。

其他適合的佐劑是例如氫氧化鋁、磷酸鹽或氧化物、油乳化劑（如：Bayol F ®或Marcol 52 ®、皂素或維生素E —溶解鹽）。因此，在一較佳的型式，如本發明的疫苗含有一佐劑用於投予動物，如本發明的疫苗可以，利用噴霧或肌肉注射經鼻內、皮內、皮下投予。

貯存亞單元和活的微生物二者有許多的方法。存放在冰箱是一種廣爲人知的方法。時常也與含甘油的緩衝液存放於-7 〇 °C。細菌也可存放在液態氮內。冷凍乾燥是另一保存方法。冷凍乾燥細菌可存放並保持生存力許多年。用於冷凍乾燥細菌存放之用的溫度可能最好在〇度以上，這樣的溫度對細菌存活力並不會有所損害。冷凍乾燥也同樣適用於亞單元。可根據所有爲人所知標準的冷凍乾燥技術進行冷凍乾燥。有益的添加物，如：脫脂牛乳、海藻糖、明膠或牛血淸白蛋白都可在冷凍乾燥過程中加入。 -20 - 1241407 (17) 因此，在一更佳的具體實例，如本發明的疫苗是存在於一冷凍乾燥形式。在此具體實例的更適宜形式中，疫苗選擇性地含有一或更多種選自病原性微生物或病毒的抗原。此種疫苗的取得係利用添加一或更多種選自其他病原菌或病原的抗原至如上述的本發明滅毒活菌和一藥學可接受載體。當然，不但添加一或更多種抗原，而且加入一或更多種失活或活的型式的完整病原菌也是可能的。我們可使用如上述已知的重組D N A技術選殖可編碼一或更多種選自其他病原性微生物或病毒的基因訊息至減毒活菌而得到此種疫苗。從醫學和健康二者觀點來看，此種疫苗對於接種動物的壓力當然低於分別接種每一病原菌。在一甚至更適宜的型式中，這些抗原係選自下列構成族群· PRRS 病毒、Pseudq-rabies 病毒、Porcine influenza 病毒、Transmissible G a s t r o e n t e r i t i s 病毒、 rotavirus 、 Escherichia coli 、 Erysipelothrix 、 rhusiopathiae、 P a stein，11a、 multocida、 Bordetella、 bronchiseptica、Haemophilus、parasuis 和 Strep tqcocus s υ i s ° 本發明也關於製備無法產生功能性A p X I V毒素的胸膜肺炎放射菌減毒活菌的方法。這些方法包括在可編碼 A p X I V蛋白質的基因中導入一突變。使用突變劑和技藝中爲人所熟知做爲嵌入，取代或缺失Apx IV基因訊息的重 >21 - 1241407 (18) 組D N A技術，這二種傳統的突變技術都可應用。在一較佳型式，如上述方法係做爲導入一缺失之用。製備如本發明減毒活疫苗的方法係包括混合如本發明的細菌和一藥學可接受載體，這些方法也爲本發明的一部分。製備亞單元疫苗的方法也屬於本發明範圍之內。此種方法包括混合純化的ApxIV毒素和一藥學可接受載體。

以活疫苗接種的領域中，另一個一般公認的問題是：在但主動物血淸中存在某些抵抗病原菌的抗體，此顯示宿主曾被毒性或減毒型式的病原菌感染。然而無法區分領域被感染動物和經活疫苗菌株感染的動物。如本發明的減毒活胸膜肺炎放射菌對此問題提供一解決方法，其方法如下 :如實施例3中所述，胸膜肺炎放射菌血淸型第1型的 ApxIV基因已被分離並在異種宿主細胞中表現。將此表現產物置於PAGE電泳，然後做爲西方點墨之用。此點墨與得自故意以胸膜肺炎放射菌感染的豬隻的康復期血淸和領域菌種血淸反應。我們發現ApxIV基因在所有試驗的胸膜肺炎放射菌領域菌株體內都表現。此暗示經胸膜肺炎放射菌感染的豬隻具有抵抗感染它們菌株的抗體，而不論感染菌株的血淸型爲何。如本發明的減毒活菌由於缺失A p X IV基因’不再製造 ApxIV毒素。因此經如本發明減毒活菌胸膜肺炎放射菌株接種的動物，在牠們的血淸中將不再有抵抗 A p X I V毒素的抗體。 -22- 1241407 (19) 在一比較試驗，如E LI S A試驗，此種血淸因將與所有免疫性胸膜肺炎放射菌蛋白質如A p XI，11和/或π丨反應，不與 ApxIV反應。然而來自經胸膜肺炎放射菌領域菌株感染的豬隻血淸將與所有免疫性胸膜肺炎放射菌蛋白質，包括ApxIV反應。因此，如本發明的減毒活菌胸膜肺炎放射菌變成一非常適合的標識疫苗，即疫苗菌株可與領域菌株區分。

區分疫苗菌株和領域菌株的診斷試驗可以是一簡單的 ELISA-試驗，其中純化的 ApxIV毒素是覆蓋在ELISA 盤的孔壁。先與被試驗豬隻的血淸反應，然後與如標識的抗緒抗體反應，可顯示是否存在抗A p X IV毒素抗體。診斷試驗系統的另一實施例是如：含有純化的ApxIV 毒素的西方點墨與被試驗豬隻的血淸反應，然後利用專一的抗一ApxIV抗體偵測。

因此，含有純化的 ApxIV毒素，用於區分來自經胸膜肺炎放射菌領域菌株感染的豬隻血淸和經含有如本發明減毒活疫苗胸膜肺炎放射菌株的疫苗接種的豬隻血淸的診斷試驗也落於本發明範圍之內。在豬隻健康照顧上另一可見的問題是：假如豬被胸膜肺炎放射菌或A. suis或可能二種組合式感染後，很困難在一快速並不含糊的狀態下測定。用於A . sui s專一性偵測的診斷試驗目前並未獲得。這主要是由於 A. p 1 e u r ο p n e u m ο n i a e和 A . s u i s分享許多的抗原。如一可能提供的實施例，兩種高度抗原性 Αρχ —毒素；Apxl和 - 23- 1241407 (20) ΑρχΙΙ在如 A.suis中有高度地保留同質性（Van Ostaayn et al.5交付發行）。編碼A p X I，一 11和一I Π毒素或同質物的已知R T X — 基因被發現存於於所有放射菌屬成員，如：A. pleuropneumoniae，A.suis，A. rossii 和 A. equuli。因此 ’開始時，本發明者認爲新的R T X —毒素 A p x I V可能也存在於所有放射菌屬成員。然而經過試驗豬病原性放射菌後我們再次驚訝地發現。與已知的三種RTX -基因相反地，此種新型的RTX—基因Apx.IV只存在於豬病原性的胸膜肺炎放射菌。它不存在於所有其他一般的豬病原性放射囷屬，因此它也不存在A. suis。參見實施例6和7。因此，令人驚訝地發現，在豬血淸中出現 ApxIV的抗體。它是一快速且不含糊的證據顯示··豬已被 A. p 1 e u r ο p n e u m ο n i a e感染，而非 A · s υ i s或任何其他豬病原性放射菌種感染。因此本發明也提供一個以是否出現抗 ApxIV的抗體爲基礎的診斷試驗，和一個專一性區分經 A. p 1 e u r ο p n e u m ο n i a e和 A · s u i s感染的區分試驗。此一試驗可能如：是一 ELISA試驗，在分別的孔中含有存在於： A. pleuropneumoniae 和 A. suis 二者白勺 ΑρχΙ 和一II 毒素，和純化的ApxIV毒素。從經A. suis感染得到的動物血淸將只與含 ΑρχΙ 和—II 的孔反應，而經 Α. ρ 1 e u r ο p n e u m ο n i a e感染得到的動物血淸將也與含純化的 Αρχ I V毒素的孔反應。 -24 - (21) 1241407 【實施方式】實施例1 胸膜肺炎放射菌血淸型第1型的Αρχίν基因的選殖和分析標準分子生物技術（質體DNA分離、限制酶消化作用、瓊脂凝膠電泳、南方點墨法、連接反應、轉型、電穿孔）除非有特別說明，否則都依照 Sambro 〇k等人所編輯的書（Molecular Cloning，A Loboratory Manual, Cold

Spring Harbor, N. Y.5 1989 )或 Ausubel 等人所編輯的書所描述的方法（Current Protocols in Molecular Biology. J o h n W i 1 e y & S ο n s，N . Y · 5 1 9 8 7 ) 。P C R 的實施依照 I η η i s 等人編輯的書（PCR protocols, A guide to Methods and Applications. Academic Press I n c. ? San Diego, 1990)戶斤描述的方法。染色體DNA分離依照Pitcher等人的方法（ Lett· Appl. Mirobiol.，8; 151-156，1 9 8 9 )。所有胸膜肺炎放射菌參考菌株血淸型第1型：4074菌株；血淸型第2 型：S 1 5 3 6菌株；血淸型第3型：S 1 4 2 1 ;血淸型第4型 :M62;血淸型第5A型：K17;血淸型第5B型；L20; 血淸型第6型：fEM 0 ;血淸型第7型；WF83 ;血淸型第8型：405;血淸型第9型：CVI 13261;血淸型第1〇型：1 3 0 3 9 ;血淸型第1 1型：5 6 1 5 3和血淸型第1 2型： 8 3 2 9 )的來源已被 F r e y 和 N i c 〇 ] e t描述（J · C h i η . Microbiol。28; 2 3 2 -2 3 6; 1 990 )。胸膜肺炎放射菌血淸型 -25- 1241407 (22) 第3型HV1 I4菌株是一領域分離株（即Bec]c等人所試驗的血淸型第3型菌株的其中一種菌株，j. Chin. Microbiol” 32;274 9-2 7 5 4，1 994 )。所使用的其他放射菌株爲：A. rossii: ATCC 27072; A· equuli: ATCC 19392; A suis ： ATCC 15558 〇

所使用的大腸桿菌宿主菌株是：XL 1 一 blue ( Stiatagene，La Y〇]la，Ca;基因型：recAl andAl gyrA96 thi」hsdR17 supE44 relAl lac〔 f' pr〇AB \ac\ Q Z D M 1 5 _TiilO(Tet )〕）和 HMS174 ( DE3) ( AMS Biotechnology Ltd, Switzer land;基因型：F· recA(rK12.mK12 + )rifr IDE3 ) 從 T. J. Anderson 的論文（U n i λ/e r s i t y o f G υ e 1 p h， 1 9 9 5 )得到初步的序列資料，由此設計並合成二個例子，並命名爲APXINA — 1L ( 5 / —T G G C A C T G A C G G T G A T G A - 3 )和 APXIVA — 1R (

5 " — G G C C A T C G A C T C A A C C A T - 3 ")。這些引子做子 PCR放大反應之用，並以胸膜肺炎放射菌血淸型第3型 Η V 1 1 4菌株和血淸型第1型參考菌株4 0 7 4的染色體D N A 做爲模板可將二種菌株內含4 4 2 B p的片段放大。將源自血淸型3型染色體DNA的片段，依照製造商的步驟以異羥基洋地黃毒酉己質一1 1 — D U T P ( B 〇 e h 1· i n g e 1· M a η n h e i m )標示（此片段命名爲探針APXIVA，參見第4圖）。然後將此標示的探針與源自40 74菌株，經CLAI消化的染色體 DNA進行南方點墨法雜交反應。此探針與一約8.0KB的 -26- (23) 1241407

片段雜交。將源自於血淸型第1型4 0 74菌株，經CLAI 消化含ApxIV基因的染色體DNA與經CLAI消化的p B 1 u e s c r i p t Π S K · ( S t r a t a g e η e U S A )連接。把此連接的 DNA送至大腸桿菌 X L 1 — b 1 u e菌株，利用含 1 0 0 M g / Μ <氨苄青黴素的LB培養盤篩選轉形物。帶有ApxIV的菌落篩選係利用培養盤的硝纖維複製本與APXIVA探針進行菌落雜交反應。因此分離出一含有約8.0KB CLAI嵌入物的質體，並命名爲PROK7。首先將6736Bp的CLAI嵌入物定序（SEQ ID 1 )，並且確認含49 7 1核苷酸的開放讀錄編碼出一含1 65 7氨基酸殘基的蛋白質（SEQ ID 2 )，推測約1 86KD。此基因命名爲ApxIV - VAR1 (見第3圖）實施例2 : 胸膜肺炎放射菌血淸型第3型的ApxIV基因的選殖和分

析使用標示的探針A P X I V A (在實施例1提及）與源自 HV114菌株經CLAI消化的染色體DNA進行南方點墨雜交。此探針與一約7.0KB的片段雜交。將源自HV1 14的分離染色體 DNA以 CLAI消化並與經 CLAI消化的p Bluesrcpt II SK- (Stratagene USA)連接。大腸桿菌 XL1 一 blue菌株以連接的DNA進行轉形，轉形物以含l〇〇Mg / Μ <氨苄青黴素的LB培養盤進行篩選。帶有ApxIV的菌落篩選係利用培養盤的硝纖維複製本與ΑΡχΙγΑ探針進 - 27 - 1241407 (24) 行菌落雜交反應。因此分離出一含有約7KB CLAI嵌入物的質體，並命名爲pROK5。利用序列分析出此嵌入物（ SEQ ID 3 )。確認一含4146Bp的開放讀錄，其編碼出一含 1 3 8 2胺基酸殘基的蛋白質（SEQ ID 4 )，推測約 154KD。此基因命名爲ApxIV - VAR3(見第3圖）。實施例3 : 在大腸桿菌中表現ApxIV VAR3 —聚組織胺酸融合蛋白從質體pR〇K5製造一缺失菌落，它含有ApxIV基因的3 /端，起自BamHI位置（SEQ ID No : 3中的核苷酸 Νο·2 74 7 )至ApxIV基因的嵌入物下游端的CLAI位置。此質體命名爲pROKl。使用寡核苷酸APXIVAHIS1 — L ( 5 / — AGCCATATGGGCGATTTAAATTTCAG-3 ^ )和 APXIVAHIS 1 - R ( 5 ^ 一 TATGGATCCTCCGTGCTTCTGAGC-3/ )爲引子，以質體 pROKl的DNA做爲模版，將2. 1KB DNA片段放大（見第 4 圖）’此 DNA 片段含有 ApxIV — VAR3(SEQ ID 3)內 3520— 5643Bp區域，並在5’和3'端分別有Ndel和 BamH 1限制酶位置。將P C R片段和表現載體ρΕΤΗ I S — 1 以N del/BamHl水解，經過連接和選殖，此質體命名爲 pIFFApxIVB/10HIS—l。質體 pETHIS — 1 是 pET14B 的衍生物（N 〇 v a g e η I n c · 5 M a d i s ο η，W i )，其中多重選殖位置已延伸並嵌入可編碼組織胺酸十聚體區域。因此， pJFTApxIVB/ 1 0HIS — 1質體含有T7啓動子，可編碼組 -28 - (25) __---— 1241407

織胺酸六聚體S E Q I D 4的6 5 3 — ] 3 6 0胺基酸殘基和組織胺酸十聚體的轉譯融合。將此質體轉移至含p L y s S的大腸桿菌HMS174 ( DE3 )菌株，它含有iPTG可誘導的丁7 RN A聚合酶基因以及T7溶菌酶基因，做爲增加穩定性之用。將此菌株培養於含 2 5 M g / μ Ζ可洛芬尼可（ Chl〇ramphenic〇l)和；[00Μ§//Μ < 氨苄青黴素的 LB 培養基至ODwo爲〇.5，並以10MM的異丙基—b— D —硫半乳糖吡喃糖苷誘發。添加I P T G後，將細胞於3 7。(：培養2.5 小時，以離心法收集細胞，從包涵體將分子量約8 〇 K D的融合蛋白分離。然後把包涵體溶解於6 Μ胍氯化氫，3 0 〇 MM NACL 和 50ΜΜ ΝΑΗ2Ρ〇4 ρΗ8·0 的溶液，80KD 融合蛋白進一步以使用ΝΙ2 +螯合管柱（Qiagen AG, Basel )的固fe式金屬親合層析法（I m m 〇 b i 1 i s e d M e t a 1 A f f i n i t y Chromatography, IMAC ) ( Schmitt et al” Molecular

Biology Reports 18; 223 -23 0，1 9 9 3 )進行純化。純的蛋白質在 ρΗ5·0從管柱沖提出。把收集到的沖出液以含 3 00ΜΜ NACL 和 50ΜΜ ΝΑΗ2Ρ04 ρΗ8.0 的溶液透析。將 5 00Mg多組織胺酸融合產物和1體積的Complete Freunds Adjuvant ( D i f c o Labs, Detroit，MI)相混合致免疫兔子。三星期後，以相同含量蛋白混合不完全 Freund Adjuvant 的加強注射劑量施予兔子。加強注射後的四星期，抽取兔子血液，可得到含有抗- ApxIV毒素抗體的超免疫血淸，命名爲5 22 — 4 0 9血淸。 -29- 1241407 (26) 實施例4 : Αρχ IV基因在體外生長的胸膜肺炎放射菌的表現

將血淸型第1型的胸膜肺炎放射菌參考菌株培養於添力口 ] 0 M g / Μ < Β — N A D的C ο 1 u m b i a培養液並如描述的方法收集（Beck et al.，J. Clin. Microbiol.，32; 2749-2754，1994)。把 ApxIA，ApxIIA、ApxIVA —多組織胺酸融合蛋白和濃縮的培養物上淸液分別置於聚丙烯醯胺凝腸上，以電泳法進行分離（Laemm 1 L Nature 227: 680-685, 1 9 7 0 )，然後進行西方點墨程序（Towbin et al.5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4 3 5 0-43 5 4, 1 9 79 )。將西方點墨與抗—ApxIA和抗—ApxIIA單株抗體反應〔Beck et al.5 J. Clin Microbiol.，32; 2749-2 7 54，1994〕，並與抗一 ApxIV 5 2 2 — 4 0 9血淸（見實施例3 )反應。血淸型第1，型的分離RTX毒素部分淸楚地含有 ΑρχΙΑ和 ΑρχΠΑ。 ApxIVA的存在無法顯示出（見第5圖）。

實施例5 :

ApxIV基因在胸膜肺炎放射菌在活體內感染時的表現將含有8 0 K D多組織胺酸—A p X IV — V A R 3融合蛋白的聚丙烯醯胺凝膠（見實施例3 )轉移至一硝纖維膜。把膜分割成條狀，然後與1 0 0倍稀釋抗血淸型第1型的復原期血淸或來自經血淸型第1型參考菌株實驗感染豬隻的血淸 (Frey and Nicolet，Vet. Microbiol·，28; 6 卜 73，1991)。此反應使用抗兔子IgG鹼性磷酸酶標示連接物（ -30 - 1241407 (27) kirkegaard Perry Inc., Gaithersburg, Md ) ，NBT ( 4 — N i 11· o b 1 u e t e 11· a z o 1 i u m c h 1 o l· i d e，氯化 4 —硝基藍四 _ )和 BCIP ( 5 — Bromo-4-chloro-3-indolyl'phosphate，5—溴一 4 一氯—3 —吲哚磷酸鹽）顯色（見第6圖）。血淸型第1 型血淸以及來自實驗感染豬的血淸都會和8 0KD的多組織胺酸-ApxIV _ VAR.3蛋白反應。此顯示並胸膜肺炎放射菌感染豬隻時，ApxIV蛋白確實表現並，具有抗原性，且誘發抗—ApxIV毒素抗體。實施例6 : 使用南方點墨法證實 ApxIV基因存在於所有胸膜肺炎放射菌血淸型並且不存在於非胸膜肺炎放射菌株

