CN112118865A - 肺炎球菌表面蛋白a(pspa)的表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的表达。本发明代表了基因工程和疫苗技术领域的进步。本发明公开了用于表达截短PspA肽的表达载体和重组宿主细胞。本发明还公开了包含作为载体蛋白的截短肽的疫苗组合物。
Description
技术领域
本发明涉及截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)在细菌中的高水平表达。
背景技术
肺炎链球菌是中耳炎、脑膜炎、菌血症和肺炎的重要病因，也是老年人和基础性疾病患者致命感染的主要原因。链球菌疫苗接种的一个有吸引力的目标是减少在接种疫苗的人群中的携带，并随后减少肺炎球菌疾病的发生率。
以品牌名称Pneumovax23销售的肺炎球菌多糖疫苗对2岁以下的儿童无效。多糖疫苗在这一人群中的无效性归因于婴儿免疫系统在B细胞受体表达方面的不成熟。多糖(PS)与载体蛋白的结合将其由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原。作为T细胞依赖性抗原，多糖可引起对同种型转换、记忆细胞生成的应答和可增强的免疫应答。
膜蛋白存在于膜中并跨膜，通过膜它们用于转运分子或促进细胞粘附。蛋白可以通过促进扩散(即，被动运输)或主动运输来协助物质的运动。肺炎球菌表面蛋白A(PspA)是一种膜蛋白，是附着在所有肺炎链球菌菌株细胞壁上的另一个重要毒力因子。
通过肺炎球菌蛋白，特别是PspA1或其片段代替通用载体蛋白，例如破伤风类毒素(TT)或CRM 197，除了扩大疫苗覆盖率外，还可以防止由于在结合疫苗中过度使用相同的载体蛋白引起的免疫应答受损。表达质粒经过工程改造，以包含充当增强子和启动子区域的调节序列，并导致表达载体上携带的基因的有效转录。设计良好的表达载体的目标是有效生产蛋白，这可以通过合成大量稳定的信使RNA来实现。可以设计一种表达载体，该表达载体对表达施加严格控制，并且仅在必要时通过使用合适的表达条件才能大量生产蛋白。
在没有严格控制基因表达的情况下，蛋白也可以组成性表达。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性发酵细菌，其被广泛用于大量生产谷氨酸单钠。由于其稳定的遗传特性和缺乏任何内毒素，谷氨酸棒杆菌被归类为GRAS生物体(通常被认为是安全的)。不清楚该细菌分泌任何细胞外蛋白酶，因此它成为在培养基中产生异源蛋白的有吸引力的平台。这可以使用表达质粒构建体来实现，该构建体可以大量合成重组蛋白。
EP2310502 B1公开了Ptac启动子在构建体中的用途，其中在LB培养基中生长含有IPTG诱导的ftsZ和minCDE缺失突变的大肠杆菌菌株。
Nokano等人，J Bacteriol.1984 Jan；157(1):79-83公开了卡那霉素抗性基因在质粒构建体中的用途，以使转化的菌株获得对卡那霉素具有抗性的性质。
Masai等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jul；84(l4):4781-5公开了用于启动R1质粒复制并与oriR序列相互作用的RepA蛋白。
Nayak等人，Infect.Immun.-l998-Nayak-3744-51公开了表达肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的口服重组沙门氏菌活疫苗株。
Nabors等人，Vaccine 18(2000)1743-54公开了重组截短PspA作为胞质蛋白在大肠杆菌中的表达。
Figueredo等人，Appl Microbiol Biotechnol(2017)101:2305-2317公开了未标记的重组肺炎球菌表面蛋白A(PspA4Pro)的生产和纯化。
上述参考文献公开了表达载体的遗传成分或肺炎球菌表面蛋白A在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)中的表达。
发明人已经鉴定了肺炎球菌表面蛋白的免疫原性片段。此后，发明人付出了巨大的努力来开发能够在细菌中高水平地稳定和组成型或可诱导地表达截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)的表达构建体。
因此，本发明打算通过制备用于表达截短肺炎球菌表面蛋白的表达载体和重组宿主细胞来克服现有技术的挑战。此外，发明人已经制备了包含截短蛋白作为载体蛋白的疫苗组合物。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种表达构建体，用于在细菌中高水平表达截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)。
本发明的另一个目的是提供一种表达构建体，该表达构建体能够在细菌中稳定地且组成性地或诱导地表达高水平的截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)。
发明内容
本发明提供了一种能够高水平表达如SEQ ID NO:3和4描述的截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)的表达构建体。
本发明提供了一种包含编码如SEQ ID NO:5和6描述的截短pspAl的基因的表达构建体。
本发明提供了一种用于在细菌中高水平表达如SEQ ID NO:3或4描述的截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)的表达构建体，其包含：
a)编码如SEQ ID NO:5或6描述的截短pspA1的基因，
b)复制原点，
c)抗生素抗性基因，
d)启动子，和
e)核糖体结合位点。
本发明还涉及用于高水平表达截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)的方法，该方法包括培养用表达构建体转化的细菌，从而纯化表达的蛋白。
附图说明
图1：小图A示出了pBE31C的示意图。小图B示出了由Rx1 PspA1的推导氨基酸序列描绘的pspA结构域的示意图。小图C示出了pBE117的示意图。小图D示出了含有RBS、天然信号肽、截短pspA1、天然终止子和trrnB的PCR扩增子。
图2：肽指纹分析中截短PspA1的蛋白质序列覆盖率。
图3：谷氨酸棒杆菌中表达的截短PspA1的完整质量分析。
图4：由陶瓷羟基磷灰石(CHT-II)柱洗脱的截短PspAl。
图5：由阴离子交换柱洗脱的截短PspAl。
图6：渗滤后的截短PspA1。
图7：肺炎球菌多糖血清型3(A)、6A(B)和6B(C)的结合反应动力学的SEC-HPLC色谱图。
图8：免疫兔针对来自血清型3、6A、6B(2.2mcg)的肺炎链球菌多糖与截短pspA 1载体蛋白的不同结合物的血清抗体滴度。
图9：免疫兔针对来自血清型3、6A、6B(4.4mcg)的肺炎链球菌多糖与截短pspA 1载体蛋白的不同结合物的血清抗体滴度。
图10：小图A示出了pBE114k的示意图。小图B示出了通过限制性消化对pBE114k的确认。
图11：由CHT I色谱法洗脱的截短PspAl。
图12：由Capto Q Impress色谱法洗脱的截短PspAl。
图13：MALDI对PspA1的蛋白质覆盖率。
图14：对在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的截短PspA1的完整质量分析。
具体实施方式
术语PspA1是指来自肺炎链球菌的肺炎球菌表面蛋白A1。
本发明涉及截短PspAl(肺炎球菌表面蛋白A1)在细菌中的高水平表达。适于PspA1的高水平表达的细菌是谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。
在一个实施方式中，本发明涉及如SEQ ID NO:3描述的截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)在谷氨酸棒杆菌中的高水平表达。
在另一个实施方式中，本发明涉及如SEQ ID NO:4描述的截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)在大肠杆菌中的高水平表达。
本发明提供了一种能够高水平表达如SEQ ID NO:3描述的表面蛋白的表达构建体。
本发明还提供了一种能够高水平表达如SEQ ID NO:4描述的表面蛋白的表达构建体。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于在谷氨酸棒杆菌中高水平表达如SEQID NO:3描述的截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)的表达构建体。
在又一个实施方式中，本发明涉及一种用于在大肠杆菌中高水平表达如SEQ IDNO:4描述的截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)的表达构建体。
本发明涉及一种用于在谷氨酸棒杆菌中高水平表达截短PspA1的表达构建体，其包括：
i.ori R复制原点，
ii.卡那霉素抗性基因，
iii.Ptac启动子，
iv.编码截短PspA1(SEQ ID NO:5)的目的基因。
本发明还涉及一种用于在大肠杆菌中高水平表达截短PspA1的表达构建体，其包括：
i.pUC复制原点
ii.卡那霉素抗性基因
iii.PT7启动子
iv.编码截短PspA1(SEQ ID NO:6)的目的基因。
在一个实施方式中，用于高水平表达截短pspA1的表达构建体还包含核糖体结合位点(RBS)。RBS包含在正向引物中，且一小段含有天然终止子的DNA包含在用于进一步扩增截短PspA1的反向引物中。RBS(核糖体结合位点)是表达构建体中的磷酸丙糖异构酶用于在谷氨酸棒杆菌中表达截短PspA1。
在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphate isomerase gene)的PspA1信号肽编码区(天然)、截短pspA1、Ptac启动子和核糖体结合位点(RBS)。
在一个优选的实施方式中，本发明提供了用于在谷氨酸棒杆菌中高水平表达截短PspA1(SEQ ID NO:3)的表达构建体，其包含：
a.编码截短PspA1(SEQ ID NO:5)的基因，
b.ori R复制原点(SEQ ID NO:12)，
