JPS62158491A - 精製蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免団立五旦 技術分野 本発明は、遺伝子工学的手法を利用した精製蛋白質の製
造法に関する。

さらに具体的には、本発明は、培地の含有成分によって
プロモーター活性が調節されるプロモーターをコードす
る遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナル配列を
コードする遺伝子をも具備したベクターに、所望外来性
蛋白質をコードする遺伝子を組込んで組換ＤＮＡとし、
これを宿主微生物（以下微生物を単に「菌」と記すこと
もある）細胞内に移入させることにより宿主の形質転換
を行って形質転換体を得て、これを一定条件下で１８養
することにより所望蛋白質を宿主菌体外（培養液中）に
分泌させたのら、この培養液中から所望蛋白質を回収・
精製を行うことよりなる遺伝子工学的手法による精製蛋
白質の製造法に関する。

友且且韮 現在組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に有用物質
を生産りる方法が確立されつつあり、具体的な方法につ
いては種々の成用や文献、公開特許公報ａ５よσ特許公
報を参照づることができる。

このような手法による物質の生産方法は、通常、ベクタ
ーに所望物質をコードする遺伝子を組込んで造成した組
換えＤＮＡを用いて宿主微生物を形質転換し、得られた
形質転換体を培養したのら、所望物質を回収することよ
りなるものである。

ところで、上記方法によって非分泌性の蛋白質の生産を
行う場合、微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌の
プロテアーゼによって分解〔プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・ザイエンシズ・オブ
・＋ｙ・ユナイテッド・スデーツ・オブ・アメリカ（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　ＳＣｉ、υＳＡ＞　、　７９．１８３０−
１８３３　（１９８２））される恐れがあるので所望蛋
白質を安定かつ大量に得ることができないという問題が
あった。また、このような非分泌性の蛋白質を回収する
に際しては宿主微生物を物理的に破壊したのら、所望蛋
白質の分離・精製を行うものであるから、一般にこのよ
うな回収操作は複雑であり、そのため所望蛋白質の収率
が低かったり、活性を右するものは回収操作中に失活り
る恐れらあるという問題があった。

そこで、上記問題点に対処寸べく、蛋白質の膜通過に関
与するジグ犬ル配列〔蛋白質・核酸・酵素、２６．３８
６〜３９４（１９８１））の作用を利用して、宿主微生
物細胞内で産生された蛋白質を細胞質膜外に分泌さ゛じ
る方法が種々提案されたく特開昭５５−１９０９２号、
同５５−４５３９５号、同５６−１３７８９６号、同５
６−１４５２２１号、同５６−１５４９９９弓各公報等
〉。

ところで、上記シグナル配列を利用した遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造にＪ３いて組換えＤＮＡが移入さ
れ得る宿主微生物は、大腸菌が普通である。この大腸菌
はグラム陰性菌であって、このような菌には細胞質膜ｄ
５よび外膜があるくこれらの膜間をペリプラズムという
）ところ、このような菌に組換えＤＮＡを移入さＵて形
質転換体としてこの形質転換体を通常の培養に付すと、
所望蛋白質はペリプラズムに蓄積される。このペリプラ
ズムに晶積された蛋白質は、オスモティック・ショック
法〔シレーナル・Ａブ・バイ第１コシカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、）　、　２４０
゜３６８５　（１９６５））によってペリプラズムから
菌体外へ放出ざｔ！なければ回収することができない。

このオスモティック・ショック法は、まず遠心により菌
体を回収したのら、これを高ｉ１！度ショ糖液〔２０％
シュークロース、３０　ｍ　Ｍ　ｔ−リスｊｐ酸緩衝液
（ｐｌ−１８，０＞１ｍＭエヂレンジアミン四酢ｉＭ　
（ＥＤＴＡ））に懸濁させてから集菌し、さらにこの菌
体を冷水に懸濁さぜ、そして氷浴中で放置することによ
り所望蛋白質を含む両分を菌体外に放出さＵ、ついで遠
心により上清（所望蛋白質を含む）を１与る、という方
法である。そして、所望蛋白質を回収するには、さらに
クロア１へグラフィー等によってこの上清を処Ｌｇ！す
るのである。このように従来から大腸菌のようなダラム
陰性菌を宿主どし、これに蛋白質の分泌機能を具備した
組換えＤＮＡを移入させて形質転換体を３’ｆて、これ
を培養することにより所望蛋白質を生産させるという方
法は、ダラム陽性菌（枯／ｙ菌、酵母菌等）を宿主とし
た場合に比べて余分な処理操作（Ａメモディックショッ
ク法）が必要となる。

これに対して、本発明者らのバ同研究者らにより、宿主
菌が大腸菌のよう＜１グラム陰性菌であっても所望外来
性蛋白質がペリプラズムに殆ど蓄積することなく、培養
液中にまで分泌り°る「菌体外分泌による蛋白質の製造
法」が提案されたく昭和６０年１２月２４日付で特許出
願。以下［先願発明」という。）（詳細後期）。しかし
ながら、このような蛋白質の製造法によって造成された
培養液中にまで分泌された所望外来性蛋白質を効率よく
回収・精製りる方法は確立されておらず、該方法の確立
が望まれていた。

発明の概要 要　　旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、プロ
モーター（プロモーターの通性として培地の３有成分に
よってプロモーター活性が左右される）をコードする遺
伝子（以下プロモーター）４伝子という）を具備し、そ
の制御下にシグナル配列をコードする遺伝子（シグナル
遺伝子）をも具備したベクターに、所望の外来性蛋白質
をコードする遺伝子（外来性蛋白質の構造遺伝子）を紺
込んで組換えＤＮＡを造成し、この組換えＤＮＡを宿主
微生物細胞内に移入さゼて形質転換体となし、この形質
転換体を上記プロモーターに対するプロモーター活性調
節物質に関して一定条件下で培養することによって所望
蛋白質を菌体外（培養液中）に分泌させ（ここまでは「
先願発明」）、培養液中からこれを回収して精製する、
という３ｕ伝転子学的手法による精製蛋白質の製造法を
提供することにより本目的を達成しようというものであ
る。

そして、本発明は、ダラム陰性菌（大腸菌）を本発明の
方法に従って形質転換してこれを培養すれば所望蛋白質
は菌体が溶菌することなしに菌体外（培養液中）に分泌
されていること、また所望蛋白質が菌体内（細胞質内）
に殆ど留まることがないこと、さらに培養液中より精製
した蛋白質の純度が高いこと、を確認してなされたもの
である。

従って、本発明による精製蛋白質の製造法は、下記（Δ
）〜（Ｆ）の工程よりなること、を＃８　′ｆｉとづる
ものである。

（Δ）　プロモーターをコードづる遺伝子ならびに該遺
伝子の制御下にシグナル配列をコードする遺伝子を具備
しかつ予定した宿主微生物細胞内で増力“１可能／ｊベ
クターを用息すること。

（Ｂ）　　上記ベクターに外来性蛋白質をコードする遺
伝子を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換
えＤＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿
主の形質転換を行って形質転換体を得ること。

（Ｃ）　　上記形質転換体を微生物の増殖過程における
対数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の
誘導がおこるに必要なｍのプロモーター活性調節物質を
含有する培地での培養に付したのち、該培養系外よりプ
ロモーター活性調節物質を含有する培地の連続的ないし
間歇的な添加を伴う培養に付すこと。

（］〕）　　上記培養終了後、この培養液を濃縮するこ
と。

（Ｅ）　　上記瀧縮液をイオン交換クロマトグラフィー
にイ」シたのら、所望の外来性蛋白質画分を回収するこ
と。

（Ｆ）　　上記で回収された所望外来性蛋白質を含む両
分をさらに高速液体り［１マドグラフイーに付したのち
、所望外来性蛋白質画分を回収すること。

立−」 このように本発明は、ダラム陰性菌（大腸菌）を用いて
遺伝子工学的手法による蛋白質の造成にＪ３いても、従
来のように所望蛋白質をペリプラズムに留めることなく
菌体外（培養液中）への分泌を行うべく、（イ）プロモ
ーター遺伝子を具備するど共にその制御下にシグナル遺
伝子をも具備し、かつ（ロ）予定した宿主細胞内で増殖
可能なベクターを用意し、ついでこれに所望の外来性蛋
白質の構造遺伝子を組込んで組換えＤＮＡとし、これを
宿主菌に移入させることによって形質転換体を得て、こ
れを一定条件下（前記の工程（Ｃ）で）培′ａすること
により所望蛋白質を菌体外（培養液中）に分泌させ、さ
らに培？！ｉ液を濃縮したのち、この濃縮液をイオン交
換カラムクロマトグラフィーｄ３よび高速液体クロマト
グラフイムに付すことにより所望の外来性蛋白質を効率
よく回収・精製することからなる遺伝子工学的手法によ
る精製蛋白質の製造方法に関するものである。

本発明の好ましい態様は、上記（イ）　Ｊ３よび（ロ）
よりなるベクターが、そのシグナル遺伝子の下流側末端
直後に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を結合し得るよ
うに仕組れたしのを用いる方法である。そしてシグナル
遺伝子の直後に外来性蛋白質の構造遺伝子の導入を容易
にするためには、シグナル遺伝子の塩基対の少なくとも
一つを構成員の少なくとも一部として人工的に創出され
た制限酵素認識部位を有するものを用いるとよい。