爲了觀察 ApxIV存在於各種胸膜肺炎放射菌血淸型和相關的細菌，因此製造三種探針（見第4圖）。探針 APXIVA 描述於實施例 1。探針 APXIVA2含有介於 BamHl和Nrul位置白勺20 15Bp DNA片段。含7 5 8 Bp的探針 APPIVA1的製造係使用寡核甘酸 APPIV1 - -L ( GGGACAGTGGCTCAATTAAG-3 / ) 和 APPIV1 - -R ( AGCTGTAAACTCCACCAACG-3 / )經 PCR 放大反應。所有探針都根據製造廠商的程序以異羥基洋地黃毒配質- 1 1 -DUTP ( Boehringer M a η n h e i m )標示。然後與含有所有胸膜肺炎放射菌參考菌株和 Η V 1 1 4領域菌株，Actin 〇 bacillus suis ( ATCC 1 5 5 5 8 ) ，Actin Obacillus suis ( ATCC 2 7 072 )和 Actin Obacillus equuli ( ATCC 1 9 3 9 2 ) -31 - (28) 1241407 經CLAI水解的染色體DNA的南方點墨雜交。三種探針反應相應（見第7圖，與APXIVA2探針反應的結果）’ 所有A . p 1 e u r ο p n e u ηι ο n i a e菌株都有反應’而與 A · s u i s， A.equuli和A· rossii菌株則無雜交反應。實施例7 :

使用p C R放大反應證實A p x I V基因存在於所有胸膜肺炎放射菌和相關菌株取50Ng來自各種A. pleuropneuinoniae血淸型’其他放射菌層和P . h a e m ο 1 y t i c a的染色體D N A爲模版’和以 APXIVA - 1L ( 5 ^ -TGGCACTGACGGTGATGA-3 / )及

APXIVA— 1R ( 5 〆-GGCCATCGACTCAACCAT-3 ')爲引子進行PCR放大反應。經過瓊脂凝膠分析產物，我們在所有A. pleuropneumoniae樣品中都觀察到4 4 2 B p的產物，而在其他放射菌層的樣品中則無產物存在（第8圖）此顯示除了實施例 6 的結果，PCR可用以區分 A. p 1 e u r ο p n e u m ο n i a e和其他放射菌層。實施例8 :

ApxIV- VAR1多組織胺酸融合蛋白的過度表現

以質體pROK - 7 (見實施例1 )爲模版，寡核苷酸 APX4/ 1 1 5 - L (5 ^ -CGCCATATGACAAAATTAACTATGCAAG)和 APX41 1 6 - R ( 5 ^ - C G C G A A T 丁 C A G C G A C A C A A G A G A T A 丁 -32- (29) 1241407

)爲PCR—引子，將PCR片段放大。將足夠量的此片段以限制酶N d e 1和E c 〇 R1水解，並選殖於事先經相同酵素水解的表現載體pETHIS — 1 (已描述於實施例3 )。所形成的質體命名爲pJFFApxIVAlHISl，含1841胺基酸殘基 2 〇 6 K D的多組胺酸融合蛋白（以p a G E決定其M W )於大腸桿菌內過度表現（如實施例3所述）。蛋白質是由S E Q I D Ν 〇 : 5內的核酸Ν 〇 . 1 1 3 2 — 6 5 4 6所編碼。蛋白質的胺基酸序列列於 S E Q ID Ν 〇 : 6。在西方點墨，此產物與抗 Αρχ IV 5 2 2 — 4 0 9血淸（抗血淸描述在實施例3 )專一性反應。實施例9 : 藉由ApxIV接種法保護老鼠抵抗ΑΡΡ攻擊

將源自於血淸型第1型參考菌株4074基因原料的 2 06KD多組織胺酸一ApxIV融合蛋白（如實施例8描述）和一可相比的1 〇 8 K D多組織胺酸—A p X IA -融合蛋白’如實施例3所述過度表現。把被誘導的大腸桿菌細胞的塊狀物再懸浮於PB S緩衝液（1 g細胞塊狀物懸浮於6M <緩衝液），於冰上超音波振盪二次，每次4 5秒’使細胞溶解。然後在4 °C，22 0 0 0 X g離心2 0分鐘，再把上淸液丟棄，所形成的塊狀物以3M尿素（ρΗ6·3 )溶液淸洗。利用22 000 xg離心20分鐘去除尿素，然後將形成的塊狀物溶解於 6 M G υ a n i d i n i u m H C 1 ( p Η 8 · 〇 )。經過 P A G E 凝膠的密度測量將蛋白樣品標準化。樣品以PBS稀釋並以油 -33 - 1241407 (30) 佐劑配方。取三組老鼠，每組1 5隻，分別經腹腔注入 ApxIV 抗原（36.3/ig) ，ApxIA 抗原（36.3//g)或單獨的佐劑，使其致免疫。投予的疫苗體積是〇.4M < 。第一次接種後2 4小時，每一組小鼠再分爲含7和8隻小鼠的兩群。含7隻老鼠的那一群以腹腔注射法注入〇 . 2 Μ <的疫苗，含8隻老鼠的那一群以肌肉注射法在每一隻後腿注入0. 1 Μ < 。加強注射後的1 3天，每隻老鼠經腹腔注入

1 . 5 1 0 8 C f ία的毒性血淸型第1型菌株。實施例1 〇 :

ApxIV的孔生成能力使用新鮮誘導的大腸桿菌細胞所表現的ΑΡχΐν做爲蛋白質來源，用以測試其在人工脂質雙層上孔生成的能力 (Maier et al·，Infect. I mm un, 64; 4415 - 4423 (19 96))。

做爲暗淡無光脂質雙層實驗之用的方法先前已被描述 (Benz et al.; Biochi m. Biophys. Acta 511:305-319 (1978) 。膜在含1%自體外源凝集素（黃豆卵磷脂IV—S型，來自Sigma，St. Louis Mo)的正一十烷溶液形成。在通過膜處建立10倍鹽梯度後，利用keithley 610C靜電計測量零電流膜電位 5 - 1 0 分鐘（B e n z e t a 1. ; B i 〇 c h i m · B i 〇 p h y s . Acta 551: 238-247(1979)) 。ApxIV 存在會造成在含 0.5% 膽固醇時，高頻率的孔形成，其平均單一通道電導係數率 (G)爲4NS。追些結果顯不ApxIV誘導孔在人工雙層形成，並且因此對真核細胞具毒性’因此對 A. -34- 1241407 (31) p ] e u r ο p 11 e u m ο n i a e 是一毒力因子〇【圖式簡單說明】

第 1 圖：ApxIVAVARl 和 ApxIVAVAR3 的比較（ VAR代表血淸型）。圖示代表在C端所發現的不同特徵。A p X I V A的橫線區塊代表直接重覆區域。粗的垂直棒顯示富含甘胺酸九胜肽的位置，黑色三角形代表DNA聚合酶B族。胺基酸序列YSDSANSKK代表在ApxIVAVAR3 基因中的區域者序列。在ApxIVAV AR3中被刪除的 ApxIVAVARl序歹ij部分也顯示在圖上。弟2圖· ApxIVAVARl和ApxIVAVAR3的直接重覆1 (A )，直接重覆2 ( B )和直接3 ( C )的胺基酸序列的排列。每一個直接重覆1，2和3的複製本，都以字母標示，以做爲區分序列比較之用。變異殘基以粗字母表示。

第 3 圖：pBLAC7 (摘自 T. J·的論文，Anderson University 〇f Guelph， 1995) ，pR0K7 和 pR〇K5 的部分限制酶位置圖。不同的開放讀錄（open readillg framer， ORF S)以箭頭表不。在pR〇K7中，iacz的中斷箭頭顯不基因的部分序列。可能的p -獨立轉譯終止者以W表示。可能的轉錄起始位置以三角形表示。限制酶位置：A二 ASp 7 0 0 ； B = BAMHI ； C 二 CLAI ； E - EC0RV ； EC -

ECORI ; H = HINDIII ; N 二 NRuI ; ND = NDEi ; NH = NHEI ;P = PSTI ; S 二 SpEI; SM=SMAI。弟4圖：在 ApxIVAV AR3基因圖上，各種寡核：g：酸 35 - (32) 1241407 和探針的位置。

第5圖：ApxIV在體外培養的血淸型第1型參考菌株 4074的表現。方格A是與抗—ApxIVA單株抗體反應’方格B是與抗—ΑρχΙΙΑ單株抗體反應和方格C是與抗一 ApxIV 522 — 409血淸反應。第1行含ApxIV —多組織胺酸融合蛋白，第2行含ΑρχΙΙΑ —多組織胺酸融合蛋白，第 3行含 4 0 7 4菌株濃縮的培養物上淸液，第 4行含 ApxIVA多組織胺酸融合蛋白。第6圖：免疫點墨顯示來自經實驗性感染血淸型第1 型參考菌株豬隻的血淸（第1行）或來自血淸型第1型領域感染豬隻的血淸與80KD多組織胺酸-ApxIV融合蛋白的反應活性。以5 22 — 4 09血淸做爲陽性控制組（+ )，以1 000倍稀釋的抗ΑρχΙ和ΑρχΙΙ多株兔子血淸（Trey et al·，Ifect. Immun.，57; 2 05 0-20 5 6，1 9 8 9 )做爲陰性控制組 (—)0

第7圖；經CLAI消化的基因DNA與探針APXIVS2 雜交的南方點墨。第行：A· pleuropneumoniae參

考菌株；1 :血淸型第1型；2 :血淸型第2型；3 :血淸型第3型；4 :血淸型第4型；5 :血淸型5 A型；B :血淸型5B型；7:血淸型6型；8:血淸型第7型；9:血淸型第8型；10:血淸型第9型；11:血淸型第10型；12 :血淸型1 1型；1 3 :血淸型1 2型；1 4 : Η V 1 1 4領域菌株；15: A.suis ( ATCC 1 5 5 5 8 ) ； 16: A. rossii ( ATCC 27072) ; 17: A. eqUUn(ATCC 19392)。分子量標識者 -36- 1241407 (33) 顯示（KBp )在左邊。第8圖：使用引子APXIVA— 1L和APXIVA— ]R進行ApxIV的PCR放大反應。行的設計：第1 一 13行分別含有 A . p 1 e u r ο p n e u m ο n i a e 參考菌株第 1、2、3、4、5 A、 5B、6、7、8、9、10、11 和 12 型；第 14 行：HV114 菌株；第 1 5 行·· A . s u i s A T C C 1 5 5 5 8 第 1 6 行 A。r 〇 s s i 1 ATCC 27072 ；第 17 行 A. equuli ATCC 1 9 3 9 2 ;第 18 行： A. lignieresii ATCC 49236;第 19 行：P.haemolytica 第 1 型ATCC 14003。分子量標識者顯示（KBp)在左邊。 -37 - 1241407 (34) 序列淸單 (1 ) 一般資料： (I )申請者： (A) 名字：AKZO Nobel N.V. (B) 街：Velpei.weg 7 6 (C )城市：Arnhem

(E )國家：The Netherlands (F )郵遞區號：6 8 4 2 Β Μ (Π )發明：胸膜肺炎放射菌之減毒活菌 (III )序列數目：4 (IV )電腦可讀型式 (A )媒體種類：塑膠製磁碟片 (B )電腦：IBM PC可相容

(C) 操作系統·· PC— DOS/MS— DOS

(D )軟體：Pate n tin Release #1.0，Version #1.30 ( E P O ) (2 ) S E Q ID N O : 1 的資料 (I )序列特徵： (A)長度：6736鹼基材 (Β )種類：核酸 (C )股：雙股 (D )拓蹼學：直線 (II )分子種類：DNA (基因組） >38- 1241407 (35) (III )假說：無 (I V )抗意識鏈：無 (VI)起始來源： (A )有機體··胸膜肺炎放射菌 (B )菌株：4 0 7 4 (血淸型第1型參考菌株） (V 11 )直接來源：

(B)菌落：pR〇K7 (IX )特色··

(A) 名稱/關鍵·· CDS (B) 位置· 1 5 7 6..6 5 4 9 (D )其他資料：/密碼-起始二1 5 7 6 /功能= :、、RTX 毒素〃 /產物= :'、ApxIV— VAR1 〃 /基因= :'、ApxIV— VAR1 〃 /數目= 二 1

(XI )序列描述：S E Q 1D Ν Ο : 1 ATCGATATGC CGCCGGGTAC GGGCGATATC CAACTTACTC TTTCGCAACA AATTCCGGTT 60 ACCGGTGCGG TGGTGGTAAC CAC丁CCGCAA GATATTGCGT TATTAGATGC GGTGAAAGGT 120 ATTTCAATGT TCCXAAAAGT GTCGGTACCG GTCTTAGGTA TCATTGAAAA TATGAGCGTA 180 CATATCTGCC AAAATTGCGG TCACCACGAA GATATTTTCG GCACCGGCGG TGCGGAGAAA 240 GTGGCGAAGA AATACGGTAC TAAAGTATTA GGACAAATGC CGTTGCATAT TCGCTTACGT 3 00 CAAGATTTGG ATGCCGGCAC ACCGACCGTC GTTGCGGCAC CGGAACACGA AACCAGCCGA 360 - 39- 1241407 (36) GCCTATATTG AATTAGCGGC AAAAGTCGCT TCGGAATTAT ACTGGCAAG<5 丁丁CGGTTATC 42 0 CCGTCTGAAA TTATGATTCG TGAAGTAAAA 丁AAGT丁丁丁AA TAACCACGAA AACACAAAGA 480 ACACAAGCGG TAGAATTTGC AGAAAAATTT GCAAATCCTA CCGCTTTTTT ATTAGTACGA 540 TTCGCTGTTG GACTGCTA丁丁丁GATTTGGTT 丁GTCAGGATA TTATGTTATT GITUVTGAAAT 600 GTTAGTGAAT TATTTTTATT AATXTGAAAG GAAACAAAAT GAAAATAAAA AAACGTTACA 660 TTGCGCTGTT GGTCTTAGGT GTCGTTATCA GCTATGCCTG GTATCAAAAT TATCAATGGG 720 AACAGCTGAT GTTAAGCGGT TATTGTGAAA AGGACGGAAG TTATTTTGAT GATAGGCATA 780 CGAAGCAAGA ACTGATTGAT AGGGCAATTA ACTATATGCT GGAGCATCAA TCTAAAAAAA 840 CATACGATGC TTATACTGAT GAACCTTTAG AAATAAAACC ATATTTAACA ATAGAGGAAT 900 TTAAAAAACT CAATCCAAAT TGTTGTGAAA TTACCTCATG GCCAGCAGAT GCAGTTCCAC 96 0 AAGATTGGGA TGTTCGTGTG GAAGGTAAGG CATATAGGTA TGTAATCGTA AAATATTTAA 1020 GAACCTTAGC AAATAGAGAA' CCTGAACGAT GGGAAACTAG TATT^TTTTT GATAATTGCG 1080 GCAATCCTAA AAGAGCAAGC TACTTATATT ATTTAAAGAG AGAAATTTAT TATGACAAAA 1140 TTAACTATGC AAGATGTGAC CAATTTATAT TTATATAAAA CGAAAACTCT ACCTAAAGAT 1200 AGATTGGATG ATTCACTTAT TTCTGAAATA GGAAAAGGAG ATGATGATAT TGATAGAAAA 1260 GAATTTATGG TGGGGCCGGG ACGTTTTGTG ACCGCTGATA ACTTTAGCGT TGTAAGAGAT 1320 TTTTTTAATG CTGGGAAATC ACGCATTATT GCGCCGCAAG TCCCGCCTAT TCGTTCACAG 13 8 0 CAGGAAAAAft. TCTTGGTCGG ΊΊΤΑΛΑΛΟΟσ GGCAAATATT CCAAAGCGCA GATATTGGAA 1440 ATGCTGGGirr ATACGAAAGG CGGAGAAGTG GTAAATGGCA TGTTTGCCGG TGAAGTCCAG 15 0 0 ACATTAGGCT TTTATGACGA TGGCAAAGGG GATTTACTCG AACGCGCCTA TATCTGGAAT 1560 ACCACAGGAT TTAA.^ ATG AGC GAC AAT GCC TTT TTT GTT ATA GAA GAA TCA 1611

Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val He Glu Glu Ser 1 5 10 GGC AAA CGC TAT ATT GAA AAC TTT GGT ATT GAA CCT CTT GGT AAG CAA 165 9

Gly Lys Arg Tyr lie Glu Asn Phe Gly lie Glu Pro Leu Gly Lys Gin 15 20 25 GAA GAT TTT GAT TTT GTC GGC GGC TTT TGG TCT AAC TTA GTG AAT CGT 17 07

Glu Asp Phe Asp Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg 30 35 40 GGT TTG GAA AGT ATT ATC GAC CCA TCC GGT ATC GGT GGA ACG GTA AAC 17 55

Gly Leu Giu Ser lie lie Asp Pro Ser Gly lie Gly Gly Thr Val Asn 45 50 55 60 CTT AAC TTT ACC GGC GAG GTG GAA ACC TAC ACG TTA GAC GAA ACA AGG 1803

Leu Asn Phe Thr Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thr Arg €5 70 75 TTT AAA GCG GAA GCG GCG AAG AAA AGC CAT TGG AGT TTA GTG AAT GCG 1851

Phe Lys Ala Glu Ala Ala Lys Lys Ser His Trp Ser Leu Val Asn Ala 80 85 90 GCG AAA GTA TAC GGC GGT TTA GAC CAA ATT ATT ΑΑΛ AAA CTA TGG GAC 1699

Ala Lys Val Tyr Gly Gly Leu Asp Gin He lie Lys Lys Leu Trp Asp 95 100 105 (37) 1241407 AGT GGC TCA ATT AAG CA丁丁丁A TAT. CAA GAT AAA GAT ACG GGC AAA ΊΤΑ 194 7

Ser Gly Ser lie Lys His Leu Tyr Gin Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu 110 115 120 AAA CCG ATT ATT TAC GGC ACG GCC GGC AAC GAC AGT AAG ATT GAA GGC 19 95

Lys Pro lie lie Tyr Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys lie Glu Gly 125 130 135 140 ACT AAA ATC ACC CGT AGG ATT GCG GGT AAA GAA GTT ACG CTT GAT ATT 2 04 3

Thr Lys lie Thr Arg Arg He Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp lie 145 150 155 GCC AAT CAG AAA ATT GAA AAA GGC GTG TTA GAG AAA TTG GGG CTG TCT 2091

Ala Asn Gin Lys lie Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser 160 165 170 GTT AGT GGT TCG GAT ATC ATT AAA TTG TTG TTT GGA GCA TTG ACT CCA 2139

Val Ser Gly Ser Asp lie lie Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro 175 160 185 ACT TTA AAT AGA ATG TTG CTA TCA CAA CTT ATC CAG TCT TTT TCC GAT 218 7