c.卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO:1)，
d.Ptac启动子(SEQ ID NO:2)和
e.磷酸丙糖异构酶核糖体结合位点。
在另一个优选的实施方式中，本发明提供了用于在大肠杆菌中高水平表达截短PspA1(SEQ ID NO:4)的表达构建体，其包含：
a)编码截短pspA1(SEQ ID NO:6)的基因，
b)pUC复制原点，
c)卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO:1)，
d)PT7启动子(SEQ ID NO:11)和
e)核糖体结合位点。
肺炎球菌表面蛋白A(PspA)是一种膜蛋白，是发现附着在所有肺炎链球菌菌株细胞壁上的重要毒力因子，并且正如已被证明具有高免疫原性一样是有前景的组分。
在本发明的一个特定实施方式中，截短PspA1用作载体蛋白。结合疫苗中使用的载体蛋白优选是无毒且无反应原性并且可以大量和纯净形式获得的蛋白。可以将载体蛋白与从病原菌分离的荚膜多糖结合以增强多糖的免疫原性。载体蛋白应符合标准的化学结合程序。
谷氨酸棒杆菌中的截短PspA1被分泌到细胞外培养基中。分泌到细胞外培养基中有助于有效纯化。
本发明涉及在谷氨酸棒杆菌中高水平表达截短PspA1，其中从肺炎链球菌的23F荚膜血清型连同上游区域扩增截短pspA1基因的N末端区域以及脯氨酸丰富区域。
在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含磷酸丙糖异构酶基因的截短pspA1、Ptac启动子和核糖体结合位点(RBS)。
在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含截短pspA1、PT7启动子和核糖体结合位点(RBS)。
将表达构建体电穿孔到谷氨酸棒杆菌中，并在卡那霉素作为选择标记的LB平板上选择。
Ptac是强大的杂合启动子，由trp启动子的-35区和lacUV5启动子/运算符的-10区组成。
pspA序列从GenBank获得，并从蛋白质数据库比对。设计引物以特异性扩增天然信号肽编码区、N末端区域以及属于家族1和2的pspA基因的脯氨酸丰富区域。从可用的肺炎链球菌临床分离株扩增所需的pspA1和pspA2区域。MHC肽分析表明，pspA1具有比pspA2相对更多的免疫原性。
在谷氨酸棒杆菌中表达和产生的编码截短PspA1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中，观察到完整质量为35452道尔顿。
在大肠杆菌中表达和产生的编码截短PspA1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4中，观察到完整质量为41966道尔顿。
在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中表达的编码截短pspA1的DNA序列分别示于SEQ IDNO:5和SEQ ID NO 6中。
用于表达截短pspA1的谷氨酸棒杆菌(先前称为产谷氨酸微球菌)是GRAS微生物革兰氏阳性棒状细菌。谷氨酸棒杆菌是GRAS微生物。可获得谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的整个基因组序列，其可以生长至更高的细胞密度，并且由于缺乏重组修复系统而在遗传上也是稳定的。它具有有限的限制修饰系统。它没有自溶作用，并且可以在生长停滞的条件下维持代谢活性。它具有低的蛋白酶活性，有利于重组蛋白生产。它的新陈代谢的可塑性和强大的次生代谢特性、利用广谱碳源(戊糖、己糖和替代碳源)的能力、对碳源的耐受力使其成为用于异源蛋白生产的有前景的宿主。这些生理特性使谷氨酸棒杆菌可以在强大的工业条件下进行操作和培养，因此使其成为成功的工业主力。在谷氨酸棒杆菌中报道了诸如α-淀粉酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、GFP、木聚糖酶的蛋白质的异源表达。
在本发明的一个实施方式中，截短PspA1的产量为为约500mg/L、约400mg/L、约300mg/L、约250mg/L、约220mg/L、约200mg/L、约180mg/L、约160mg/L、约150mg/L、约120mg/L、约100mg/L。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种肺炎球菌结合疫苗，其包含来自肺炎链球菌血清型的至少一种多糖与本发明的截短PspA1或截短PspA1和其他载体蛋白的组合结合，肺炎链球菌血清型选自1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、23F、24B、24F、31、33F、34、35B、35F、38、39和45，其他载体蛋白如CRM197、破伤风类毒素、百日咳类毒素；PsaA等。
在另一个实施方式中，本发明提供了选自10价、14价、15价、17价、18价、19价、20价、22价、23价、24价或25价的多价肺炎球菌疫苗组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型的多糖与本发明的截短PspA1或与截短PspA1和其他载体蛋白的组合结合，肺炎链球菌血清型选自1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、23F、24B、24F、31、33F、34、35B、35F、38、39和45，其他载体蛋白如CRM197、破伤风类毒素、百日咳类毒素；psaA等。
在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种多价结合疫苗，其包含与本发明的截短PspA1结合的至少三种来自肺炎链球菌血清型3、6A和6B的多糖。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种结合疫苗，其包含来自与本发明的截短PspA1结合的肺炎链球菌血清型3、6A和6B的多糖和与CRM197结合的肺炎链球菌血清型1、4、5、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。
本发明提供了包含2.2μg或4.4μg的来自各自与本发明的截短PspA1结合的血清型3、6A和6B的每种肺炎球菌多糖和约2.2μg的来自各自与CRM197结合的血清型1、4、5、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的每种肺炎球菌多糖的制剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种单次0.5mL剂量的肺炎球菌疫苗组合物，该单次剂量包含约2.2至4.4μg的一种或多种肺炎球菌多糖；约1μg至约50μg的与一种或多种肺炎球菌多糖的每一种结合的本发明的截短PspA1；约0.2mg至约1mg的磷酸铝佐剂；和赋形剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种单次0.5mL剂量的肺炎球菌疫苗组合物，该单次剂量包含约2.2至4.4μg的一种或多种肺炎球菌多糖；约1μg至约30μg的与一种或多种肺炎球菌多糖中的每一种结合的本发明的截短PspA1；约1μg至约30μg的与一种或多种肺炎球菌多糖中的每一种结合的CRM197；约0.2mg至约1mg的磷酸铝佐剂；和赋形剂。
在另一个实施方式中，本发明还提供了通过施用将通过将本发明的截短PspA1与肺炎球菌多糖结合而制备的结合疫苗，来预防由肺炎链球菌引起的侵袭性疾病的疫苗。
实施例
提供以下实施例以例示本发明，仅用于说明目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：截短PspA1在谷氨酸棒杆菌中的重组表达。
pBE31C的构建
使用具有2.692Kb pNG2 oriR序列的合成质粒，产生小稳定复制的广宿主范围质粒pBE30。使用该质粒DNA作为模板，使用引物pEP-Fl(5’-GCG CGG ACT AGT AGA TCT ATGGTA AAT CTG CGC AGA CAG-3’)和pEP-Rl(5’-GCG CGG ACT AGT GAA TTC GGT GAG GTTATG GCG-3’)扩增1.8Kb oriR区域。
同时，使用pUC4-KIXX模板DNA和Kan-F2(5’-AAG GTC CCG GGA TGG CGA TAG CTAGAC TGG GCG GT-3’)和Kan-R2(5’-AAG GTC CCG GGG GTT GGG CGT CGC TTG GTC GG-3’)引物扩增1.033Kb kanR序列。将kanR基因扩增子和oriR扩增子二者平端连接以产生pBE30载体。此外，使用各自附有Spe I限制酶切位点的Ptac-Fl(5’-GG AGC ACT AGT CTG AAA TGAGCT GTT GAC AAT TAA TC-3’)和Ptac-Rl(5’-GG AGC ACT AGT TTT AAA CAT GAG CGG ATACAT ATT TGA A-3’)引物扩增包含串联的tac lac UV5启动子、多克隆位点、lacZa组分和TrrnB终止子序列的0.851Kb表达盒。用于扩增表达盒的模板DNA是pMMB206(ATCC37808)。之后，将表达盒克隆到在pBE30质粒中设计的唯一SpeI位点。如此获得的质粒称为pBE31C(图1A；SEQ ID NO:14)。
pBE117的构建
从肺炎链球菌的23F荚膜血清型连同上游区域扩增截短PspAl基因(N末端区域以及脯氨酸丰富区域，图1B)。使用引物PSPAF1_FP(5’ATG AAT AAG AAA AAA ATG ATT TTAACA AGT CTA GCC 3’)和PSPAF1_RP(5’CGA GAG AGA TCT AAA TTA AAA TGT CAA ATG TTCTTA ACA TGC TTT AAT TTT TAT TTT GGT GC 3’)将其克隆到TA载体(来自Fermentas的pTZ57R/T)中并序列验证。这被指定为pTZ-PspAl。天然终止子序列包括在反向引物PSPAF1_RP中。将进化枝限定区域映射到获得的截短PspA1序列中，以证实其属于PspA蛋白的家族1。