この部位を創出するに当っては、ＤＮＡ塩基対からなる
コドンには縮重があるということを巧みに利用すること
ができる。すなわら、ｆｉｌｌ出された制限酵素認識／
切断部位を該制限酵素で切断すれば、その切断部位がシ
グナル遺伝子のＦ流側末端に接して存在する場合は、該
制限酵素切断端と相補性の端部を上流側に形成させた外
来性遺伝子を用意してこれを上記切断端にａ３いてシグ
ナル；ｍ転子と結合させることによって、シグナル遺伝
子の下流側に外来性遺伝子を直結させることができる。

また、シグナル遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流側末
端より上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断部位
より下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側に結
合した断片を用意して上記と同じように結合を行えば、
一旦切断されたシグナル遺伝子がＤＮＡの両鎖について
復元されると共にそれの下流側に外来性遺伝子が直結さ
れた構造が実現される（詳細後記）。

このようなベクターに所望外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えＤＮＡとし、この紺換えＤＮＡで宿主菌
を形質転換して形質転換体を得て、これを一定条件下（
本発明の工程（Ｃ）により）で培？ｆすれば、宿主菌が
大腸菌のようなダラムｎ性菌であってｂ、所望蛋白質は
べりブラズムに蓄積りることなく菌体外（培養液中）ま
で分泌される。そして、培養液中から所望外来性蛋白質
を回収・精製づることにより、本発明の目的が達成され
る。

従って、本発明は、前記の問題点を回避するととらに下
記の利点を右するものである。

（１）　遺伝子工学的手法による蛋白質の製造・回収・
精製工程が簡素化される。

本発明の方法に従えば、上記（イ）Ｊ３よび〈口）の要
件を満すベクターに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んでなる組換えＤＮＡで宿主微生物を形質転換して
形質転換体を得てこれを培養すれば、所望蛋白質は成熟
蛋白質として（シグナル配列は蛋白質がペリプラズムに
分泌されるときに切断されている）培養液中まで分泌さ
れる。すなわち、形質転換された宿主微生物をオスモテ
ィック・ショック法に付すことなく、所望蛋白質を含有
する培養液を、まず濃縮したのち、イオン交換クロマト
グラフィーに付し、さらに高速液体クロマトグラフィー
に付すことにより高ＩＩＩＩ度の所望蛋白質の精製椋品
を得ることができるのである。従って、遺伝子工学手法
による蛋白質の製造・回収・精製工程が簡素化されるこ
とになる。

なお、本発明方法は宿主菌がダラム陽性菌にも適用され
るのであるが、枯草菌のようなダラム陽性菌はべりブラ
ズムがないので、本発明に係る培養方法に従えば所望蛋
白質は１８養液中にまで分泌されるということはいうま
でもない。

（２）　所望蛋白質の精製が容易である。

本発明に係る培養方法に従えば所望蛋白質は培養液中ま
で分泌され、その分泌の際にシグナル配列は脱酵素にに
つて切断されるので、シグナル配列が付着していない蛋
白質が得られる。ここｔ−（Ｒられる蛋白質は、シグナ
ル配列をコードする遺伝子と所望蛋白質をコードする遺
伝子との間に余分な遺伝子（リンカ−としてのＤＮＡ遺
伝子）が存在すれば、余分なアミノ酸を付着したままで
分泌される。しかしながら、本発明の一具体例で示され
たようにシグナル配列をコードする遺伝子の直後に所望
蛋白質をコードする遺伝子を結合しておけば、所望蛋白
質は余分なアミノ酸が付着することなく完全な成熟蛋白
質として培養液中に分泌される。従って、形質転換体の
培養を菌体が溶菌してしない時期に終了してＪ′５りば
、培養液中には実質的に所望蛋白質および培養液の構成
成分が存在することになる。

そしＣ１使用する培養液はその（１４成成分がわかって
いるうえ、この液中には他の余分な夾雑蛋白も少ないの
で、上清を濃縮したのちイオン交換クロマトグラフィー
に付すだけで所望蛋白司を含む両分の濃縮および所望蛋
白質の部分精製が可能となり、さらにつづく高速液体ク
ロマトグラフィーによって短時間で完全に所望蛋白質を
精製することができる。

このように操作が容易なイオン交換クロマトグラフィー
および試料を迅速に処理できる高速液体クロマトグラフ
ィーに付すだけで所望蛋白質が精製されるので１労力を
省くことができ、かつ精製期間を短縮することも可能４
賞ので、所望蛋白質の精製コストを低減することができ
る。このようなことから所望蛋白質の精製が容易である
といえよう。

（３）　工業規模での精製蛋白質の産生が可能である。

工業規模で培養された培地中から所望蛋白質をつるには
、まず第一に、大言ωの培養炉液を短時間で処理しやす
いｍまで濃縮することが重要である。第二に、高純度標
品をうるためには、複数種の液体カラムクロマトグラフ
ィーを必要とするが、クロマトグラフィーを困難にする
夾雑蛋白質、色素あるいは塩を除いておくことが重要で
ある。第一の点については、本発明では大容量の培養液
を自動化された限外濾過法により効率よく濃縮すること
ができて、大幅なコスト低減が可能である。

また、第二の所望蛋白質の塩析されやすい、あるいは有
機溶媒に溶ｔ−Ｊにくいという化学的性質を効果的に利
用して、培養液を塩析・エタノール沈殿をくみあわせる
ことににりさらに濃縮し、天粕製ステップへの移行を非
常に容易にすることを可能にしている。そして、この濃
縮工程に続いて、イオン交換クロマトグラフィーＪ３よ
び高速液体クロマｌ−グラフィーを行うのであるが、こ
れらの操作は自動化にすることが可能なので、上記工程
を工業規模へスケール・アップすることも可能となるの
である。

一〇の−１・８１１ 本発明は精製蛋白質の製；方法に係るものであるところ
、この方法は工程（Ａ）〜（Ｆ）よりなるしのである。

工程　Ａ　／ベクターの用意 本発明の工程（Ｃ）におけや培養方法は、培地の含有成
分によって形質転換体に組込れたベクターのプロモータ
ー活性が左右されるということを利用したものである。

従って、本発明で用いられるベクターは、使用すべき培
地の関係においてこのようなプロモーターを具備するこ
とが一つの要件である。

ここで「培地の含有成分にＪ：ってプロモーター活性が
左右される」とは、該成分中の少なくとも一つの成分に
よってプロモーター活性が誘導されたり抑制されたりす
ることをいう。また、逆に、このような物質（本発明で
は、プロモーター活性調節物質という）は、その物質の
存在の有無、酒の多少によって、プロモーター活性を阻
害したり、誘導したりする物質のことである。

このようなプロモーター活性調節物質とプ［］モーター
との組合せとしては、例えば以下のようｔｇものがある
。無は燐とアルカリホスファターピのプロモーターどの
組合け〔ビオキミ力・工・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　。

３８．４６０　（１９６０）、ネーチ７−　（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　、　１８３１５２９　（１９５９））　、同様
に無は燐とｐｈｏＥ蛋白質のプロモーター〔化学と生物
、２３、ｐ１８４〜１８５、蛋白質・核酸・酵素、ｉ旦
、２６（１９８３）〕あるいは酸酸性ボスフッタ−のプ
ロモーター〔成用「酵母の解剖ｊｐ１６１〜１６５゜講
談社すイエンティノイク刊〕、グルコースとｌａｃプロ
モーター〔但し、ラクトースあるいはＩＰＴＧ（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）等の誘導物質存在
下〕、炭素源あるいは窒素源また（まその両者と１−（
ｕｔプロモーター（但し、ヒスデシン存在下）、グルコ
ースとａｒａプロモーター（但し、アラビノース存在下
）、トリプトファンとｔｒｐプロモーター（但し、イン
ドールアクリル酸あるいはインドールプロピオン酸など
のトリプトファンアナログの存在下）（成書１゛遺伝子
の分子生物学」　（下）第３版　ｐ４３３〜４５７（株
）化学同人用〕やグルコースとｌａｍＢブ［」モーター
（但し、フル１−−ス存在下）〔化学と生物、２３、ｐ
１８５〜１８６〕等がある。

このようなプロモーター活性調節物質の一具体例は無機
燐である。無機燐とは、微生物にとって無害であってか
つ水溶液に溶解しｌｃときに微生物がリン源どして利用
可能な形の無機燐を金石する化合物から供給されるもの
をいう。そしこのような無機燐は燐酸塩として培地に添
加するのがふつうであって、具体的にはＫ　２　ＨＰ　
Ｏ４とＫＨ２ＰＯ４とを適宜組合せて用いる。また、無
機燐は、このような燐化合物として培地に添加する代り
に、そのような無機燐を含む酵母エキスなどの天然培地
成分の形で添加り゛ることもできる。

本発明で使用するベクターは、このようなプロモーター
を具備しさらに蛋白質の分泌に関与するシグナル遺伝子
をその制御下に具備するベクターであってかつ予定した
宿主細胞内で増殖可能なもの（前記（イ）および（ロ）
の要件を満すベクター）であればよい。ここで用いられ
るプロモーターをコードする遺伝子（ＲＮＡポリメラー
ゼが結合して転写を開始するＤＮＡ領域）は、天然の染
色体ＤＮＡより取得してもよいし、また既に多数のプロ
七−ター遠転子の塩基配列が決定されているので合成し
たものの使用も可能である。