Thr Leu Asn Arg Met Leu Leu Ser Gin Leu lie Gin Ser Phe Ser Asp 190 195 200

AGC TTG GCT AAA CTT GAT AAT CCC TTA GCC CCT TAC ACT AAT GGC 2235

Ser Le'u Ala Lys Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyi: Thr Lys Ajsn Gly 205 ·· 210 215 220 GTG GTT TAT GTC ACC GGC AAA GGG AAT GAT GTG CTT AAA GGA ACT GAA 2283

Val Val Tyr Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu ^ 225 230 235 CAT GAG GAT TTG TTT CTC GGT GGT GAG GGG AAT GAT ACT TAT TAT GCG 2331

His Glu Asp Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thx Tyr Tyr Ala 240 245 250 AGA GTA GGC GAT ACA ATT GAA GAC GCC GAC GGC AAA GGT GTC TAT 2379

Arg Val Gly Asp Thr lie Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr 255 260 265 TTT GTG AGA GAA AAA GGG GTA CCT AAG GCG GAT CCT AAG CGG dTA GAG 242 7

Phe Val Arg Glu Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu 270 275 280 TTT AGC GAG TAC ATA ACG AAA GAA GAA ATA AAA GAG GTT GAA AAG GGG 2475

Phe Ser Glu Tyr lie Thr Lys Glu Glu He Lys Glu Val Glu Lys Gly 285 290 295 300

TT'A TTA ACT TAC GCA GTT TTA GAA AAT TAT AAT TGG GAA GAG ΑΑΛ ACG 2523

Leu Leu Thr Ίγτ Ala Val Leu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr 305 310 315 · GCG ACT TTC GCT CAT GCG ACT ATG CTT AAT GAG CTT TTT ACT GAT TAT 2 571

Ala 丁hr Phe Ala His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr 320 325 330 ACT AAT TAT CGT TAT GAA GTT AAA GGA CTA AAA TTG CCC GCC GTT AAA 2619

Thr Asn Tyr Arg Tyr Glu Val Lys 'Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys 335 340 345 AAG 丁丁A ΑΑΛ AGT CCG TTG GTG GAG TT丁 ACA GCT GAT TTA TTA ACT GTT 2667

Lys Leu Lys Ser Pro Leu Val Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val 350 355 360 ACG CCT ATT GAC GAA AAC GGA AAA GCA CTT AGC GAA AAA AGT ATT ACG 2715

Thr Pro lie Asp Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Glu Lys Ser lie Thr 365 370 375 380 - 41 - 1241407 (38) GTT AAA AAT TTT AAA AAT GGT GAT TTA GGA ATA AGG TTG TTG GAT CCT Val Lys Asn Phe Lys Asn Gly Ajsp Leu Gly lie Arg Leu Leu Asp Pro 2763

385 350 AAT AGC TAT TAT TAT TTC CTT GAA GGC CAA GAT ACG GG丁 Asn Ser Tyr Tyr Tyr Phe Leu Glu Gly Gin Asp Thr Gly 400 405 CCT GCT TTT TAT ATT GAA CGA AAA AAC GGT GGC GGC GCT

395 TTT TAT GGT Phe Tyr Gly 410 AAA AAT AAC 2811

Pro Ala Phe Tyr lie Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ala Lys Asn Asn 2859

415 420 425 TCG TCG GGA GCA GGA AAT AGC AAA GAT TGG GGC GGG AAC GGG CAT GGA 2907

Ser Ser Gly Ala Gly Asn Ser Lys Asp Trp Gly Gly Asn Gly His Gly 430 435 440 AAT CAC CGA AAT AAT GCC TCC GAC CTG AAT AAA CCG GAC GGA AAT AAT Asn His Arg Asn Asn Ala Ser Asp Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Asn 445 450 455 460 GGG AAT AAC CAA. AAT AAC GGA AGC AAT CAA GAT AAT CAT AGC GAT GTG Gly Asn Asn Gin Asn Asn Gly Ser Asn Gin Asp Asn His Ser Asp Val 465 470 475 AAT GCG CCA AAT AAC CCG GGA CGT AAC TAT GAT ATT TAC GAT CCT TTA Asn Ala Pro Asn Asn Pro Gly Arg Asn Tyx Asp lie Tyr Asp Pro Lreu " 480 485 490 GCT TTA GAT TTA GAT GGA GAT GGG CTT GAA ACC GTG TCG ATG AAC GGG Ala Lreu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Lieu Glu Thr Val Ser Met Asn Gly 495 500 505 CGA CAA GGC GCG TTA TTC GAT CAT GAA G<3A AAA GGT ATT CGT ACC GCA Arg Gin Gly Ala Leu Phe Asp His Glu Gly Lys Gly He Arg Thr Ala 510 515 520 ACG GGC TGG CTC GCT GCG GAT GAC GGT TTT TTA GTG TTA GAT CGT AAC Thr Gly Trp Leu Ala Ala Asp Asp Gly Phe Leu Val Leu Asp Arg Asn 525 530 535 540 CAA GAC GGC ATT ATT AAT GAT ATA AGC GAG TTA TTT AGT AAT AAA AAT Gin A^p Gly lie lie Asn Asp lie Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn 545 550 555 CAA CTT TCC GAC GGC AGT ATT TCT GCA CAC GGT ΊΤΤ GCG ACA TTA GCC Gin Leu Ser Asp Gly Ser He Ser Ala His Gly Phe Ala Thr Leu Ala 560 565 570· GAT TTG GAT ACA AAC CAA GAT CAG CGT ATC GAC CAA AAT GAT AAG CTG Asp Leu Asp Thr Asn Gin Asp Gin Arg lie Gin Asn Asp Lys Leu 575 580 585 TTT TCT AAA CTC CAA ATT TGG CGG GAT TTA AAT CAA AAC GGT TTT. AGT Phe Ser Lys Leu Gin lie Trp Arg Asp Leu Asn Gin Asn Gly Phe Ser 590 595 600 GAA GCG AAT GAG CTG TTT AGC TTA GAA AGT TTG AAT ATT AAA TCT TTA Glu Ala Asn Glu Leu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Asn lie Lys Ser Leu 605 610 615 620 CAT ACC GCC TAT GAA GAG CGT AAT GAT TTT CTA GCG GGC AAT AAT ATC His Thr Ala lyr Glu Glu Arg Asn Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn He 625 630 " 635 CTT GCT CAG CTT GGG AAG TAT GAA AAA ACG GAC GGT ACT TTT GCA CAA Leu Ala Gin Leu Gly Lys Tyr Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Ala Gin 640 645 650 2955 3003 3051 3099 3147 3195 3243 3291 33 3 9 3387 3435 3483 3531

-42- 1241407 (39) ATG GGC GAT TTA AAT TTC AGT TTT AAC CCG TTT TAT AGC CGA TTT ACC 3579

Met Gly Asp Leu Asn Phe Ser Phe .Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr 655 660 665 GAA GCG TTA AAT TTA ACC GAG CAA CAA CGT CGC ACA ATT AAT CTA ACC 3627

Glu Ala Leu Asn Leu Thr Glu Gin Gin Arg Arg Thr lie Asn Leu Thr 670 675 680 GGC ACC GGT CGG G丁丁 CGG GA丁丁丁G CGT GAA GCC GCC GCA CTT TCT GAG 3 67 5

Gly Thr Gly Arg Val Arg Asp Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu 685 690 695 7 00 ' GAG TTG GCT GCT TTA TTA CAA CAG TAC ACT AAG GCC TCC GAT TTT CAG 3723

Glu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Gin Tyr Thr Lye Ala Ser Asp Phe Gin 705 710· 715 GCA CAA CGA GAA TTA TTG CCT GCC ATT TTA GAT AAA TGG GCG GCA ACG 3771

Ala Gin Arg Glu Leu Leu Pro Ala lie Leu Asp Lys Trp Ala Ala Thr 720 725 730 GAT TTA CAG TAT CAA CAT TAT GAT AAA ACA TTA CTT AAA ACG GTA GAA 3 819

Asp Leu Gin Tyr Gin His Tyr Asp Lys Thr Ireu Leu Lys Thr Val Glu 735 740 74S AGT ACC GAT AGT AGT GCT TCT GTC QTT AGA GTC ACG CCT TCT CAA ΤΤΛ 3 867

Ser Thx Asp Ser Ser Ala Ser Val Val Arg Val Thr Pro Ser Gin Leu 750" 755 760 AGT AGT ATA CG-C AAT GCA AAG CAT GAT CCT ACC GTT ATG CAA AAC TTT 3915

Ser Ser lie Arg Asn AJLa Lys His Asp Pro Thr Val Met Gin Asn Phe 765 770 775 780 GAA CAG AGT AAG GCA AAA ATT GCG ACT TTA ΛΑΤ TCG CTC TAC GGG TTA 3963

Glu Gin Ser Lys Ala Lys lie Ala Thr Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Leu 785 ISO 795 AAT ATC GAT CAA CTT TAT TAC ACG ACG GAT AAA GAC ΆΤΓ CGC TAT ATT 4011

Asn lie Asp Gin Leu Tyr Tyr Thr Thr Asp Lys Asp lie Arg Tyr lie 800 805 810 ACT GAT AAA GTG AAT AAT ATG TAT CAA ACA ACC GTA GAA CTT GCC TAC 4 059

Thr Asp Lys Val Asn Asn Met Tyr Gin Thr Thr Val Glu Leu Ala Tyr 815 820 825 CGT TCT TTA CTT TTA CAA ACG CGT TTG AAG AAA TAT GTT TAT AGC GTT 4107

Arg Ser Leu Leu Leu Gin Thr Arg Leu Lys Lys Tyr Val Tyr Ser Val

Θ30 835 840 AAT GCG AAA CAA TTC GAA GGG AAA TGG GTA ACC GAT TAT TCT CGT ACT 4155

Asn Ala Lys Gin Phe Glu Gly Lys Trp Val Thr Asp Tyr Ser Arg Thr 845 850 855 860 GAA GCC TTA TTT AAC TCT ACT TTT AAA CAA TCG CCT GAA AAT GCA TTA 4203

Glu Ala Leu Phe Asn Ser Thr Phe Lys Gin Ser Pro Glu Asn Ala Leu 865 870 875 TAT GAT TTA AGC GAA TAC CTT TCT TTC TTT AAC GAT CCT ACG GAA TGG 4 2 51 lyr Asp Leu Ser Glu Tyr Leu Ser Phe Phe Asn Asp Pro Thr Glu Trp 880 B85 890 AAA GAA GGG CTA TTA CTG TTA AGC CGT TAT ATA GAT TAT GCT AAA GCA 4299

Lys Glu Gly Leu Leu Leu Leu Ser Arg Tyr He Asp Tyr Ala Lys Ala 835 900 505 CAA GGA TTT TAT GAA AAC TGG GCG GCT ACT TCT AAC TTA ACT ATT GCC 4 34 7

Gin Gly Phe Tyr Glu Asn Trp Ala Ala Thr Ser Asn Leu Thr lie Ala 910 515 920 -43- 1241407(40) CG丁丁丁A AGA GAG Arg Leu Arg Glu 925 GGC GAT GAA AAA Gly Asp Glu Lys

ΊΤΑ TCG GGT AGT Leu Ser Gly Ser 560 GAT ACG TTA AAA GCT GGA GTA ATT Ala Gly Val lie 930 AAT AAT A丁丁*TTG Asn Asn lie Leu 945 GCA GGT GAT GAT Ala Gly Asp Asp

GGC AGC TAC GGT

丁丁丁 GCA GAA TCG Phe Ala Glu Ser 935 TTA GGT AGC CAA Leu Gly Ser Gin 950 CTA CTT ATC GGC Leu Leu lie Gly 365 GCA GAC ACC TAT

ACG GAT 丁丁A AAA Thr Asp Leu Lys 940 AAA GAT AAT AAC Lys Asp Asn Asn 355 GGA GAG GGT AAT Gly Glu Gly Asn 97 0 ATC TTT AGC AAA 4395 4443 4491 4539

Asp Thr Leu Lys Gly Ser Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys 975 980 985 GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC CGC Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Ajsn Asn Asp Asn Arg 990 995 1000 GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACC GAT GTG AAT TAT GCG GAA 4587

Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu 1005 1010 1015 1020 4635 GTG AAG TTT CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT CAT Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr His " 1025 1030 1035 GAT ACG GAT TCG GTC ACG GTA AAA TCC TTC TAC AGC CAT GTA GAT TAT Asp Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His Val Asp Tyr 1040 104S 1050 CAA TTT GAC AAA TTG GAG TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGC GAT GAA Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser He Thr Arg Asp Glu 1055 1060 1065 CTG ATT AAA GCA GGG CTT CAT CTA TAC GGC ACC GAT GGC AAT GAT GAT Leu lie Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp 1070 1075 1080 ATA AAG GAT CAT GCG GAT TGG GAC AGC ATT TTG GAA GGC GGC AAA GGC lie Lys Asp His Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly Gly Lys Gly 1085 1090 10S5 1100 AAC GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC TTT AGC Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser 1105 1110 1115 AAA GGA CaC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC Lys Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn 1120 1125 1130 CGC GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT GTG AAT TAT GCG Axg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala 1135 1140 1145 4683 4 731 4779 4827 4875 4923 4971 5019 GAA GTG AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT Glu Val Lys Phe Arg Arg Vai Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr 1150 1155 1160 CAT GAT ACG GAT TCG GTC ACG AT，AAA TCC TTC TAC AAC CAT G丁A GAT His Asp Thr Asp Ser Val Thr lie Lys Ser Phe T>^r Asn His Val Asp 1165 1170 1175 1180 TAT CAA TTT GAC AAA TTG GAA TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGT GAT Tyr Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp 1185 11S0 1195 5067 5115 5163 - 44- 1241407 (41)

GAA CTA GGT AAA CAA GGT ATG GCA 丁丁A 丁丁丁 G<5C ACT GAC GGT GAT GAT

Glu Leu Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp 1200 1205 1210

AAT AT.C AAC GAC TGG GGA CGT AAC TCG GTG A丁丁 GAT GCC. GGT GCG GGT

Asn lie Ajsn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val He Asp Ala Gly Ala Gly 1215 1220 1225

AAT. GAT ACG GTT AA丁 GGC GGT AAT GGC GAT GAC ACC CTC ATC GGC GGC

Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu lie Gly Gly 1230 1235 1240 AAA GGT AAT GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC Lys Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie 1245 1250 1255 1260 TTT AGC AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT Phe Ser Lys Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyx Glu Asp Thr Asn Asn 1265 1270 1275 GAT AAC CGC GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACC GAT GTG AAT A^p Asn Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn 1280 1285 1290 TAT GCG GAA GTG AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAG TTA ATG TTA TTC Tyr Ala Glu Val Lys Phe Arg Arg Val A^p Asn Asp Leu Met Leu Phe 1295 1300 1305 GGT TAT CAT GAT ACG GAT TCG GTC ACG GTA AAA TCC TTC TAC AGC CAT Gly Tyr His Asp Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His 1310 1315 1320' GTA GAT TAT CAA TTT GAC AAA TTG GAG TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT Val Asp Tyr Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Ajsp Arg Ser lie Thr 1325 1330 1335 1340 CGC GAT GAA CTG ATT AAA GCA GGG CTT CAT CTA TAC GGC ACC GAT GGC Arg Asp Glu Leu lie Lys Ala Gly Leu His Leu Tyx Gly Thr Asp Gly 1345 1350 1355 AAT GAT GAT ATA AAG GAT CAT GCG GAT TGG GAC AGC ATT TTG GAA GGC Asn Asp Asp lie Lys Asp His Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly 1360 1365 1370 GGC ΑΑΛ GGC AAC GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT Gly Lys Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr 1375 1380 1385 ATC TTT AGC AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT lie Phe Ser Lys Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn 1390 1395 1400 AAT GAT AAC CGA GCA AGA GAT ATC GAC ACC ΤΤΛ AAA TTT ACT GAT GTG Asn Asp Asn Axg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val 1405 1410 1415 1420 AAT TAT GCG GAA GTG AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG · TTA Asn Tyr Ala Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu 1425 1430 1435 TTC GGT TAT CAT GAT ACG GAT TCG GTC ACG ATA AAA TCC TTC TAC AAC Phe Gly Tyr His Asp Thr Asp Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyr Asn 1440 1445 1450 CAT GTA GAT TAT CAA TTT GAC AAA TTG GAA TTT GCT GAC CGC AG丁 ATA His Val Asp Tyr Gin Phe Asp Lys' Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie '1455 1460 1465 5211 5259 5307 5355 5403 5451 5499 554 7 5595 5643 5691 5739 578 7 5835 5883 5931 5979 -45 1241407 (42) ACT CGT GAT GAA CTA GG丁 AAA CAA GGT ATG GCA TTA ΓΓΓ GGC ACT GAC 602 7

Thr Arg Asp Glu Leu Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp 1470 1475 1480 GGT GAT GAT AAT ATC AAC GAC TGG GGA CGT AAC TCG GTG ATT GAT GCC 6075

Gly Asp Asp Asn lie Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala 1485 1490 1495 1500 GGT GCG GGT AAT GAT ACG GTT AAT GGC GGT AAT GGC GAT GAC ACC CTC 6123

Gly Ala Gly Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu 1505 1510 1515 ATC GGC GGC AAA GGT AAT GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC 6171 lie Gly Gly Lys Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp 1520 1525 1530 ACC TAT ATC TTT AGC AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT 6219

Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly His Gly Gin Asp He Val Tyr Glu Asp 1535 1540 1545 ACC AAT AAT GAT AAC CGC GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT 6267

Thx Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr 155.0 1555 1560 GAT ATT AAT TTA TCC GAA CTT TGG TTT AGC CGA GAA AAT AAC GAT TTG 6315

Ajgp IΙέΓ Asn Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn A«sn Asp Leu 1565 1570 157S · 1S80 ATT ATT AAA TCA TTA. TTA AGT GAG GAT AAA GTC ACG GTT CAA AAT TGG 6363 lie lie Lys Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gin Asn Trp 1585 15.9 0 1595' • TAT TCA CAC CAA GAT CAT AAA ATA GAA AAT ATT CGT TTA TCG AAT GAG · 6411

Tyr Ser His Gin Ajsp His Lys He Glu Asn lie Axg Leu Ser Asn Glu 1600 1605 1610 CAA ACG TTG GTG AGC ACT CAG GTG GAG AAG ATG GTT GAG TCX3 ATG GCC 6459

Gin Thr Leu Val Ser Thr Gin Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala 1615 1620 1625 GGC TTT GCT CAG AAG CAC GGA GGA GAG ATA TCT CTT GTG TCG CTT GAA 6507

Gly Phe Ala Gin Lys His Gly Gly Glu He Ser Leu Val Ser Leu Glu 1630 1635 1640 GAG GTA AAA CAA TAT ATC AAT AGC TTA ACA GCT GCT TTA TAA 6549

Glu Val Lys Gin Tyr lie Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu ★ 1645 1650 1655 CATACGAAAG AAATCGGCAC AGTTTTTTTG AACTGTGCCG ATTTGATTTT AGTGTAAGAA 6609 TATAGCCTGA TTTTAAGAAA TTTACTCTTG GCTAATAACT ATTTCCCATT TTATAACTTA 6669 TTGACGGATG GTTTTATCAA ATATGAGATC AAATCTTATT TTAAATTCGC TTTCCATTAA 6729 GCGATAT 6736 -46- 1241407 (43) (2 ) S E Q ID Ν Ο : 2 的資料 (I )序列特徵 (A )長度：1 6 5 8個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (II )分子種類：蛋白質 (XI)序歹描述：SEQIDNO: 2:

