JP6636546B2 - 発現系 - Google Patents
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Description
(2)大腸菌のペリプラズムは、ジスルフィド結合の形成を可能にする酸化環境であり、このことは可溶性で正確に折りたたまれたタンパク質を製造するのを助け得、および/または;
(3)大腸菌のペリプラズムは、細胞質よりも少ないプロテアーゼを含み、このことは、発現したタンパク質のタンパク質分解性開裂を回避するのを助け得、および/または; (4)ペリプラズムは、より少ないタンパク質も含み、このことは、より純粋な組換えタンパク質が得られるのを可能にする。
(a)5’シグナル配列部分は、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有する異種性ポリペプチドをコードし、かつ
(b)3’毒素部分は、配列番号32あるいは少なくとも15のアミノ酸および/または少なくとも1つのBもしくはT細胞エピトープをコードするその断片と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、
該5’シグナル配列部分と該3’毒素部分とを含んでなる、ポリヌクレオチドが提供される。
(a)5’シグナル配列部分は、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ、該5’シグナル配列部分はジフテリア菌由来ではなく、かつ
(b)3’毒素部分は、配列番号32あるいは少なくとも15のアミノ酸および/または少なくとも1つのBもしくはT細胞エピトープをコードするその断片と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、
該5’シグナル配列部分と該3’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、
(b)発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる、1、2、もしくは3の点突然変異、挿入、もしくは欠失によって相応の配列から変動する配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のバリアント、または
(c)発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26の少なくとも10のアミノ酸の断片
のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードし、かつ3’毒素部分は、細菌毒素またはその断片もしくはバリアントをコードする、該5’シグナル配列部分と3’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
を含んでなる、細菌毒素を作製するためのプロセスが提供される。
用語「ポリヌクレオチド(複数可)」は一般的に、一本鎖および二本鎖領域/形態を含む修飾されていないRNAもしくはDNAまたは修飾されたRNAもしくはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。
アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス:Henikoff由来のBLOSSUM62およびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)
ギャップペナルティ:8
ギャップ長ペナルティ:2
これらのパラメータを用いた有用なプログラムは、Genetics Computer Group, Madison WI由来の「ギャップ」プログラムとして公共的に入手可能である。上記のパラメータは、(末端ギャップについてペナルティがないことに加えて)ペプチド比較のためのデフォルトパラメータである。
アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0
ギャップペナルティ:50
ギャップ長ペナルティ:3
Genetics Computer Group, Madison WI製の「ギャップ」プログラムとして入手可能。これらは、核酸比較のためのデフォルトパラメータである。
本発明の一態様は、ペリプラズムに発現する毒素をコードするポリヌクレオチドに関する。
(a)5’シグナル配列部分は、異種性(毒素)タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向することのできるアミノ酸配列を有する異種性(シグナル)ポリペプチドをコードし、かつ
(b)3’毒素部分は、配列番号32あるいは少なくとも15の(連続した)アミノ酸および/または少なくとも1つのBもしくはT細胞エピトープをコードする(免疫原性であり得る)その断片と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