为了在谷氨酸棒杆菌中表达截短PspA1，选择Ptac启动子(SEQ ID NO:2)和属于棒杆菌属的磷酸丙糖异构酶基因(SEQ ID NO:7)的核糖体结合位点(RBS)，使用引物-SDTICGR0949_FP5(5’GAG CGA TGG ATC CTA GAA AGG TGT GTT TCA CCC ATG AAT AAG AAAAA 3’)和PSPA2_2RP(5’TCA AAT GTT CTT AAC ATG CTT TAA TTT TTA TGG TGC AGG AGCTGG TTG 3’)和pTZ-PspA 1作为模板扩增psp A1基因以及包括RBS的完整盒、天然信号肽(SEQ ID NO:8)、截短PspA l基因、天然终止子(SEQ ID NO:10)。RBS包含在正向引物SDTICGR0949_FP5中。rrn B终止子(SEQ ID NO:13)从内部可得到的pBE31C中扩增区域，并使用通过重叠延伸(SOE)PCR剪接连接至编码截短PspA1的基因。使用TER FP2(5’ATG TTAAGA ACA TTT GAC ATT TTA ATT TCG GCA CTG GCC GTC GTT 3’)和TER RP3(5’GCG AT ATGG ATC CCA TGA GCG GAT ACA 3’)扩增rrnB基因。设计PSPA2 2RP和TER FP2使得有17个碱基的重叠。扩增子pspA1和rrn B以1:1的摩尔比添加，并用作带有引物SDTICGR0949_FP5(5’GAG CGA TGG ATC CTA GAA AGG TGT GTT TCA CCC ATG AAT AAG AAA AA 3’)和TER_RP3(5’GCG ATA TGG ATC CCA TGA GCG GAT ACA3’)的SOE PCR的模板。随后，用附加在正向(SDTICGR0949_FP5)和反向引物(TER_RP3)上的限制性内切酶消化包括RBS的整个扩增子、天然信号肽(SEQ ID NO:8)、截短pspA l基因、天然终止子(SEQ ID NO:8)、rrnB终止子，并克隆到为棒杆菌属制备的表达载体pBE31C中。将所得克隆命名为表达构建体pBEH7(图1C；SEQ ID NO:15)。下文将表达载体以及截短PspA1一起称为表达构建体。通过PCR分析确认插入物的方向(图1D)。通过DNA测序确认截短PspA1基因的序列及其表达盒。
截短PspA1的表达
将表达构建体电穿孔到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，并在卡那霉素作为选择标记的LB平板上选择。挑选二十个重组谷氨酸棒杆菌菌落，并通过PCR进行分析。选择五个菌落用于截短pspA1的组成型表达。将重组菌落以及谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(作为阴性对照)一起接种到具有25μg/ml终浓度的卡那霉素的10ml的非常丰富的培养基中，并在35℃下伴随在200rpm下摇动进行孵化。在16小时后，在10ml的上述相同培养基中进行二次接种，使得最终OD为0.1。伴随在200rpm下振荡将培养物在35℃下孵化18-20h。在18小时后，检查培养物上清液中截短pspA1的表达。将30μl的上清液加载到12％的SDS-PAGE上并分析截短pspA1表达。在约45kDa观察到一个突出的带。
使用N末端表位特异性pspA多克隆抗体(SantaCruz)进行的Western分析确认截短PspA1的表达。将重组克隆5的表达分析放大至500ml，并确认截短PspA1的表达至少3次。最初使用1型CHT从摇瓶实验中纯化截短PspA1，且Capto Q impress达到接近99％的纯度。随后，在确认截短PspA1在谷氨酸棒杆菌中的一致表达后，该表达被放大至1.5L。
截短PspAl的纯化和验证
将从上游获得的含有1.6L(0.66mg/ml)的截短PspA1的800ml培养上清液透析至10kDa，并浓缩至260ml(1.92mg/ml)。使用1型CHT和Capto Q impress对70ml的这种透析浓缩物进行纯化。截短pspA1的最终回收率为162mg/L。
含有来自SDS-PAGE的纯化的截短PspA1的凝胶塞的MALDI MS/MS分析给出肺炎球菌表面蛋白A的明确的命中得分为233。具有NCBI蛋白id ABY67187.1的pspA蛋白显示31％(图2)的序列覆盖率。完整的分子量分析表明，表达的截短PspA1的分子量为35.4kDa。该质量与截短的pspAl的理论分子量匹配。17725.4处的峰是电荷为2的分子的峰，因此在m/z中，该峰出现在截短pspA1完整质量的一半处。(图3)
实施例2：截短PspA1的生产
从LB培养基中的来源库中再生具有包含截短PspA 1(以下称为PspA1)基因的表达构建体的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。将其用于接种发酵罐(5L；CSTR)。生产过程期间监控的参数为pH、DO、温度(△T)、碳源、代谢物。采用基于过程自动化技术(PAT)的补料策略来进行截短PspA1发酵的短补料分批。没有产物(截短PspA1)的基于诱导的控制，因为这是生长相关的产物。在半合成培养基中收获时，收获的OD为约90(OD6oonm)。收集细胞并用PBS洗涤，然后在弗氏压碎器中破坏细胞。
截短PspAl的纯化
从20L的发酵批次中收集16.2L的废培养基、总蛋白质浓度为0.8mg/mL。通过使用10kDa 0.5m2盒将16.2L的废培养基浓缩至2.6L(3.6mg/mL)，然后对20mM的磷酸钾pH-6.8进行Dia过滤，浓度为3.2ms/cm。将该2.6L分成两批次，即具有1.4L的批次1和具有1.2L的批次2，并进行进一步纯化。在HiScale 50/40色谱柱中填充500ml的CHT I树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用8个柱体积(CV)的20mM磷酸钾pH-6.8(缓冲液A)平衡。将1400mL(3.6mg/mL)的废培养基浓缩液(批次1)上样至色谱柱，并收集流过液。用5倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。使用250mM的磷酸钾pH-6.8(缓冲液B)以阶梯梯度洗脱PspA1。阶梯梯度涉及5CV的步骤-40％B，5CV的步骤-80％B和3CV的0.5M的磷酸钾缓冲液。在整个运行过程中，流速保持在80mL/min。在步骤-80％B的级分1中收集PspA1，级分体积为1250mL。(图4)
Capto Q Impress用作PspA1纯化的第二色谱步骤。在XK 50/20色谱柱中填充250ml的Capto Q Impress树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用5个柱体积(CV)的20mM磷酸钾和100mM的NaCl，pH-6.8(缓冲液A)平衡。用20mM的磷酸钾(pH-6.8)将1250mL的CHT I级分稀释至2300mL，上样到色谱柱上并收集流过液。用5倍柱体积的缓冲液A洗涤色谱柱。用12CV的缓冲液B(20mM的磷酸钾和1M的NaCl，pH-6.2)以0-40％B的线性梯度洗脱PspA1，最后一步为3CV的100％B。收集250mL的每个级分。流速保持在40mL/min。以40％B的线性梯度收集PspAl，合并级分体积为1250mL。(图5)
合并4、5、6、7和8的Capto Q级分，用20mM的pH-6.8的磷酸钾浓缩/渗滤。从批次1获得的最终回收物为100mL的PspAl，浓度为15.5mg/mL的蛋白质(总PspAl为1550mg)。批次2遵循类似的过程，获得的最终回收率为70mL的PspAl，批次2的浓度为16mg/mL(总PspAl为1120mg)。来自批次1和批次2的纯化的PspAl为2670mg的来自16.2L批次(纯化的PspA1产量为164mg/L)。(图6)
实施例3：pBE114K的构建
表达载体pRSET A(来自Invitrogen的商业载体)通过使用Dral限制性消化去除氨苄青霉素抗性基因并与Smal消化的卡那霉素编码基因(从pUC4 KIXX获得)连接而被修饰。将该修饰的载体命名为pRSET-km。截短PspA1在pRSET-km的PT7启动子(SEQ ID NO:11)下在大肠杆菌中表达。含有天然终止子的短DNA片段被包括在用于进一步扩增PspA1的反向引物中。随后，扩增完整的截短PspA基因及其天然终止子，用附加在正向和反向引物中的限制酶消化，并克隆到pRSET-km载体中。所得克隆命名为pBEH4k(图10A)。下文将表达载体以及截短PspA1一起称为表达构建体。通过限制性消化确认表达构建体pBEH4k(图10B)。通过DNA测序确认截短PspA1基因的序列及其表达盒。
截短PspA1的表达
将pBEH4k转化到大肠杆菌DH5α-T1R化学感受态细胞(购自Invitrogen)中，并在卡那霉素作为选择标记的LB平板上进行选择。挑选40个重组大肠杆菌菌落并通过PCR进行分析。选择所有40个菌落用于截短PspA1的诱导表达。将重组菌落与大肠杆菌(作为阴性对照)一起接种到具有25μg/ml终浓度的卡那霉素的10ml的非常丰富的培养基中，并在37℃下伴随在200rpm下摇动进行孵化。在对数中期，加入1mM IPTG以诱导PspA1在大肠杆菌(pBel14k)中的表达。诱导后，将培养物在30℃下以200rpm振荡孵化16小时。在16小时后，检查培养物上清液中截短PspA1的表达。通过离心收集细胞，裂解并上样到12％SDS-PAGE上，并分析截短PspA1表达。在约65kDa观察到一个突出的带。使用N末端表位特异性PspA多克隆抗体(SantaCruz)进行的Western分析确认截短PspAl的表达。确认重组克隆29的表达分析用于表达截短PspA1至少3次。最初使用1型CHT和Capto Q impress从摇瓶实验中纯化截短PspA1。
截短PspAl的纯化和验证
取40克(湿重)的来自大肠杆菌(pBEH4k)的细胞团块，并将其重新悬浮于400ml的含1mg/ml溶菌酶和1mM的PMSF的20mM的磷酸钾缓冲液pH-6.8中。使用高压匀浆器在1000psi下裂解细胞悬液3次。用20mM的磷酸钾缓冲液pH-6.8将400mL的总蛋白浓度为4mg/mL的细胞裂解液稀释至750mL，并使用CHT I树脂纯化，然后Capto Q Impress作为第二色谱法纯化。