-47 - 1241407 (44)

Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val lie Glu Glu Ser Gly Lys Arg Tyr 1 5 10 15 lie Glu Asn Phe Gly lie Glu Pro Leu Gly Lys Gin Glu Asp Phe A9p 20 25 30

Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg Gly Leu Glu Ser 35 40 45

He lie Asp Pro Ser Gly lie Gly Gly Thr Val Asn Leu Asn Phe Thr 50 55 60

Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thr Arg Phe Lys Ala Glu 65 Ί0 75 80

Ala Ala Lys Lys Ser His Trp Ser Leu Val Αβη Ala Ala Lys Val Tyr ** 85 90 95

Gly Gly Leu Asp Gin lie lie Lys Lys Leu Trp Asp Ser Gly Ser lie 100 105 110

Lys His Leu Tyr Gin Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu Lys Pro lie lie 115 120 125

Tyx Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys lie Glu Gly Thr Lys lie Thr 130 135 140

Arq Arg lie Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp lie Ala Asn Gin Lys 145 150 155 160 lie Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser Val Ser Gly Ser

165 170 17S

Asp lie lie Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro Thr Leu Asn Axg 180 185 190

Met Leu Leu Ser Gin Leu lie Gin Ser Phe Ser Asp' Ser Leu Ala Lys 195 200 205

Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly Val Val Tyr Val 210 215 220

Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu His Glu Asp Leu 225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala Arg Val Gly Asp 245 250 255

Thr lie Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr Phe Val Arg Glu 260 265 270

Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu Phe Ser Glu Tyr 275 280 285

He Thr Lys Glu Glu lie Lys Glu Val Glu Lys Gly Leu Leu Thr Tyr 290 295 300

Ala Val Leu Glu Asn Tyx Asn Trp Glu Glu Lys Thr Ala Thr Phe Ala 305 310 315 320 -48 - 1241407 (45)

His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr Thr Asn Tyr Arg 325 330 335

Tyr Glu Val Lys 340 Pro Leu Val Gl-u 355

Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys Lys Leu Lys Ser 345 350 Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val Thr Pro lie Asp 360 365

Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Glu Lys Ser lie Thr Val Lys Asn Phe 370 375 380

Lys Asn Gly A^p Leu Gly lie Arg Leu Leu Asp Pro Asn Ser Tyr Tyr 385 390 395 400

Tyr Phe Leu Glu Gly Gin Asp Thr Gly Phe Tyx Gly Pro Ala Phe Tyr 405 410 415 lie Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ala Lys PlBTi Asn Ser Ser Gly Ala 420 425 430

Gly Asn Ser Lys Asp Trp Gly Gly Asn Gly Hie Gly Asn His Arg Asn 435 440 445

Ajbh Ala Ser Asp Leu Asn Lvs Pro Asp Gly Asn Aon Gly Asn Asn Gin 450- 455 460

Asn Asn Gly Ser Asn Gin Asp Asn 465 470 Asn Pro Gly Arg Asn Tyr Asp lie 485 Asp Gly Asp Gly Ireu Glu Thx Val • 500 Leu Phe Asp His Glu Gly Lys Gly 515 520 Ala Ala Asp Asp Gly Phe Leu Val 530 535

His Ser Asp Val Asn Ala Pro Asn 475 480 Tyr Asp Pro Leu Ala Leu Asp beu 490 4S5 Ser Met Asn Gly Arg Glrx Gly Ala 505 510 lie Arg Thr Ala Thr Gly Trp I^u 525 Leu Asp Arg Asn Gin Asp Gly lie 540

He Asn Asp lie Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn Gin Leu Ser Asp 545 550 555 560

Gly Ser lie Ser Ala His Gly Phe Ala Thr Leu Ala Asp Leu Asp Thr 565 570 575

Asn Gin Asp Gin Arg lie Asp Gin Asn Asjp Lys Leu Phe Ser Lys Leu 580 58S 590

Gin lie Trp Arg Asp Leu Asn Gin Asn Gly Phe Ser Glu Ala Asn Glu 595 600 605 beu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Asn lie Lys Ser Leu His Thr Ala Tyr 610 615 620

Glu Glu Arg Asn Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn He Leu Ala Gin Leu 625 630 635 640

Gly Lys Tyr Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Ala Gin Met Gly Asp Leu 645 650 655

Asn Phe Ser Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr Glu Ala Leu Asn 660 665 670

Leu Thr Glu Gin Gin Arg Arg Thr lie Asn Leii 丁hr Gly Thr Gly Arg 675 680 685 49- (46)1241407

Val Arg Asp 690 Leu Leu Gin 705 Leu Leu Pro

Gin His Tyr

Ser Ala Ser 755 Asn Ala Lys 77 0 Ala Lys lie 785 Leu Tyr Tyr

Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Ala Ala 695 700 Gin Tyr Thr Lys Ala Ser Asp Phe Gin Ala Gin Arg Glu 710 715 720 Ala lie Leu Asp Lys Trp Ala Ala Thr Asp Leu Gin Tyr 725 730 Ί35 Asp Lys Thr Leu Leu Lys Thr Val Glu Ser Thr Asp Ser 740 745 750 Val Val Arg Val Thr Pro Ser Gin Leu Ser Ser lie Axg 760 765 His Asp Pro Thr Val Met Gin Asn Phe Glu Gin Ser Lys 775 7Θ0

Ala Thr Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn lie Asp Gin 790 795 800 Thr Thr Asp Lys Asp lie Arg Tyr lie Thr Asp Lye Val 805 810

Asn Asn Met

Tyr Gin Thr Thr Val Glu Leu Ala 820 825 815 Arg Ser Leu Leu 830

Leu Gin Thr 835 Phe Glu Gly ， 850 Asn Ser Thx 865 Glu Tyr Leu

Arg Lreu Lys Lys Tyr Val 840

Ser Val Asn Ala Lys Gin 845

Lys Trp Val Thr Asp Tyr Ser Arg Thr Glu Ala Leu Phe 855 860 Phe Lys Gin Ser Pro Glu Asn Ala Leu Tyr Asp Leu Ser 870 875 880

Leu Leu Leu

Glu Asn Trp 915 Ala Gly Val 93 0 Asn Asn lie 945 Ala Gly Asp

Ser Phe Phe Asn Asp Pro Thr Glu Trp Lys Glu Gly Leu 885 890 895 Ser Arg Tyr lie Asp Tyr Ala Lys Ala Gin Gly Phe Tyr S00 905 910 Ala Ala Thr Ser Asn Leu Thr lie Ala Arg Leu Arg Glu 920 925 lie Phe Ala Glu Ser Thr Asp Leu Lys Gly Asp Glu Lys 935 940 Leu Leu Gly Ser Gin Lys Asp Asn Asn Leu Ser Gly Ser 950 955 960

Asp Leu Leu lie Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Leu Lys 965 910 975

Gly Ser Tyr

Gly Ala Asp Thr 980 lie Phe Ser Lys Gly His Gly Gin 985 590

Asp lie Val 995 Asp Thr Leu 1010 Arg Val Asp 1025 i Val Thr Val

Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg Asp lie -1000 1005 Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val Lys Phe Arg 1015 1020 Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr His Asp Thr Asp Ser 1030· 1035 1040

Lys Ser Phe Tyr Ser His Val Asp Tyr Gin Phe Asp Lys 1045 1050 1055 -50- 1241407 (47)

Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arq Asp Glu Leu lie Lys Ala 1060 1065 1070

Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp lie Lys Asp His 1075 1080 1085

Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp lie Leu 1090 1095 1100

Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly His Gly 1105 1110 1115 1120

Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg Ajep 1125 1130 1135 lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val Lys Phe 1140 1145 1150

His Asp Thr Asp 1165

Axg Axg Val Asp Ajbh Asp Leu Met Leu Phe Gly 1155 1160

Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyr Asn His Val Asp Tyr Gin Phe Asp 1170 1175 1180

Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu Gly Lys 1185 ·· 1190 1195 ' 1200

Gin Gly Met Ala Deu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp Asn lie Ajsh Asp 1205 1210 1215

Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala Gly Ala Gly Asn Asp Thx Val " 1220 1225 1230

Asn Gly Gly AjBn Gly Asp Asp Thr Leu lie Gly Gly Lys Gly Asn Asp 1235 1240 1245

Gly Ala Asp Thr 1255 lie Leu Arg Gly Gly 1250 lie Phe Ser Lys Gly 1260

His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Aia 12β5 1270 1275 · 12B0

Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyx Ala Glu Val 1285 1290 1295

Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr His Asp 1300 1305 1310

Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyx Ser Kis Val Asp Tyx Gin 1315 1320 1325

Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu 1330 1335 1340 lie Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp lie 1345 1350 1355 1360

Lys Asp His Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asn 1365 1370 1375

Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys 1380 1385 1390

Gly His Gly Gin Asp He Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg 1395 1400 1405

Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu 1410 1415 1420 1241407 (48)

Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr His 1425 1430 1435 1440

Asp Thr Asp Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyr Asn His Val Asp Tyr 1445 1450 1455

Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu 1460 1465 1470

Leu Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Ajsp Asn 1475 1480 1485 lie Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala Gly Ala Gly Asn 1490 1495 1500

Asp Thr Val Ajsn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu lie Gly Gly Lys 1505 1510 1515 .1520

Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe 1525 1530 1535

Ser Lys Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp 1540 1545 1550

Asn Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp lie Asn Leu 1555 1560 1565

Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn Asp Leu He lie Lys Ser 1S10 1575 1580

Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gin Asn Trp Tyr Ser His Gin 1S85 1590 . 1595 1600

Asp Kis Lys lie Glu Asn lie Arg Leu Ser Asn Glu Gin Thx Leu Val 1605 1610 1615

Ser Thr Gin Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala Gly Phe Ala Gin 1620 1625 1630

Lys His Gly Gly Glu. lie Ser Leu Val Ser Leu Glu Glu Val Lys Gin 1635 1640 1645

Tyr lie Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu 1650 1655 (2 ) S E Q ID N 0 ·· 3 的資料 (I )序列特徵： (A)長度：7004驗基材 (B )種類··核酸 (C )股··雙股 (D)拓蹼學：直線 (Π )分子種類·· DNA (基因組） (III)假說··無 -52- (49)1241407 (IV )抗意識鏈：無 (VI )起始來源： (A )有機體：胸膜肺炎放射菌 (B )菌株：Η V ] 1 4 (血淸型第3型領域菌株） (VII )直接來源： (Β )菌落：pROK5 (IX )特色：

(A )名稱/關鍵：CDS (B )位置：1 5 6 6..5 7 1 4 (D )其他資料：/密碼—起始二1 5 6 6 /功能=RTX—毒素" / 產物='' A p XIV — V A R 3 " / 基因=vv ApxIV- VAR3 " /數目二1 (XI)序列描述：SEQIDNO: 3

-53 - (50) 1241407 (50)

ATCGATATGC CGCCGGGTAC GGGCGATATC CAACTTACTC TTTCGCAACA AATTCCGGTT 60 ACCGGTGCGG TAGTGGTAAC TACTCCGCAA GATATTGCGT TATTAGATGC GGTGAAAGGT 120 ATTTCAATGT 丁CCAAAAAGT GTCGGTACCG GTCTTAGGTA TCATTGAAAA TATGAGCGTG 180 CATATCTGCC AAAATTGCGG TCACCACGAA GATATTTTCG GCACCGGCGG TGCGGAGAAA 240 GTGGCGAAGA AATACGGTAC TAAAGTATTA GGACAAATGC CGTTGCATAT TCGCTTACX5T 300 CAAGATTTGG ATGCCGGCAC ACCGACCGTC GTTGCGGCAC CGGAACACGA CACCAGCAGA 360 GCCTATATTG AATTAGCGGC AAAAGTCGCT TCGGAATTAT ACTGGCAAGG 丁丁CGGTTATC 420 CCGTCTGAAA TTATGATTCG TGAAGTAAAA TAAGCCTACA TAACCACGGA ATACCAGATA 480 ACACAGAAGG AAAACAAGCG GTAGAATTTG CAGAAAAAGT TGCAAATTCT ACCGCTTTTT 540 TATTAGTACG ATTCGCTGTT GGACTGCCAT TTGATTTGGT TTGTCAGGAT ATTATGTTAT 600 TGTAATGAAA TGTTAGTGAA TTATTTTTAT TAATTTGAAA GGAGACAAAA TGAAAATAAA 660 AAAACGTTAC ATTGCGCTGC TAGCTTTAGG CAGTGTTATT GGCTATGCCT GGTATCAAAA ' 720 TTATCAATGG GAACAGTT<3A 丁GTTAAGTGG CTATTGTGAA AAGGACGGAA GCTATTGTGA 780 TGATAGGCAT ACGAAGCAGG AACTGATTGA TAGGGCAATT AACTATGTGC TGGAAAATCA 840 AATTCAACAG ACA’TATGAAG GTGATGACCT TGTGGATATA AAACAATATT CAACAATAGA 900 GGAATTTAAA AAACTAAATC CGAATTGTTG TAAGGTAGAT TCTTGGCCGG ATGATGCTGT 960 TCGTGAGGAT GCTGATTTAC AGCGAGAGGG CAWVGCGTAT AAATACGTAA AAGTCAAATA 1020 TTTAAGAACC TATTTAGCG^ ATAGAGAACC TGAACAATGG GAAAATTACA TAGTATTTGA 1080

-54 - 1241407 (51) TAATTGCAGT GGAA丁丁AAAG AAAGACACCA AC丁GTATTAA AAATAGA丁丁A GATGGAGACA 1140 ACACGATGAC AAAACTAACT ATCCAAGATG TGACTAATTT ATATTTATAT AAGCAAAGAA 1200 CTTTACCTAC GGA丁AGGTTA GA丁GATTCGC TTATTAGCAA AACAGGAAAA GGGGAAAATA 1260 TTGATAAAAA GGAATTTATG GCGGGGCCGG GACGTTTTGT GACGGCCGAT AATTTTAGTG 1320 TTGTAAAAO^ CmTTTACT GCAAAGGATT CA丁丁AATAAA CCTAAGCTTG CAG^CTCGTA . 1360 TATTAGCGAA TTTAAAGCCG GGCAAATATT CCAAAGCGCA GATATTAGAA ATGTTGGGCT 1440 ATACGAAAAA TGGAGAAAAG GTAGATGGCA TGTTTACCGG TGAAGTCCAG ACATTAGGCT 1500 TTTATGACGA TGGCAAAGGG GATTTACTCG AACGCGCCTA TATCTGAAAT ACCACAGGAT 1560 TT；VAA ATG AGC GAC AAT GCC TTT TTT GTT ATA GAA GAA TCA GGC AAA 1607

Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val lie Glu Glu Ser Gly Lys 1660 1665 1670 CGC TAT ATT GAA AAC TTT GGT ATT GAA CCT CTT GGT AAG CAA GAA GAT 1655

Arg IVr lie Glu Asn Phe Gly He Glu Pro Leu Gly Lys Gin Glu Asp 1675 1680 1685 TTT GAT TTT GTC GGC GGC TTT TGG TCT AAC TTA GTG AAT CGT GGT TTG 1703

Phe Asp' Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg Gly Leu 1690 1695 1700 GAA AGT ATT ATC GAC CCA TCC GGT ATC GGT GGA ACG GTA AAC CTT AAC 1751

Glu Ser He lie Asp Pro Ser Gly lie Gly Gly Thx Val Asm Leu Asn 1705 1710 1715 1720 TTT ACC GGC GAG GTG GAA ACC TAC ACX5 TTA GAC GAA ACA AGG TTT AAA 1799

Phe Thr Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thx Arg Phe Lys 1725 1730 ' 1735 GCG GAA GCG GCG AAG AAA AGC CAT TGG AGT TTA GTG AAT GCG GCG AAA 1847

Ala Glu Ala Ala Lys Lys Ser His Trp Ser Leu Val Asn Ala Ala Lys 1740 1745 1750 GTA TAC GGC GGT TTA GAC CAA ATT ATT AAA AAA CTA TGG GAC AGT GGC . 1895

Val *Tyr Gly Gly Leu Asp Gin lie lie Lys Lys Leu Trp Asp Ser Gly 1755 1760 1765 TCA ATT AAG CAT TTA TAT CAA GAT AAA GAT ACG GGC AAA TTA AAA CCG 1543

Ser lie Lys His Leu Tyr Gin Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu Lys Pro 1770 1775 17Θ0 ATT ATT TAC GGC ACG GCC GGC AAC GAC AGT AAG ATT GAA GGC ACT AAA 1951 lie lie Tyr Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys lie Glu Gly Thr Lys 1785 1790 1795 1800 ATC ACC CGT AGG ATT GCG GGT AAA GAA GTT ACG CTT GAT ATT GCC AAT 2039 lie Thr Arg Arg lie Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp lie Ala hsn 1805 1810 1815 CAG AAA ATT GAA ΑΑΛ GGC GTG TTA GAG AAA TTG GGG CTG TCT GTT AGT 2087

Gin Lys lie Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser Val Ser 1B20 1825 1B30 GGT TCG GAT ATC ATT AAA TTG TTG TTT GGA GCA TTG ACT CCA ACT TTA 2135

Gly Ser Asp lie lie Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro Thr Leu 1835 1840 1845 AAT AGA ATG TTG CTA TCA CAA CTT ATC CAG TCT ΊΤΤ TCC GAT AGC TTG 2183

Asn Arg Met Leu Leu Ser Gin Leu lie Gin Ser Phe Ser Asp Ser Leu 1850 1855 . 1860 -55- (52) 1241407 GCT AAA C丁丁 GAT AAT CCC 丁丁A GCC CC丁丁;VC ACT AAA AA丁 GGC G丁G GTT Ala Lys Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly Val Val 1865 1870 1675 1680 TAT GTC ACC GGC AAA GGG AAT GAT GTG CTT AAA GGA ACT GAA CAT GAG Tyr Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu His Glu 1865 18S0 1895 GAT TTG TTT CTC GGT GGT GAG GGG ίΛΤ GAT ACT TAT TAT GCG AGA GTA Asp Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala Arg Val 1900 1905 1910 GGC GAT ACA ATT GAA GAC GCC GAC GGC AAA GG丁 AAA GTC TAT TTT GTG Gly Asp 丁hr lie Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Τγτ Phe Val 1915 1920 1925 AGA GAA AAA GGG GTA CCT AAG GCG GAT CCT AAG CGG GTA GAG TTT AGC Arg Glu Lye Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu Phe Ser 1930 1935 1940 GAG TAC ATA ACG AAA GAA GAA ATA AAA GAG GTT GAA AAG GGG TTA ΊΤΑ

Glu Tyr lie Thr Lys Glu Glu lie Lys Glu Val Glu Lys Gly Leu Leu 1945 1950 1955 1960 ACT TAC GCA GTT TTA GAA AAT TAT ΑΛΤ TGG GAA GAG AAA ACG GCG ACT Thr Tyx Ala Val Leu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr Ala Thr 1965 1970 1575

