EA045199B1 - ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA) - Google Patents
ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA) Download PDFInfo
- Publication number
- EA045199B1 EA045199B1 EA202092065 EA045199B1 EA 045199 B1 EA045199 B1 EA 045199B1 EA 202092065 EA202092065 EA 202092065 EA 045199 B1 EA045199 B1 EA 045199B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- pspa1
- truncated
- seq
- expression
- valent
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 85
- 108010040473 pneumococcal surface protein A Proteins 0.000 title description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 64
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 claims description 35
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 35
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 35
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 22
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 19
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 18
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 17
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 17
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 17
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 claims description 7
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 claims description 7
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 3
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 24
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 14
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 13
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 12
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 12
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710138270 PspA protein Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 3
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000012531 mass spectrometric analysis of intact mass Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 101150080370 pspA gene Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710090029 Replication-associated protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 101150111615 ftsZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009057 passive transport Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229940031960 pneumococcal polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940033515 pneumovax 23 Drugs 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004801 process automation Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000013120 recombinational repair Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях.
Уровень техники
Streptococcus pneumoniae является важным возбудителем отита среднего уха, менингита, бактериемии и пневмонии, а также основной причиной смертельных инфекций у людей пожилого возраста и лиц с имеющимися сопутствующими заболеваниями. Привлекательной целью вакцинации против стрептококков является снижение числа носителей инфекции в вакцинированных популяциях и, как следствие, снижение уровня заболеваемости пневмококковой инфекцией.
Пневмококковые полисахаридные вакцины, представленные на рынке под товарным знаком Pneumovax23, не эффективны у детей младше 2 лет. Отсутствие эффективности полисахаридных вакцин в данной популяции является следствием незрелости детской иммунной системы в отношении экспрессии В-клеточных рецепторов. Конъюгация полисахаридов (PS) с белками-носителями превращает их из Т-независимого антигена в Т-зависимый антиген. В качестве Т-зависимого антигена полисахариды могут вызывать ответную реакцию с переключением изотипа иммуноглобулинов, генерацией клеток памяти и стимуляцией иммунного ответа.
Мембранные белки находятся внутри мембраны и охватывают ее, через которую они служат для транспорта молекул или облегчения клеточной адгезии. Белки могут способствовать перемещению веществ за счет облегченной диффузии (т.е. пассивного транспорта) или активного транспорта. Пневмококковый поверхностный белок A (PspA) является мембранным белком и еще одним важным фактором вирулентности, обнаруженным присоединенным к клеточной стенке всех штаммов Streptococcus pneumoniae.
Замена универсальных белков-носителей, таких как столбнячный анатоксин (ТТ) или CRM197, пневмококковым белком, в частности PspA1 или его фрагментом, помимо расширения охвата действия вакцины, также предупреждает нарушение иммунных ответов, вызванных чрезмерным использованием одних и тех же белков-носителей в конъюгированных вакцинах. Экспрессионная плазмида сконструирована таким образом, чтобы включать регуляторные последовательности, которые функционируют в качестве энхансерной и промоторной областей и приводят к эффективной транскрипции гена, переносимого в экспрессионном векторе. Целью хорошо сконструированного экспрессионного вектора является эффективная продукция белка, и это может быть достигнуто посредством синтеза значительного количества стабильной матричной РНК. Возможно сконструировать экспрессионный вектор, который обеспечивает жесткий контроль экспрессии, и белок продуцируется в больших количествах только при необходимости в подходящих для экспрессии условиях. В отсутствие жесткого контроля экспрессии гена белок также может экспрессироваться конститутивно.
Corynebacterium glutamicum представляет собой грамположительную ферментативную бактерию, которая широко используется в производстве глутамата натрия в больших количествах. За счет своих стабильных генетических характеристик и отсутствия каких-либо эндотоксинов Corynebacterium glutamicum классифицируется как GRAS-микроорганизм (в общем, считается безопасным). Известно, что бактерия не секретирует каких-либо внеклеточных протеаз, и как следствие она становится привлекательной платформой для продуцирования гетерологичных белков в среду. Это может быть достигнуто с использованием экспрессионной плазмидной конструкции, которая может синтезировать рекомбинантный белок в больших количествах.
В ЕР 2310502 В1 раскрыто применение промотора Ptac в конструкции, где штамм Escherichia coli, содержащий IPTG-индуцибельную мутацию ftsZ и делецию minCDE, культивировали в среде LB.
В публикации Nokano et al., J. Bacteriol., 1984 Jan., 157(1):79-83 раскрыто использование гена устойчивости к канамицину в плазмидной конструкции для создания трансформированного штамма, который приобретает свойство устойчивости к канамицину.
В публикации Masai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987 Jul., 84(14):4781-5 раскрыт белок RepA для инициации репликации плазмиды R1 и взаимодействия с последовательностью oriR.
В публикации Nayak et al., Infect. Immun.-1998-Nayak-3744-51 раскрыта живая рекомбинантная вакцина для перорального введения на основе штамма Salmonella, экспрессирующего пневмококковый поверхностный белок A (PspA).
В публикации Nabors et.al. Vaccine, 18 (2000) 1743-54 раскрыта экспрессия рекомбинантного усеченного PspA в виде цитоплазматического белка в Escherichia coli.
В публикации Figueredo et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2017), 101:2305-2317 раскрыто получение и очистка немеченого рекомбинантного пневмококкового поверхностного белка A (PspA4Pro).
В вышеуказанных документах раскрыты генетические элементы экспрессионного вектора или экспрессия пневмококкового поверхностного протеина А в Escherichia coli и Salmonella.
Авторы изобретения идентифицировали иммуногенные фрагменты пневмококкового поверхностного белка. Затем авторы изобретения приложили интенсивные усилия для разработки экспрессионных конструкций, способных к стабильной и конститутивной или индуцибельной экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях на высоком уровне.
- 1 045199
Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает преодоление проблем предшествующего уровня техники посредством получения экспрессионных векторов и рекомбинантных клеток-хозяев для экспрессии усеченных пневмококковых поверхностных белков. Кроме того, авторы изобретения получили вакцинные композиции, содержащие усеченные белки в качестве белков-носителей.
Цель изобретения
Основной целью настоящего изобретения является получение экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях.