在HiScale 50/20色谱柱中填充250ml的CHT I树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用5倍柱体积(CV)的缓冲液A平衡。将750mL的稀释的细胞裂解液上样至柱中并收集流过液。用5倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。使用250mM的磷酸钾pH-6.8，cond-29.5ms/cm(缓冲液B)以阶梯梯度洗脱PspA1。阶梯梯度涉及5CV的步骤-50％缓冲液B，5CV的步骤-80％缓冲液B并将色谱柱用3CV的0.5M磷酸钾缓冲液pH-6.8，Cond-48ms/cm(缓冲液C)洗脱。在整个运行过程中，流速保持在40mL/min。手动收集PspA1蛋白的峰级分，步骤-80％B的5、6和7的洗脱级分合并，最终体积为350mL(图11)。
Capto Q Impress用作PspA1纯化的第二色谱步骤。在XK 26/20色谱柱中填充60ml的Capto Q Impress树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用5个柱体积(CV)的20mM磷酸钾和100mM的NaCl，pH-6.8，con-13.6ms/cm(缓冲液A)平衡。用l mM的磷酸钾(pH-6.8)将350mL的CHT I级分稀释至700mL，上样到色谱柱上并收集流过液。用5个柱体积的缓冲液A洗涤色谱柱。使用线性梯度10CV的缓冲液B(20mM的磷酸钾和1M NaCl，pH-6.2，cond-89ms/cm)以0至40％的线性梯度洗脱PspA1。手动收集B级分，级分4至8、10和11为60mL，且9和12为100mL级分(图12)。收集最终步骤的3CV的100％B，收集180mL作为级分13。流速维持在10mL/min。收集PspA1蛋白，其中线性梯度为40％的级分9为100mL。
收集9的Capto Q级分，用20mM的磷酸钾pH-6.8浓缩/渗滤。获得的最终回收率是来自浓度为4mg/mL的400mL的细胞裂解物的100mL的PspAl，浓度为5mg/mL的蛋白质(总PspA1蛋白为500mg)。回收率％是31.25。
含有来自SDS-PAGE的纯化的截短PspA1的凝胶塞的MALDI MS/MS分析给出肺炎球菌表面蛋白A的明确的命中得分为223。具有NCBI蛋白id WP 050210652.1的PspA蛋白显示39％(图13)的序列覆盖率。
完整的分子量分析表明，表达的截短PspA1的分子量为41.96kDa。在大肠杆菌中表达的截短PspA1的完整质量分析显示41966Da(41.9kDa)，与截短PspA1的理论分子量相符。20982.7Da处的峰是电荷为2的分子的峰，因此在m/z中，该峰出现在截短PspA 1完整质量的一半处。(图14)。
实施例4：单独的肺炎球菌多糖与载体蛋白的结合以形成多糖截短PspAl结合物
血清型3的活化和与截短PspA1结合
在玻璃小瓶中混合约1:1比例的调整尺寸的血清型3(6.0mF的PS，浓度为10mg/mF)和CDAP(乙腈中的100mg/mF(w/v))并搅拌1分钟。用0.2M三乙胺将肺炎球菌多糖血清型3的pH调节至9.25，并在室温(RT)下搅拌3分钟。将截短PspA1(4.0mF的浓度15.0mg/mF)以1:1的比例添加到活化的血清型3中(截短PspAl：血清型3)。
用0.2M的三乙胺将反应的pH调节至约9.05，并在室温下在搅拌下继续反应5小时，最后通过加入过量浓度的甘氨酸使反应淬灭。
使用100kDa的MWCO膜对反应混合物进行渗滤，并通过尺寸排阻色谱法进行纯化，其中实线表示多糖，虚线表示截短PspAl，且五小时反应用色谱图A中的虚线表示(图7)。通过SEC-MAFFS蒽酮方法分析级分，合并包含结合物的级分，并用0.2μ过滤器无菌过滤。从现在开始，这种材料被称为单价结合物本体(血清型3-截短PspAl结合物)。
血清型6A的活化和与截短PspA1结合
在玻璃小瓶中混合约1:1比例的调整尺寸的血清型6A(6.0mF的PS，浓度为10mg/mF)和CDAP(乙腈中的100mg/mF(w/v))并搅拌1分钟。用0.2M的三乙胺将肺炎球菌多糖血清型6A的pH调节至9.25，并在室温(RT)下搅拌3分钟。将截短PspA1(4.0mF的浓度15.0mg/mF)以1:1的比例添加到活化的血清型6A中(截短PspAl：血清型6A)。
用0.2M的三乙胺将反应的pH调节至约9.05，并在室温下在搅拌下继续反应5小时，最后通过加入过量浓度的甘氨酸使反应淬灭。
使用100kDa的MWCO膜对反应混合物进行渗滤，并通过尺寸排阻色谱法进行纯化，其中实线表示多糖，虚线表示截短PspAl，且五小时反应用色谱图B中的虚线表示(图7)。通过SEC-MALLS蒽酮方法分析级分，合并包含结合物的级分，并用0.2μ过滤器无菌过滤。从现在开始，这种材料被称为单价结合物本体(血清型6A-截短PspAl结合物)。血清型6B的活化和与截短PspA1结合
血清型6B的活化和与截短PspA1结合
在玻璃小瓶中混合约1:1比例的调整尺寸的血清型6B(6.0mF的PS，浓度为10mg/mL)和CDAP(乙腈中的100mg/mL(w/v))并搅拌1分钟。用0.2M的三乙胺将肺炎球菌多糖血清型6B的pH调节至9.25，并在室温(RT)下搅拌3分钟。将截短PspA1(4.0mL的浓度15.0mg/mL)以1:1的比例添加到活化的血清型6B中(截短PspAl：血清型6B)。
用0.2M的三乙胺将反应的pH调节至约9.05，并在室温下在搅拌下继续反应5小时，最后通过加入过量浓度的甘氨酸使反应淬灭。
使用100kDa的MWCO膜对反应混合物进行渗滤，并通过尺寸排阻色谱法进行纯化，其中实线表示多糖，虚线表示截短PspAl，且五小时反应用色谱图C中的虚线表示(图7)。通过SEC-MALLS蒽酮方法分析级分，合并包含结合物的级分，并用0.2μ过滤器无菌过滤。从现在开始，这种材料被称为单价结合物本体(血清型6B-截短PspAl结合物)。
实施例5：结合疫苗的免疫原性研究
制备包含2.2μg或4.4μg的各自与截短PspA1结合的血清型3、6A和6B的两种制剂，包含2.2μg的各自与CRM197结合的血清型1、4、5、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。这些结合物被吸附到铝水凝胶上。
将体重为1.5至2kg的兔子分成每组7只动物，并用上述结合物制剂免疫。在免疫之前和之后分析血清样品。在间接ELISA中分析获自免疫兔子的血清中多糖特异性抗体的存在。
通过间接ELISA评估免疫兔的血清抗体滴度。使涂覆有特定多糖的微量滴定板与血清抗体反应。在免疫前，第1次和第2次给药后的兔血清用于分析，其中Y轴表示抗体滴度，使用最大稀释度的倒数得出，从而使ELISA OD450高于截止点。免疫前兔子的血清抗体滴度低于检测极限。空心条表示第一剂疫苗施用后的滴度，而黑色实心条表示第二剂疫苗后的抗体滴度(图8和9)。截短PspA1结合的血清型和CRM 197结合的血清型滴度均存在剂量依赖性的增加。截短PspA1结合物的存在没有抑制CRM197结合的多糖的滴度，反之亦然。这表明截短PspA1可用作多糖蛋白结合疫苗的替代载体蛋白。
SEQUENCE LISTING
<110> 生物E有限公司
<120> 肺炎球菌表面蛋白A的表达
<130> pspA1
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 卡那霉素抗性基因
<400> 1
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg ggatggagcc gggtcttgtc gatcagatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 杂合启动子
<400> 2
ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt 30
<210> 3
<211> 310
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌
<400> 3
Glu Asp Ala Pro Val Ala Asn Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Lys Arg Asp Ala Glu Asn Ala Lys Lys Ala Leu Glu Asp Ala
20 25 30
Lys Arg Ala Gln Lys Lys Tyr Lys Asp Asp Gln Lys Ile Thr Glu Glu
35 40 45
Lys Ala Glu Glu Glu Lys Lys Ala Ser Gln Glu Gln Gln Lys Ala Asn
50 55 60
Leu Asp Tyr Gln Gln Lys Leu Arg Lys Tyr Ile Asn Glu Lys Asp Ser
65 70 75 80
Lys Lys Arg Ser Met Leu Gln Lys Glu Met Glu Glu Ala Glu Arg Lys
85 90 95
Asp Lys Glu Lys Gln Ala Glu Phe Lys Lys Ile Arg Glu Lys Val Ile
100 105 110
Pro Ser Ala Glu Glu Leu Thr Glu Thr Arg Arg Lys Ala Glu Glu Ala
115 120 125
Glu Ala Lys Glu Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val Lys Glu Ala Glu Glu
130 135 140
Lys Val Thr Glu Ala Lys Gln Lys Leu Asp Ala Glu Arg Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Ala Leu Gln Ala Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Glu Val His Arg
165 170 175
Leu Glu Thr Lys Leu Lys Glu Ile Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr
180 185 190
Val Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu Asp Ala Lys
195 200 205
Gln Ala Lys Leu Ser Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu
210 215 220