TTC GCT CAT GCG ACT ATG CTT AAT GAG CTT TTT ACT GAT TAT ACT AAT

Phe Ala His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Fhe Thx Asp Tyx Thr Asn 1980 1985 1990 TAT CGT TAT GAA GTT AAA GGA CTA AAA TTG CCC GCC GTT AAA AAG TTA Tyx Arg Tyx Glu Val Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys Lys Leu 1995 2000 2005 AAA AGT CCG TTG GTG GAG TTT ACA GCT GAT TTA TTA ACT GTT ACG CCT Lys Ser Pro Leu Val Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val Thx Pro 2010 2015 2020 ATT GAC GAA AAC GGA AAA GCA CTT AGC GAA AAA AGT ATT ACG GTT AAA. lie Asp Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Glu Lys Ser lie thr Val Lys 2025 2030 2035 2040 AAT TTT AAA AAT GGT GAT TTA GGA ATA AGG TTG TTG GAT CCT AAT AGC Asn Phe Lys Asn Gly Asp Leu Gly lie Arg Leu Leu Asp Pro Asn Ser 2045 2050 2055 丁AT TAT TAT TTC CTT GAA GGC CAA GA：T ACG GG丁丁ΊΤ TAT GGT CCT GCT Tyr Tyr Tyr Phe Leu Glu Gly Gin Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Pro Ala 2060 2065 2070 TTT TAT ATT GAA CGA AAA AAC GGT GGA GGC TCT AAA AAT AAC TCG TCG Phe Tyr lie Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ser Lys Asn Asn Ser Ser 2075 2080 2085 GGA GCA GGA AAT AGC AAA GAT TGG GGC GGG AAC GGG CAT GGA AAT CAC Gly Ala Gly. Asn Ser Lys Asp Trp Gly Gly Αβπ Gly His Gly Asn His 2090 2095 2100 CGA ΑΆΤ AA丁 GCC TCC GAC C丁G AAT AAA CCG GAC GGA AAT AAT GGG AAT Arg Asn Asn Ala Ser Asp Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Asn Gly Asn 2105 ' 2110 2115 2120 AAC CAA AA丁 AAC GGA AGC AAT CAA GAT AAT CAT AGC GAT GTG AAT GCG Asn Gin Asn Asn Gly Ser Asn Gin Asp Asn His Ser Asp Val Asn Ala 2125 2130 2135 2233 2219 2327 2375 2423 24 71 2519 2567 2615 2663 2711 2 755 2807 26 55 2903 2951 2999

(53)1241407

CCA ΑΛΤ AAC CCG GGA CGT AAC 丁AT GAT ATT TAC GAT CC丁 Pro Asn Asn Pro Gly Arg Asn Tyr Asp lie Tyr Asp Pro 2140 2145 GA丁丁TA GAT GGA GAT GGG CTT GAA ACC GTG TCG ATG AAC

丁丁A GCT TTA Leu Ala Leu 2150 GGG CGA CAA 3047

Asp Leu Asp Gly Asp Gly Leu Glu Thr Val Ser Met Asn Gly Arg Gin * 2155 * 2160 2165 " 3095 GGC GCG TTA TTC GAT CAT GAA GGA AAA GQT ATT - CGT ACC GCA ACG GGC Gly Ala Leu Phe Asp His Glu Gly Lvs Gly lie Arg Thr Ala Thr Gly 2170 2175 ** 2180 丁GG CTC GCT GCG GAT GAC GGT TT丁丁TA GTG TTA GAT CGT AAC CAA GAC Trp Leu Ala Ala Asp Asp Gly Phe Leu Val Leu Aisp Arg Asn Gin Asp 2185 2190 2195 2200 GGC ATT ATT AAT GAT ATA AGC GAG TTA TTT AGT ΛΑΤ AAA AAT CAA CTT Gly He lie Asn Asp lie Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn Gin Leu 2205 2210 2215 TCC GAC GGG AGT ATT TCT GCA CAC GGT TTT GCG ACA TTA GCC GAT TTG Ser Asp Gly Ser lie Ser Ala His Gl'y Phe Ala Thr Leu Ala Asp Leu 2220 2225 2230 3143 3151 3239 3287 GAT ACA Asp Thr AAC Asn 2235 CAA GAT CAG CGT ATC GAC CAA AAT GAT AAG CTG TTT TCT Gin Asp Gin Arg He Asp Gin Asn Asp Lys Leu Phe Ser 2240 2245 3335

AAA CTC CAA ATT TGG CGG GAT TTA AAT CAA AAC GGT TTT AGT GAA. GCG Lys Leu Gin lie Trp Arg Asp Leu Asn Gin Asn Gly Phe Ser Glu Ala 3383 AAT Asn 2250 2255 2260 GAG CTG TTT AGC TTA GAA AGT TTG AAT ATT AAA TCT Glu Leu Phe Ser Ireu Glu Ser Leu Asn He Lyf3 Ser TTA CAT ACC Leu His Thr 3431

2265 2270 2275 2280 GCC TAT GAA GAG GGT AAT GAT TTT CTA GCG GGC ΛΆΤ AAT ATC CTT GCT

Ala Tyr Glu Glu Arg Asn Asp Phie Leu Ala Gly Asn Asn lie Leu Ala 2285 2290 2295 CAG CTT GGG AAG TAT GAA AAA ACG GAC GGT ACT TTT GGA CAA ATG GGC 3479 3527

Gin Leu Gly Lys Tyx Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Gly Gin Met Gly 2300 2305 2310 GAT TTA AAT TTC AGT TTT AAC CCG TTT TAT AGC CGA TTT ACC GAA GCG Asp Leu Asn Phe Ser Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr Glu Ala 2315 2320 2325 TTA AAT TTA ACC GAG CAA CAA CGT CGC ACA ATT AAT CTA ACC GGC ACC Leu Asn Leu Thr Glu Gin Gin Arg Arg- Thr lie Asn Leu Thr Gly Thr 2330 2335 2340 GGT CGG GTT CGG GAT TTG CGT GAA GCC GCC GCA CTT TCT GAG GAG TTG 357 5 3623 3671

Gly Arg Val Arg Asp Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu 2345 2350 2355 2360 GCT GCT TTA TTA CAA CAG TAC ACT AAG GGC TCC GAT TTT CAG GCA CAA Ala Ala Leu Leu Gin Gin Tyr Thr Lys Gly Ser Asp Phe Gin Ala Gin 2365 2370 23*75 CGA GAA 丁丁A TTG CCT GCC JVTT TTA GAT AAA TGG GCG GCA ACG GAT TTA Arg Glu Leu Leu Pro Ala lie Leu Asp Lys Trp Ala Ala Thr Asp Le.u 2380 2385 2390 CAG TAT CAA CAT TAT GAT AAA ACA TTA CTT ΛΑΑ ACG GTA GAA AGT ACC Gin Tyr Gin His Tyr Asp Lys Thr Leu Leu Lys Thr Val Glu Ser Thr 23S5 2400 2405 3719 3767 3815 -57- (54)1241407 GAT AGT AGT GC丁丁CT GTC GTT AGA GTC ACG CCT TCT CAA TTA ；\GT AGT Asp Ser Ser Ala Ser Val Val Arg Val Thr Pro Ser Gin Leu Ser Ser 2410 2415 2420 ATA CGC AAT GTA AAG CA丁 GAT CCT ACC G丁丁；VTG CAA AAC TGT GAA CAA lie Arg Asn Val Lys His Asp Pro Thr Val Met Gin Asn Cys Glu Gin 2425 2430 2435 2440 AGT AAG GCA AAA ATT GCG AC丁丁丁A AAT TCG C丁C TAC GGG ΊΤΑ ；UVT ATT Ser Lys Ala Lys lie Ala Thr Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn lie 2445 2450 2455 GAT CAA CTT TA丁丁AT ACG ACG GAT AAA GAC ATT CGT TAT ATT AC丁 GAC Asp Gin Leu Tyr TVr Thr Thr Asp Lys Asp lie Arg Tyr lie Thx Asp 2460 2465 2470 AAA GTG AA丁 AAT A丁G TAT CAA ACA ACC GGA GAA C丁C GGC TAT CGT TCT Lys Val Asn Asn Met Tyr Gin Thr Thr Gly Glu Leu Gly Tyr Arg Ser 2475 2480 2485 TTA CTT TTA CAA ACG CGT GTG AAG AAA TAT GTT TAT AGC GTT AAT GCG Leu Leu Leu Gin Thr Arg Val Lys Lys Tyr Val Tyr Ser Val Asn Ala 2490 2495 2500 AAA CAA TTC GAA GGG AAA TGG GTA GCC GAT TAT TCT CGT ACT GAA GCC Lys Gin Phe Glu Gly Lys Trp Val Ala Asp Tyr Ser Arg Thx Glu Ala 2505 一 2510 2515 2520 TTA TTT AAC TCT ACT TAT AAA CAA TCG CCC GAA AAT GTA TTA TAT GAT l»eu Phe Asn Ser Thr Tyr Lys Gin Ser Pro Glu Asn Val Leu Tyr Asp ^ 2525 2530 2535 TTA CGC GAA TAC CTT TCT TTC TAT AAC GAC CCT ACG GAA TGG AAA GAA Leu Arg Glu Tyx Leu Ser Phe Tyr Asn Asp Pro Thr Glu Trp Lye Glu 2540 2545 2550 GGG CTA TTA CTG TTA AGC CGT TAT ATA GAT TAT GCT AAA GCA CAA GGA Gly Leu Leu Leu Leu Ser Arg Tyr lie Asp IVr Ala Lys Ala Gin Gly 2555 25€0 2565 TTT TAT GAA AAC TGG GCG GCT ACT TCT AAC TTA ACT ATT GCC CGT TTA Phe Tyr Glu Asn Trp Ala Ala Thr Ser Asn Leu Thr lie Ala Arg Leu 2570 2575 2580 AGA GAG GCT GGA GTA ATT TGT GCA GAA TCG ACG GAT TTA AAA GGC GAT Arg Glu Ala Gly Val lie Cys' Ala Glu Ser Thr Asp Leu Lye Gly Asp 2585 2590 2595 2600 GAA AAA AAT AAT ATT GTG TTA GGT AGC CAA AAA GAT AAT AAC TTA TCG Glu Lys Asn Asn lie Val Leu Gly Ser Gin Lys Asp Asn Asn Leu Ser 2605 2610 2615 * GGT AGT GCA GGT GAT GAT CTA CTT ATC GGC GGA GAG GGT AAT GAT ACG Gly Ser Ala Gly Asp Asp Leu Leu He Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr 2620 2625 2630 TTA AAA GGC AGC TAC GGT GCA GAC ACC TAT ATC TTT AGC ΛΑΑ GGG CAT I*eu Lys Gly Ser Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly His 2635 2640 2645 GGA CAA GAT GTA ATT TAT GAA TAT TCC GAC AGT GCA AAC TCT AAA AAA Gly Gin Asp Val lie Tyr Glu Tyr Ser Asp Ser Ala Asn Ser Lys Lys 2650 2655 2660 3863 3911 3959 4007 4055 4103 4151 4199 4247 4295 4343 4391 4439 4487 4535 4583 GAT ATT GAT ACC TTA AAA TTT ACC GAT GTG ΑΆΤ TAT GCG GAA GTG AAG Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val Lys 2665 2670 2675 2680 4631 -58 - 1241407 (55) ΤΊΤ CGA CGA G丁A GAT ΑΑΊ GAC 丁丁A ATG TTA TTC GG丁丁AT CAT GAT ACG 4 67 9

Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr His Asp Thr 2685 2690 26S5 GAT 丁CG GTC ACG GTA AAA 丁CC TTC 丁AC AGC CAT GTA GAT TAT CAA TTT 4 72 7

Asp Sex Val 丁hr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His Val Asp Tyr Gin Phe 2700 2705 2710 GAC AAA TTG GAG TTT GC丁 GAC CGC AGT ATA ACT CGC GAT GAA CTG ATT 4 77 5

Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu lie 2715 2720 2725 AAA GCA GGG CTT CAT C丁A TAC GGC ACC GAT GGC AAT GAT GAT ATA AAG 4823

Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp lie Lys 2730 2735 2740 GAT CAT GCG GAT TGG GAC AGC ATT GTG GAA GGC GGC AAA GGC AAC GAT 4 8 71

Asp His Ala Asp Trp Asp Ser lie Val Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp 2 74S 2 750 2755 2760 ATT CTA AGA G<ST GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC TTT AGC AAA GGA 4915 lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly 2765' 2770 2775 CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC CGA GCA 4967

His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp . Thr Asn Asn Asp Αεη Arg Ala 一 2780 2785 2790 AGA GAT ATC GAC ACC TTA ACA TTT ACT GAT GTG AAT TAT GCG GAA GTG 5015

Arg Asp lie Asp Thx Leu Thr Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val 2795 2800 * 2805 AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG ΊΤΑ TTC GGT TAT CAT GAT 5063

Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met I^eu Phe Gly Tyx His Asp 2810 2815 2820 ACG GAT TCG GTC ACG ATA AAA T.CC TTC TAC AAC CAT GTA GAT TAT CAA 5111

Thr Asp Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyrr Asn His Val Asp Tyr Gin 2825 2 830 2835 2840 TGT GAC AAA TTG GAC TTT GCT. GAC CGC AGT ATA ACT CGT GAT GAA CTA 515 9

Cys Asp Lys Leu Asp Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Ajbo Glu Leu 2845 2850 2855 GGT AAA CAA GGT ATG GCA TTA TTT GGC ACT GAC GGC GAT GAT AAT ATC 5207

Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp Asn lie 2860 2865 2870 AAC GAC TGG GGA CGT AAC TCG GTG ATT GAT GCC GGT GCG GGT AAT GAT 5255

Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val He Asp Ala Gly Ala Gly Asn Asp 2875 2880 2885 ACG GTT AAT GGC GGT AAT GGC GAT GAC ACC CTC ATC GGC GGC AAA GGT 5303

Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu lie Gly Gly Lys Gly 2890 2895 2900 AAT GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC TTT AGC 5351

Asn Asp He Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyx He Phe Ser 2905 2910 2915 2920 AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC 5399

Lys Gly His Gly Gin Asp He Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn 2925 2930 2935 CGC GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT ATT AAT TTA TCC 5447

Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp lie Asn Leu Ser 2540 2545 2S50 -59- 1241407 (56) GAA C丁丁 TGG 丁丁丁 AGC CGA GM AA*T AAC GA丁丁丁G ΑΊΤ ΛΤΤ AAA 丁CA ΊΤΑ

Glu Leu Trp Phe Ser Arg Giu Asn Asn Asp Leu lie lie Lys Ser Leu 2955 2960 2365

ΊΤΑ AGT GAG GAT AAA GTC ACG GTT CAA AA丁丁GG TAT TCA CAC CAA GAT

Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gin Asn Trp Tyr Ser His Gin Asp 2970 " 2575 2980

CAT AAA ATA GAA ΑΛΤ ΑΊΤ CGT 丁丁A TCG AA丁 GAG CAA ATG TTG GTG AGC

His Lys lie Glu Asn lie Arg Leu Ser Asn Glu Gin Met Leu Val Ser 2985 2BB0 299S 3000

ACT CAG GTG GAG AAG ATG GTT GAG TCG ATG GCC GGC TTT GCT CAG AAG

Thr Gin Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala Gly Phe Ala Gin Lys 3005 3010 3015

CAC GGA GGA GAG ATA TCT CTT CTG TCG CCT GAA GAG GTA AAA CAA TAT

His Gly Gly Glu lie Ser Leu Leu Ser Pro Glu Glu Val Lys Gin Tyr 3020 · 3025 3030 ATC AAT AGC TTA ACA GOT GCT TTA TAA CATACGAAAG AAATCGGCAC lie Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu * 3035 3040

AGTTTTTGTG AACTGTGCCG ΑΊΤΤΟΑΊΤΤΙ* AGTGTAAGAA TATAGCCTGA TTTTAAGAAA TTTACTCTTG GCTAATAACT ATTTCCCATT TTATAAGTTA TTGACGGATG GTTTTATCAA ATATGAGATC AAATCTTATT TTAAATTCGC TTTCCATTAA GCGATATTGA TCTTTTAAGT TTGGGGCCGC ATGAGTTTGG AACCGATACC ACTCATTGTG GGAATCAATA CACAATACXX： TGTAATCGGA CTCTTGCAGT TCATAATAAT GCTTTCTCTC CGTTAATTCT TCTTGCGTAT ATGGCGAGAG ATTAAAGCTG AATGGCTGGT TCGCACTAAC AAACAGGTTC TCCXSATTTCA GATATTCACA ACCGTAATGG CTACCGGTTT CCTGCGGTTT TACATAATTG GTATGATTTT GTTTAGCTGT TATACGGTAG ATGCCTAATT GTGGTAAATT GCGTGTGTCA ATATAGCTTT CTTGTTCTCC GTAACCGAAA TACTCAATGG CGTTTTCTGT TTTAGCTAAG AAGAAACGTA AGCCGAAGCG GGGTAAATAC GGTAATTCGA TCGGGCGAAT AGCGTTAATT TCAACCGAAA (5TTG丁CCGTC ATTGAAGATA CC3ATAACTGAA TATCCAGTGT TAAAATGCGA CCGCGAGAAA TTGACACAAT TGCAGATTTT ACTGAAAATT CGACCGCTTG TTCGCTTTGC TGCCACTGAA TTTCATACGC TCTGGTATAG GCTTTATCGT AGCCGGCATT TTG<5CACGCC TCACGAATGA GGCGATCATT G丁CGGTTGGC GCACGCCAAA I^TTAAAATC TAACGATTGT TGGATAATCG CTTTACCGGC TTTTTCAATA CGGGTGAAAA TCCCTTTCTG TTTATCTAAT TGATAACTAA ATTGACCGTT GTGTACGTTA ATGTGGAAGC GATCTTCTTG TACTTCAAAT GCACTGTTCT CAA丁丁GTGAA TTG丁GGTAAT ACTAATTTAT TTTCOCTAAA TAAATTGAGC TGCTCGAAGC CAAGTGAATG TGCTTCGTCT AATAATTCGA CCGCGGTATT TAAGCGATAA TTTAAATTCA GTAGCCATAA ATGCCCGTTA TTTTTTGGTA ACTCAATCGG TAATACTACG CTGCCGTGCG GTTGGCAAGA AACGGATAAA 丁丁CCCACCGC TTGTCACCAC GCCGTTTTCG ACAAATTCGT AATCAATCGT TAAATAATCG GCAAGATCAG TGAAATCCAA GTAGTTGTGG ATCACAATTT GGTTATCGAT 5455 5543 55S1 5639 5687 5734 5794 5854 5914 5974 6034 6094 6154 6214 6274 6334 6394 6454 6514 6574 6634 6694 6 7S4 6814 6874 6934 6934 7004 -60- (57) (57)1241407 (2 ) S E Q ] D N〇：4的資料 (I )序列特徵： (A )長度：1 3 8 3個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (II )分子種類：蛋白質 (XI)序歹 1J 描述：SEQIDNO: 4:

-61 - (58) 1241407

Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val lie Glu Glu Ser Gly Lys Arg Tyr 1 5 10 15 lie Glu Asn Phe Gly lie Glu Pro Leu Gly Lys Gin Glu Asp Phe Asp 20 25· 30

Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg Gly Leu Glu Ser 35 40 45 lie lie Asp Pro Ser Gly lie Gly Gly Thr Val Abu Leu Asn Phe Thr 50 55 60

Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thr Arg Phe Lys Ala Glu 65 70 75 80

Ala Al'a Lys Lys Ser His Trp Ser Leu Val A^n Ala Ala Lys Val Tyr " 85 90 95

Gly Gly Leu Asp Gin lie lie Lys Lys Leu Trp Asp Ser Gly Ser lie 100 105 110

Lys His Leu Tyr Gin Asp Lys Asp Thr Gly Lys Lreu Lys Pro He lie 115 120 125

Tyx Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys lie Glu Gly Thr Lys lie Thr 130 135 140

Arg Arg lie Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp lie Ala Asn Gin Lys 145 150 155 160 lie Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser Val Ser Gly Ser 165 170 175

Asp lie lie Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro Thr Leu Asn Arg 180 185 190

Met Leu Leu Ser Gin Leu lie Gin Ser Phe Ser Asp Ser Leu. Ala Lys 195 200 205

Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly Val Val Tyr Val 210 215 220

Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu His Glu Asp Leu 225 230 235 240

Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala Arg Val Gly Asp 245 250 · 255

Thr lie Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr Phe Val Arg Glu 260 265 270 .