Другой целью настоящего изобретения является получение экспрессионной конструкции, способной к стабильной и конститутивной или индуцибельной экспрессии на высоком уровне усеченного пневмококкового поверхностного белка A1 (PspA1) в бактериях.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, способной к высокоуровневой экспрессии усеченного пневмококкового поверхностного белка А1 (PspA1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3 и 4.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, содержащей ген, который кодирует усеченный PspA1, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 5 и 6.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3 или 4, в бактериях, содержащей
a) ген, кодирующий усеченный PspA1, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 5 или 6;
b) ориджин репликации;
c) ген устойчивости к антибиотикам;
d) промотор; и
e) сайт связывания рибосомы.
Настоящее изобретение также относится к способу высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1), который включает культивирование бактерий, трансформированных экспрессионной конструкцией, и тем самым очистку экспрессированного белка.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 на панели А приведено схематическое представление рВЕ31С. На панели В приведено схематическое представление доменов pspA, определенных из выведенной аминокислотной последовательности Rx1 PspA1. На панели С приведено схематическое представление рВЕ117. На панели D показан ампликон ПЦР, содержащий RBS, нативный сигнальный пептид, усеченный PspA1, нативный терминатор и trrnB.
На фиг. 2 показано покрытие белковой последовательности усеченного PspA1 в анализе пептида отпечатков пальцев.
На фиг. 3 показан анализ интактной массы усеченного PspA1, экспрессированного в Corynebacterium glutamicum.
На фиг. 4 показан усеченный PspA1, элюированный с колонки с керамическим гидроксиапатитом (СНТ-II).
На фиг. 5 показан усеченный PspA1, элюированный с анионообменной колонки.
На фиг. 6 показан усеченный PspA1 после диафильтрации.
На фиг. 7 показана хроматограмма SEC-HPLC кинетики реакции конъюгации пневмококкового полисахарида серотипа 3 (А), 6А (В) и 6В (С).
На фиг. 8 показан титр сывороточных антител у иммунизированных кроликов против различных конъюгатов полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А, 6В (2,2 мкг) с усеченным белкомносителем PspA1.
На фиг. 9 показан титр сывороточных антител у иммунизированных кроликов против различных конъюгатов полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А, 6В (4,4 мкг) с усеченным белкомносителем PspA1.
На фиг. 10 на панели А приведено схематическое представление рВЕ114k. На панели В показано подтверждение pBE114k рестрикционным расщеплением.
На фиг. 11 показан усеченный PspA1, элюированный с хроматографической колонки с CHT I.
На фиг. 12 показан усеченный PspA1, элюированный с хроматографической колонки с Capto Q Impress.
На фиг. 13 показано покрытие белка PspA1 MALDI.
На фиг. 14 показан анализ интактной массы усеченного PspA1, экспрессированного в Escherichia coli.
Подробное описание изобретения
Термин PspA1 относится к пневмококковому поверхностному белку А1 из Streptococcus pneumonia.
Настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) в бактериях. Бактериями, подходящими для высокоуровневой экспрессии PspA1, являются Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli.
- 2 045199
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного протеина А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, в Escherichia coli.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, способной к высокоуровневой экспрессии поверхностного белка с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:3.
Настоящее изобретение также относится к экспрессионной конструкции, способной к высокоуровневой экспрессии поверхностного белка с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1) с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, в Escherichia coli.
Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, которая используется для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1, в Corynebacterium glutamicum, содержащей
i) ориджин репликации ori R;
ii) ген устойчивости к канамицину;
iii) промотор Ptac;
iv) представляющий интерес ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 5).
Настоящее изобретение также относится к экспрессионной конструкции, которая используется для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 в Escherichia coli, содержащей
i) ориджин репликации pUC;
ii) ген устойчивости к канамицину;
iii) промотор PT7;
iv) представляющий интерес ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 6).
В одном варианте осуществления экспрессионная конструкция для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 дополнительно содержит сайт связывания рибосомы (RBS). RBS включен в прямой праймер, и короткий участок ДНК, содержащий нативные терминаторы, включен в обратный праймер, используемые для дальнейшей амплификации усеченного PspA1. RBS (сайт связывания рибосомы) представляет сайт гена триозофосфатизомеразы в экспрессионной конструкции для экспрессии усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция содержит кодирующую область (нативную) сигнального пептида PspA1, усеченный PspA1, промотор Ptac и сайт связывания рибосомы (RBS) гена триозофосфатизомеразы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (SEQ ID NO: 3) в Corynebacterium glutamicum, которая содержит
a) ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 5);
b) ориджин репликации ori R (SEQ ID NO: 12);
c) ген устойчивости к канамицину (SEQ ID NO: 1);
d) промотор Ptac (SEQ ID NO: 2); и
е) сайт связывания рибосомы гена триозофосфатизомеразы.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (SEQ ID NO: 4) в Escherichia coli, которая содержит
a) ген, кодирующий усеченный PspA1 (SEQ ID NO: 6);
b) ориджин репликации pUC;
c) ген устойчивости к канамицину (SEQ ID NO: 1);
d) промотор РТ7 (SEQ ID NO: 11); и
e) сайт связывания рибосомы.
Пневмококковый поверхностный белок A (PspA) является мембранным белком и представляет важный фактор вирулентности, обнаруженный присоединенным к клеточной стенке всех штаммов Streptococcus pneumoniae, и является многообещающим компонентом вакцины, который, как было показано, обладает высокой иммуногенностью.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения усеченный PspA1 используется в качестве белка-носителя. Белки-носители, используемые в конъюгированных вакцинах, предпочтительно представляют собой белки, которые не являются токсичными и реактогенными, и которые можно получить в большом количестве и с высокой чистотой. Белок-носитель можно конъюгировать с капсульным полисахаридом, выделенным из патогенных бактерий, для усиления иммуногенности полисахарида. Бел
- 3 045199 ки-носители должны поддаваться стандартным процедурам химической конъюгации.
Усеченный PspA1 в Corynebacterium glutamicum секретируется во внеклеточную среду. Секреция во внеклеточную среду способствует эффективной очистке.
Настоящее изобретение относится к высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum, где N-концевая область вместе с пролин-богатой областью усеченного гена PspA1 была амплифицирована из капсульного серотипа 23F Streptococcus pneumoniae вместе с расположенной выше областью.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция содержит усеченный PspA1, промотор Ptac и сайт связывания рибосомы (RBS) гена триозофосфатизомеразы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция содержит усеченный PspA1, промотор PT7 и сайт связывания рибосомы (RBS).