このようなベクターとして特に好ましいものは、（イ）
　Ｊ５　Ｊ：び（ロ）の必須要件を具備したうえ、シグ
ナル遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の構
造遺伝子を結合させ得るように仕組まれたもの、である
。この好ましいベクター（プラスミド）の具体例として
は、本発明名らの共同研究者によって先に提案されたプ
ラスミドｐＴＡ５２９（特ＪＩＳ′ｉ昭５８−１４０７
４８号）、ｌ）ＴΔ１５２９（特願昭５９−１５９７０
３号）、ｐＴ△２５３９（Ｖｊ願昭５９−２７９５８５
号）等がある。これらのプラスミドはいずれらアルカリ
性小スファターゼ由来のプロモーターおよびシグナル配
列（萌二名についてはアルカリ性ボスファターピ由来、
ｐＴ△２５３９はβ−ラクタマーゼ山来）を具備するも
のであり、かつシグナル配列を］−ドづる遺伝子の直後
に外来性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なものである
。ここでｐＴ△１５２９は、ｐＴΔ５２９　（ｐＹＫ２
８３　（Ｅ。

ｃｏｌｉに１２　Ｃ６００（１）ＹＫ　２８３）として
機工研に寄託（機工研条奇策　５５６号））をもとにし
てこれを特願昭５８−１４０７４８号の明細書に記載の
方法に従って造成したしの）とｐＨ３Ｉ（このプラスミ
ドは、ｐＢＲ３２２（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００
（１）ＢＲ３２２）として機工研に寄託（機工？ｌＩ）
条奇第２３５号）〕を制限酵素Ｅ　ＣＯＲＩ　Ｊ５よび
１」ｉ　ｎｄｌｌＩで間化し、このＥｃｏＲＩ−Ｈｉ　
ｎｄｌ［［部分を下記の塩基配列（Ｉ）で示される合成
リンカ−と置換したもの（特開昭５９−７１６９２号公
報参照））とから造成したものである。このプラスミド
の造成操作の詳細は特願昭５９−１５９７０３号の明４
１Ｉｌ泪を参照されたい。

Ｅ　　ｃ　　ｏ　　ＲＩ　　　　　Ｈｐ　　ａ　　Ｉ　
　　　　Ｓ　　ｍ　　ａ　　Ｉ　　　　　ｌ−１ｉ　　
　ｎ　　ｄ　　ＩＩ［（Ｉ） ここで破線は制限酵素切断部位を示し、ＥｃＯＲ■等は
その切断を行う制限酵素の名称を示す。

また、ｐＴＡ２５３９は、ｐＴＡ１５２９のアンピシリ
ン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に変換し、さら
にシグナル配列をβ−ラクタマーＵ由来のものに変換し
たプラスミドである。このプラスミド造成の詳細は、特
願昭５９−２７９５８５号の明細書を参照されたい。

ここでｐＴＡ１５２９は下記の塩基配列（Ｉ）からなる
ＤＮＡ部分を含むので、シグナル遺伝子の直後に外来性
蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なプラスミドぐある。

↓　〜（４） 配列（Ｉ）はシグナル遺伝子部分（１）とその下流側に
結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているが、本発
明の一実施例態様でいう［シグナル配列を］−ドする遺
伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードする
遺伝子を結合させ得るように仕組まれたもの」とは、こ
のようなりＮＡ部分を含むｂのである。なお、本発明に
おいてＤＮＡに関して「下流側」というときは、５′→
３′鎖（十鎖）を上に３′←５′鎖（−鎖）を下に表示
したときの右側を意味する。

塩基配列＜１）は二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ遺伝子の
一部を示すものであって、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞ
れアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンを示しく
前記の（Ｉ）も同様）、Ｌｙｓ、ＡｌａおよびＴｒｐは
それぞれリジン、アラニンおよびトリプトファンを示ず
。この二本鎖ＤＮＡの区域（１）はシグナル遺伝子部分
であり、区域（３）は制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｌ［の認
識部位であり、破線はＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ切断部位である
。区域（２）は、シグナル遺伝子の下流側の直後に結合
されたＤＮＡ部分である。

本発明に用いるベクターは、シグナル遺伝子がアルカリ
性ホスファターゼ由来□であるもの、である。この遺伝
子の塩基配列は、下流側末端のアラニンのコドンがＧＣ
Ｃである。

一方、上記塩基配列（ＩＦ）は、アルカリ性ホスファタ
ーゼ由来の遺伝子の部分（１）の下流側末端のアラニン
のコドンＧ　ＣＣをＧＣＴに、ざらに続く塩基Ｃを王に
改変したものに相当する。アラニンのコドンには縮重が
あるから、改変後のＧＣＴもアラニンのコドンであり、
従って上記（ＩＩ）のＤＮＡ部分（１）は依然としてア
ルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝子に対応す
るＩ）　Ｎ　Ａである。

ところで、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺
伝子は、その下流側末端のアラニンのコドンの上流側に
リジンのコドン△ＡＡおよび下流側にアルギニンのコド
ンＣＧＧを右する。

従って、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝
子が木来有していた下流側末端のアラニンのコドンＧＣ
ＣをＧＣＴに改変し、さらにアラニンに続く塩ＩＣをＴ
に改変したことによって、この末端の塩基対と上流側の
４塩基対および下流側の１塩基対とで制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌＩの認識部位（３）ＡＡＧＣＴＴが現出している。

すなわち、シグナル遺伝子には、少なくとも該末端の塩
基対を構成員の少なくとも一部とする制限酵素認識部位
が創出されている訳である。

ｐＴＡ１５２９の上記（［）の具体例では、Ｈｉｎｄｌ
［［の認識部位（３）内の切断゛部位は破線で示した通
りであって、その位置はシグナル遺伝子とその下流側直
後に結合されていることあるべきＤＮＡ部分（上記ｐＴ
Ａ５２９に係る塩基配列（ＩＩ）では、既に結合されて
いる区域（２））との間に存在している（切断部位の位
置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味する）。制限
酵素認識部位がこのような位置に存在することは、本発
明に用いるベクターにおいて最も好ましいことである。

何故ならば、この切面部位はそれを利用して外来性蛋白
質のｍ造遺転子をこのシグナル遺伝子に心結するための
ものであり、一方この雑種遺伝子が発現して生じる雑種
ないし融合蛋白はシグナル配列とそれに続く蛋白との間
でシグナル・ぺブチターゼによって切断されるのである
から、制限酵素切断部位とシグナル・ベブチターゼ切断
位置とがこのように一致していれば、上記ｐＴＡ１５２
９の例でいえば外来性蛋白質の構造遺伝子（この例では
、ＴｒｐのコドンＴ　Ｇ　Ｇで始まっている）の十鎖の
５′−側にＡＧＣＴを補なっておくだけで、ｌ−１ｉｎ
ｄＩＩ［消化後のシグナル遺伝子の粘着末端との間の結
合が可能だからである。なお、外来性遺伝子の一鎖の３
′−側にも塩基を補うことを扁わなければ、制限酵素切
断部位が上流側に存在してもよいことはいうまでもなく
、そのような切断部位の存在するベクターもまた本発明
に用いられるベクターの範囲内である。

「シグナル配列をコードする遺伝子」は、一般にシグナ
ル配列の種類に応じて各種の塩基配列のものがある。シ
グナル配列の具体例をいくつか挙げれば、β−ラクタマ
ーゼのもの〔プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・丈イエンシズ・オブ・ユナイテッド
・ステーブ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　、ひ、３７３７　（１９７８）　）　
、リポ蛋白のもの（同上、圓、１００４　（１９７７）
　）　、アルカリ性ホスファターゼのもの（ユーロビア
ン・ジ１！−ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｆｕｒ
、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、　）、凹、４９　（１９７
９）　）等がある。シグナル配列については、［蛋白質
・核酸・酵素」臨時増刊号（「遺伝子操作」）、第２６
巻、第４号、第３８６−３９４頁、を参照することがで
きる。しかしながら、本発明で使用する好ましいシグナ
ル配列は、アルカリ性ホスファターゼの塩基配列のもの
およびβ−ラクタマーぜ由来のものである。このような
シグナル配列を具備する上記プラスミドであれば、本発
明の工程（Ｃ）の培養方法を利用することにより前記し
たような利点が得られるからである。

上記（ＩＩ）に示した本発明に用いるプラスミド（ベク
ター）が具備するＤＮＡＷ伝子の転子体例は、アルカリ
性ホスファターゼ由来のＤＮＡを改変してつくったもの
であるから、シグナル遺伝子ＤＮＡの部分（１）の下流
側末端直後にアルカリ性ホスファターゼ由来のＤＮＡ部
分（２）が結合している。本発明の具体例は、このＤＮ
Ａ部分（２）が外来蛋白をコードする遺伝子に対応する
ＤＮＡ部分であるものである。

なお、この具体例の範賭に属する本発明に用いられるプ
ラスミドが具備するＤＮＩＨ伝子の転子は、シグナル遺
伝子部分が天然物由来の部分と合成された部分とからな
るものである。ずなわら、制限酵素切断部位より上流側
が天然物由来の部分であり、下流側が合成されたもので
ある。この場合の下流側の合成された部分は上記（■）
したような切断部位の位置の場合には一重鎖の４！２阜
（ＡＧＣＴ）であるが、切断部位がこれより上流側に存
在す°れば一鎖にし合成部分が必要となることはいうま
でもない。

より／　　”’Ｉ−（Ｄ゛告ｌ’ 微生物の形質転換【よ、組換えＤＮＡ技術の分野におり
る公知の常法に従って行うことができる。

例えば、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の横Ｂ　１
仏子を組込んで１］換えＤＮＡ（キメラプラスミド）と
し、これを用いて微生物を公知の方法（例えばクシュナ
ー法；ジエネテイツク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　、１９７８．１７
（１９７８）　）に従って形質転換したのち、所望の形
質転換体を取得（通常はプラスミドのマーカーを利用す
る）する合目的的な任意の方法によって行うことができ
る。