Lys Gly Val Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu Phe Ser Glu Tyr 275 ** 2Θ0 285 lie Thr Lys Glu Glu lie Lys Glu Val Glu Lys Gly Leu Leu Thr Tyr 290 295 300

Ala Val Leu Glu hsn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr Ala Thr Phe Ala 305 310 315 320

-62- 1241407 (59) His Ala. Thr

Met Leu Asn Glu 325

Leu Phe Thr Asp Tyr Thr Asn Tyr Arg 330 335

Tyr Glu Val

Pro Leu Val 355 Glu Asn Gly 370 Lys Asn Gly 385 Tyr Phe Leu

Lys Glv Leu Lvs Leu Pro Ala Val Lys Lys Leu Lys Ser 340 " 345 350 Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val Thr Pro lie A^p 360 365 Lys Ala Leu Ser Glu Lys Ser lie Thr Val Lys Asn Phe 375 380 Asp Leu Gly lie Arg Leu Leu Asp Pro Asn Ser Tyr Tyr 390 395 400

He Glu Arg

Gly Asn Ser 435 Asn Ala Ser 4 5V Asn Asn Gly 465 Asn Pro Gly

Asp Gly Ajbd

Leu Phe Asp 515 Ala Ala Asp 53 0 lie Asn Asp 545 Gly Ser lie

Ajsn Gin Asp

Gin lie Trp 595 Leu Phe Ser 610 Glu Glu Arg 625 Gly Lys Tyr

Ajsn Phe Ser

Leu Thr Glu 675

Glu Gly Gin Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Pro Ala Phe Tyr 405 410 415 Lys Asn Gly Gly Gly Ser Lys Asn Asn Ser Ser Gly Ala 420 425 430 Lys Asp Trp Gly Gly Ash Gly His Gly Asn His Arg Asn 440 445 Asp Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Ajbh Gly Αεη Asn Gin 455 460 Ser Ajsn Gin Asp Asn His Ser Asp Val Asn Ala Pro Asn 470 475 480 Arg Asn Tyx Asp lie Tyr Asp Pro Leu Ala Leu Asp Leu 485 490 495 Gly Leu Glu Thr Val Ser Met Asn Gly Arg Gin Gly Ala 500 505 510 His Glu Gly Lys Gly lie Arg Thr Ala Thr Gly Trp Leu 520 525 Asp Gly Phe Leu Val Leu Asp Arg Aisn Gin Asp Gly lie 535 540 lie Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn Gin Leu Ser Asp 550 555 560 Ser Ala His Gly Phe Ala Thr I^eu Ala Asp Leu Asp Thr 5€5 570 575 Gin Arg lie Asp Gin Asn Asp Lys Leu Phe Ser Lys Leu 580 585 590 Arg Asp Leu Asn Gin Asn Gly Phe Ser Glu Ala Asn Glu 600 605 Leu Glu Ser Leu Asn lie Lys Ser Leu His Thr Ala Tyr 615 620 Asn Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn lie Leu Ala Gin Leu 630 635 640 Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Gly Gin Met Gly Asp Leu 645 650 655 Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr Glu Ala Leu Asn 660 665 670 Gin Gin Arg Arg Thr lie Asn Leu Thr Gly Thr Gly Arg 680 685

-63- (60)1241407

Gin His Tyr Asp 740 Ser Ala Ser Val 755 Asn Val Lys His 770 Ala Lys lie Ala 785 Leu Tyr Tyr Thr

Asn Asn Met Tyr ·:· 820 Leu Gin Tlir Axg 835 Phe Glu Gly Lys " 850 Asn Ser Thr Tyr 86 5 Glu Tyr Leu Ser

Leu Leu Leu Ser 900 Glu Asn Trp Ala 915 Ala Gly Val lie 930 Asn Asn lie Val 945 Ala Gly Asp Asp

Gly Ser Tyr Gly 980 Asp Val lie Tyr 995 Asp Thr Leu Lys 1010 Arg Val Asp Asn 1025 Val Thr Val Lys

Val Arg Asp Leu 690 Leu Leu Gin Gin 705 Leu Leu Pro Ala Arg Glu Ala 695 Ala Ala Leu Tyr Thr 710 Lys Gly Ser Asp lie 725 Leu Asp Lys Trp Ala 730 Lys Thr Leu Leu Lys 745 Thr Val Arg Val Thr 760 Pro Ser Asp Pro Thr 775 Val Met Gin Thr Leu 7 90 Asn Ser Leu Tyr Thr 805 Lys Asp lie Arg 810 Gin Thr Thr Gly Glu 825 Leu Val Lys Lys Tyr 840 Val Tyr Trp Val Ala 855 Asp Tyr Ser Lys Gin 870 Ser Pro Glu Asn Phe 885 Tyr Asn Asp Pro Thr 890 Arg. Tyr He Asp Tyr 905 Ala Ala Thr Ser Asn 920 Leu Thr Cys Ala Glu 935 Ser Thr Asp Leu Gly 950 Ser Gin Lys Asp Leu 965 Leu I；Le Gly Gly Glu 970 Ala Asp Thr Tyr lie 985 Phe Glu Tyr Ser Asp Ser 1000 Ala Phe Thr Asp Val 1015 Asn Tyr Asp Leu Met Leu Phe Gly 1030

Ser Phe Tyr Ser His Val 1045 105

Ser Glu Glu Leu Ala Ala 700 Phe Gin Ala Gin Arg Glu-· 715 720 Ala Thr Asp Leu Gin Tyr 735 Val Glu Ser Thr Asp Ser ΊΞ>0 Gin Leu Ser Ser lie Axg 765 Asn Cys Glu Gin Ser Lys 780 Gly Leu Asn lie Asp Gin 795 800 Tyr lie Thr Asp Lys Val 815 Gly Tyr Arg Ser Leu Lreu 830 Ser Val Asn Ala Lys Gin •845 Arg Thr Glu Ala Leu Phe 860 Val Leu Tyx Asp I^eu Arg 675 880 Glu Trp Lys Glu Gly Leu 895 Lys Ala Gin Gly Phe Tyr S10 lie Ala Arg Leu Arg Glu 925 Leu Lys Gly Asp Glu Lys SAO Asn Asn Leu Ser Gly Ser 955 960 Gly Asn Asp Thr Leu Lys 975 Ser Lys Gly His Gly Gin 990 Asn Ser Lys Lys Asp lie 1005 Ala Glu Val Lys Phe Arg 1020 Tyr His Asp Thr Asp Ser 1035 1040 Asp Tyr Gin Phe Asp Lys 0 1055

-64 - (61) 1241407

Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu lie Lys Ala 1060 1065 10*70

Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp lie Lys Asp His • 10 7 5 1080 1085

Ala Asp Trp Asp Ser lie Val Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp lie Leu 1050 1095 1100

Axg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr He Phe Ser Lys Gly His Gly 1205 1110 1115 · 1120

Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Ajsp Asn Arg Ala Arg Asp 1125 1130 1135 lie Asp Thr Leu Thr Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val Lys Phe 1140 1145 1150

His Asp Thr Asp 1165

Arg Arg Val Asp A9n Asp Leu Met Leu Phe Gly 1155 1160

Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyr Asn His Val Asp Tyr Gin Cys Asp ：L170 1175 1180

Lys Leu A-sp Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu Gly Lys 1185 1190 1195 1200

Gin Gly Met: Ala Leu Phe Gly 丁hr Asp Gly Asp Ajsp Asn lie Asn A<8p 1205 1210 1215

Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala Gly Ala Gly Asn Asp Thr Val 1220 1225 1230

Asn Gly Gly Asn Gly Ajsp Asp Thr Leu lie Gly Gly Lys Gly Asn Asp 1235 1240 1245

Gly Ala Asp Thr 1255 lie Leu Axg Gly Gly 1250

He Phe Ser Lys Gly 1260

His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala 1265 1270 1275 128 0

Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp lie Asn L*eu Ser Glu Leu ~ 1285 12S0 1295

Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn Asp Leu He lie Lys Ser Leu Leu Ser 1300 1305 1310

Glu Asp Lys Val Thr Val Gin Asn Trp Tyr Ser His Gin Asp His Lys 1315 1320 1325 lie Glu Asn lie Arg beu Ser Asn Glu Gin Met Leu Val Ser Thr Gin 1330 1335 1340 Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala Glv Phe Ala Gin Lys His Gly 1345 1350 1355 1360 Gly:Glu He Ser Leu Leu Ser Pro Glu Glu Val Lys Gin Tyr lie Asn 1365 1370 1375

Ser Leu Thr Ala Ala Leu 1380 -65 - (62) (62)1241407 (2 ) S E Q ID N〇：5的資料 (I )序列特徵： (A )長度：6 7 3 6鹼基材 (B )種類：核酸 (C )股：雙股 (D )拓蹼學：直線 (II )分子種類：DNA (基因組） (III )假說：無 (IV )抗意識鏈：無 (VI )起始來源： (A )有機體：胸膜肺炎放射菌 (B )菌株：4 7 0 7 (血淸型第1型參考菌株） (VII )直接來源： (B )菌落：pROK7 (IX )特色： (A )名稱/關鍵：CDS (B )位置：1132..6549 (C )確認方法：實驗 (D )其他資料：/密碼-起始二1 I 3 2 /功能=RTX毒素〃 / 產物二 '' ApxIV" /證據=實驗 / 基因二 A p X I V - VI (XI )特色： -66- (63) (63)1241407 (A )名稱/關鍵：DOS (B )位置：6 3 9..1 1 7 8 (D )其他資料：/密碼_起始=6 3 9 /功能= 未知〃 /產物 /基因 (IX )特色： (A )名稱/關鍵：DOS (B )位置：619.·1453 (D )其他資料：/部分 / 產物 '' Μ Ε Τ — G 〃 / 基因=MRp" /標準—名稱=MRP〃 /標示二MRp (IX )特色：

(A )名稱/關鍵：一 1 0 —訊息 (B )位置：617..623 (D )其他資料：/標準-名稱—1 〇 / 標不二—10-S (IX )特色：

(A )名稱/關鍵：一 3 5 -訊息 (B )位置：5 94..5 9 9 (D )其他資料：/標準-名稱''一 3 5 / 標不=—35—S -67- (64) - 1241407 (IX)特色·· (A )名稱/關鍵：啓動者 .- (B )位置：4 5 4 · · 1 1 3 1 ‘ (D )其他資料·· /功能二啓動者 /標準名稱= 啓動者A p XIV π /標示二啓動者 (XI)序列描述：SEQIDN0··5 Φ ATC GAT ATG CCG He Asp Met Pro CCG GGT ACG GGC GAT ATC Pro Gly Thr Gly Asp lie CAA CTT ACT CTT TCG CAA Gin Leu Thr Leu Ser Gin CAA ATT CCG Gin lie Pro GTT·ACC GGT GCG GTG GTG Val^ Thr Gly Ala Val Val GCG TTA TTA GAT GCG GTG Ala Leu Leu Asp Ala Val

TCA ATG TTC CAA AAA GTG TCG Ser Met Phe Gin Lys Val Ser 45 GTA ACC ACT CCG CAA GAT ATT Val Thr Thr Pro Gin Asp lie GTA CCG GTC Val Pro Val 50 ΤΤΛ GGT ATC ATT Leu Gly He lie GAA AAT ATG AGC GTA CAT ATC TQC CAA Glu Asn Met Ser Val His lie Cys Gin 60 -68- (65) 1241407 AAT TGC GGT CAC CAC- GAA GAT ATT TTC GGC ACC GGC GGT GCG GAG AAA 24 0

Asn Cys Gly His His Glu Asp lie Phe Gly Thr Gly Gly Ala Glu Lye 65 70 75 80 GTG GCG AAG AAA TAC GGT ACT AAA GTA ΊΤΑ GGA CAA ATG CCG 1TG CAT 288

Val Ala Lys Lye Tyr Glv Thr Lys Val Leu Gly Gin Met Pro Leu His 85 30 95 ATT CGC TTA CGT CAA GAT TTG GAT GCC GGC ACA CCG ACC GTC GTT GCG 336 lie Arg Leu Arg Gin Αερ Leu Asp Ala Gly Thr Pro Thr Val Val Ala 100 105 110 GCA CCG GAA CAC GAA ACC AGC CGA GCC TAT ATT GAA 丁丁A GCG GCA ΛΑΑ 384

Ala Pro Glu His Glu Thr Ser Arg Ala Tyr lie Glu Leu Ala Ala Lys 115 120 125 GTC GCT TCG GAA ΤΓΑ TAC TGG CAA G<ST’TCG GTT ATC CCG TCT GAA ATT 432

Val Ala Ser Glu Leu Tyr Trp Gin Gly Ser Val He Pro Ser Glu lie 130 135 140 ATG ATT CGT GAA GTA AAA TAA GTTTTAATAA CCACGAAAAC ACAAAGAACA 483

Met He Arg Glu Val Lys ★ 145 150 CAAGCGGTAG AATTTGCAGA AAAATTTGCA AATCCTACCG CTTTTTTATT AGTACGATT匚 54 3

GCTGTTGGAC TGCTATTTGA TTTGGTTTGT CAGGATATTA TGTTATTGTA ATGAAATGTT 603 AGTGAATTAT TTTTATTAAT TTGAAAGGAA ACAAAATGAA AATAAAAAAA CGTTACATTG 663

• I CGCTGTTGGT CTTAGGTGTC GTTATCAGCT ATGCCTGGTA TCAAAATTAT CAATGGGAAC 723 AGCTGATGTT AAGCGGTTAT TGTGAAAAGG ACGGAAGTTA TTTTGATGAT AGGCATACGA 783 AGCAAGilACT GATTGATAGG GCAATTAACT ATATGCTGGA GCATCAATCT AAAAAAACAT 8 43 ACGATGCTTA TACTGATGAA CCTTTAGAAA TAAAA匚CATA TTTAACAAITl GAGGAATTTA 303 AAAAACTCAA TCCAAATTGT TGTGAAATTA CCTCATGGCC AGCAGATGCA GTTCCACAAG 963 ATTGGGATGT TCGTGTGGAA GGTAAGGCAT ATAGGTATGT AATCGTAAAA TATTTAAGAA 1023 CCTTAGCAAA TAGAGAACCT GAACGATGGG AAACTAGTAT TGTTTTTGAT AATTGCGGCA 1083 ATCCTAAAAG AGCAAGCTAC TTATATTATT TAAAGAGAGA AATTTATT ΑΊΧ5 ACA AAA 1140

Met Thr Lys . 1 丁丁A ACT ATG CAA GAT GTG ACC AAT TTA TAT TTA 17VT AAA ACG AAA ACT 1188

Leu Thr Met Gin Asp Val Thr Asn Leu Tyr Leu Tyr Lys Thr Lys Thr 5 10 15 CTA CC丁 AAA GAT AGA TTG GAT GAT TCA CTT ATT TCT GAA ΑΊΤν GGA AAA 1236

Leu Pro Lys Asp Arg Leu Asp Asp Ser Leu lie Ser Glu He Gly Lys

20 25 30 35 GGA GAT GAT GAT ATT GAT AGA AAA GAA TTT ATG GTG GGG CCG GGA CGT 1284

Gly Asp Asp Asp lie Asp Arg Lys Glu Phe Met Val Gly Pro Gly Arg 40 45 50 TTT GTG ACC GCT GAT AAC TTT AGC GTT GTA AGA GAT TTT TTT AAT GCT 1332

Phe Val Thr Ala Asp Asn Phe Ser Val' Val Arg Asp Phe Phe Asn Ala 55 60 65 GGG AAA TCA CGC ATT ATT GCG CCG CAA GTC CCG CCT ATT CGT TCA CAG 1380

Gly Lys Ser Arg lie lie Ala Pro Gin Val Pro Pro He Arg Ser Gin 70 75 60 CAG GAA AAA ATC TTG GTC GGT TTA AAA CCG GGC AAA ΤΛΤ TCC AAA GCG 1428

Gin Glu Lys lie Leu Val Gly Leu Lys Pro Gly Lys Tyr Ser Lys Ala 85 SO 95 CAG ATA TTG GAA ATG CTG GGT ΤΛΤ ACG AAA GGC GGA GAA GTG GTA AAT 1476

Gin lie Leu Glu Met Le\i Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Glu Val Val Asn 100 105 110 115 GGC ATG TTT GCC GGT GAA GTC CAG ACA TTA GGC TTT TAT GAC GAT GGC 1524

Gly Met Phe Ala Gly Glu Val Gin Thr Leu Gly Phe Tyr Asp Asp Gly 120 125 130 AAA GGG GAT TTA CTC GAA CGC GCC TAT ATC TGG AAT ACC ACA GGA TTT 1572

Lys Gly A^p Leu Leu Glu Arg Ala Tyr lie Trp Asn Thr Thr Gly Phe 135 140 145 ίΛΑ ATG AGC GAC ΑΑΊ GCC ΓΤΤ TTT GTT ATA GAA GAA TCA GGC AAA CGC 1620 -69 (66) 1241407

Lys Met Ser Asp Asn Ala Phe Phe Val lie Glu Glu Ser Gly Lys Arg 150 155 160

TAT A丁 1 GAA AAC ΊΤΤ GGT ATT GAA CCT C丁T GGT AAG CAA GAA GAT ΉΓΤ 166B

Tyr lie Glu Asn Phe Gly lie Glu Pro Leu Gly Lys Gin Glu Asp Phe 165 170 175 GAT TTT GTC GGC GGC 丁丁T TGG TCT ΑΑς ΓΓΑ GTG AAT CGT GGT TTG GAA 1716

Asp Phe Val Glv Gly Phe Trp Ser Asn ijeu Val Asn Arg Gly Leu Glu 180 185 190 195 AGT ATT ATC GAC CCA TCC GGT ATC GGT GGA ACG GTA AAC CTT AAC TTT 17 64

Ser lie lie Asp Pro Ser Gly lie Gly Gly Thr Val Asn Leu Asn Phe 200 20b 210 ACC GGC GAG GTG GAA ACC TAC ACG TTA GAC GAA ACA AGG TTT AAA GCG IB 12