Экспрессионную конструкцию подвергают электропорации в Corynebacterium glutamicum и отбирают на чашках со средой LB с использованием канамицина в качестве селективного маркера.
Ptac представляет сильный гибридный промотор, состоящий из области -35 промотора trp и области -10 промотора/оператора lacUV5.
Последовательности pspA получали из GenBank и выравнивали с белками из базы данных. Праймеры конструировали для специфической амплификации кодирующей области нативного сигнального пептида, N-концевой области вместе с пролин-богатой областью генов PspA, относящихся к семействам 1 и 2. Необходимые области PspA1 и PspA2 амплифицировали из доступных клинических изолятов Streptococcus pneumoniae. Анализ МНС пептидов показал, что PspA1 является сравнительно более иммуногенным, чем pspA2.
Аминокислотная последовательность кодированного усеченного PspA1, экспрессированного и продуцированного в Corynebacterium glutamicum, приведена в SEQ ID NO: 3, имеет определенную интактную массу, составляющую 35452 Да.
Аминокислотная последовательность кодированного усеченного PspA1, экспрессированного и продуцированного в Escherichia coli, приведена в SEQ ID NO: 4, имеет определенную интактную массу, составляющую 41966 Да.
Последовательность ДНК, кодирующая усеченный PspA1, экспрессированный в Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli, приведена в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO 6 соответственно.
Corynebacterium glutamicum (ранее известная как Mcrococcus glutamicus), используемая для экспрессии усеченного PspA1, представляет собой GRAS-микроорганизм, грамположительные палочковидные бактерии. Corynebacterium glutamicum представляет GRAS-микроорганизм. Доступна полная геномная последовательность Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, которую можно культивировать до более высокой плотности клеток, и которая также является генетически стабильной за счет отсутствия системы рекомбинационной репарации. Она имеет ограниченную систему рестрикции-модификации. Она не проявляет аутолиза и может сохранять метаболическую активность в условиях задержки роста. Она обладает низкой протеазной активностью, что способствует получению рекомбинантного белка. Пластичность ее метаболизма и сильный вторичный метаболизм, способность использовать широкий спектр источников углерода (пентозы, гексозы и альтернативные источники углерода), стрессоустойчивость к источникам углерода делают ее многообещающим хозяином для продукции гетерологичных белков. Такие физиологические свойства делают Corynebacterium glutamicum доступной для манипуляций и культивирования в жестких производственных условиях, что делает ее успешной промышленной рабочей лошадкой. Сообщалось о гетерологичной экспрессии таких белков, как а-амилаза, эндоглюканаза, эндоксиланаза, GFP, ксиланаза и т. д., в Corynebacterium glutamicum.
В варианте осуществления настоящего изобретения выход усеченного PspA1 составляет приблизительно 500 мг/л, приблизительно 400 мг/л, приблизительно 300 мг/л, приблизительно 250 мг/л, приблизительно 220 мг/л, приблизительно 200 мг/л, приблизительно 180 мг/л, приблизительно 160 мг/л, приблизительно 150 мг/л, приблизительно 120 мг/л, приблизительно 100 мг/л.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пневмококковой конъюгированной вакцине, содержащей по меньшей мере один полисахарид из Streptococcus pneumoniae серотипов, выбранных из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 18С, 19F, 19А, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 23F, 24В, 24F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38, 39 и 45, конъюгированный с усеченным PspA1 по настоящему изобретению или комбинацией усеченного PspA1 и других белков-носителей, таких как CRM197, столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин; PsaA и т.п.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к поливалентной пневмококковой вакцинной композиции, выбранной из 10-валентной, 14-валентной, 15-валентной, 17-валентной, 18-валентной, 19-валентной, 20-валентной, 22-валентной, 23-валентной, 24-валентной или 25-валентной композиции, содержащей полисахариды из Streptococcus pneumoniae серотипов, выбранных из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 18С, 19F, 19А, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 23F, 24В, 24F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38, 39 и 45, конъюгированные с усеченным PspA1 по настоящему изобретению или комбинацией усеченного PspA1 и других белков-носителей, таких как CRM197, столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин; PsaA и т.п.
- 4 045199
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к поливалентной конъюгированной вакцине, содержащей по меньшей мере три полисахарида из Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А и 6В, конъюгированные с усеченным PspA1 по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгированной вакцине, содержащей полисахариды из Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А и 6В, конъюгированные с усеченным PspA1 по настоящему изобретению, и из Streptococcus pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированные с CRM197.
Настоящее изобретение относится к составам, содержащим приблизительно 2,2 мкг или 4,4 мкг каждого из пневмококковых полисахаридов из серотипов 3, 6А и 6В, каждый конъюгированный с усеченным PspA1 по настоящему изобретению, и приблизительно 2,2 мкг каждого из пневмококковых полисахаридов из серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый конъюгированный с CRM197.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пневмококковой вакцинной композиции в виде разовой дозы 0,5 мл, где разовая доза содержит приблизительно от 2,2 до 4,4 мкг одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 1 мкг до приблизительно 50 мкг усеченного PspA1 по настоящему изобретению, конъюгированного с каждым из одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 0,2 мг до приблизительно 1 мг адъюванта на основе фосфата алюминия; и эксципиент.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пневмококковой вакцинной композиции в виде разовой дозы 0,5 мл, где разовая доза содержит приблизительно от 2,2 до 4,4 мкг одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 1 мкг до приблизительно 30 мкг усеченного PspA1 по настоящему изобретению, конъюгированного с каждым из одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 1 мкг до приблизительно 30 мкг CRM197, конъюгированного с каждым из одного или более пневмококковых полисахаридов; приблизительно от 0,2 мг до приблизительно 1 мг адъюванта на основе фосфата алюминия; и эксципиент.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к вакцине для профилактики инфекционного заболевания, вызванного Streptococcus pneumoniae, введением конъюгированной вакцины, полученной посредством конъюгации усеченного PspA1 по настоящему изобретению с пневмококковыми полисахаридами.
Примеры
Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения и предназначены только для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Рекомбинантная экспрессия усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum.
Конструирование рВЕ31С.