Leu Asp Ala Glu Ile Ala Lys Leu Glu Lys Asp Val Glu Asp Phe Lys
225 230 235 240
Asn Ser Asp Gly Glu Tyr Ser Ala Leu Tyr Leu Glu Ala Ala Glu Lys
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu
260 265 270
Lys Lys Ala Val Asp Glu Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr
275 280 285
Pro Ala Pro Glu Ala Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
290 295 300
Gln Pro Ala Pro Ala Pro
305 310
<210> 4
<211> 369
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌
<400> 4
Glu Asp Ala Pro Val Ala Asn Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Lys Arg Asp Ala Glu Asn Ala Lys Lys Ala Leu Glu Asp Ala
20 25 30
Lys Arg Ala Gln Lys Lys Tyr Lys Asp Asp Gln Lys Ile Thr Glu Glu
35 40 45
Lys Ala Glu Glu Glu Lys Lys Ala Ser Gln Glu Gln Gln Lys Ala Asn
50 55 60
Leu Asp Tyr Gln Gln Lys Leu Arg Lys Tyr Ile Asn Glu Lys Asp Ser
65 70 75 80
Lys Lys Arg Ser Met Leu Gln Lys Glu Met Glu Glu Ala Glu Arg Lys
85 90 95
Asp Lys Glu Lys Gln Ala Glu Phe Lys Lys Ile Arg Glu Lys Val Ile
100 105 110
Pro Ser Ala Glu Glu Leu Thr Glu Thr Arg Arg Lys Ala Glu Glu Ala
115 120 125
Glu Ala Lys Glu Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val Lys Glu Ala Glu Glu
130 135 140
Lys Val Thr Glu Ala Lys Gln Lys Leu Asp Ala Glu Arg Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Ala Leu Gln Ala Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Glu Val His Arg
165 170 175
Leu Glu Thr Lys Leu Lys Glu Ile Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr
180 185 190
Val Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu Asp Ala Lys
195 200 205
Gln Ala Lys Leu Ser Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu
210 215 220
Leu Asp Ala Glu Ile Ala Lys Leu Glu Lys Asp Val Glu Asp Phe Lys
225 230 235 240
Asn Ser Asp Gly Glu Tyr Ser Ala Leu Tyr Leu Glu Ala Ala Glu Lys
245 250 255
Asp Leu Ala Ala Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu
260 265 270
Lys Lys Ala Val Asp Glu Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr
275 280 285
Pro Ala Pro Glu Ala Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
290 295 300
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys
305 310 315 320
Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg
325 330 335
Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala
340 345 350
Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Lys
<210> 5
<211> 933
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌
<400> 5
gaagacgctc ctgtagctaa ccagtctaaa gctgagaaag actatgatgc agcgaagaga 60
gatgctgaga atgcgaaaaa agctttagag gacgcaaaac gtgcgcagaa aaaatataag 120
gatgatcaga agataactga ggagaaagcg gaagaagaaa aaaaagcttc tcaagagcaa 180
caaaaagcaa atctggacta tcaacaaaag ttgaggaaat atattaacga aaaagactcc 240
aaaaaaagat ctatgcttca gaaagaaatg gaggaagctg agagaaaaga taaggaaaaa 300
caagcagaat ttaagaagat tagagaaaag gtgattccta gcgcggaaga gttaacagag 360
actagacgaa aagcagaaga ggctgaagca aaagaaccag agcttactaa aaaagtaaaa 420
gaagctgagg aaaaagttac tgaagccaaa caaaaattgg atgctgaacg tgctaaagaa 480
gttgctcttc aagccaaaat cgctgagttg gaaaatgaag ttcatagact agaaacaaaa 540
ctcaaagaga ttgatgaatc tgactcagaa gattatgtta aagaaggtct ccgtgctcct 600
cttcaatctg aattggatgc taagcaagct aaactatcaa aacttgaaga gttgagtgat 660
aagattgatg agttagacgc tgaaattgca aaacttgaaa aagatgtaga agatttcaaa 720
aactcagacg gtgaatattc tgcattatat cttgaagctg cagaaaaaga tttagctgct 780
aaaaaagctg aattagaaaa aactgaagct gacctcaaga aagcagttga tgagccagaa 840
aaaccagctc cagctccaga aactccagcc ccagaagcac cagctgaaca accaaaacca 900
gcgccggctc ctcaaccagc tcctgcacca taa 933
<210> 6
<211> 1110
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌
<400> 6
gaagacgctc ctgtagctaa ccagtctaaa gctgagaaag actatgatgc agcgaagaga 60
gatgctgaga atgcgaaaaa agctttagag gacgcaaaac gtgcgcagaa aaaatataag 120
gatgatcaga agataactga ggagaaagcg gaagaagaaa aaaaagcttc tcaagagcaa 180
caaaaagcaa atctggacta tcaacaaaag ttgaggaaat atattaacga aaaagactcc 240
aaaaaaagat ctatgcttca gaaagaaatg gaggaagctg agagaaaaga taaggaaaaa 300
caagcagaat ttaagaagat tagagaaaag gtgattccta gcgcggaaga gttaacagag 360
actagacgaa aagcagaaga ggctgaagca aaagaaccag agcttactaa aaaagtaaaa 420
gaagctgagg aaaaagttac tgaagccaaa caaaaattgg atgctgaacg tgctaaagaa 480
gttgctcttc aagccaaaat cgctgagttg gaaaatgaag ttcatagact agaaacaaaa 540
ctcaaagaga ttgatgaatc tgactcagaa gattatgtta aagaaggtct ccgtgctcct 600
cttcaatctg aattggatgc taagcaagct aaactatcaa aacttgaaga gttgagtgat 660
aagattgatg agttagacgc tgaaattgca aaacttgaaa aagatgtaga agatttcaaa 720
aactcagacg gtgaatattc tgcattatat cttgaagctg cagaaaaaga tttagctgct 780
aaaaaagctg aattagaaaa aactgaagct gacctcaaga aagcagttga tgagccagaa 840