Thr Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Thr Arg Phe Lys Ala 215 220 225 GAA GCG GCG AAG AAA AGC CAT TGG AGT TTA GTG AAT GCG GCG AAA GTA I860

Glu Ala Ala Lys 1>γε Ser His Trp Ser Leu Val Asn Ala Ala Lys Val· 23D 235 240 TAC GGC GGT TTA GAC CAA ATT ATT AAA AAA CTA TGG GAC AGT GGC TCA 1908

Tyr Gly Gly Leu Asp Gin lie lie Lys Lys Leu Trp Aap Ser Gly Ser 245 250 255

ATT AAG CAT TTA TAT CAA GAT AAA GAT ACG GGC AAA TTA AAA CCG ATT 1356 lie Lys His Leu Tyr Glri Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu Lys Pro lie 260 265 270 275 ATT TAC.X5GC ACG GCC GGC AAC GAC AGT AAG ATT GAA GGC ACT AAA ATC 2004

He Tyx Gly Thr Ala Gly Asn Asp Ser Lys lie Gl*u Gly Thr Lys lie 280 285 230 ACC CGT AGG ATT GCG GGT AAA GAA GTT ACG CTT GAT ATT GCC AAT CAG 2 052

Thr Arg Arg lie Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp He Ala Asn Gin 295 300 305 AAA ATT GAA AAA GGC GTG TTA GAG AAA TTG GGG CTG TCT GTT AGT GGT 2100

Lys lie Glu L；ys Gly Vai L»eu Glu Lys Leu Gly Leu Ser Val Ser Gly . 310 315 320 TCG GAT ATC ATT AAA TTG TTG TTT GGA GCA TTG ACT CCA ACT TTA ΑΛΤ 2148

Sex Asp lie He Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro Thr Leu Asn 325 330 335 AGA ATG TTG CTA TCA CAA CTT ATC CAG TCT TTT TCC GAT AGC TTG GCT 2IS6

Arg Met Leu Leu Ser Gin Leu lie Gin Ser Phe Ser Asp Ser Leu Ala 340 345 350 355 - AAA CTT GAT AAT CCC TTA GCC CCT TAC ACT AAA AAT GGC GTG GTT TAT 2244 3L,ys Leu Asp Asn Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly Val Val Tyr 360 365 370 GTC ACC GGC AAA GGG AAT GAT GTG CTT AAA GGA ACT GAA CAT GAG GAT 22 32

Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Gin His Glu Asp 215 3B0 3B5 TTG TTT CTC GGT GGT GAG GGG AAT GAT ACT ΤΛΤ TAT GCG AGA GTA GGC 2 34 0

Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyx Tyr Ala Arg Val Gly 330 355 400 GAT ACA ATT GAA GAC GCC GAC GGC AAA GGT AAA GTC TAT TTT GTG AGA 2388

Asp Thr lie Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr Phe Val Arg 405 410 - 415 GAA AAA GGG GTA CCT AAG GCG GAT CCT AAG CGG GTA GAG ΤΓΓ AGC GAG 2436

Glu Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lys Arg Val Glu Phe Ser Glu 420 425 430 435 TAC ATA ACG AAA GAA GAA ATA AAA GAG GTT GAA AAG GGG TTA TTA ACT 2484

Tyr lie Thr Lys Glu Glu lie Lys Glu Val Glu Lys Gly Leu Leu Thr 440 445 450 TAC GCA GT丁丁TA GAA ΑΛΤ TAT AAT 丁GG GAA GAG AAA ACG GCG ACT TIC 2532'

Tyr Ala Val Leu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr Ala Thr Phe 455 460 465 GCT CAT GCG ACT ATG CTT AAT GAG CTT ITT ACT GAT TAT ACT AAT TAT 2580

Ala His Ala Thr Met Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr Thr Asn Tyr 470 475 4B0 CG了丁AT GAA GTT AAA GGA CTA ΛΑΑ TTG CCC GCC GTT AAA AAG ΊΤΑ AAA 2628

Axg Tyr Glu Val Lye Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys Lys Leu Lys - 70- (67) 1241407 485 490 495 AGT CCG 丁TG GTG GAG 丁ΤΓ ACA GCT GAT ΓΙΑ ΓΓΑ AC丁 GTT ACG CCT ATT 2 6 76

Ser Pro Leu Val Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val Thr Pro lie 500 505 510 515 GAC GAA AAC GGA AAA GCA CTT AGC GAA AAA AGT ATT ACG GTT AAA ΑΆΤ 2 724

Asp Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Glu Lvs Ser lie Thr Val Lys Asn 520 525 530 TTT AAA AA丁 GGT GAT ΤΓΑ GGA AITV AGG TTG 丁丁G GAT CCT AAT AGC TAT 2772

Phe Lys Asn Gly Asp Leu Gly lie Arg Leu Leu Asp Pro Asn Ser Tyr 535 540 545 TAT TAT TTC CTT GAA GGC CAA GAT ACG GGT TTT TAT GGT CCT GCT TTT 2B20

Tyr Tyr Phe Leu Glu Gly Gin Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Pro Ala Phe 550 555 . 560 TAT ATT GAA CGA ΑΑΆ AAC GGT GGC GGC GCT AAA AAT AAC TCG TCG G<SA 2B68

Tyr lie Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ala Lys Asn Asn Ser Ser Gly 565 570 575

GCA GGA AAT AGC ΛΑΑ GAT TGG GGC GGG AAC GGG CAT GGA AAT CAC CGA 291S

Ala Gly A^n Ser Lye Asp Trp Gly Gly Asn Gly His Gly Asn His Arg 580 585 550 555 AAT AAT. GCC TCC GAC CTG AAT AAA CCG GAC GGA AAT AAT GGG AAT AAC 2364 Αεπ Asn Ala Ser A9p Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Asn Gly Asn Asn 600 605 610 CAA AAT . AAC GGA AGC AAT CAA GAT ΑΆΤ CAT AGC GAT GTG AAT GCG CCA 3012

Gin A.sn-Asn Gly Ser Asn Gin Asp Asn His Ser Asp Val Asn A2a Pro 615 620 ¢25 AAT AAC CCG GGA CGT AAC TAT GAT ATT TAC GAT CCT TTA GCT TTA GAT 3060

Asn Asn Pro Gly Arg Asn Tyr Asp lie Tyr Asp Pro Leu Ala Len Asp S30 635 640 ΤΤΛ GAT GGA GAT GGG CTT GAA ACC GTG TCG ATG AAC GGG CGA CAA GGC 3108

Leu Asp Gly Asp Gly Leu Glu Thr Val Ser Met Asn Gly Axg Gin Gly 645 650 €55 GCG TTA TTC GAT CAT GAA GGA AAA GGT ATT CGT ACC GCA ACG GGC TGG 3156

Ala Leu Phe Asp His Glu Gly Lys Gly lie Arg Thr Ala Thr Gly Trp 660 GSS 670 675 CTC GCT GCG GAT GAC GGT TTT TTA GTG TTA GAT CGT AAC CAA GAC GGC 32 04

Leu Ala AJLa Asp Asp Gly Phe Leu Val Leu Asp Arg Αεη Gin Asp Gly 680 685 690 ATT ATT AAT GAT ATA AGC GAG TTA TTT AGT AAT AAA AAT CAA CTT TCC 3252 lie lie Asn Asp lie Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn Gin Leu Ser 695 700 705 GAC GGC AGT MT TCT GCA CAC GGT TTT GCG ACA TTA GCC GA丁 TTG GAT 3 3 00

Asp Gly Ser lie Ser Ala His Gly Phe Ala Thr Leu Ala Asp Leu Asp 710 715 720 ACA AAC CAA GAT CAG CGT ATC GAC CAA ΆΆΊ GAT AAG CTG TTT TCT ΛΑΑ 33 4 8

Thr Asn Gin Asp Gin Arg lie Asp Gin Asn Asp Lys Leu Phe Ser Lys 725 730 735 CTC CAA ATT TGG CGG GAT TTA AAT CAA AAC GGT TTT AGT GAA GCG AAT 3 3 56 heu Gin lie Trp Arg Asp Leu Asn Gin Asn Gly Phe Ser Glu Ala Asn 740 745 750 755 GAG CTG TTT AGC TTA GAA AGT TTG AAT ATT AAA TCT TTA CAT ACC GCC 3444

Glu Leu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Asn lie hys Ser Leu His Thr Ala 760 765 770 TAT GAA GAG CGT AAT GA丁 TTT CTA GCG GGC AAT AAT ATC CTT GCT CAG 3492

Tyx Glu Glu Arg Aen Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn lie Leu Ala Gin 775 780 7B5 CTT GGG AAG TAT GAA AAA ACG GAC GGT ACT TTT GCA CXk ATG GGC GAT 3540

Leu Gly Lys Tyx Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Ala Gin Met Gly Asp 7S0 755 800

TTA ΑΛΤ TTC AGT TTT AAC CCG TTT TAT AGC CGA TTT ACC GAA GCG TTA 35BB

Leu Asn Phe Ser Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr Glu Ala Leu B05 810 815 AAT TTA ACC GAG CAA 0ΆΆ CGT CGC ACA ATT AAT 0ΤΛ ACC GGC ACC GGT 3636

Asn Leu Thr Glu Gin Gin Arg Arg Thx lie Asn Leu Thr Gly Thr Gly 820 825 630 B35 -71 - (68)1241407 CGG GTT CGG GAT TTG CGT GAA GCC GCC GCA C丁丁 TCT GAG GAG 丁丁G GCT Axg Val Arg Asp Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Ala 8^0 845 850 GC丁丁ΤΑ TTA CAA CAG TAC ACT AAG GCC TCC GAT ΤΊΤ CAG GCA CAA CGA Ala Leu -Leu Gin Gin Tyx Thr Lys Ala Sex Αερ Phe Gin Ala Gin Arg B55 860 B65 GAA TTA TTG CCT GCC ATT TTA GAT AAA TGG GCG GCA ACG GAT TTA CAG Glu Leu Leu Pro Ala lie Leu Αερ Lys Trp Ala Ala Thr Ajsp Leu Gin 870 8*75 880 TAT CAA CAT TAT GAT AAA ACA TTA CTT AAA ACG GTA GAA AGT ACC GAT Tyr Gin His Tyr Asp Lys Thr Leu Leu Lye Thr Val Glu Ser Thr Asp 885 BSO 895 AGT AGT GCT TCT GTC GTT AGA GTC ACG CCT TCT CAA TTA AGT AGT ATA Ser Ser Ala Ser Val Val Arg Val Thr Pro Ser Gin Leu Ser Ser lie 300 905 910 S15 CGC AAT GCA AAG CAT GAT CCT ACC GTT ATG CAA AAC TIT GAA CAG AGT Arg Asn Ala Lys His Asp Pro Thr Val Met Gin Aeti Phe Glu Gin Ser 920 925 930 AAG GCA AAA ATT GCG ACT TTA AAT TCG CTC TAC GGG TTA AAT ATC GAT Lys Ala Lys lie Ala Thr Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Leu Asn lie Asp 335 940 545

CAA CTT TAT TAC ACG ACG GAT AAA GAC ATT CGC TAT ATT ACT GAT ΑΑΛ Gin Leu Tyx Tyr Thr Thr Αερ Lys Αερ lie Arg Tyr lie Thr Asp Lvs 950 355 S60 * GTG AAT AAT ATG TAT CAA ACA ACC GTA GAA C1T GCC TAC CGT TCT TTA Val Asn Ajsn Met Tyr Gin Thr Thr Val Glu Leu Ala Tyr Arg Ser Leu 9€5 970 975 CTT TTA CAA ACG CGT TTG AAG AAA TAT GTT TAT AGC GTT AAT GCG AAA Leu Leu Gin Thr Arg Leu Lys Lys Tyr Val Tyr Ser Val Asn Ala Lys 9BV 9BS 990 995 'CAA TTC GAA GGG AAA TGG. GTA ACC GAT TAT TCT CGT ACT GAA GCC TTA

Gin Phe Glu Gly Lys Trp Val Thr Asp Tvr Ser Arg Thr Glu Ala Leu 1000 1005 1010 TTT AAC TCT ACT TTT AAA CAA TCG · CCT GAA AAT GCA TTA TAT GAT TTA Phe Asn Ser Thr Phe Lys Gin Ser Pro Glu Asn Ala Leu Tyx Asp Leu 1015 1020 1025 AGC GAA TAC CTT TCT TTC TTT AAC GAT CCT ACG GAA TGG AAA GAA GGG

Ser Glu Tyr Leu Ser Phe Phe Asn Asp Pro Thr Glu Trp Lys Glu Gly-103.0 1035 1040 CTA ΊΤΑ CTG TTA AGC CGT TAT ATA GAT TAT GCT AAA GCA CAA GGA 'ΤΊΤ Leu Leu Leu Leu Ser Arg Tyr lie Asp Tyr Ala Lye Ala Gin Gly Phe 1045 1050 1055 TAT GAA AAC TGG GCG GCT ACT TCT AAC TTA ACT ATT GCC CGT TTA AGA Tyr Glu Asn Trp Ala Ala Thr Ser Asn Leu Thr lie Ala Arg* Leu Ara 1060 1065 1070 1075 GAG GCT GGA GTA ATT TTT GCA GAA TCG ACG GAT TTA AAA GGC GAT GAA

Glu Ala Gly Val lie Phe Ala Glu Ser Thr Asp Leu Lys Gly Asp Glu 1080 10Θ5 1090 AAA AAT AAT ATT TTG TTA GGT AGC CAA AAA GAT AAT AAC TTA TCG GGT

Lys Asn Asn lie Leu Leu Gly Ser Gin Lys Asp Asn Asn Leia Ser Gly 1095 1100 1105

AGT GCA GGT GAT GAT CTA CTT ATC GGC GGA GAG GGT AAT GAT ACG TTA Ser Ala Gly Asp Asp Leu Leu He Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Leu 1110 1115 1120 AAA GGC AGC TAC GGT GCA GAC ACC TAT ATC 丁丁丁 AGC AAA GGA CAC GGA Lys Glv Ser Tyr Glv Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly His Gly 1125 - 1130 .1135 CAG GAT ATC G丁丁 TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC CGC GCA AGA GAT Gin Asp He Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg Asp 1140 1145 1150 1155 ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACC GAT GTG ΑΆΤ TAT GCG GAA GTG AAG TTT lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val Lys Phe 1160 11€5 1170 CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT CAT GAT ACG GAT 3684 3732 3 7 80 3828 3876 3924 3972 4020 4068 4116 4164 4212 4260 4308 4356 4404 4452 4500 4548 4596 4644 ^692

-72- (69) 1241407

Axg Val Asp Αεη Αερ Leu Met Leu Phe Gly Tyr His Asp Thr Aep " 1175 1180 1185

TCG GTC ACG G丁A AAA TCC TIC TAC AGC CAT GTA GAT TAT CAA 丁丁T GAC

Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His Val Asp Tyr Gin Phe Αερ 1190 11S5 1200

TTG GAG TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGC GAT GAA CTG ATT AAA

Lys Leu Glu Phe Ala Ajsp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu lie Lys 1205 1210 1215

OCA GGG CTT CAT CTA TAC GGC ACC GAT GGC AAT G^T GAT ΑΤΛ AAG GAT A_la Gly Leu Kis Leu Tyr Gly Thr Αερ Gly Asn Asp Asp He Lys Asp 1220 1225 1230 1235

CLAT GCG GAT TGG GAC AGC ATT TTG GAA GGC GGC AAA GGC AAC GAT ATT

His Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asn Asp lie 1240 '1245 1250

CTTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC TTT AGC AAA GGA CAC

Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly His 1255 1260 1265

GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC CGC GCA AGA

Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg Ala Arg 1270 1275 1280

GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT GTG AAT TAT GCG GAA GTG AAA

Asp lie Asp Thr Leu Lye Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu Val Lys 1285 1250 1235

TTC CGA--CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT CAT GAT ACG

Pile Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr Ηίε Αερ Thr X300 1305 1310 1315

GAT TCG GTC ACG ATA AAA TCC TTC TAC AAC CAT GTA GAT TAT CAA TTT

Asp Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyx Asn Hie Val Asp Tyx Gin Phe 1320 1325 1330.

GAC ΑΑΆ TTG GAA TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGT GAT GAA CTA GGT

Asp Lys beu Glu Phe Ala Asp Arg. Ser lie Thr Arg Asp Glu Leu Gly 1335 1340 1345

AAA CAA GGT ATG GCA TTA TTT GGC ACT GAC GGT GAT GAT AAT ATC AAC

Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp Ajsh lie Asn 1350 1355 1360

GAC TGG GGA CGT AAC TCG GTG ATT GAT GCC GGT GCG GGT AAT GAT. ACG

Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala Gly Ala Gly A^n Asp Thr· 1365 1370 1375

GTT AAT GGC GGT AAT GGC GAT GAC ACC CTC ATC GGC GGC AAA GGT AAT

Val Asn Gly Gly Asin Gly Asp Aep Thr Leu He Gly Gly Lys Gly Asn 1380 1385 1390 1395

GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC TTT AGC AAA Αερ lie Leu Arg Gly Gly Tyx Gly Ala Asp Thr Tyr lie Phe Ser Lys 1400 1405 1410

GGA CAC G<5A CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC CGC

Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Αερ Thr Asn Asn Asp Asn Arg 1415 1420 1425

GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACC GAT GTG AAT TAT GCG GAA

Ala Arg Asp lie A^p Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu 1430 1435 1440

GTG AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT CAT

Val Lys Phe iorg >jrg Val Αερ Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly TVx His 1“5 1450 1455

GAT ACG GAT TCG GTC ACG GTA AAA TCC TTC TAC AGC CAT GTA GAT TAT

Asp Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His Val Asp Tyr 1460 1465 1470 1475

CAA TTT GAC AAA TTG GAG TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGC GAT GAA

Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Aep Glu 1480 2485 1490

CTG ATT AAA GCA GGG CTT CAT CTA TAC GGC ACC GAT GGC AAT GAT GAT

Leu lie Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr'Asp Gly Asn A^p Asp 1495 1500 1505

ATA AAG GAT CAT GCG GAT TGG GAC AGC ATT ΤΊΧ； GAA GGC GGC AAA GGC lie Lys Asp Kis Ala Asp Trp Asp Ser He Leu Glu Gly Gly Lye Gly 4 740 4 7 88 4836 4684 4932 4980 5028 5076 5124 5172 5220 5268 5316 5364 5412 5460 5508 5556 5604 5652 5700 -73- (70) 1241407 1510 1515 1520 AAC GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC 丁ΊΤ AGC 5 74 8

Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Αερ Thr Tyr lie Fhe Ser 1525 1530 1535 AAA GC-A CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC AAT AAT GAT AAC 5796

Lys Gly His Gly Gin Asp He Vai Tyr Glu Asp Thr Asn Aan Asp Asn 1540 1545 1550 1555 CGA GCA AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT GTG AAT TAT GCG 5844

Axg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Vai Asn Tyr Ala 1560 1565 1570 GAA GTG AAA TTC CGA CGA GTA GAT AAT GAC TTA ATG TTA TTC GGT TAT 5892