(b)3’毒素部分は、配列番号32あるいは少なくとも15のアミノ酸および/または少なくとも1つのBもしくはT細胞エピトープをコードするその断片と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、または配列番号2、4、1012、14、16、18、20、22、24、もしくは26、または配列番号NO2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24、もしくは配列番号24、または配列番号2、4、もしくは24、または配列番号2、10、もしくは24、または配列番号2、12、もしくは24、または配列番号2、14、もしくは24、または配列番号4、10もしくは24、または配列番号4、12、もしくは24、または配列番号4、16、もしくは24、または配列番号4、18もしくは24、または配列番号4、20もしくは24、または配列番号4、22、もしくは24、または配列番号10、12、もしくは24、または配列番号10、14、もしくは24、または配列番号10、16、もしくは24、または配列番号10、18、もしくは24、または配列番号10、22もしくは24、または配列番号12、14、もしくは24、または配列番号12、16、もしくは24、または配列番号12、18、もしくは24、または配列番号12、20、もしくは24、または配列番号12、22、もしくは24、または配列番号14、16、もしくは24、または配列番号14、18、もしくは24、または配列番号14、20もしくは24、または配列番号14、22、もしくは24、または配列番号16、18、もしくは24、または配列番号16、20もしくは24、または配列番号16、22、もしくは24、または配列番号18、20もしくは24、または配列番号18、22、もしくは24の任意の1つ、
(b)発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる1、2、または3の点突然変異、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失によって相応の配列から変動する配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、または配列番号NO2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24、または配列番号24、もしくは配列番号2、4、もしくは24、または配列番号2、10、もしくは24、または配列番号2、12、もしくは24、または配列番号2、14、もしくは24、または配列番号4、10もしくは24、または配列番号4、12、もしくは24、または配列番号4、16、もしくは24、または配列番号4、18もしくは24、または配列番号4、20もしくは24、または配列番号4、22、もしくは24、または配列番号10、12、もしくは24、または配列番号10、14、もしくは24、または配列番号10、16、もしくは24、または配列番号10、18、もしくは24、または配列番号10、22もしくは24、または配列番号12、14、もしくは24、または配列番号12、16、もしくは24、または配列番号12、18、もしくは24、または配列番号12、20、もしくは24、または配列番号12、22、もしくは24、または配列番号14、16、もしくは24、または配列番号14、18、もしくは24、または配列番号14、20もしくは24、または配列番号14、22、もしくは24、または配列番号16、18、もしくは24、または配列番号16、20もしくは24、または配列番号16、22、もしくは24、または配列番号18、20もしくは24、配列番号18、22、もしくは24の任意の1つ(のバリアント)、あるいは
(c)発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、または配列番号2、4、10、12、14、16、18、20、22、もしくは24、または配列番号24、もしくは配列番号2、4、もしくは24、または配列番号2、10、もしくは24、または配列番号2、12、もしくは24、または配列番号2、14、もしくは24、または配列番号4、10、もしくは24、または配列番号4、12、もしくは24、または配列番号4、16、もしくは24、または配列番号4、18もしくは24、または配列番号4、20、もしくは24、または配列番号4、22、もしくは24、または配列番号10、12、もしくは24、または配列番号10、14、もしくは24、または配列番号10、16、もしくは24、または配列番号10、18、もしくは24、または配列番号10、22もしくは24、または配列番号12、14、もしくは24、または配列番号12、16、もしくは24、または配列番号12、18、もしくは24、または配列番号12、20、もしくは24、または配列番号12、22、もしくは24、または配列番号14、16、もしくは24、または配列番号14、18、もしくは24、または配列番号14、20、もしくは24、または配列番号14、22、もしくは24、または配列番号16、18、もしくは24、または配列番号16、20もしくは24、または配列番号16、22、もしくは24、または配列番号18、20、もしくは24、または配列番号18、22、もしくは24の任意の1つの少なくとも10のアミノ酸からなる断片
を有するシグナルペプチドをコードし、3’毒素部分は、細菌毒素またはその断片もしくはバリアントをコードする。
(d)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26、
(e)発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる、1、2、もしくは3の点突然変異、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失によって、相応の配列から変動する配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26のバリアント、または
(f)発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26の少なくとも10のアミノ酸からなる断片
のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードし、かつ3’毒素部分は、細菌毒素またはその断片もしくはバリアントをコードする。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供する。加えて、これらのポリペプチドの断片およびバリアントが提供される。
本発明は、本発明の1つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(複数)を含んでなるベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。本発明のDNAコンストラクトに由来するRNAを用いてこのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を採用することもできる。
本発明のさらなる態様において、a)本発明の細菌宿主細胞の培養物を増殖させる工程と、b)細菌トキソイドがペリプラズムに発現するよう、ポリペプチドの発現を誘導する工程と、を含んでなる、細菌毒素を作製するためのプロセスが提供される。
A.グラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させること、および
B.タンパク質がペリプラズムに発現するよう、ポリペプチドの発現を誘導すること
による組換えポリペプチドのペリプラズム発現のためのプロセスが提供され、この中で、以下の工程の1つ以上が発現時に作用する:
i.工程a)のpHは、工程b)のpHよりも低く、
ii.工程a)の温度は、工程b)の温度よりも高く、または
iii.工程a)の基質供給速度は、工程b)の基質供給速度よりも高い。
本発明は、i)本発明のプロセスを用いて細菌毒素を作製する工程と、b)工程ii)の細菌毒素を抗原に抱合させる工程とを含んでなる、抱合体を作製するためのプロセスも提供する。
A)カルボキシル(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を介する)。一実施態様において、この基は、糖質上のアミノ基に直接的に、またはリンカー上のアミノ基にカルボジイミド化学物質を用いて、例えばEDACを用いて連結される。
糖質−OH + CNBrまたはCDAP −−−−−> シアナートエステル + NH2−保護基 −−−−> 抱合体
糖質−アルデヒド + NH2−保護基 −−−−> シッフ塩基 + NaCNBH3 −−−−> 抱合体
糖質−COOH + NH2−保護基 + EDAC −−−−> 抱合体
糖質−NH2 + COOH−保護基 + EDAC −−−−> 抱合体
スペーサー(リンカー)を介した間接的なカップリングアプローチ:
糖質−OH + CNBrまたはCDAP −−−> シアナートエステル + NH2−−−−NH2 −−−−> 糖質−−−−NH2 + COOH−保護基 + EDAC −−−−−> 抱合体
糖質−OH + CNBrまたはCDAP −−−−> シアナートエステル + NH2−−−−−SH −−−−−> 糖質−−−−SH + SH−保護基(露出したシステインを有するかまたは例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる天然タンパク質) −−−−−> 糖質−S−S−保護基
糖質−OH + CNBrまたはCDAP −−−> シアナートエステル + NH2−−−−SH −−−−−−−> 糖質−−−−SH + マレイミド−保護基(アミノ基の修飾) −−−−> 抱合体
糖質−OH + CNBrまたはCDAP −−−> シアナートエステル + NH2−−−−−SH −−−> 糖質−SH + ハロアセチル化した保護基 −−−−> 抱合体
糖質−COOH + EDAC + NH2−−−−−NH2 −−−> 糖質−−−−−−NH2 + EDAC + COOH−保護基 −−−−> 抱合体
糖質−COOH + EDAC+ NH2−−−−SH −−−−−> 糖質−−−−SH + SH−保護基(露出したシステインを有するかまたは例えばSPDPによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる天然タンパク質) −−−−−> 糖質−S−S−保護基
糖質−COOH + EDAC+ NH2−−−−SH −−−−−> 糖質−−−−SH + マレイミド−保護基(アミノ基の修飾) −−−−> 抱合体
糖質−COOH + EDAC + NH2−−−−SH −−−> 糖質−SH + ハロアセチル化保護基 −−−−> 抱合体
糖質−アルデヒド + NH2−−−−−NH2 −−−−> 糖質−−−NH2 + EDAC + COOH−保護基 −−−−> 抱合体
注記:先のEDACの替わりに、任意の好適なカルボジイミドを用いてもよい。
本発明はさらに、
A.本発明のプロセスを用いて細菌毒素または抱合体を作製する工程と、
B.該細菌毒素またはその抱合体を医薬として許容し得る賦形剤と混合する工程と、
を含んでなる、ワクチンまたは免疫原性組成物を映像するためのプロセスを提供する。
CRM197トキソイドに融合したN末端シグナル配列をコードする配列を含むプラスミドを、標準的な分子生物学技術を用いて作製した。13の異なるシグナル配列を用い(表2)、これらをGenEMBLデータベースから選択した。
本実験において、実施例1において作製されたものと同様だが、ペリプラズムシグナル配列を欠失するプラスミドを作製した。この設計プロセスを図2に要約する。まず、CRM197配列(配列番号31)をMDSCRM1(配列番号27)およびMDSCRM2(配列番号28)と命名された2つのプライマーをテンプレートとして用いて、標準的なPCR技術によって増幅した(使用した温度周期は、(94℃2分―55℃2分―72℃2分30秒)×25回―72℃10分―終止4℃であった)。