本発明によるこのようなキメラプラスミドによって形質
転換しうる微生物は、その菌体内で上記プラスミドが増
殖し得るものであればよく、具体的には大腸菌、枯草菌
Ｊ′３．Ｊ：び酵母菌等がある。なかでも大腸菌が比較
的よく利用されており、そして本発明は大腸菌のような
ダラム陰性菌を宿主菌として用いるときに特に前記した
ような効果を有するものである。大腸菌としては、例え
ば、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　Ｃ６００（機工研条奇
第１１５号）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７
（機工研菌奇第７９４１号）、［Ｅ、ｃｏｌ　１ＲＲ１
（ＡＴＣＣ３１４−４７）およびＥ、ｃｏ　ｌ　ｉ　　
１−ＩＢｌｏｌ　（ＡＴＣＣ３３６９／Ｉ）等がある。

本発明の具体例では［、ｃｏｌｉＫ１２　　ＹＫ５３７
を用いている。

本発明において使用したこのような形質転換体の具体例
は、プラスミドｐＴＡ１５２９　（前記）に人工的に合
成したｈ−ＥＧＦ（後記）の構造遺伝子を組込んでキメ
ラプラスミドｐＴ１５２２を造成し、ついでこのキメラ
プラスミド（組換えＤＮＡ）を宿主菌Ｅ、ｃｏｌｉ　　
Ｋ１２ＹＫ５３７に移入させることにより造成した形質
転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴＡ
１５２２）である。

なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経
ベブヂドおよび酵素等のものが考えられる。これらのＷ
Ｉ構造遺伝子調製方法どしてＧ、Ｕ、天然の染色体ＤＮ
Ａより取得する方法や、あるいは人工的に合成する方法
等が考えられ、実際の構造遺伝子の調製方法については
種々の成鶏や文献を参照することができる。

本発明の一実施例においては、このような外来性蛋白質
の構造遺伝子としてヒ１−Ｊ：皮細胞成長因子（ｈ−Ｅ
ＧＦ／１）−ＵＧ、以下ｈ　−ＥＧＦと記す）をコード
する遺伝子であって化学的に合成したもの（合成の詳細
は特願昭５８−１２３５０号の明細書参照のこと）、を
用いた。

工程（Ｃ／　生　の立 本発明の工程（Ｃ）による培養は、培地の含有成分によ
ってプロモーター活性が調節されるプロモーター（本発
明の一興体例ではアルカリ性ホスファターゼ由来のプロ
モーター）を具備するベクター（プラスミド）に所望の
外来性蛋白質の構造遺伝子を組込んでキメラプラスミド
（組換えＤＮＡ）とし、これを宿主微生物に移入させる
ことにより形質転換した微生物を対象とするものである
。

そして、本工程の培養方法の特徴は、形質転換された微
生物が保持しているベクター（プラスミド）の性質、す
なわち培地の含有成分（本発明の一具体例では無機燐皇
）に依存して蛋白質合成能に誘導がかかったり、かから
なかったりする性質（前記ビオキミカ・工・ビオフィジ
力・アクタおよびネーチア参照）、を巧みに利用して、
単一の培養系において微生物の増殖とそれに続く微生物
による蛋白質合成能の誘導を行わせたのら、さらに微生
物の生育と蛋白質合成とを維持するための成分（本発明
の具体例では無機燐）を含有する培地を該培養系外より
連続的に添加するということよりなる点である。

このような培養方法の詳細は下記の通りである。

１）　培養方法 工程（Ｃ）による微生物の培養方法は、まず形質転換さ
れた微生物を単細胞純粋分離培養し、ついで前培養にイ
リシたのち〔以上は微生物を培養する場合の公知の常法
であり、多数の文献ヤ）成γ）を参照することができる
。例えば、成鶏「微生物学実験法」　（講談社用）、「
微生物実験法」　（共立出版刊）、「細菌学実習提要」
　（丸善刊）等がある。〕、単一の培養系において微生
物の増殖に続き蛋白質の合成能の誘導を行わけ（以下「
第一工程」）だのち、微生物の生育と蛋白質合成能とを
維持するための成分く例えば本発明の一具体例では（無
機燐）を含有する培地（流加培地）を該培地系外より連
続的に添加する（以下「第二工程」）というものである
。

この培養方法は、通気撹拌培養の範晴に属するものであ
って、具体的には、培養系において菌を接種したのち培
地に無菌空気（必要に応じて純酸素を混入したもの）を
導入し、これを′物理的に撹拌しつつ、ｐＨ，温度、溶
存酸索溌度等を、培養する微生物の成育条件に適合させ
て好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる
。

このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアップが可能であること
【よいうまでもない（成書「生物化学工学」　（上）、
（下）巻く東京大学出版会）参照）。

２）　　培　　地 第一工程で用いる培地および第二工程で用いる添加培地
は、下記で示されるものである。

（１）第一工程 本工程は、微生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白
質合成を行う工程である。

従って、培地としては、ＬＢ培地（トリプトン、酵母エ
キス、塩化ナトリウム）あるいはこのうち塩化ナトリウ
ムを除去したものを基本培地とし、必要に応じて他の成
分（例えばＭ　Ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２０、ＫＨ２ＰＯ４
、Ｋ２ＨＰＯ４、抗生物質等）を添加したものであって
、ざらに形質転換された微生物の増殖過程における対数
増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘導
を起こすに必要充分量のプロモーター活性調節物質を含
有するように調整したものを用いる。このような物質は
、例えば本発明の一員体例ではプロモーターがアルカリ
性ホスファターゼ由来のものなので、これは無機燐であ
り、燐１として１００〜３００η／ンχ含有する培地を
用いるのが好ましい。

なお、プロモーターがｐｈｏｌ：や酸性ホスファターゼ
由来のものであってもこの条件で培養は可能であろう。

Ｉａｃプロモーター、Ｈｕｔプロモーター、ａｒａプロ
モーターおよびＬａｍＢプロモーターでは、このような
プロモーター活性調節物質がグルコース、ｔｒｐプロモ
ーターはトリプトファンなのでこれらの物質を適宜用い
ればよい。

また、本発明の一興体例においては、抗生物質をも培地
に添加している。づ゛なわち、形質転換体がＥ、ｃｏｌ
ｉ　　ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）の培地にはアンピ
シリンを、［：、ｃｏｌｉ　　ＲＲｌ　（ｐＴＡ２５３
２）の培地にはカナマイシンを添加している。これは、
各々の宿主菌に移入されたプラスミドはアンピシリン耐
性若しくはカナマイシン耐性の遺伝子を具備するものな
ので宿主もアンピシリン耐性若しくはカナマイシン耐性
であり、従って、培養中にプラスミドの脱落した菌（ア
ンピシリン感受性若しくはカナマイシン感受性である）
は培地中のアンピシリン若しくはカナマイシンによって
成育が抑制されるので、形質転換されたものであって該
プラスミドが保持されている菌体のみが成育することを
目的としているからである。このような培地への抗生物
質の添加は、宿主菌の成育上の便宜を図るための一手段
である。

（２）　第二工程 本工程は微生物の生育を保持し、第一工程での蛋白質合
成能の誘導による蛋白質合成をできるだけ長期にわたり
維持することを目的とする培養工程である。

このような蛋白質合成能はプロモーター作用の誘導によ
り引き起されて、本発明の一員体例のようにプロモータ
ーがアルカリ性ボスファターげ由来のものである場合、
培養液中の無機燐の欠乏条件下で誘導が起こる。

従って、本工程の目的を満足し得る具体的手段は、上記
第一工程の培養液中に一定量の無機燐含有培地（流加培
地）を連続的ないし間歇的に添加することである（間歇
的添加の場合の添加間隔は同一であっても同一でなくて
もよい）。ここで注意すべきことは、培地中の無機ｇ４
ｍが過剰にならない程麿に流加培地を添加するというこ
とである。

培地中の無機燐量が過剰状態になると、プロモーター作
用に抑制がかかり、その結果、蛋白質合成能が低下する
からである。

本工程で用いられる流加培地は、微生物の培養に一般に
使用されている種々の培地のうち一定も１の無機燐を含
むものであればよく、流加培地の添加により培養液量が
増加することを考慮すればできるだけ高濃度の培地を用
いるのが好ましい。

このような流加培地の具体例は、トリプトン、酵母エキ
ス、Ｍｇ５０　・７Ｈ２０およ・びグルコ−スからなる
ものであり、さらに第一工程と同様の目的でアンピシリ
ンまたはカナマイシンを添加したものである。そして、
本工程の目的に適合させるべくこの培地の流加速度を適
宜調節すればよい。流加速度は一定にしても、あるいは
微生物活性状態に合せて随時増大させるようにしてもよ
い。

本発明の具体例では、８３戒／時間および７５ｍ／時間
で速度を一定にして行っている。

本培地の流加開始時期は、プロモーター活性誘導開始か
ら微生物の死滅が始まるまでの間であればよい。本発明
の具体例では第一工程でプロモーター活性の誘に）開始
後５．５時間、ずなわち培養開始後約１２．５時間後よ
り流加培地の添加を開始している。

なお、プロモーターがアル−カリ性ホスファターピ由来
以外のものであっても、上記に準じてそのプロモーター
活性に影響を及ぼす物Ｓｉ　（前記）を含む培地を適宜
添加すればよいと考えられる。

３）　培養条件 （１）　培養温度 第一工程の培養温度は、用いる微生物の増殖に適した温
度であればよい。通常用いる大腸菌および本培養工程に
使用した大腸菌の場合は、３７℃が好適である。

第二工程の培養温度は、微生物の活性が維持できく例え
ば２５℃〜４０℃）、かつ形質転換された微生物によっ
て産生された産物が安定である温度であればＪ：い。そ
のような温度としては、本発明のようなｈ　−ＥＧＦを
産生させる場合は３７℃が好ましい。

（２）　培養時間 本発明の工程（Ｃ）に−ハノる培養時間は、ｊ８養液中
に分泌されている所望蛋白質の闇が最大どなる時間であ
る。そして好ましくは、宿主菌が溶菌せずにかつ所望蛋
白質が培養液中に多量に分泌された時間である。菌体が
溶菌すると、菌体中の秤々の雑多な物質が培地中に混入
するに到って所望蛋白質の回収が難しくなるからである
。

このような培養時間の検討は、培地中のグルコースおよ
びプロモーター活性に影響を与える物質（例えば無機燐
）の定量、ＯＤ　　の測定、生菌数の測定、ペリプラズ
ム中および培養液中の産生物質の定量を指標として行う
ことができる。グルコースの定量はグルコースオキシダ
ーゼ法にューグルコスタット「フジサワ」のキットを利
用。）により、生菌数はＥ、Ｃ０１ｉ　　Ｋ１２ＹＫ　
　５３７（ｐＴＡ１５２２）の場合についていえばアン
ピシリンを含むし一培地（前記）の寒天上に成育するコ
ロニー数を測定することにより、無機燐の定量はモリブ
デンブルー法（工場排水試験方法：ＪＩＳ　　Ｋ　　０
１０２）に従って行い、また培養液中の産物ｈ　−ＥＧ
Ｆの定量はまず培養液（１０ｍ）をとり、これを遠心し
たのち上清をＲＲＡ法（後記）に従って行い、ペリプラ
ズム中のｈ　−ＥＧＦについては菌体をオスモティック
・ショック法〔前記ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー参照〕によって処理後、この溶液を遠心
して上清をラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）法〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、凹３０５３（１９８２）
　）によって分析することににり行った（ｈ−ＥＧＦ定
量の詳細は後記参照例および特願昭５９−１５９７０３
号明細書参照）。

なお、ここで、菌体内で発現されたｈ　−ＥＧＦが菌体
内（細胞質内）に存在しているかどうかをも調べた。す
なわち、上記オスモティック・ショック処理後、得られ
た沈殿（菌体）を純水に再度懸濁させたのち、超音波処
理を行って菌体破壊を行い、ついで遠心を行って上清を
得、この上清を上記ＲＲＡ法に従って分析覆ることによ
り、菌体内（細胞質内）のｈ−ＥＧＦを定量した。

ざらに、菌が溶菌しているかどうかの判断をするためベ
ータガラクトシダーゼ（β−〇ａ１）を定量した。β−
ｐａｌは細胞内に存在する酵素であるところ、もしも菌
が溶菌しているならば培養液中にもβ−ｇａｌが存在す
ることになるからである。このようなβ−ｇａｌの定量
は、ミラーの方法（成鶏「エクスペリメンツ・インパモ
レキュラー・ジェネティックスＪ　　（ＥＸｐｅｒｉｍ
ｅｎｔＳ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
）　、　Ｐ２Ｓ５．（１９７２）　：Ｉ−ルド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−刊〕に従って行って、０
Ｄ４２ｏで活性を表示した。なお、このβ−ｇａｌの定
量を菌が溶菌しているかどうかの判断の指標どしている
文献として、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・アプラ
イド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロ
ジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ＾ｐｐ
ｌｉｃｄ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、　１６．１４６　（１９８２
）、同、厘、５（１９８４）がある。

（３）　培地のｌ）Ｈ り　ｌ−１は微生物の成育可能な範囲であればよく、用
いられる微生物によって適宜好ましいｐＨを設定づれば
よい。大腸菌を用いる場合には、大腸菌の成育可能なｐ
Ｈは通常４．６〜８．８であり、このうちｐｌ−１７，
０〜８．０の間が１！ｆに好ましい。

（４）　消泡剤 培養中発泡の著しいときは、消泡剤（高級アルコール、
植物油等）を添加するのが常套手段である。本発明の場
合にＪ３いて用いる消泡剤は、本発明の一具体例では無
改燐の存在Ｉｔによって微生物の蛋白質合成能を制御す
るのであるから、ｗ、機燐を含有しないしのであること
が肝要である。そのような消泡剤の具体例としては、「
アンヂホームーへ］ニーエマルジョン」　（牛丼化学）
がある。

（５）　溶存酸素（Ｄｏ） 溶存ＰＩｉ糸どｔよ、液相中に溶解している分子状酸素
のことをいう。

一般に通気撹拌培養に際しては、Ｄｏが過多の場合は微
生物の増殖【よｌ！Ｉ害され、一方Ｄｏがｌｐｐｍ以下
になっても同様に増殖が阻害されるということが知られ
ている。従って、ＤＯｔｌｉを微生物成育の阻害因子と
仕らないように制η１１することが好ましい。本発明の
一具体例の場合は、Ｄｏコントロール装置〔オリエンタ
ル電気（■ＦＣ−４型）によりＤＯｆｆｉを４　ｐｐｍ
に保持している。

工程（Ｄ）／培養液の８’Ａ縮 この段階は、前記工程にＪ３ける培養液を好ましくは濾
過したのち、ン戸液を濃縮する工程である。

ηなわら、遠心分離法により大まかに菌体を除去し、つ
いで膜を利用して濾過り゛ることにより完全な除菌を行
ったのち、この膜にＪ：るン濾過によって生じることが
ある濃縮が不十分なる場合にはこれを濃縮する、という
工程である。この工程で１９られる画分を、ｒＩｌ縮両
分」という。ここで膜を利用して濾過するとは、好まし
くは限外濾過膜を用いて行うン濾過のことをいい、この
ようなン濾過法は公知の常法である限外ン濾過法により
行うのがふつうである。そしてこの方法を行うための装
置は秤々市販されている。なお、ここでいう限外濾過と
は、たとえば、中空糸状の膜からなる中空糸膜内部に培
養１戸液を圧送するかあるいは薄層流路型のモジュール
に培養液を圧送してこれを膜内表面に対して平行に流す
クロスフロー６式で、ｉ濾過限界分子量以上の低分子物
質は濾過されていくが、ｉ濾過限界分子量以上の蛋白質
等は通過することなく系を循環しながら濃縮されるとい
う方法を指づしのであるし成田［生化学実験講座１・蛋
白質の化学Ｉ　Ｊ　Ｅ１本生化学会編、東京化学同人用
（１９７６）参照］。本発明の一員体例では、限界濾過
は自動限界濾過装置を用いて行っている（詳細は後記）
。

本発明の一員体例では限外ン濾過ににり濃縮した培地上
清は、そのままではゲル濾過等のカラムク［１７１〜グ
ラフイーに直接付すことができない。なぜならば、Ｉ８
養ン戸液中に含まれる塩あるいは培地成分（例えば）ト
リプメン、ゴース１〜抽出物等が、ｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆの吸
容あるいは溶出を妨害づ゛るからである。そこで、この
ような場合は硫酸アンモニウムに、」：る塩析を行って
、ｈＥＧＦを含む大部分の蛋白質を沈殿物どして回収す
るのが望ましい。そして、この沈殿物は培谷鎮液中にみ
られるる色成分を未だ含んでいて黒褐色に着色してｄ３
す、そのままではカラムクロマトグラフィーをおこなう
ことはできないので、次のエタノール沈殿によりこの着
色成分の除去を効果的に行うことが望ましい。

すなわち、硫安分画でえられる沈殿物を最少量の水に溶
解後、冷エタノールを徐々に添加して、　　ｈＥＧＦを
沈殿物として回収づる。こめように、本発明の一具体例
で【ま１タノールの添加により、大部分の着色成分は、
遠心分離後の上清に回収され、ｈＥＧＦは、灰白色沈殿
物として回収される。

従って、本工程で濃縮とは、培養液を限外濾過法で濃縮
したのら、必要に応じて硫安分画、エタノール沈殿等の
処理に付１ことも含む。

本発明の一具体例Ｃはエタノール沈殿物を、水に懸濁さ
ばて遠心分離にｆ＝Ｊすことにより、大部分のｈＥＧＦ
を水溶液としで回収することができる。

ここで１ｑられるｈＥＧＦ溶液は、塩讃度が高く、その
ままでは後続のイオン交換クロマトグラフィー（工程Ｅ
）に付すことが難がしいので、透析により脱塩操作をお
こなうことがふつうである。

以上のような８）コ縮操作により、本発明の一員体例で
は培養か液をおよそ３５　Ｇ’！　濃縮Ｊることができ
、以後のカラムクロマトグラフィーによる処理を容易に
することが可能にしている。

工工Ｅ／Ｆ−クロマ］〜ｌラフイー エ稈ＥおよびＦは、本発明に係る工程のうら、上記で１
５られた濃縮両分より所望物質を精製する過程である。

７Ｉなわら、上記濃縮両分をまずイオン交換クロマトグ
ラフィ＝（工程Ｅ）に付して所望の蛋白質画分をある程
度精製して濃縮された両分を（Ｈて、ついでこの両分を
高速液体クロマトグラフィーに付すことにより精製され
た所望蛋白質画分をｊｑる（工程Ｆ）。

ここで、イオン交換クロマトグラフィーは、所望蛋白質
を粗精製するという工程であり、ＶＪ製手段として高速
液体クロマ［−グラフィーを行う上では前処理がふつう
は必要であるところから、この工程Ｅは高速液体クロマ
トグラフィーの前処理にも相当する工程である。従って
、本発明では、工程Ｅでイオン交換クロマトグラフィー
に付し、つづく工程Ｆで高速液体クロマ１〜グラフイー
に付ずことになる。

イオン交換クロア１〜グラフイー この工程ば、上記所望蛋白質を含む濃縮両分から所望蛋
白質画分を分離し、ざらにｆＪ縮することを目的とする
ものである。すなわら、上記工程りで調製された濃縮両
分をイオン交換カラムに付して所望蛋白質画分をカラム
に吸着さヒ、ついで所望蛋白質の溶出を行う。

ここで、イオン交換体に吸着される物質を溶出する方法
には、塩濃度等を直線的に変化さＵる直線的ｆ１度勾配
法と階段的にｉｆ１度を変化させるステップワイズ法が
知られている。工業的現役でのイオン交換カラムクロマ
トグラフィーの溶出は、濃磨勾配をつくるための装置に
限界があるため、ステップワイズ法が望ましい。

なお、−具体例においては、この工程は上記操作により
えられるｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　ＷＪ縮液を陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより完全な構造をもつＥＧＦ（ｈＥＧ
Ｆ−１）ないしはこれと同等の活性を右１′る誘導体く
カルボキシル末端から２個のアミノ！’ｉ！２（（Ｌ　
ｅ　ｕ５２−　Ａ　ｒ　Ｃ＋”３））を欠いたｈＥＧＦ
　−１１＞を分離することを目的としていたので、本発
明名らは、ｈＥＧＦＩ、■、Ｊ５よび夾雑物との分離の
ための条件検討をおこない、ステップワイズ法によるり
［１マドグラフイ一条件を確立して、これらを確実に分
離づることかできた。

このようなイオン交換クロマ１〜グラフイーを用いた蛋
白質の分離・精製方法は公知であり、種々の成用や文献
等を参照することができる（例えば前記［生化学実験講
座　タンパク質の化学ＩＪ）。

Ｊなわら、ここで用いるイオン交換樹脂は、精製しにう
どする蛋白質、の安定性や溶解性（蛋白質が失活や沈殿
を起すことのないＤ　Ｈやイオン強度等）、また、等電
点等によって適宜選択づる必要がある。例えば、生理活
性を右する蛋白質（ｈＥＧ「、インターフェロン、成長
ホルモン等）を精製づる場合のイオン交換樹脂としては
、解離基としてジエチルアミノエヂル（ＤＥＡＦ）を右
する基材（１１繊維性セルロース、繊組性セルロース、
微顆粒性セルロース、セファデックス等）が考えられる
。そして、これら樹脂は種々市販されており、精製する
物質にあったものを容易に入手することができる。この
ような樹脂の市販品の具体例としてｈＥＧＦを精製する
場合は、ＤＥＡＥ−セロルースＲＤＥ−５２（ワットマ
ン）やＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥΔＲＬＲ（東洋曹達）力
〈ある。また、カラムサイズ、カワムｄｌ１１度や溶出
液、溶出速度等の溶出条件は、精製する物質によって適
宜変更するのが好ましい。なお、目的とする所望蛋白質
の両分は、溶出した各両分の吸光度および生理活性を測
定してこれらのピークが重なった両分を回収することに
より（ｑることかできる。

本発明の一具体例としてｈＥＧＦのイオン交換クロマ１
ヘゲラフイーは、試料を陰イオン交換カラム（樹脂はＤ
ＥＡＥ　　ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　　Ｒ）にイ１したのら
、カラムを酢酸系の溶媒で洗浄し、ついでｌ［系の溶媒
で溶出を行うことにより所望蛋白画分を分取することか
らなるものＣある。なお、ここで所望蛋白両分は、各溶
出画分の２８０ｎｍにおりる吸光度、および活性（ラジ
オリレブタ−アッセイ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ１１ｃｍ
、　３０５３（１９８２））に従って行った）を測定す
ることにより吸光度のピークと活性のビークとが一致し
た両分を分取して１またものである（操作の詳細は後記
実施例を参照されたい）。

高速液体クロマトグラフィー この工程は、前工程のイオン交換クロマ１−グラフィー
によって完全に除去できない夾雑蛋白から所望蛋白質を
分離して、高純度標品を得ることを目的とするものであ
る。すなわら、前工程のイオン交換クロマトグラフィー
によって得られる所望蛋白質の両分を高速液体クロマ１
−グラフィー初期緩衝液に溶解して試料とし、これを高
速液体クロマトグラフィーに付すことにより所望蛋白質
の高純度画分を得る。

高速液体クロマトグラフィーは、充填剤の種類によって
、分配吸着クロマトグラフイー、ゲル浸透クロマトグラ
フィーおよびイオン交換クロマトグラフィーに分類でき
るが、本発明の場合は、前工程でイオン交換クロマトグ
ラフィーを行っているので分配吸着クロマトグラフィー
（逆相系）が好ましい。

ここで逆相系とは、逆相系クロマトグラフィ　−をいい
、リガンドとしてアルキル基（Ｃ８やＣ）などの疎水性
基を化学的に結合させた担休たとえばシリカを固定相と
して含水育成溶媒で溶出する方法をいう。また、このよ
うな系にＪ３ける所望蛋白質の溶出は、アセトニトリル
やアルコール類（エタノール、ブ［１パノール等〉で行
うのがふつうであり、これらのｍ度を直線的に増加さけ
る直線的濃度勾配法によって行なうのが好ましい。

このような高速液体クロマｌ−グラフィー自体は公知で
あって、種々の成田や文献、例えば（ｉ）化学増刊１０
２「タンパク質・ベブグードの高速液体クロマトグラフ
ィーＪ　　（１９ＥＥＩ＞、東京化学同人刊、（ｉｉ）
成田「クロマトグラフィー分離システムＪ　　（１９８
１）九西刊等を参照することができる。また、このよう
にして得られた所望蛋白質の精製度の確認は、高速液体
クロマトグラフィーや電気泳動等の手段によって行う（
後記参考側参照）のが一般的である。そして、ざらにこ
こで得られた蛋白質の物理化学的性質（アミノ酸組成、
−次構造、二次４ｆ４造等）を調べればなおさらＪ、い
。

本発明の場合は、このようなりロマトグラフィーの一具
体例として、まず工程Ｅ″ｃ得られた粗精製ｈＥＧＦ画
分を凍結乾燥し、ついでこれを溶媒（アセトニトリル、
酢酸を含む水溶液）に溶解したのら逆相系の高速液体ク
ロマトグラフィーに付づことにより精製されたｈｔＥＧ
Ｆ画分を、常法により凍結乾燥したのち、酢′ｍ塩とし
て得ている（詳細は後記実施例を参照されたい）。

実　　験　　例 実施例１ 工程（△）　ｌ）よび　Ｂ　　／　３ｎｒ　、；　、　
　の゛ニー１゛下記の方法に従って、形質転換体Ｅ、ｃ
ｏｌｉＫ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴ△１５２２）を造成
した。

ｐＴＡ１５２９（造成の詳細は特願昭５９−１５９７０
３号の明細書参照）５μびを、５０μＩの緩衝液（１０
ｍＭｌ−リス−塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）（
ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｑＣｌ　　　５０Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１）中で４単位の制２・ 限酵索Ｈｉ　ｎｄｌＩ［（タカラ〕　（以下ｌ−１ｉｎ
ｄｐｉを用いて３７℃で１時間加水分解した。□ついで
、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を、３０μｍ
の反応液（６７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ（ｐＨ８，
８）　、１６．６ｍｆｖＨｆｆｌｌｆｆｌアンモニウム
（以下（Ｎ）−１４）２Ｓ０４〕、６．７ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡ）、０．６６ｍＭずつの
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）中で１単位の
Ｔ４−　ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃で１５分間
処理した。ついで、エタノール沈殿物を、５０μｍの反
応液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、６
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１５０ｍＭ　　ＮａＣＩ）中で４
単位の制限酵素５ａｌＩ（タカラ）（以下、３ａｌｌと
記す）を用いて３７℃で１時間加水分解した。反応終了
後、アガロースゲル電気泳動によって、３９００ｂｐの
ＤＮＡ断片（図中■）を（Ｕた。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＵＧ （ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐ
ＢＲ３２２）として寄託済み〔機工団栗奇策２３５号〕
）をＥ　ＣＯＲＩ　ａ３よび５ａｔＩで消化したものに
ムコ−的に合成したｈ　−ＥＧＦ構造遺伝子をＥＣＯＲ
Ｉおよび５ａｌＩで消化した断片を組み込んだもの〕　
（特開昭６０−２８９９４号公報記載の方法で造成）５
μグを、５０μｍの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＩ−１７，５）、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、５
０ｍＭＭｇＣｌ２）中で４単位の制限酵素ＥＣＯＲＩ〔
タカラ〕を用いて３７℃で１時間加水分解したのち、上
記と同様にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行い、さらに
５ａｌＩ処理を行ったのち、アガロースゲル電気泳動に
よって１６０ｂｐのＤＮＡ断片（図中■）を冑た。

上記で調製した二つのＤ　Ｎ　Ａ　１ｆｌｉ片（図中■
および■）を、３０ｕ　ｌの反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ
−１−１ｃＩ　　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣｌ　
　　　１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ２・ ＡＴＰ）中で３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ〔タカラ
〕を用いて１４℃で１６時間反応させた。

反応終了後、これで大腸菌に１２ＹＫ５３７の形質転換
を行って、目的のプラスミド（以下、ｐＴ△１５２２）
（図中■）を含有する形質転換株（Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ
１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２））　　　を　ヤ７　
Ｉこ　。

■、　Ｃ／形′１１尺１色本の培養 形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ
１５２２）を、以下の方法に従って培養した。Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７（ｐＴＡｌ　５２２）を複合
培地（トリプトン　１０ｊ／リツトル、酵母エキス５ｇ
／リツ１〜ル、アンピシリン２０ＲＦｉ／リツトル）１
００ｄを含む５００ｄ容の坂ロコルベンで３７℃で一夜
振盪培養した（前培養）。

ついで、この培養液５ｄをとり、複合培地（１リットル
当りグルコース３０ｇ、トリプトン２０び、酵母エキス
１　ｏｙＳＭＱＳｏ　　・７Ｈ２０１Ｊ１アンピシリン
２０Ｉｎ！Ｊ／リットル）１リツトルに接種したのち３
リツトル容の小型通気撹拌培養装置（ミニジ１Ｆ−ファ
ーメンタ−）中で培養した。

培養温度は３７℃、通気量は０　、５　ｖｖｍ　　（１
ｖｖｍはｉ　ｖｏｌｕｍｅ−ｖｏｌｕｍｅ−ｍｉｎｕｔ
ｅのことで、１分間あたり培養液１リツトルに対して１
リツトルの空気が導入されることを意味する）、ｐＨは
７．０（’Ｉ　Ｎ　Ｎ　ａ　Ｏ＋−１，４ＮＭＣＩで調
整する）、溶存酸素（Ｄｏ）Ｉｎ度はＤｏコントロール
装置により撹拌速度を変化させて４　ｐｐｍ付近に保持
した。

無Ｒ燐がＷＪ殖制限囚子となってプロモーター活性の誘
導がおこってから５．５時間（培養時間１２．５時間）
ｆ８養を行ったのら、流加培地の添加を開始した（第二
工程）。流加培地は、グルコース８０ｊ／リツトル、ト
リプトン４０Ｃｊ／リットル、酵母エキス２０ｇ／リッ
トル、アンピシリン８０ｍ９／リツトルからなる複合培
地を用い、流加速度は８３成／時間で一定に保った（定
速流加培養）。

培養は、ＯＤ　　を目安として菌体けが最大に達した後
、菌体量が低下し始めるのを確認し、培養液中のｈ　−
ＥＧＦのｍが最大となるまで行った。

また、培養状態を把握するため、グルコースｄ３よび無
機燐の定量、生菌数の測定、菌体内（細胞質内）および
ペリプラズム中のｈ　−ＥＧＦの定量を経時的に行った
。

グルコースの定量は、グルコースオキシダーゼ法にュー
グルコースタット「フジササワ」のキットを用いた）に
従って行った。生菌数の測定は、アンピラ９２２０ｍｇ
／リットルを含むし一培地（トリプトン１０ｇ／リット
ル、ＩｆＴｈエキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ　　５ｙ
／リツトル）の゛寒天プレート上に出現するコロニーの
数を測定することにより行った。

ｙａｖａｖＡの定量は、モリブデンブルー法（前記）に
よって行った。また、菌体内（細胞質中）、ｊａ　ａ液
中およびペリプラズム中のｈ　−ＥＧＦの定量は下記の
方法で行った。ずなわら、培養液１０ｔｎ（ｌをとり、
遠心分離したのち上清をＲＲＡ法（下記）で分析するこ
とにより培養液中のｈ−ＥＧＦを定量し、ついでこのと
き沈殿物として１コ１られた菌体を２０％シューりｏ−
ス、０．０３ＭＴｒｉｓ−１−ＩＣＩ　　　（＋）Ｈ８
，０＞　　　、　　ＥＤＴＡｏ、００１Ｍからなる溶液
２０ｄに懸濁さｕ、室温で１０分放置した。ついで、再
度遠心して集菌し、この菌体を２０ｄの冷却水（Ｄ℃〜
４℃）に懸濁ざば、水中で１０分間放置した（オスモテ
ィック・ショック法による処理）。そしてこの懸濁液を
遠心して上清を１７、この上清をラジオリセブターアッ
セイ（１１ＲＡ　）法によって分析することによりペリ
プラズム中のｈ−ＥＧＦを定量し、また、上記オスモテ
ィック・ショック処理後に１９られた沈殿物（菌体）を
純水１０ｍに再懸渇したのちこれを超音波処理（［クボ
タインソネーターモデル２００ＭＪ　）（１０分間）を
行って菌体を破壊し、遠心（２７０００ｙ、３０分間）
して得られた上清をＲＲＡ法（下記）に従って分析する
ことにより、菌体中（細胞質中）のｈ　−ＥＧＦの定量
を行った。ＲＲＡ法は、下記のようにして行った。まず
、ヒト−帰咽腔癌柵胞由来のＫｆ３細胞（ＡＴＣＣＮｏ
、ＣＣＬ１７）を、８０（７１７）フラスコ中でダルベ
ツコ変法イーグル（ＤＭＥ）培地〔日本〕中で単層培養
した。つぃぐ培地を除き、０．０５％のＥＤＴＡを含む
リン酸平衡化Ｉｎ溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがし
て、細胞懸濁液を作成した。その後、２０ｍＭヒープス
（１１ｃｐｃｓ）（ｐＨ７，４）をＤ　ＣＡ　ンクス（
ｆｌａｎｋｓ）平衡塩類）８液（ＨＢＳＳ）で２回細胞
を洗浄した。細胞をパインディング・ツルージョン（Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ　Ｓ。

１ｕｔｉｏｎ）　　（Ｄ　Ｍ　Ｅ培地２０ｍＭヒーブス
（１１ｅｐｃｓ）（ｐＨ７，４）　　・０．３５ｇ／’
Ｊット）ＬｔＮａＨＣＯ３・１００１１ｇ／ｍ１．スト
レプトマイシン〕に懸濁後、細胞数を５１鈴して３０万
〜７Ｉｏ万１０．２ｍパインディング・ソルーショーン
となる様調整し、チューブに０．２ｄｆっ分注した。

ついで上記３種の上清を各々および１２５１−ｍＥＧＦ
（マウス上皮細胞成長囚子（以下ｍＥＧＦ））を含む試
料液０．２ｍｌをチューブに加えて、３７°Ｃで１時間
インキュベートした。細胞を氷冷した１−Ｉ　Ｂ　Ｓ　
Ｓで３回洗浄後、１０％のトリクロロ酢酸〔以下、ＴＣ
Ａ）に懸濁ざＶ１グラスフィルターを用いて細胞を固定
し、アセトンでＴＣＡを除いた後、液体シンデレージョ
ンカウンターを用いて計数した。そして、ｈ　−［ＥＧ
Ｆのｆｆｉをｒｒｌ　Ｅ　Ｇ　Ｆに換りした。本工程に
お（プる各培養時間にお１〕る、ＯＤ　　、生菌数、無
驕燐、グルコースおよびｈ６Ｏ −ＥＧＦ吊、さらに培養中での菌の溶菌の度合を調べる
ため培養液中のβ−ｇａｌおよび菌体内（細胞質中）、
オスモティックショック処理後に冑られる上清中のβ−
ｇａｌ（ｉＪなわらペリプラズム中のβ−ｇａｌ）の定
量結果を第１表に示した。なお、表中の％は、培養液中
、ペリプラズム中（Ａメモティック処理上清中）および
細胞質中の総和に対する各割合を示し、■、■、■は各
々培養液中、ペリプラズム中、細胞質中を示したもので
ある。また、ここでβ−ｇａｌの足回を行っているのは
、菌が溶菌しているかどうかを調べるためである。β−
ｇａｌは細胞内に？′ｊ在する酵素であるので、本発明
の場合に培養液中に存在するｈＥＧＦが菌の溶菌による
ものであれば、本物質も培養液中に存在することになる
からである。

第１表の結果より、以下のことがいえる。ずなわら、ま
ず第一にβ−ｇａｌの定量結果より、β−ｇａｌは少な
くとも９０％程度が細胞質中に存在することが示唆され
、このことより培養液中に存在するｈ　−ＥＧＦは菌の
溶菌によって・生ずるものではなくて、本発明中の（Ｃ
）の培養工程において培養液中まで分泌されているとい
うことが示唆される。第二に、培養後３１時間程度で培
ｆ液中に分泌されるｈ　−ＥＧＦｆｍが最大となってい
るので、本培養条件での培養時間は３１時間桿度がまた
、この培養工程中、ｐＨを７．２に、流加培地の添加速
度を７５＃１ｉ！／時間にしたこと以外は全く同一条件
でＰｉ養を行った。そのときの培養液中の無機燐、グル
コースおよびＥＧＦの定ｍ結果を第２表に示す。

第　　２　　表 この結果より、本培養条件下でも培養時間は約３１時間
程度がよいことになる。

工１　Ｄ　〜　Ｆ　／　　　の回　・１上記培養終了後
、培養成約１７．５リツトルを連続遠心分離様で、１３
，０００！？／９０分の遠心に付し、その上清を「ゼー
タプラスカートリッジ８Ｃ６０ＳＪ　　（ＡＭＦ社製）
、［ミリディスクＣＭＣＧＬ４０ＳＯＩＪ　　（日本ミ
リボア社製）による連続ｉ濾過後、培養ン戸液を［モジ
コール５ＥＰ１０３１Ｊ　　（旭化成社製）による限外
か過て３リツトルまで濃縮した。濃縮液に水冷下に固体
の硫酸アンモニウムを添加（最終濃度６０％）し、１２
０分放置後、遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）して
、沈殿を回収した。得られる沈殿を約２００　ｍｌの水
に溶解後、水冷下、エタノールを徐々に添加して、最終
ａ瓜９０％に到らせ、１２０分聞放置したのち、生じた
沈殿を遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）によって回
収した。

ついで沈殿を約２００ｍの水にＦ４濁させ、よく撹拌後
、遠心分離（１０，０００ｙ、２０分）して、上清と沈
殿とに分離した。沈殿はさらに１ｏ。

ｄの水に再懸濁させ、撹拌後、遠心分離（１０，０００
び、２０分）して、上清を１９だ。

それぞれの遠心分離操作によりえられる上清液（およそ
３００ｄ）をプールし、スペク１〜う／ポア６透析膜を
使用して一晩冷水に対して透析・脱塩をおこなった。脱
塩後のｈＥＧＦ溶液は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐ
Ｉ−１６で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　
　　６５０Ｃ（内径４．４ｃｍＸ長さ３０　ｃｍ　）カ
ラムに、流速２００ｍ１／ｈで通塔した。上記透析液の
通塔後、同じ初期！ＩＶｆＪ液２５００−で、非吸着画
分を洗い出した。

その後、１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６，０，２
，０ＯＯｄ、２００ｍＭ酢酸アンモニウム、　ｐＨ６，
０、ｉ、ｏｏｏ戒を順次通塔することにより、ｈＥＧＦ
ＩおよびｈＥＧＦＩＩを溶出させた。その時のクロマト
グラムを第２図に示す。同図中、〇−〇は２８０ｎｍに
おける吸光度を示し、Ｏ−ＯはｈＥＧＦ活性を示ず〔な
お、ここでのｈＥＧＦ活性はＲＲＡ法による結合阻害率
（％）により表示したものである〕。そして、ここで、
吸光度と活性のピークが重なっている２つの両分を回収
した〔前のピークをｈＥＧＦ−Ｉ、後のピークをｈＥＧ
Ｆ−ＩＩとする〕。ついで各両分を凍結乾燥後、９％ア
セトニトリルおよび３．３％酢酸を含有する溶液的１ｏ
ｏｙに溶解し、遠心分離（１０，０ＯＣＩ、１０分）し
、得られる上清をつづく逆相液体クロマトグラフィーの
試料とした。

ここで、高速逆相液体クロマトグラフィーの諸条件は以
下の通りであった。

８速波体クロマ１−グラフィー装置：モデルＨＬ　Ｃ８
３７システム（東洋四速） カラム：’ｒｓＫ−ＧＥＬ　　０ＤＳ−１２０Ｔ（東洋
四速）内径５．５ｃｍＸ長さ３０ｃｍカラム温度：室渇 流速：２０ｍ／分 溶離液および溶離条件 Ａ法（１０％アセトニトリル、３．３％酢酸）Ｂ液（８
０％アセトニトリル、３．３％酢酸）溶離は、下表のよ
うなＡ法とＢ液の濃度によるグラジェントでおこなった
。

時間（分）　　Ａ法（％）　　Ｂ液（％）６０　　　　
　　８０　　　　　　２０・検出波長：吸光度２８０ｎ
ｍ 逆相液体クロマトグラノィーの溶出パターンを第３図に
示した。同図中　実線（−）が吸光度を示し、０−ｅが
活性を示している。活性は前記ＲＲＡ法により測定した
ｂのである。なお、同図中、保持時間５７分付近にでて
くるメイン・ピークがｈＥＧＦ−Ｉである。また、ｈＥ
ＧＦ−ＩＩについＵ−（）上記と同様にして精製をおこ
なうことができた。

なお、いずれの精製画分についても高速液体クロマトグ
ラフィーによって純度を検討したところ、いずれの両分
も９９％以上であった。また、ここで精製された蛋白質
の物理化学的性質（アミノ酸組成、−泡構造、二次ＷＩ
造）を調べたところ、ｈＥＧＦ−Ｉは完全なＥＧＦであ
り、ｈＥＧＦ−１（は、カルボキシ末端から２個のアミ
ノ酸（Ｌｅｕ、Ａｒｇ　）が欠損しているものであるこ
とがわかった。

゛署！　　生　の菌学的性質および８託ｉ号本発明にお
いて開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下
記の通りである。

受託年月日 （１）　昭和５６年　６月　９日 （２）　昭和５８年　４月３０口 （３）　昭和５６年　６月　９日 （４）　昭和５９年１１月１４日 ；１；通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受
託番号 菌学的性質 （１）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００この菌は、
ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の人ｆ
ｌｕ菌属の一般属性を有する他、「因子を含まず、ナブ
レッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組換えに関与す
るヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢｃｍ伝子に欠陥転
子するものである。栄養要求性どしては、トレオニンと
ロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする。また
、分類学上、腸内細菌科、大１ｇＪｉｉｌＪ属に属する
ものである。なお、本閑に関する文献は以下の通りであ
る。

（イ）　ジエネティックス（ＱｅｎｃｔｉｃＳ）、１旦
、４４０ （ロ）　　ネーチ−ｐ−，（Ｎａｔｕｒｅ）、２１７゜
＜２）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫこ
の菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性
等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず、
ザプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組換えに関
与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢｃＷ伝子に欠
陥転子するものである。栄養要求性どしては、トレオニ
ンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする。

ｐｈｏＡｍ伝子のプ転子−ター−オペレーター領Ｗｔ　
ｐＡ　ＣＹ　Ｃ１７７由来（７）　ｍ　’ＩＪ　ｌｎｌ
　ＩＮ　’ＴＪ　Ｈ４３に　Ｕｌ）ＢＲ３２２のｂｌａ
ｉ伝子か転子成されたプラスミドｐＹＫ２８３を含み、
アンピシリンに対して耐性を示ず。また１、分類学上、
腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。

’３　Ｊ３、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除け
ば、この菌株の菌学的性質はその親株Ｅ、ｃｏｌｉ　　
Ｋ１２Ｃ６００のそれと同じである。

（３）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＢＲこ
の菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性
等の大腸菌属の一般属性を右する他、Ｆ因子を含まず、
ザブレッサー道転子ＥのＩ能を欠き、遺伝子組換えに関
与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢｃＷ伝子に欠
陥転子するものである。栄養要求性としては、トレオニ
ンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする。

また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を含む。なお、
プラスミドｐＢＲ３２２に関してはＱｅｎｅ、２９５（
１９７７）、大腸菌Ｋｌ　２Ｃ６００に関しては上記Ｎ
ａｔｕｒｅを参照することができる。

ｐＢＲ３２２由来の形質を除けば、Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ　
２Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）の菌学的性質は親株のそれ
と同じである。

（４）　　　　Ｅ　、　ｃｏｌｉ　　　　Ｋ１２ＹＫ５
３７大腸菌Ｋｌ　２ＹＫ５３７は、公知株であるところ
の大腸菌ｌく１２株〔（マイクロバイオロジカル・レビ
ューズ（Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ　）、土Ａ、１〜５６（１９８０））の誘導体大腸
菌に１２ＲＲ１１ジーン（Ｇｅｎｅ）　、Ｚ、９５（１
９７７）、ビオキミカ・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ八ｃｔａ、　へ　、５
５５、２４３（１９８１））をさらに改変したものであ
って、下記の性質を示し、他の性質についてはに１２Ｒ
Ｒ１のそれと異なるところのない菌株である。

（ｒｅＣＡｌ、ｐｈｏＡ８、ｐｒｏ　　）

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＴＡ１５２２調製のフローチャ
ートである。 第２図は、イオン交換クロマトグラフィーを行ったとき
のクロマトグラムを模写したものである。 第３図は、画分ｈＥＧＦ−１について逆相クロマトグラ
フィーを行ったときのクロマトグラムを模写したもので
ある。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）〜（Ｆ）よりなることを特徴とす
   る精製蛋白質の製造法。 （Ａ）プロモーターをコードする遺伝子ならびに該遺伝
   子の制御下にシグナル配列をコードする遺伝子を具備し
   かつ予定した宿主微生物細胞内で増殖可能なベクターを
   用意すること。 （Ｂ）上記ベクターに外来性蛋白質をコードする遺伝子
   を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換えＤ
   ＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主の
   形質転換を行って形質転換体を得ること。 （Ｃ）上記形質転換体を該微生物の増殖過程における対
   数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
   導がおこるに必要な量の上記プロモーターに対するプロ
   モーター活性調節物質を含有する培地での培養に付した
   のち、該培養系外よりプロモーター活性調節物質を含有
   する培地の連続的ないし間歇的な添加を伴う培養に付す
   こと。 （Ｄ）上記培養終了後、この培養液を濃縮すること。 （Ｅ）上記濃縮液をイオン交換クロマトグラフィーに付
   したのち、所望の外来性蛋白質画分を回収すること。 （Ｆ）上記で回収された所望外来性蛋白質を含む画分を
   さらに高速液体クロマトグラフィーに付したのち、所望
   外来性蛋白質画分を回収すること。 ２、工程Ａのベクターがそのシグナル配列をコードする
   遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードす
   る遺伝子を結合させ得るように仕組まれたものである、
   特許請求の範囲第１項記載の精製蛋白質の製造法。 ３、工程Ａにおけるプロモーターをコードする遺伝子が
   アルカリ性ホスファターゼ由来のものである、特許請求
   の範囲第１項あるいは第２項のいずれか１項に記載の精
   製蛋白質の製造法。 ４、工程（Ｄ）の培養液の濃縮を、限外ろ過、塩析およ
   びエタノール沈殿の工程により行う、特許請求の範囲第
   １〜第３項のいずれか１項に記載の精製蛋白質の製造法
   。 ５、所望外来蛋白質がヒト上皮細胞成長囚子である、特
   許請求の範囲第１〜第４項のいずれか１項に記載の精製
   蛋白質の製造法。