Небольшую, стабильно реплицирующуюся плазмиду рВЕ30 с широким кругом хозяев получали с использованием синтетической плазмиды, имеющей последовательность pNG2 oriR размером 2,692 т.п.н. Используя данную плазмидную ДНК в качестве матрицы, область oriR размером 1,8 т.п.н. амплифицировали с использованием праймеров pEP-F1 (5'-GCG CGG ACT AGT aGa tCt ATG GTA AAT CTG CGC AGA CAG-3') и pEP-R1 (5'-GCG CGG ACT AGT GAA TTC GGT GAG GTT ATG GCG-3').
Одновременно амплифицировали последовательность kanR размером 1,033 т.п.н. с использованием ДНК-матрицы pUC4-KIXX и праймеров Kan-F2 (5'-AAG GTC CCG GGA TGG CGA TAG СТА GAC TGG GCG GT-3') и Kan-R2 (5'-AAG GTC CCG GGG GTT GGG CGT CGC TTG GTC GG-3'). Ампликон гена kanR и ампликон oriR лигировали по тупым концам для получения вектора рВЕ30. Также экспрессионную кассету размером 0,851 т.п.н., содержащую тандем из промотора tac lac UV5, сайта множественного клонирования, компонента lacZa и последовательности терминатора TrrnB, амплифицировали с использованием праймеров Ptac-F1 (5'-GG AGC ACT AGT CTG AAA TGA GCT GTT GAC AAT TAA TC-3') и Ptac-R1 (5'-GG AGC ACT AGT TTT AAA CAT GAG CGG ATA CAT ATT TGA A-3'), каждый из которых добавляет сайт рестрикции SpeI. ДНК-матрица, используемая для амплификации экспрессионной кассеты, представляет собой рММВ206 (АТСС 37808). Затем экспрессионную кассету клонировали в уникальный сайт SpeI, сконструированный в плазмиде рВЕ30. Плазмиду, полученную таким образом, обозначали как рВЕ31С (фиг. 1А; SEQ ID NO: 14).
Конструирование рВЕ117.
Усеченный ген PspA1 (N-концевая область вместе с пролин-богатой областью, фиг. 1В) амплифицировали из капсульного серотипа 23F Streptococcus pneumoniae вместе с расположенной выше областью. Ампликон клонировали в вектор ТА (pTZ57R/T, полученный от Fermentas) с использованием праймеров PSPAF1_FP (5'-ATG AAT AAG ААА ААА ATG АТТ ТТА АСА AGT СТА GCC-3') и PSPAF1_RP (5'-CGA GAG AGA TCT ААА ТТА ААА TGT CAA ATG TTC ТТА АСА TGC TTT AAT TTT TAT TTT GGT GC-3') и последовательность подтверждали. Ее обозначали как pTZ-PspA1. Последовательность нативного терминатора включали в обратный праймер PSPAF1RP. Определяющие клад области картировали в полученной последовательности усеченного PspA1, для подтверждения его принадлежности к семейству 1 белков PspA.
Для экспрессии усеченного PspA1 в Corynebacterium glutamicum выбрали промотор Ptac (SEQ ID NO: 2)
- 5 045199 и сайт связывания рибосомы (RBS) гена триозофосфатизомеразы (SEQ ID NO: 7), относящийся к Corynebacterium. Ген PspA1 вместе со всей кассетой, включая RBS, нативный сигнальный пептид (SEQ ID NO: 8), усеченный ген PspA1, нативный терминатор (SEQ ID NO: 10), амплифицировали с использованием праймеров -SDTICGR0949_FP5 (5'-GAG CGA TGG АТС СТА GAA AGG TGT GTT ТСА ССС ATG AAT AAG ААА АА-3') и PSPA2_2RP (5'-ТСА AAT GTT CTT AAC ATG СТТ ТАА ТТТ ТТА TGG TGC AGG AGC TGG TTG-3') и pTZ-PspA1 в качестве матрицы. RBS включали в прямой праймер SDTICGR0949_FP5. Область терминатора rrnB (SEQ ID NO: 13) амплифицировали из рВЕ31С, имеющегося у заявителей, и лигировали с геном, кодирующим усеченный PspA1, с использованием ПЦР на основе сплайсинга путем расширения перекрытия (SOE). Ген rrnB амплифицировали с использованием TER FP2 (5'-ATG ТТА AGA АСА TTT GAC АТТ ТТА ATT TCG GCA CTG GCC GTC GTT-3') и TER_RP3 (5'GCG ATA TGG АТС CCA TGA GCG GAT АСА 3'). PSPA2_2RP и TER FP2 конструировали таким образом, чтобы имело место перекрытие 17 оснований. Оба ампликона PspA1 и rrnB добавляли в молярном соотношении 1:1 и использовали в качестве матрицы для ПЦР на основе SOE с праймерами SDTICGR0949_FP5 (5'-GAG CGA TGG АТС СТА GAA AGG TGT GTT ТСА ССС ATG AAT AAG ААА АА-3') и TER_RP3 (5'-GCG ATA TGG АТС CCA TGA GCG GAT АСА-3'). Затем весь ампликон, включая RBS, нативный сигнальный пептид (SEQ ID NO: 8), усеченный ген PspA1, нативный терминатор (SEQ ID NO: 10), терминатор rrnB, расщепляли рестриктазой, добавленной в прямой (SDTICGR0949_FP5) и обратный (TER_RP3) праймеры и клонировали в экспрессионный вектор рВЕ31С, сконструированный для Corynebacterium. Полученный клон обозначали как экспрессионную конструкцию рВЕ117 (фиг. 1С; SEQ ID NO: 15). Экспрессионный вектор вместе с усеченным PspA1 далее по тексту относится к экспрессионной конструкции. Ориентацию вставки (фиг. 1D) подтверждали анализом ПЦР. Последовательность усеченного гена PspA1 вместе с его экспрессионной кассетой подтверждали секвенированием ДНК.
Экспрессия усеченного PspA1.