シグナル配列FlgIを、改良されたコンストラクトを作製するための使用のために選択した。以下のクローン化プロセスを図3に要約する。
本実験において、実施例1において作製したDsbAシグナル配列コンストラクトで形質転換した細胞を培養し、発現を誘導した。B834(DE3)、HMS174(DE3)、およびBLR(DE3)組換え株の前培養物(3mL)を、カナマイシン(50μg/mL)の存在下で1%グルコースを補充したLBT培地において37℃で一晩、攪拌の下で増殖した。翌日、培地の光学密度OD620が0.1に到達した後、この前培養物の試料を、50μg/mLのカナマイシンを有する20mLのLBT培地へと転化した。これらの細胞を撹拌の下で30℃で増殖しておいた。このプラスミドにおいて、CRM197発現は、lacオペレーターの制御下にあり、それゆえ、コードされたCRM197の発現は、イソプロピル−ベータ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)の添加の際に誘導されることができる。光学密度が0.6に到達すると、IPTG(1mMの終濃度になるまで添加)を用いた誘導を実施し、培養物をさらに30℃で3時間増殖させておいた。
実施例4の工程を反復したが、この場合、100mMのK2HPO4/KH2PO4緩衝液を誘導前に培養物に添加し、それにより培地をpH7.5に緩衝した。発現を1mMのIPTGの添加によって誘導し、培養物を23℃または30℃のいずれかで一晩増殖させておいた。上清およびペレットにおいて発現したタンパク質のレベルを、実施例4において説明されるように、クーマシー染色およびウェスタンブロット技術を用いて評価した。
DE3細胞を実施例2において製造したプラスミドで形質転換し、培養し、CRM197の発現を実施例4において説明される通り誘導した。実施例4に説明される通り、CRM197発現レベルを、SDS−PAGEゲルにおおける全細菌細胞の産物を泳動し、クーマシーブルー染色およびウェスタンブロット技術を用いることによって評価した。細菌抽出を標準的なPBS緩衝液におけるワンショット技術(Constantの系)によって実施した。遠心分離後、得られた可溶性画分および不溶性画分をゲルに負荷した。
BLR(DE3)大腸菌細胞を実施例3において製造したコンストラクトで形質転換し、培養し、実施例5の最適化されたプロトコールにおいて説明された通り、発現を誘導した。加えて、いくつかの試料細胞を、100mMのK2HPO4/KH2PO4緩衝液の添加なしで増殖した。同様に、発現したタンパク質のレベルを、実施例4に説明される通り、クーマシー染色およびウェスタンブロット技術を用いて評価した。誘導時に、温度を23℃または30℃のいずれかで維持し、試料を誘導時、誘導2時間後、誘導4時間後、および一晩の誘導後に採取した。
前培養物を、大腸菌株B2355の凍結種培養を用いて調製した。この株は、大腸菌由来のFlgIのシグナルペプチドとCRM197の成熟部分の間の融合タンパク質をコードする配列を含むpET26b誘導体(これは、図3および実施例3において説明されたプラスミドpRIT16681である)を用いて形質転換されたB834(DE3)株である。シード培養能は、1mLあたりおよそ1×1010コロニー形成単位として決定された。
方法
20リットルの発酵槽(Biolafitte)を用いた。9リットルのバッチ相培地を発酵槽へと無菌的に転移させた(Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))から応用)。培地のpHを塩基の添加により、6.8に再調整した。次に、3mLの希釈していない照射済み消泡剤(SAG471)も発酵槽に添加した。温度(28℃)、頭部圧力(0.5バール)、曝気速度(1分間当たり20リットルの撒き散らした空気)、および初期撹拌速度(300rpm)を設定した後に接種した。これらの条件下の溶存酸素レベルは100%であった。頭部圧力および曝気速度を、発酵の間定常レベルで維持した。
本実験において、応答−表面方法論(J.ind. Microbiol. Biotechnol. 37:195-204 (2010))を用いて、組換えタンパク質のペリプラズム産生を最大化するために、3つのパラメータについての最適な値を決定した。研究した3つの発酵パラメータは、増殖相の間のpH、誘導中のpH、および誘導中の供給速度であった。これら3つのパラメータについての値を、Doehlertの均一なシェル設計(Doehlert (Applied Statistics 19:231-239 (1970)))に従って選択した。表5に示される値を用いて、15の発酵を実施した。
Claims (1)
- 5’シグナル配列部分と3’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドであって、
(a)5’シグナル配列部分は、グラム陰性菌宿主細胞において発現された場合に異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ、該5’シグナル配列部分はジフテリア菌由来ではなく、かつ
(b)3’毒素部分は、配列番号32と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する細菌毒素ポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド。
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