Glu Vai Lys Phe Arg Arg Vai Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr 1575 1580 1585 CAT GAT ACG GAT TCG GTC ACG ATA AAA TCC TTC TAC AAC CAT GTA GAT 5940

His Asp Thr Asp Ser Vai Thr lie Lys Ser Phe Tyr Asn His Vai Asp 1590 1595 1600 TAT CAA TTT GAC AAA TTG GAA TTT GCT GAC CGC AGT ATA ACT CGT GAT 5 98 8

Tyr Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp 1605 1610 1615 GAA CTA GGT AAA CAA GGT ATG GCA TTA TTT GGC ACT GAC GGT GAT GAT 6036

Glu Leu Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp 1620 1625 1630 1635 AAT ATC AAC GAC TGG GGA CGT AAC TCG GTG ATT GAT GCC GGT GCG GGT 6084

Asn Ile _Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Vai 工le Asp Ala Gly Ala Gly 1640 1645 1650 AAT GAT ACG GTT AAT GGC GGT AAT GGC GAT GAC ACC CTC ATC GGC GGC 6132

Asn Asp Thr Vai Asn Gly Gly Asn Gly Aep Asp Thr Leu lie Gly Gly 1655 1660 1665 ΑΛΑ GGT AAT GAT ATT CTA AGA GGT GGC TAC GGT GCG GAC ACC TAT ATC 6180

Lys Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyx lie 1670 . 1675 · 1680 TTT AGC AAA GGA CAC GGA CAG GAT ATC GTT TAT GAA GAT ACC ΆΑΊ AAT 6228

Phe Ser Lys Gly His Gly Gin Asp He Vai Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 1685 16SO 1655 GAT AAC CGC GCA' AGA GAT ATC GAC ACC TTA AAA TTT ACT GAT ATT AAT 6276 Αερ Asn Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp lie Αεη 1700 1705 1710 1715 TTA TCC GAA CTT TGG TTT AGC CGA GAA AAT AAC GAT TTG ATT ATT AAA 6324

Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn Asp Leu lie lie Lys 1720 1725 1730 TCA TTA TTA AGT GAG GAT AAA GTC ACG GTT CAA AAT TGG TAT TCA CAC 6372

Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Vai Thr Vai Gin Asn Trp Tyr Ser His 1735 1740 1745 CAA GAT CAT AAA ATA GAA AAT ATT CGT TTA TCG AAT GAG CAA ACG TTG 6420

Gin Αερ His Lys lie Glu Asn He Arg Leu Ser Asn Glu Gin Thr Leu 1750 1755 1760 GTG AGC ACT CAG GTG GAG AAG ATG GTT GAG TCG ATG GCC GGC TTT GCT .6468

Vai · Ser Thr Gin Vai Glu Lys Met Vai Glu Ser Met Ala Gly Phe Ala . 17G5 1770 1775 CAG AAG CAC GGA GGA GAG ATA. TCT CTT GTG TCG CTT GAA GAG GTA AAA 6516

Gin Lys His Gly Gly Glu lie Ser Leu Vai Ser Leu Glu Glu Vai Lys 1780 1785 1790 1795 CAA ΤΛΤ ATC AAT AGC TTA ACA GCT GCT ΤΓΑ ΊΆΑ CATACGAAAG AAATCGGCAC 6569

Gin Tyr lie Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu ， 1800 1805 AGTTTTTTTG AACTGTGCCG ATTTGATTTT AGTGTAAGAA TATAGCCTGA TTTTAAGAAA 6623 TTTACTCTTG GC了AATAACT ATTTCCCATT 丁丁ATAAGTTA TTGACGGATG GTITTATCAA 6689 ATATGAGATC AAATCTTATT TTAAATTCGC TTTCCATTAA GCGATAT 6736 -74- (71) (71)1241407 (2 ) S E Q ID Ν Ο : 6 的資料 (I )序列特徵· (A )長度：1 5 1個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (II )分子種類：蛋白質 (XI)序列描述：S E Q ID N 0 : 6 : lie Asp Met Pro Pro Gly Thr Gly Asp lie Gin Leu Thr Leu Gin 1 5 10 15

Gin lie Pro Val Thr Gly Ala Val Val Val Thr Thr Pro Gin Asp lie 20 25 30

Ala Leu Leu Asp Ala Val Lys Gly He Ser Met Phe Gin Lys Val Ser 35 40 45

Val Pro Val Leu Gly lie lie Glu Asn Met Ser Val His lie Cys Gin 50 55 6〇 Λετι Cys Gly His His Glu Asp He Phe Gly Thr Gly Gly Ala Glu Lvs 65 70 75 80

Val Ala Lys Lys Tyr Gly Thx Lys Val Leu Gly Gin Met Pro Leu His 85 90 95 lie Arg Leu Arg Gin Asp Leu Asp Ala Gly Thr Pro Thr Val Val Ala 100 105 110

Ala Pro Glu His Gin Thr Ser Arg Ala Tyr lie Glu Leu Ala Ala Lys 115 120 125

Val Ala Ser Glu Le*u Tyx Trp Gin Gly Ser Val lie Pro Ser Glu lie 130 135 140

Met He Arg Glu' Val Lys 145 150 (2) SEQIDNO: 7 的資料 (I )序列特徵： (A )長度：1 8 0 6個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓蹼學：直線 (Π )分子種類：蛋白質 -75 - (72) (XI)序列描述：SEQIDNO: 7:

Met Thr Lvs Leu Thr Met Gin Asp Val Thr Asn Leu Tyr Leu Tyr Lys 1 - 5 10 15

Thr Lys Thr Leu Pro Lys Αερ Arg Leu Asp Asp Ser Leu lie Ser Glu 20 25 30 lie Gly Lys Gly A-sp Asp Asp lie Asp Arg Lye Glu Phe Met Val Gly 35 40 45

Pro Gly Arg Phe Val Thr Alai Asp Asn Phe Ser Val Val Arg Aj9p Phe 50 55 60

Phe Asn Ala Gly Lys Ser Arg lie lie Ala Pro Gin Val Pro Pro lie 65 70 75 80

Arg Ser Gin Gin Glu Lys lie Leu Val Gly Leu Lys Pro Gly Lys Tyx 85 90 95

Ser Lys Ala Gin lie Leu Glu Met Leu Gly Tyr 丁hr Lys Glv Gly Glu 100 105 110

Val Val Asn Gly Met Phe Ala Gly Glu Val Gin Thr Leu Gly Phe Tyr 115 120 125

Asp Asp Gly Lys Gly Asp Leu Leu Glu Arg Ala Tyr lie Trp Asn Thr 130 135 140

Thr Gly Phe Lyb Met Ser Αερ Asn Ala Phe Phe Val lie Glu Glu Ser 145 150 155 160

Glv Lvs Arc? Tvr lie Glu Asn Phe Gly lie Glu Pro Leu Gly Lys Gin -** ^ ' 165 170 175

Glu Asp Phe Asp Phe Val Gly Gly Phe Trp Ser Asn Leu Val Asn Arg 180 185 ^ 190

Gly Leu Glu Ser lie lie Ajsp Pro Ser Gly lie Gly Gly Thr Val Asn 195 200 205 (73) 1241407

Leu Αετ^ Phe Thr Gly Glu Val Glu Thr Tyr Thr Lrevi Asp Glu Thr Axg 210 215 220

Phe Lvs Ala Glu Ala Ala Lys Lys Ser His Tro Ser Leu Val Asn Ala 225 * 230 235 240

Als Lys Val Tyr Glv Gly Leu Ajbp Gin lie lie Lys Lye Leu Τΐφ Asp 245 250 255

Ser Gly Ser He Lvs His Leu Tyr Gin Asp Lys Asp Thr Gly Lys Leu 260 * 265 270

Lys Pro lie lie Tyr Gly Thr Ala Gly Αεη Asp Ser Lys lie Glu Gly 275 280 2S5

Thr Lys lie Thr Arg Arg lie Ala Gly Lys Glu Val Thr Leu Asp lie 290 255 300

Ala Αεη Gin Lys lie Glu Lys Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Ser 305 310 315 320

Val Ser Gly Ser Asp lie lie Lys Leu Leu Phe Gly Ala Leu Thr Pro 325 . 330 335

Thr Leu Αεη Arg Met Leu Leu Ser Gin Leu lie Gin Ser Phe Ser Asp 340 345 350

Ser Leu Ala Lys Leu Asp Αεη Pro Leu Ala Pro Tyr Thr Lys Asn Gly 355 360 365

Val Val Tyr Val Thr Gly Lys Gly Asn Asp Val Leu Lys Gly Thr Glu 370- 375 3B0

His Glu Asp Leu Phe Leu Gly Gly Glu Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Ala 385 . 390 395 400

Krg Val Gly Asp Thr lie Glu Asp Ala Asp Gly Lys Gly Lys Val Tyr 405 410 415

Pile Val Arg Glu Lys Gly Val Pro Lys Ala Asp Pro Lye Arg Val Glu 420 425 430

Phe Ser Glu Tyr He Thr Lys Glu Glu He Lys Glu Val Glu Lys Gly 435 440 445

Leu Leu Thr Tyr Ala Val I；eu Glu Asn Tyr Asn Trp Glu Glu Lys Thr 450 455 <60

Ala Thr Phe Ala His Ala Thr Met . Leu Asn Glu Leu Phe Thr Asp Tyr 465 470 475 480 丁hr Asia Tyr Arg Tyr Glu Val Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ala Val Lys 485 490 495

Lys Leu Lys Ser Pro Leu Val Glu Phe Thr Ala Asp Leu Leu Thr Val 500 505 510

Thr Pro lie Asp Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ser Gl*u Lys Ser lie Thr 515 520 525

Val Lys Asn Phe Lys Asn Gly Asp Leu Gly lie Arg Leu Leu Asp Pro 530 535 540

Asn Ser Tyr Tyx Tyr Phe Leu Glu Gly Gin Asp Thr Gly Phe iyr Gly 545 550 555 560

Pro Ala Phe Tyr lie Glu Arg Lys Asn Gly Gly Gly Ala Lys Asn Asn 565 570 575

Ser Ser Gly Ala Gly Asn Ser Lys Asd Trp Gly Gly Αεη Gly His Gly 580 、 5B5 550

Asn His Arq Asr. Asn Ala Ser Asp Leu Asn Lys Pro Asp Gly Asn Asn 59S 600 605

Gly Αεη Asn Gin Asn Asn Gly Ser Asn Gin Asp Αεη Ηίε Ser Asp Val 610 615 620

Asn Ala Pro Asn Asn Pro Gly Arg Asn Tyr Asp lie Tyr Asp Pro Leu 625 630 635 640

Ala Leu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Leu Glu Thr Val Ser Met Αεη Gly

645 650 GSS

Arg Gin Gly Ala Leu Phe Aep His Glu Gly Lys Gly lie Arg Thr Ala •77- (74) 1241407 660 665 670

Thr Glv Trp Leu Ala Ala Asp Asp Gly Phe Leu Val Leu Asp Arg Asn "67 5 680 GB5

Gin Asp Gly lie lie Asn Asp lie Ser Glu Leu Phe Ser Asn Lys Asn 690 655 700

Gin Leu Ser Asp Gly Ser He Ser Ala His Gl^ Phe Ala Thr Leu Ala 705 710 71 720

Asp Leu Asp Thr Asn Gin Asp Gin Ara lie Asp Gin Asn Asp Lys Leu 725 730 735

Phe Ser Lys Leu Gin lie Trp Arg Asp Leu Asn Gin Asn Gly Phe Ser 740 745 750

Glu Ala Asn Glu Leu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Asn lie Lys Ser Leu 755 760 765

His Thr Ala Tyr Glu Glu Arq Asn Asp Phe Leu Ala Gly Asn Asn lie 77

7BO

Leu Ala Gin Leu Gly Lys Tyr Glu Lys Thr Asp Gly Thr Phe Ala Gin

785 79S BOO

Met Gly Asp Leu Asn Phe Ser Phe Asn Pro Phe Tyr Ser Arg Phe Thr 805 810 B15

Glu Ala Leu Asn Leu Thr Glu Gin Gin Axg Arg Thr lie Asn Leu Thx 820 825 830

Gly Thr Gly Arg Val Arg Asp Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Glu B35 B40 845

Glu Leu Ala Ala Leu Leu Gin Gin Tyr Thr Lys Ala Ser Asp Phe Gin 850 855 860

Ala Gin Arg Glu Leu Leu Pro Ala lie Leu Asp Lvs Trp Ala Ala Thr 865 870 87¾ - 880

Asp Leu Gin Tyr Gin His Tyr Asp Lys Thr Leu Leu Lys Thr Val Glu 885 850 895

Ser Thr Asp Ser Ser Ala Ser Val Val Arg Val Thr Pro Ser Gin Leu 900 905 310

Ser Ser lie Arg Asn Ala Lys His Asp Pro Thr Val Met. Gin Asn Phe 915 920 925

Glu Gin Ser Lys Ala Lys lie Ala Thr Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Le'u S30 935 540

Asn lie Asp Gin Leu 545 950

Tyr Thr Thr Asp Lys Asp He Arg Tyr lie 955 960

Thr Asp Lys Val Asn Asn Met 565

Gin Thr Thr Val Glu Leu Ala Tyr 970 975

Arg Ser Leu Leu Leu Gin Thr Arg Leu Lys Lys Tyr Val Tyr Ser Val 980 5B5 990

Asn Ala Lys Gin Phe Glu Gly Lys Trp Val Thr Asp 995 1000

Tyr Se 1005 r Arg Thr

Glu Ala Leu Phe Asn Ser Thr Phe Lys Gin Ser Pro Gl\i Asn Ala Leu 1010 1015 1020 Tyr Asp Leu Ser Glu Tyr Leu Ser Phe Phe Asn Αερ Pro Thr Glu Trp 1025 1030 1035 1040 lie Asp Tyr Ala Lys Ala

Lys Glu Gly Leu Leu Le*u Leu Ser Arg 1045

Ty: 10! 50 1055

Gin Gly Phe Tyr Glu Asn Trp Ala Ala Thr Ser Asn Leu Thr lie Ala 1060 1065 1070

Arg Leu Arg Glu Ala Gly Val lie Phe Ala Glu Ser Thr Asp Leu Lys 1075 1080 · 1085

Gly Asp Glu Lys Asn Asn lie Leu LeO Glv Ser Gin Lys Asp Asn Asn 1090 1095 * 1100

Leu Ser Gly Ser Ala Gly Asp Asp I»eu Leu lie Gly Gly Glu Gly Asn 1105 - 1210 1115 1120 -78^ (75) 1241407

Asp Thr Leu Lys Gly Ser Tyr Gly Ala A<sp Thr Tyr 工le Phe Ser Lys 1125 1130 1135 Glv Kis Glv Gin Asp lie Val T>^r Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn Arg • " 1140 1145 1150 Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lye Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu 1155 1160 1165

Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Αερ Leu Met Leu Phe Gly 1170 1175 1180 ryr Ser His Val Asp Tyr 1155 1200

Asp Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe 11B5 1190

Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp Glu 1205 1210 1215 Leu lie Lys Ala Gly Leu His Leu Tyx Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp 1220 1225 1230 lie Lys Asp His Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly Gly Lys Gly 1235 1240 1245 Asn Asg lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Alsi Asp Thr Tyr lie Phe Ser 1250 1255

Lye Gly His Gly Gin Asp lie Val 1265 1270 1260 Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn 1275 1280

Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyx Ala 1285 1290 1295

Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr 1300 · ·1305 1310

His Asp Thr Αερ' Ser Val Thr lie Lys Ser Phe Tyr Asn Hie Val Asp 1315 1320 1325

Tvr Gin Phe Asp Lys L.eu Glu Phe Ala Asp Arg Ser lie Thr Arg Asp • 1330 1335 1340

Glu Leu Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp 13-4 5 1350 1355 1360

Asn lie Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala Gly Ala Gly 1365 1370 1375

Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu lie Gly Gly 1380 1385 1330

Gly Ala Asp Thr Tyr lie 1405

Lys Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly 1395 1400

Phe Ser Lys Gly His Gly Gin A^p lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn' 1410 1415 1420

Asp Asn Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn 1425 1430 1435 1440

Tyr Ala Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe 1445 1450 1455

Gly Tyr His A^p Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His 1460 1465 1470

Val Asp Tyr Gin Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Axg Ser lie Thr 1475 1480 1485

Ara Asp Glu Leu lie Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly "1490 1435 1500

Asn Asp Asp lie Lye Αερ His Ala Asp Trp Asp Ser lie Leu Glu Gly 1505 1510 1515 1520

Glv Lys Gly Asn Asp lie Leu Arg Gly Gly Tyr Giy Ala Asp Thr Tyr J 1525 1530 1535 lie Phe Ser Lvs Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp Thr Asn 1540 1545 1550

Asn Asp Asn Arg Ala Arg Asp lie Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val 1555 1560 15β5

Asn Tyr Ala Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Αερ Asn Αερ Leu Met Leu (76) 1241407 1570 157 5 1580

Phe Gly Tyr His Asp Thr Asp Ser Val 丁hr lie Lye Ser Phe Tyr Asn 1585 His Val Asp 15S0 15S5 1600

Gin Phe Asp Lys Leu G1o Phe Ala Asp Arg Ser lie 1605 1610 1615

Thr Arg Asp Glu Leu Gly Lys Gin Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp 1620 16^5 1630

Glv A^p Asp Asn He Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val lie Asp Ala 一 1635 1640 1645

Gly Ala Gly Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu 1650 1655 1660 lie Gly Gly Lys Gly Asn Αερ lie Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp 1665 1670 1675 1680

Thr Tyr lie Phe Ser Lys Gly His Gly Gin Asp lie Val Tyr Glu Asp 1685 1690 1655

Thr Asn Asn Asp Asn Axg Ala Arg Asp Il*e Asp Thr Leu Lys Phe Thr 1700 1705 1710 1715 1725

Asp lie Asn Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn A日n Asp Leu ---- 1720 ---- lie lie Lys Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gin Asn Trp 1730 1735 1740

Tvr Ser His Gin Asp His Lys lie Glu Asn He Arg Leu Ser Asn Glu 1745 1750 1755 1760

Gin Thr Leu Val Ser Thr Gin Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala " 3L765 17*7 0 1775

Gly Phe Ala Gin Lys His Gly Gly Glu lie Ser Leu Val Ser Leu Glu 1780 1785 1730

Glu Val Lys Gin Tyr lie Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu 1795 1800 1B05

-8ΓΚ

Claims

1241407

年月 >i. 6. 一一— 拾、申請專利範圍 ^ 第9 3 1 1 2 4 9 2號專利申請案附件2A : 中文申請專利範圍替換本民國94年6月30 日修正 1 · 一镡區分豬隻感染胸膜肺炎放射菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)和豬放射菌（Actinobacillus suis)之診斷試驗方法，其包含酶聯免疫吸附分析（ELISA )，其包含利用純化之 ApxIV毒素塗覆盤之孔槽，藉由欲測試豬隻之血淸培育該經塗覆之盤，及藉由經標記之抗豬抗體培育所生成之盤以顯現存在或不存在拮抗該ApxIV毒素之抗體，或蛋白質吸漬（Western blot )分析，其包含利用欲測試豬隻之血淸培育包含純化之ApxIV毒素的蛋白質吸漬片以偵測存在或不存在特定之抗A p XIV抗體。