aaaccagctc cagctccaga aactccagcc ccagaagcac cagctgaaca accaaaacca 900
gcgccggctc ctcaaccagc tcccgcacca aaaccagaga agccagctga acaaccaaaa 960
ccagaaaaaa cagatgatca acaagctgaa gaagactatg ctcgtagatc agaagaagaa 1020
tataaccgct tgactcaaca gcaaccgcca aaagcagaaa aaccagctcc cgcaccaaaa 1080
ccagagcaac cagctcctgc accaaaataa 1110
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 7
tagaaaggtg tgtttcaccc 20
<210> 8
<211> 93
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌
<400> 8
atgaataaga aaaaaatgat tttaacaagt ctagccagcg tcgctatctt aggggctggt 60
tttgttgcgt cttcgcctac tgttgtaaga gca 93
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌
<400> 9
Met Asn Lys Lys Lys Met Ile Leu Thr Ser Leu Ala Ser Val Ala Ile
1 5 10 15
Leu Gly Ala Gly Phe Val Ala Ser Ser Pro Thr Val Val Arg Ala
20 25 30
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌
<400> 10
aaattaaagc atgttaagaa catttgacat tttaattt 38
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PT7 启动子
<400> 11
taatacgact cactatagg 19
<210> 12
<211> 1854
<212> DNA
<213> 白喉棒杆菌
<400> 12
gaattcggtg aggttatggc ggagggttgc gaggtctagg agaacagagg aagtcatgct 60
ttgaagcata taagctgccc tgcccctcaa ggttttcttc aagtgaggtt ttatctaact 120
gcctaacggc aggggaaccg tatattgctt acggtatgag accccttaaa cgtccggata 180
gtcaccgctc ttctttagct ccgcgacatg cctagcaacc gtggcgcgag agactcctac 240
ctctgcccct atttcagccc acgtgggaac tgtccctgtc tggaaatact gatcgttcac 300
catttggcta atacgggact tcgtagatcg tccttgagcc tttttcttac ggtgcgtctt 360
ttcaagcttc gacctttgtg cttgcgcata tttgccctcg gggtctgttt tccagcgttg 420
tgcggctttt tgtccgcctc tgcgtcccat cgtggccaag gctttccgct cgctgctggt 480
ggctttacct ggtgcgttag agccgctgta ggtctcgctc ttggattggg cgacataccc 540
gcgcacgcgc cttgccatgg tttggcggtc gcgcatgggt ggcatctcgt tgtcgcggcc 600
tgcaccgccg tgggtgtgtg cgacgttgta ggcgtgctca taggcgtcga tgattgctgc 660
gtctgtcagg cgttggcctt gctggcgcaa gcggtggcca gtcttaagcg catgtctaaa 720
ggctgtttcg tcgcgtgctg cggttccttg gacaatccag agcacacgca caccgtcgat 780
aagttccggg tcatactggt cgagaccacc ggcgatttcc gcgtctacgt cctgggcgag 840
tgctttgaat gcttgggctt cttcacggcg ggtcttgacc gcgttgataa gttcgcggcc 900
agagctgaat tgctggcgtg gggtggggtt gaactggtcg tgtcctgcca tatcccttac 960
ctgctttatc aagtctccaa ggcgcatcac ccggttgtgc tgcctatacc aacgataagc 1020
ggtaggggct ttgcctgtgt agaacgggtt gcggctaaag cggtgggaaa agtgcgggtc 1080
atggtctaaa agctcaccca gcacacgcgt ggttgctgca agaagcttca tctgcgcaga 1140
tttaccgtta cggtcagcgt agacagggtc aataagccat atgaactggg ctttgccgtt 1200
agttgggtta atacccaccc aggctggccc gacgctatga gtaatcagtg agcgcaccac 1260
gtcgcggacg tacgggttta agtctgcggg gtcaccgcct gcggtaccta cttggtcaac 1320
gtctacgacc aggacggcgg cgtactgctt ggtggtgagc atggcgtact cgcaccgtcc 1380
taaagcatca gtctcgaagc gatacatacg cggcgagttc gtgccgtcag cgttgcgtcg 1440
ataggccttt ttaaagtctc gtgtgactga accgtggagt acatcgcggc ctagatgatc 1500
gcgtaaaagg tcgcggtcac tggcagatgc tggggtgttg tccagtccac cacggtcgcg 1560
ctcgacgcgg gtaggtgttt tagtgtgcgc attctgcgca tgagtctgta aactcatgac 1620
cgtgatttct cccaggtgtg tgctgggtga taagcgaaag tcatcgggtt gccgcccggt 1680
ggctttcttc gtttttcatt gtctttccct gactctaaat gacaccggtg ttatttacta 1740
gccatgacac gcgaaaaata tgccttttac ctgcggttac gtatggctag acatatggca 1800
agctatacgt aaccgcgttt cagctgcaca gggctgtctg cgcagattta ccat 1854
<210> 13
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> rrnB终止子
<400> 13
cggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 60
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggctaat agcgaagagg cccgcaccga 120
tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgatggc tgttttggcg gatgagagaa 180
gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt 240
gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg 300
ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc 360
aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg 420
tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac 480
ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga 540
aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa 600
atacattcaa atatgtatcc gctcatg 627
<210> 14
<211> 3784
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> pBE31C
<400> 14
actagtctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg 60
agcggataac aatttcacac aggaaactag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 120
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 180
catgattacg aattcccggg gatccgtcga cctgcagcca agcttggcac tggccgtcgt 240
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 300
tccccctttc gccagctggc taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 360
ttgcgcagcc tgaatggcga tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 420
cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 480
gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 540
agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 600
tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 660
taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 720
ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 780
tggccttttt gcgtttctac aaactctttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 840
atccgctcat gtttaaaact agtccgaggt cccgggggtt gggcgtcgct tggtcggtca 900
tttcgaaccc cagagtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 960
ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 1020
aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 1080
cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 1140
gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg ccttgagcct 1200
ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat ctgatcgaca 1260
agacccggct ccatcccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 1320
tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 1380
tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 1440
cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 1500
cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg caccggacag 1560
gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 1620
agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 1680
cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 1740
ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 1800
tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 1860
tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatccc gggaccttct agtagatctg 1920
aattcggtga ggttatggcg gagggttgcg aggtctagga gaacagagga agtcatgctt 1980
tgaagcatat aagctgccct gcccctcaag gttttcttca agtgaggttt tatctaactg 2040
cctaacggca ggggaaccgt atattgctta cggtatgaga ccccttaaac gtccggatag 2100
tcaccgctct tctttagctc cgcgacatgc ctagcaaccg tggcgcgaga gactcctacc 2160
tctgccccta tttcagccca cgtgggaact gtccctgtct ggaaatactg atcgttcacc 2220
atttggctaa tacgggactt cgtagatcgt ccttgagcct ttttcttacg gtgcgtcttt 2280
tcaagcttcg acctttgtgc ttgcgcatat ttgccctcgg ggtctgtttt ccagcgttgt 2340
gcggcttttt gtccgcctct gcgtcccatc gtggccaagg ctttccgctc gctgctggtg 2400
gctttacctg gtgcgttaga gccgctgtag gtctcgctct tggattgggc gacatacccg 2460
cgcacgcgcc ttgccatggt ttggcggtcg cgcatgggtg gcatctcgtt gtcgcggcct 2520
gcaccgccgt gggtgtgtgc gacgttgtag gcgtgctcat aggcgtcgat gattgctgcg 2580
tctgtcaggc gttggccttg ctggcgcaag cggtggccag tcttaagcgc atgtctaaag 2640
gctgtttcgt cgcgtgctgc ggttccttgg acaatccaga gcacacgcac accgtcgata 2700
agttccgggt catactggtc gagaccaccg gcgatttccg cgtctacgtc ctgggcgagt 2760
gctttgaatg cttgggcttc ttcacggcgg gtcttgaccg cgttgataag ttcgcggcca 2820
gagctgaatt gctggcgtgg ggtggggttg aactggtcgt gtcctgccat atcccttacc 2880
tgctttatca agtctccaag gcgcatcacc cggttgtgct gcctatacca acgataagcg 2940
gtaggggctt tgcctgtgta gaacgggttg cggctaaagc ggtgggaaaa gtgcgggtca 3000
tggtctaaaa gctcacccag cacacgcgtg gttgctgcaa gaagcttcat ctgcgcagat 3060
ttaccgttac ggtcagcgta gacagggtca ataagccata tgaactgggc tttgccgtta 3120
gttgggttaa tacccaccca ggctggcccg acgctatgag taatcagtga gcgcaccacg 3180
tcgcggacgt acgggtttaa gtctgcgggg tcaccgcctg cggtacctac ttggtcaacg 3240
tctacgacca ggacggcggc gtactgcttg gtggtgagca tggcgtactc gcaccgtcct 3300
aaagcatcag tctcgaagcg atacatacgc ggcgagttcg tgccgtcagc gttgcgtcga 3360
taggcctttt taaagtctcg tgtgactgaa ccgtggagta catcgcggcc tagatgatcg 3420
cgtaaaaggt cgcggtcact ggcagatgct ggggtgttgt ccagtccacc acggtcgcgc 3480
tcgacgcggg taggtgtttt agtgtgcgca ttctgcgcat gagtctgtaa actcatgacc 3540
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gctttcttcg tttttcattg tctttccctg actctaaatg acaccggtgt tatttactag 3660
ccatgacacg cgaaaaatat gccttttacc tgcggttacg tatggctaga catatggcaa 3720
gctatacgta accgcgtttc agctgcacag ggctgtctgc gcagatttac catagatcta 3780
ctag 3784
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<211> 5501
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> pBE117
<400> 15
actagtctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg 60
agcggataac aatttcacac aggaaactag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 120
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 180
catgattacg aattcccggg gatcctagaa aggtgtgttt cacccatgaa taagaaaaaa 240
atgattttaa caagtctagc cagcgtcgct atcttagggg ctggttttgt tgcgtcttcg 300
cctactgttg taagagcaga agacgctcct gtagctaacc agtctaaagc tgagaaagac 360
tatgatgcag cgaagagaga tgctgagaat gcgaaaaaag ctttagagga cgcaaaacgt 420
gcgcagaaaa aatataagga tgatcagaag ataactgagg agaaagcgga agaagaaaaa 480