Экспрессионную конструкцию подвергали электропорации в Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 и отбирали на чашках со средой LB с использованием канамицина в качестве селективного маркера. Собирали двадцать рекомбинантных колоний Corynebacterium glutamicum и анализировали с помощью ПЦР. Было отобрано пять колоний для конститутивной экспрессии усеченного PspA1. Рекомбинантные колонии вместе с Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (использовали в качестве отрицательного контроля) инокулировали в 10 мл бульона Terrific с конечной концентрацией канамицина 25 мкг/мл и инкубировали при 35°С со встряхиванием при 200 об/мин. Через 16 ч проводили вторичную инокуляцию в 10 мл той же среды, указанной выше, так что конечное значение OD составило 0,1. Культуры инкубировали при 35°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение 18-20 ч. Через 18 ч культуральные супернатанты тестировали на экспрессию усеченного PspA1. 30 мкл супернатанта загружали в 12% SDS-PAGE и анализировали на экспрессию усеченного PspA1. Видна заметная полоса приблизительно на уровне 45 кДа.
Результаты анализа вестерН блоттингом с использованием поликлонального антитела против pspA, специфичного к N-концевому эпитопу (SantaCruz), подтверждали экспрессию усеченного PspA1. Анализ экспрессии рекомбинантного клона 5 масштабировали до 500 мл, и экспрессия усеченного PspA1 была подтверждена, по меньшей мере, 3 раза. Усеченный PspA1 был первоначально очищен в опытах со встряхиваемыми колбами с использованием смолы СНТ типа 1 и Capto Qpress почти до 99% чистоты. Позднее после подтверждения стабильной экспрессии усеченного PspA1 в С. glutamicum, экспрессию масштабировали до 1,5 л.
Очистка и валидация усеченного PspA1.
800 мл культурального супернатанта, содержащего усеченный PspA1 из 1,6 л (0,66 мг/мл), полученного как описано выше, диализовали с порогом отсечения по молекулярной массе 10 кДа и концентрировали до 260 мл (1,92 мг/мл). 70 мл данного диализованного концентрата подвергали очистке с использованием колонок со смолой СНТ типа 1 и Capto Q Impress. Конечное извлечение усеченного PspA1 составляло 162 мг/л.
Анализ MALDI MS/MS гелевой заслонки, содержащей очищенный усеченный PspA1 из SDS-PAGE, дал четкую оценку попадания 233 для пневмококкового поверхностного белка А. 31% покрытие последовательности (фиг. 2) было показано для белка PspA с белком с идентификационным номером NCBI ABY67187.1. Анализ интактной молекулярной массы показал, что молекулярная масса экспрессированного усеченного PspA1 составляет 35,4 кДа. Данная масса совпадает с теоретической молекулярной массой усеченного PspA1. Пик при 17725,4 представляет собой пик молекулы, имеющей заряд 2, поскольку в m/z пик появляется на половине интактной массы усеченного PspA1 (фиг. 3).
Пример 2. Получение усеченного PspA1.
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, несущую экспрессионную конструкцию, содержащую усеченный ген PspA1 (далее по тексту относящийся к PspA1), восстанавливали из исходного банка в среде LB. Ее использовали для инокуляции ферментера (объемом 5 л; CSTR). В процессе получения контролировали следующие параметры: рН, DO, температура (AT), источник углерода, метаболиты. Страте
- 6 045199 гия подачи, основанная на технологии автоматизации процессов (PAT), была принята для проведения короткой периодической ферментации с подпиткой для получения усеченного PspA1. Отсутствовал индукционный контроль продукта (усеченного PspA1), поскольку это был продукт, связанный с ростом. OD выхода собранного продукта составляла приблизительно 90 (OD600 НМ) на время сбора продукта в полусинтетической среде. Клетки собирали и промывали PBS перед разрушением клеток во Френч-прессе.
Очистка усеченного PspA1.
16,2 л отработанной среды с концентрацией общего белка 0,8 мг/мл было собрано из партии ферментации объемом 20 л. 16,2 л отработанной среды концентрировали до 2,6 л (3,6 мг/мл) с использованием кассеты с порогом отсечения по молекулярной массе 10 кДа 0,5 м с последующей диафильтрацией против 20 мМ фосфата калия, рН 6,8, электропроводность 3,2 мС/см. Эти 2,6 л разделяли на две партии, т. е. партию 1 объемом 1,4 л и партию 2 объемом 1,2 л, и переходили к дальнейшей очистке. 500 мл смолы СНТ I помещали в колонку HiScale 50/40. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 8 объемами колонки (CV) 20 мМ фосфата калия, рН 6,8 (буфер А). 1400 мл (3,6 мг/мл) концентрата отработанной среды (партия 1) загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали в ступенчатом градиенте с использованием 250 мМ фосфата калия рН 6,8 (буфер В). Ступенчатый градиент включал 5 CV на стадии 40% В, 5 CV на стадии 80% В и 3 CV 0,5 М калий-фосфатного буфера. Скорость потока поддерживалась на уровне 80 мл/мин в течение всего цикла. PspA1 собирали во фракции 1 на стадии 80% В с объемом фракции 1250 мл (фиг. 4).
Capto Q Impress использовали на второй стадии хроматографии в очистке PspA1. 250 мл смолы Capto Q Impress упаковывали в колонку XK 50/20. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 5 объемами колонки (CV) 20 мМ фосфата калия и 100 мМ NaCl, рН 6,8 (буфер А). 1250 мл фракции с колонки со смолой СНТ I разбавляли до 2300 мл 20 мМ фосфатом калия, рН 6,8, загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали с использованием 12 CV буфера В (20 мМ фосфат калия с 1 М NaCl, рН 6,2) в линейном градиенте от 0 до 40% В и на заключительной стадии 3 CV 100% В. Каждую фракцию собирали в объеме 250 мл. Скорость потока поддерживали на уровне 40 мл/мин. PspA1 собирали в линейном градиенте 40% В с объемом объединенной фракции 1250 мл (фиг. 5).
Фракции 4,5,6,7 и 8 с колонки с Capto Q объединяли, концентрировали/подвергали диафильтрации с 20 мМ фосфатом калия рН 6,8. Полученное конечное извлечение составляло 100 мл PspA1 с концентрацией 15,5 мг/мл (общее количество PspA1 составляло 1550 мг) из партии 1. Аналогичную процедуру выполняли для партии 2, и полученное конечное извлечение составило 70 мл PspA1 с концентрацией 16 мг/мл (общее количество PspA1 составляло 1120 мг) из партии 2. Очищенный PspA1 из партии 1 и партии 2 составлял 2670 мг из партии объемом 16,2 л (выход очищенного PspA1 составлял 164 мг/л) (фиг. 6).
Пример 3. Конструирование рВЕ114k.
Экспрессионный вектор pRSET А (коммерческий вектор от Invitrogen) модифицировали удалением гена устойчивости к ампициллину с использованием рестрикционного расщепления DraI и лигирования с расщепленным SmaI геном, кодирующим канамицин (полученным из pUC4 KIXX). Данный модифицированный вектор обозначали как pRSET-km. Усеченный PspA1 экспрессировали в Escherichia coli под контролем промотора РТ7 (SEQ ID NO: 11) pRSET-km. Короткий участок ДНК, содержащий нативные терминаторы, включали в обратный праймер, использованный для дальнейшей амплификации PspA1. Затем весь усеченный ген PspA1 вместе с его нативным терминатором амплифицировали, расщепляли рестриктазой, добавленной в прямой и обратный праймеры, и клонировали в вектор pRSET-km. Полученный клон обозначали как pBE114k (фиг. 10А). Экспрессионный вектор вместе с усеченным PspA1 в дальнейшем по тексту относится к экспрессионной конструкции. Экспрессионную конструкцию рВЕ114k подтверждали рестрикционным расщеплением (фиг. 10В). Последовательность гена усеченного PspA1 вместе с его экспрессионной кассетой подтверждали секвенированием ДНК.
Экспрессия усеченного PspA1.
pBE114k трансформировали в химически компетентные клетки Escherichia coli DH5a-T1R (полученные от Invitrogen) и отбирали на чашках со средой LB с канамицином, который использовали в качестве селективного маркера. Было собрано и анализировано с помощью ПЦР 40 рекомбинантных колоний Escherichia coli. Все 40 колоний отбирали на индуцибельную экспрессию усеченного PspA1. Рекомбинантные колонии вместе с Escherichia coli (в качестве отрицательного контроля) инокулировали в 10 мл бульона Terrific с конечной концентрацией канамицина 25 мкг/мл и инкубировали при 37°С со встряхиванием при 200 об/мин. В середине логарифмической фазы роста добавляли 1 мМ IPTG для индукции экспрессии PspA1 в Escherichia coli (pBE114k). Культуры инкубировали при 30°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение 16 ч после индукции. Через 16 ч культуральные супернатанты тестировали на экспрессию усеченного PspA1. Клетки собирали центрифугированием, лизировали и загружали в 12% SDS-PAGE и анализировали на экспрессию усеченного PspA1. Видна заметная полоса приблизительно на уровне 65 кДа. Анализ вестерН блоттингом с использованием поликлонального антитела против PspA, специфичного к
- 7 045199
N-концевому эпитопу (SantaCruz), подтвердил экспрессию усеченного PspAl. Анализ экспрессии рекомбинантного клона 29 подтвердил экспрессию усеченного PspA1 по меньшей мере 3 раза. Усеченный PspA1 первоначально очищали в экспериментах со встряхиваемыми колбами с использованием колонок со смолой СНТ типа 1 и Capto Q Impress.
Очистка и валидация усеченного PspA1.
Отбирали 40 г (влажная масса) клеточного осадка из Escherichia coli (pBE114k) и ресуспендировали в 400 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера с рН 6,8, содержащего 1 мг/мл лизоцима и 1 мМ PMSF. Клеточную суспензию лизировали с использованием гомогенизатора высокого давления за 3 хода при 1000 фунт/кв. дюйм. 400 мл клеточного лизата с общей концентрацией белка 4 мг/мл разбавляли до 750 мл 20 мМ калий-фосфатным буфером рН 6,8 и очищали, используя смолу СНТ I, и затем смолу Capto Q Impress на второй стадии хроматографии.
250 мл смолы СНТ I помещали в колонку HiScale 50/20. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 5 объемами колонки (CV) буфера А. 750 мл разбавленного клеточного лизата загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали в ступенчатом градиенте, используя 250 мМ фосфат калия, рН 6,8, электропроводность 29,5 мС/см (буфер В). Ступенчатый градиент включал 5 CV на стадии 50% буфера В, 5 CV на стадии 80% буфера В, и колонку промывали 3 CV 0,5 М фосфатно-калиевого буфера рН 6,8, электропроводность 48 мС/см (буфер С). Скорость потока поддерживали на уровне 40 мл/мин в течение всего цикла. Фракции пика белка PspA1 собирали вручную, пул элюированных фракций 5, 6 и 7 на стадии 80% В с конечным объемом 350 мл (фиг. 11).
Capto Q Impress использовали на второй стадии хроматографии в очистке PspA1. 60 мл смолы Capto Q Impress упаковывали в колонку XK 26/20. Смолу промывали стерильной дистиллированной водой с последующим уравновешиванием 5 объемами колонки (CV) 20 мМ фосфата калия и 100 мМ NaCl, рН 6,8, электропроводность 13,6 мС/см (буфер А). 350 мл фракции с колонки с СНТ I разбавляли до 700 мл 1 мМ фосфатом калия, рН 6,8, загружали на колонку и собирали проточную фракцию. Колонку промывали 5 объемами колонки буфера A. PspA1 элюировали с использованием линейного градиента из 10 объемов колонки буфера В (20 мМ фосфат калия с 1 М NaCl, рН 6,2, электропроводность 89 мС/см) в линейном градиенте от 0 до 40% В, которые собирали вручную, фракции 4-8, 10 и 11 составляли 60 мл, и фракции 9 и 12 составляли 100 мл (фиг. 12). На заключительной стадии из 3 CV 100% В, собирали 180 мл в виде фракции 13. Скорость потока поддерживали на уровне 10 мл/мин. Белок PspA1 собирали во фракции 9 в линейном градиенте 40% В, которая составляла 100 мл.
Собирали фракцию 9 с колонки с Capto Q, концентрировали/подвергали диафильтрации с 20 мМ фосфатом калия, рН 6,8. Полученное конечное извлечение составляло 100 мл PspA1 с концентрацией 5 мг/мл белка (общий белок PspA1 равнялся 500 мг) из 400 мл клеточного лизата с концентрацией 4 мг/мл. % извлечения составил 31,25.