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attaacgaaa aagactccaa aaaaagatct atgcttcaga aagaaatgga ggaagctgag 600
agaaaagata aggaaaaaca agcagaattt aagaagatta gagaaaaggt gattcctagc 660
gcggaagagt taacagagac tagacgaaaa gcagaagagg ctgaagcaaa agaaccagag 720
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gctgaacgtg ctaaagaagt tgctcttcaa gccaaaatcg ctgagttgga aaatgaagtt 840
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ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 1380
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tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgatgg 2100
ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag 2160
cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat 2220
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gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg 2400
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ccgaggtccc gggggttggg cgtcgcttgg tcggtcattt cgaaccccag agtcccgctc 2640
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gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatctg atcgacaaga cccggctcca tcccgagtac 3000
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cgcatatttg ccctcggggt ctgttttcca gcgttgtgcg gctttttgtc cgcctctgcg 4080
tcccatcgtg gccaaggctt tccgctcgct gctggtggct ttacctggtg cgttagagcc 4140
gctgtaggtc tcgctcttgg attgggcgac atacccgcgc acgcgccttg ccatggtttg 4200
gcggtcgcgc atgggtggca tctcgttgtc gcggcctgca ccgccgtggg tgtgtgcgac 4260
gttgtaggcg tgctcatagg cgtcgatgat tgctgcgtct gtcaggcgtt ggccttgctg 4320
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tggcccgacg ctatgagtaa tcagtgagcg caccacgtcg cggacgtacg ggtttaagtc 4920
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ctgcttggtg gtgagcatgg cgtactcgca ccgtcctaaa gcatcagtct cgaagcgata 5040
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gggtgataag cgaaagtcat cgggttgccg cccggtggct ttcttcgttt ttcattgtct 5340
ttccctgact ctaaatgaca ccggtgttat ttactagcca tgacacgcga aaaatatgcc 5400
ttttacctgc ggttacgtat ggctagacat atggcaagct atacgtaacc gcgtttcagc 5460
tgcacagggc tgtctgcgca gatttaccat agatctacta g 5501
Claims (18)
1.一种编码包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列的截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)的核酸。
2.一种包含权利要求1所述的核酸的表达构建体。
3.一种能够高水平表达SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4描述的截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)的表达构建体。
4.一种用于高水平表达SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4描述的截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)的表达构建体，包含：
a.编码SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6描述的截短PspA1的基因；
b.复制原点；
c.抗生素抗性基因；
d.启动子；和
e.核糖体结合位点。
5.根据权利要求4所述的表达构建体，其中所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
6.根据权利要求4所述的表达构建体，包含：
a.ori R复制原点；
b.卡那霉素抗性基因；
c.Ptac启动子；和
d.编码SEQ ID NO:5描述的截短pspA1的目的基因。
7.根据权利要求4所述的表达构建体，包含：
a.pUC复制原点；
b.卡那霉素抗性基因；
c.PT7启动子；和
d.编码SEQ ID NO:6描述的截短PspA1的目的基因。
8.根据权利要求7所述的表达构建体，还包含SEQ ID NO:7描述的磷酸丙糖异构酶核糖体结合位点。
9.一种用于在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高水平表达截短PspA1(SEQ ID NO:3)的表达构建体，包含：
a.编码截短pspA1(SEQ ID NO:5)的基因；
b.ori R复制原点(SEQ ID NO:12)；
c.卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO:1)；
d.Ptac启动子(SEQ ID NO:2)；和
e.磷酸丙糖异构酶核糖体结合位点。
10.一种用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中高水平表达截短PspA1(SEQ ID NO:4)的表达构建体，包含：
a.编码截短PspA1(SEQ ID NO:6)的基因；
b.pUC复制原点；
c.卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO:1)；
d.PT7启动子(SEQ ID NO:11)；和
e.核糖体结合位点。
11.一种重组宿主细胞，包含权利要求2-10中任一项所述的表达载体。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述宿主是谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
13.一种用于高水平表达肺炎链球菌截短PspA1(肺炎球菌表面蛋白A1)的方法，包括培养用权利要求2-10中任一项所述的表达构建体转化的细菌，从而纯化其表达的蛋白。
14.根据权利要求13所述的高水平表达和纯化截短PspA1的方法，其中截短pspA1的产率为约500mg/L、约400mg/L、约300mg/L、约250mg/L、约220mg/L、约200mg/L、约180mg/L、约160mg/L、约150mg/L、约120mg/L、约100mg/L。
15.一种肺炎球菌结合疫苗，包含来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的至少一种多糖，并与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4描述的截短PspA1、或截短PspA1与其他载体蛋白的组合结合，所述肺炎链球菌血清型选自1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、23F、24B、24F、31、33F、34、35B、35F、38、39和45，所述其他载体蛋白选自包含CRM 197、破伤风类毒素、百日咳类毒素和PsaA的组。
16.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述疫苗是选自10价、14价、15价、17价、18价、19价、20价、22价、23价、24价和25价的多价疫苗。
17.根据权利要求15所述的多价结合疫苗，包含来自与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4描述的截短PspA1结合的肺炎链球菌血清型3、6A和6B，和与CRM197结合的肺炎链球菌血清型1、4、5、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的至少三种多糖。
18.包含氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的截短肺炎球菌表面蛋白A1(PspA1)作为结合疫苗中的载体蛋白的用途。
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