Анализ MALDI MS/MS гелевой заслонки, содержащей очищенный усеченный PspA1 из SDS-PAGE, дал четкую оценку попадания 223 для поверхностного пневмококкового белка А. 39% покрытие последовательности (фиг. 13) было показано для белка PspA с белком с идентификационным номером NCBI WP_050210652.1.
Анализ интактной молекулярной массы показал, что молекулярная масса экспрессированного усеченного PspA1 составляет 41,96 кДа. Анализ интактной массы усеченного PspA1, экспрессированного в Escherichia coli, показал 41966 Да (41,9 кДа), что совпадает с теоретической молекулярной массой усеченного PspA1. Пик при 20982,7 Да является пиком молекулы, имеющей заряд 2, поскольку в m/z пик появляется на половине интактной массы усеченного PspA1 (фиг. 14).
Пример 4. Конъюгация отдельного пневмококкового полисахарида с белком-носителем с образованием конъюгатов полисахарид-усеченный PspA1.
Активация серотипа 3 и конъюгация с усеченным PspA1.
Серотип 3 (6,0 мл PS, концентрация 10 мг/мл) и CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле (мас./об.) в приблизительном соотношении по размеру 1:1 смешивали в стеклянном флаконе и перемешивали в течение 1 мин. рН пневмококкового полисахарида серотипа 3 доводили до 9,25 с использованием 0,2 М триэтиламина и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Усеченный PspA1 (4,0 мл с концентрацией 15,0 мг/мл) добавляли к активированному серотипу 3 в соотношении 1:1 (усеченный PspA1:серотип 3).
рН реакционной смеси доводили до 9,05 с использованием 0,2 М триэтиламина, и реакцию продолжали при перемешивании в течение 5 ч при комнатной температуре, и, наконец, реакцию гасили добавлением избыточной концентрации глицина.
Реакционную смесь подвергали диафильтрации, используя мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 100 кДа, и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, где сплошная линия соответствует полисахаридам и пунктирная линия - усеченному PspA1, и 5-часовая реакция представлена пунктирной линией на хроматограмме А (фиг. 7). Фракции анализировали антроновым методом SEC-MALLS, фракции, содержащие конъюгаты, объединяли и стерилизовали фильтрованием с использованием 0,2 мкм фильтров. Далее данный материал называется моновалентным конъюгатом (конъюгат
- 8 045199 серотип 3-усеченный PspAl).
Активация серотипа 6А и конъюгация с усеченным PspAl.
Серотип 6А (6,0 мл PS, концентрация 10 мг/мл) и CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле (мас./об.) в приблизительном соотношении по размеру 1:1 смешивали в стеклянном флаконе и перемешивали в течение 1 мин. рН пневмококкового полисахарида серотипа 6А доводили до 9,25 с использованием 0,2 М триэтиламина и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Усеченный PspA1 (4,0 мл с концентрацией 15,0 мг/мл) добавляли к активированному серотипу 6А в соотношении 1:1 (усеченный PspA1: серотип 6А).
рН реакционной смеси доводили приблизительно до 9,05 с использованием 0,2 М триэтиламина, и реакцию продолжали при перемешивании в течение 5 ч при комнатной температуре, и, наконец, реакцию гасили добавлением избыточной концентрации глицина.
Реакционную смесь подвергали диафильтрации, используя мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 100 кДа, и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, где сплошная линия соответствует полисахаридам, и пунктирная линия соответствует усеченному PspA1, и 5-часовая реакция представлена пунктирной линией на хроматограмме В (фиг. 7). Фракции анализировали антроновым методом SEC-MALLS, и фракции, содержащие конъюгаты, объединяли и стерилизовали фильтроваением с использованием фильтров 0,2 мкм. Далее данный материал называется моновалентным конъюгатом (конъюгат серотип 6А-усеченный PspA1).
Активация серотипа 6В и конъюгация с усеченным PspA1.
Серотип 6В (6,0 мл PS, концентрация 10 мг/мл) и CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле (мас./об.) в приблизительном соотношении по размеру 1:1 смешивали в стеклянном флаконе и перемешивали в течение 1 мин. рН пневмококкового полисахарида серотипа 6В доводили до 9,25 с использованием 0,2 М триэтиламина и перемешивали в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Усеченный PspA1 (4,0 мл с концентрацией 15,0 мг/мл) добавляли к активированному серотипу 6В в соотношении 1:1 (усеченный PspA1: серотип 6В).
рН реакционной смеси доводили до 9,05 с использованием 0,2 М триэтиламина, и реакцию продолжали при перемешивании в течение 5 ч при комнатной температуре, и, наконец, реакцию гасили добавлением избыточной концентрации глицина.
Реакционную смесь подвергали диафильтрации с использованием мембраны с порогом отсечения по молекулярной массе 100 кДа и очищали с помощью эксклюзионной хроматографии, где сплошная линия соответствует полисахаридам, и пунктирная линия соответствует усеченному PspA1, и 5-ч реакция представлена пунктирной линией на хроматограмме С (фиг. 7). Фракции анализировали антроновым методом SEC-MALLS, и фракции, содержащие конъюгаты, объединяли и стерилизовали фильтрованием с использованием 0,2 мкм фильтров. Далее данный материал называется моновалентным конъюгатом (конъюгат серотип 6В-усеченный PspA1).
Пример 5. Исследование иммуногенности конъюгированной вакцины.
Готовили два состава, содержащие 2,2 или 4,4 мкг серотипов 3, 6А и 6В, каждый конъюгированный с усеченным PspA1, содержащих 2,2 мкг серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый конъюгированный с CRM197. Эти конъюгаты были адсорбированы на А1-гидрогеле.
Кроликов с массой тела 1,5-2 кг разделяли на группы по 7 животных в каждой и иммунизировали вышеуказанными составами конъюгатов. Образцы сыворотки крови анализировали до и после иммунизации. Сыворотку, полученную от иммунизированных кроликов, анализировали на наличие полисахарид-специфических антител в непрямом ELISA.
Титр сывороточных антител у иммунизированных кроликов определяли с использованием непрямого ELISA. Планшеты для микротитрования, покрытые специфическими полисахаридами, подвергали взаимодействию с сывороточными антителами. Сыворотку кроликов до иммунизации, после 1 и 2 дозы использовали для анализа, где на оси Y представлен титр антител, полученный с использованием обратного значения максимального разведения, которое дало ELISA OD450 выше порогового значения. Титр сывороточных антител у кроликов до иммунизации был ниже предела обнаружения. Пустые столбцы указывают титр после введения первой дозы вакцины, и черные сплошные столбцы указывают титр антител после введения второй дозы вакцины (фиг. 8 и 9). Наблюдали дозозависимое увеличение титров как серотипа, конъюгированного с усеченным PspA1, так и для серотипа конъюгированного с CRM197. Титры антител на полисахарид, конъюгированный с CRM197, не ингибировались присутствием конъюгатов с усеченным PspA1 и наоборот. Это указывает на то, что усеченный PspA1 можно использовать в качестве альтернативного белка-носителя для полисахарид-белковой конъюгированной вакцины.
Claims (15)
1. Нуклеиновая кислота, кодирующая усеченный пневмококковый поверхностный белок A1 (PspA1), приведенная в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.
2. Экспрессионная конструкция для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, содержащая
- 9 045199
а) ген, кодирующий усеченный PspAl, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6;
b) ориджин репликации;
c) ген устойчивости к антибиотикам;
d) промотор; и
e) сайт связывания рибосомы.
3. Экспрессионная конструкция по п.2, в которой ген устойчивости к антибиотикам представляет ген устойчивости к канамицину.
4. Экспрессионная конструкция по п.2, содержащая
a) ori R в качестве ориджина репликации;
b) ген устойчивости к канамицину в качестве гена устойчивости к антибиотикам;
c) Ptac в качестве промотора; и
d) представляющий интерес ген, кодирующий усеченный PspA1, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 5.
5. Экспрессионная конструкция по п.2, содержащая
a) pUC в качестве ориджина репликации;
b) ген устойчивости к канамицину в качестве гена устойчивости к антибиотикам;
c) PT7 в качестве промотора; и
d) представляющий интерес ген, кодирующий усеченный PspA1, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6.
6. Экспрессионная конструкция по п.5, дополнительно содержащая сайт связывания рибосомы гена триозофосфатизомеразы с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7.
7. Экспрессионная конструкция для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (SEQ ID NO: 3) в Corynebacterium glutamicum, которая содержит
a) ген, кодирующий усеченный PspA1, приведенный в SEQ ID NO: 5;
b) ориджин репликации ori R, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12;
c) ген устойчивости к канамицину, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1;
d) промотор Ptac, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2; и
e) сайт связывания рибосомы гена триозофосфатизомеразы.
8. Экспрессионная конструкция для высокоуровневой экспрессии усеченного PspA1 (SEQ ID NO: 4) в Escherichia coli, которая содержит
a) ген, кодирующий усеченный PspA1, приведенный в SEQ ID NO: 6;
b) ориджин репликации pUC;
c) ген устойчивости к канамицину, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1;
d) промотор РТ7, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11; и
e) сайт связывания рибосомы.
9. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по любому из пп.2-8.
10. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.9, где хозяином является Corynebacterium glutamicum или Escherichia coli.
11. Способ высокоуровневой экспрессии усеченного Streptococcus pneumoniae PspA1 (пневмококкового поверхностного белка А1), который включает культивирование бактерий, трансформированных экспрессионной конструкцией по любому из пп.2-8, и очистку усеченного PspA1, экспрессированного экспрессионной конструкцией.
12. Способ высокоуровневой экспрессии и очистки усеченного PspA1 по п.11, где выход усеченного PspA1 составляет приблизительно 500 мг/л, приблизительно 400 мг/л, приблизительно 300 мг/л, приблизительно 250 мг/л, приблизительно 220 мг/л, приблизительно 200 мг/л, приблизительно 180 мг/л, приблизительно 160 мг/л, приблизительно 150 мг/л, приблизительно 120 мг/л или приблизительно 100 мг/л.
13. Пневмококковая конъюгированная вакцина, содержащая по меньшей мере один полисахарид из Streptococcus pneumoniae серотипов, выбранных из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 18С, 19F, 19А, 20А, 20В, 22F, 23А, 23В, 23F, 24В, 24F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38, 39 и 45, конъюгированный с усеченным PspA1, приведенным в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, или комбинацией усеченного PspA1, приведенного в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, и других белковносителей, выбранных из группы, включающей CRM197, столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин и PsaA.
14. Вакцинная композиция по п.13, где вакцина представляет поливалентную вакцину, выбранную из 10-валентной, 14-валентной, 15-валентной, 17-валентной, 18-валентной, 19-валентной, 20-валентной, 22-валентной, 23-валентной, 24-валентной и 25-валентной вакцины.
15. Поливалентная конъюгированная вакцина по п.13, содержащая по меньшей мере три полисахарида из Streptococcus pneumoniae серотипов 3, 6А и 6В, конъюгированные с усеченным PspA1 с последова-
- 10 045199 тельностью, приведенной в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, и из Streptococcus pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированные с CRM197.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN201841007814 | 2018-03-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045199B1 true EA045199B1 (ru) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6636546B2 (ja) | 発現系 | |
| KR100316004B1 (ko) | Crm단백질및디프테리아독소의생산을위한방법및플라스미드 | |
| US20230322871A1 (en) | Expression of pneumococcal surface protein a (pspa) | |
| JP7042305B2 (ja) | Ｃｒｍ１９７の高レベル発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチド | |
| EA006232B1 (ru) | Стрептококковые антигены | |
| PT778781E (pt) | Vacinas de conjugados de polissacarido pneumococico-pneumolisina recombinante para imunizacao contra infeccoes pneumococcicas | |
| KR100338894B1 (ko) | 백신조성물 | |
| TW593678B (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumoniae | |
| CA2235445A1 (en) | Clostridium perfringens vaccine | |
| EP0810283A2 (en) | Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family Pasteurellaceae | |
| Frey et al. | Cloning and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein belonging to the family of PAL lipoproteins | |
| EA045199B1 (ru) | ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA) | |
| US20040202678A1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
| US6770275B1 (en) | Live attenuated RTC-producing bacteria of the family | |
| OA20033A (en) | Expression of Pneumococcal Surface Protein A (PSPA). | |
| RU2745161C1 (ru) | Способ получения аттенуированного бесплазмидного штамма F.tularensis 15 CMSA, синтезирующего микобактериальный антиген супероксиддисмутазу А | |
| MXPA98002798A (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumon |