CN116731115A - 一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法 - Google Patents

一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116731115A
CN116731115A CN202310431859.7A CN202310431859A CN116731115A CN 116731115 A CN116731115 A CN 116731115A CN 202310431859 A CN202310431859 A CN 202310431859A CN 116731115 A CN116731115 A CN 116731115A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antigen
darwin
influenza
dna molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310431859.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张静静
邢体坤
宋路萍
刘伟
安文琪
王斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Original Assignee
Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd filed Critical Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Priority to CN202310431859.7A priority Critical patent/CN116731115A/zh
Publication of CN116731115A publication Critical patent/CN116731115A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法。本发明提供了SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达产量或在宿主细胞中的分泌表达效率或制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白制品。本发明结果显示人工信号肽SP1分泌表达水平显著优于天然信号肽Ha，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

Description

一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法。
背景技术
流感病毒感染人类可以导致患者出现流行性感冒，流行性感冒是一种常见的呼吸道传染性疾病，这种疾病可以导致患者出现高热，头痛，肌肉酸痛，乏力等全身的表现，也可以导致患者出现咳嗽，鼻塞，流鼻涕，咽痛等呼吸道的症状。流感病毒通常情况下可以分为三种类型，包括甲型，乙型以及丙型，其中感染人类最常见的还是甲型流感病毒。
流感病毒一直是人类最强劲的对手之一，作为一种RNA病毒，流感病毒虽然结构简单，但其变异性和传播性强。因此，世界卫生组织(WHO)每年上、下半年会分别公布下一季的北半球和南半球流感疫苗组分。WHO发布的2022-2023鸡胚培养流感病毒疫苗组分A/Darwin/9/2021(H3N2)毒株，研究其真核细胞分泌表达将助力疫苗相关研发或检测工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原(简称HA抗原)制备方法。
本发明发现人工信号肽(信号肽SP1，SEQ ID No.1)可引导流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌至培养上清，经过镍柱亲和层析即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于HA蛋白天然信号肽(信号肽Ha)和白蛋白信号肽(信号肽Al)。
第一方面，本发明要求保护SEQ ID No.1所示多肽(即为实施例中的SP1信号肽)或其相关生物材料在如下任一中的应用：
P1、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达产量；
P2、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达效率；
P3、制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白制品；
所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.7所示DNA片段(SEQID No.7的第13-69位为信号肽SP1的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如Hind III和Pac I)后得到的重组质粒。
进一步地，所述宿主细胞可为真核宿主细胞。如：HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
进一步地，所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因可为如下任一：
(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。
上述编码基因中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述核酸分子或编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
在P2中，所述流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达效率是指：在宿主细胞的培养上清中，所述流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的表达量与总蛋白的表达量的比值。
第二方面，本发明要求保护一种融合蛋白。
本发明要求保护的融合蛋白自N端到C端顺次包含SEQ ID No.1所示多肽和流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原。
在上述第一方面和第二方面中，流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的氨基酸序列具体可如SEQ ID No.3所示。
在第二方面中，进一步地，所述融合蛋白具体可为将SEQ ID No.1所示多肽融合于流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的N端所得。
在本发明的具体实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第1-532位(SP1信号肽+HA抗原)或第1-537位所示(SP1信号肽+HA抗原+linker)或如SEQ IDNo.5(SP1信号肽+HA抗原+linker+His标签)所示。
SEQ ID No.5的第1-19位为信号肽SP1(即SEQ ID No.1)，第20-532位为所述流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原，第533-537位为Linker接头，第538-545位为组氨酸标签。
第三方面，本发明要求保护编码前文第二方面所述融合蛋白的核酸分子。
本发明所要求保护的核酸分子自5’端到3’端顺次包含SEQ ID No.1所示多肽的编码基因和流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的编码基因。
更进一步地，所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因可为如下任一：
(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。
更进一步地，所述流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的编码基因可为如下任一：
(b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且相同蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方式中，所述核酸分子可为SEQ ID No.7的第7-1608位(Kozak序列+SP1编码基因+HA抗原编码基因)或第7-1623位所示DNA分子(Kozak序列+SP1编码基因+HA抗原编码基因+Linker编码序列)或第7-1650位所示DNA分子(Kozak序列+SP1编码基因+HA抗原编码基因+Linker编码序列+His标签编码序列)或SEQ IDNo.7所示DNA分子。
SEQ ID No.7的第1-6位为HindIII酶切位点，7-12位置为Kozak序列，13-69位为人工信号肽SP1编码基因，第70-1608位为HA抗原编码基因，1609-1623为Linker接头，1624-1647为组氨酸标签，1648-1650为终止密码子，1651-1658为PacI酶切位点。
第四方面，本发明要求保护含有前文第三方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第二方面中所述融合蛋白的DNA，该DNA不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.7所示DNA片段(SEQID No.7的第13-69位为信号肽SP1的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如Hind III和Pac I)后得到的重组质粒。相应地，所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到Expi293F细胞后所得。
第五方面，本发明要求保护前文第二方面所述融合蛋白或前文第三方面所述的核酸分子或前文第四方面所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：
P1、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达产量；
P2、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达效率；
P3、制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白制品。
其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。
进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
第六方面，本发明要求保护一种制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白的方法。
本发明要求保护的制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白的方法，可包括如下步骤：
(A1)将前文第三方面所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；
(A2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白。
其中，所述核酸分子可通过前文所述重组载体导入所述宿主细胞。
步骤(A1)中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。如：HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
步骤(A2)中，所述培养为培养至细胞活率降至65％-75％时终止培养。
步骤(A2)中，是按照包括如下步骤的方法从所述培养上清中获得流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白的：收集培养物于3500g离心30min，收集上清进行超滤浓缩和镍柱纯化。
本发明采用HA抗原的天然信号肽Ha，人工设计信号肽SP1和白蛋白信号肽Al三种信号肽引导流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原真核细胞分泌表达。研究证明：人工合成信号肽SP1实验组的流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌表达量显著优于天然信号肽Ha和白蛋白信号肽Al实验组，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。本发明适用于疫苗开发中的抗原制备等应用。
本发明采用真核细胞分泌表达方式制备A/Darwin/9/2021(H3N2)的HA抗原，具有以下优势：1)分泌上清蛋白背景低，易于纯化；2)可溶性表达，避免形成包涵体；3)信号肽酶精准切割，N端无冗余Met残基，产生符合预期的蛋白序列。
本发明适用于流感疫苗开发中的抗原制备等应用。对流感疫苗开发具有重要意义。
附图说明
图1为重组表达质粒构建酶切鉴定图。其中，1为pCGS3-Ha-HA(Ha为天然信号肽)，2为pCGS3-SP1-HA(SP1为人工信号肽)，3为pCGS3-Al-HA(Al为白蛋白信号肽)。
图2为流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原细胞分泌上清SDS-PAGE鉴定图。
其中，1为天然信号肽Ha分泌上清(转染pCGS3-Ha-HA的细胞上清液)，2为人工信号肽SP1分泌上清(转染pCGS3-SP1-HA的细胞上清液)，3为白蛋白信号肽Al分泌上清(转染pCGS3-Al-HA的细胞上清液)，4为无转染表达质粒的阴性组。
图3为流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原细胞分泌上清灰度分析图。其中，箭头指示为目的条带；A为天然信号肽Ha分泌上清(转染pCGS3-Ha-HA的细胞上清液)，B为人工信号肽SP1分泌上清(转染pCGS3-SP1-HA的细胞上清液)，C为白蛋白信号肽Al分泌上清(转染pCGS3-Al-HA的细胞上清液)，D为无转染表达质粒的阴性组。横坐标为电泳泳道的不同位置，纵坐标为灰度值。
图4为流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原蛋白纯化SDS-PAGE纯化鉴定。其中，1为天然信号肽Ha分泌表达纯化样品(转染pCGS3-Ha-HA的细胞上清液)，2为人工信号肽SP1分泌表达纯化样品(转染pCGS3-SP1-HA的细胞上清液)，3为白蛋白信号肽Al分泌表达纯化样品(转染pCGS3-Al-HA的细胞上清液)。
图5为流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原纯化样品灰度分析图。其中，1为天然信号肽Ha纯化样品(转染pCGS3-Ha-HA的细胞上清液)，2为人工信号肽SP1纯化样品(转染pCGS3-SP1-HA的细胞上清液)，3为白蛋白信号肽Al纯化样品(转染pCGS3-Al-HA的细胞上清液)。横坐标为电泳泳道的不同位置，纵坐标为灰度值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：
pCGS3表达载体：Merck公司；
HindIII内切酶：NEB公司；
PacI内切酶：NEB公司；
GXL Premix：TAKARA公司；
DNA Ligation Kit Ver.2.1：TAKARA公司；
Expi293FTM Cells(文中简称Expi293F)：Thermo Fisher公司；
Expi293TMExpression Medium：Thermo Fisher公司；
ExpiFectamineTM293Transfection Kit：Thermo Fisher公司；
Opti-MEMTMI Reduced Serum Medium：Thermo Fisher公司；
Ni-NTA蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
Amicon Ultra-15离心过滤装置：Millipore公司；
Amicon Ultra-0.5离心过滤装置：Millipore公司；
PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；
凝胶成像系统：Protein Simple公司；
细胞计数仪：Roche公司；
超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；
电热恒温水浴锅：Fisher Scientific公司；
NanoDrop分光光度计：Fisher Scientific公司；
CO2恒温摇床：CRYSTAL公司；
HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；
DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；
DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；
微量移液器：Eppendorf公司。
实施例1、重组表达质粒构建
流感毒株选自WHO发布的北半球2022-2023鸡胚培养流感病毒疫苗组分A/Darwin/9/2021(H3N2)毒株(GSIAID登录号为EPI_ISL_2233240)，其中，HA抗原的选自第17到529位胞外区。
HA抗原天然信号肽Ha，人工信号肽SP1和白蛋白信号肽Al的编码基因融合到流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原蛋白的编码基因5’端，对应片段名称分别为Ha-HA，SP1-HA和Al-HA，克隆至pCGS3载体，构建真核重组表达质粒，具体操作流程如下文所述。
Ha-HA基因合成：天然信号肽Ha的碳端融合流感病毒抗原HA的氮端，委托生工生物进行密码子优化，合成序列Ha-HA核酸序列(SEQ ID No.6)，生工生物交付合成质粒为pUC57-Ha-HA。
采用pUC57-Ha-HA为模板，使用聚合酶GXL Premix(TAKARA公司)扩增SP1-HA和Al-HA目的片段。
SP1-HA基因片段扩增：用pUC57-Ha-HA为模板,引物1和引物5扩增片段A，片段A作为第二轮模板，使用引物2和引物5进行第二轮扩增获得片段B，即为SP1-HA目标片段；
Al-HA基因片段扩增：用pUC57-Ha-HA为模板,引物3和引物5扩增片段C，片段C作为第二轮模板，使用引物4和引物5进行第二轮扩增获得片段D，即为Al-HA目标片段。
上述PCR扩增使用引物序列如下：
引物1：5’-TGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTGCTAGATCTCAGAAGATCCCCGGCAACG-3’；
引物2：5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGCCTTGCCTGTTTGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATT-3’；
引物3：5’-TATTTCCCTGCTGTTTAGCTCCGCCTATAGTCAGAAGATCCCCGGCAACG-3’；
引物4：5’-CCCAAGCTTGCCACCATGAAGTGGGTGACATTTATTTCCCTGCTGTTTAGCTC-3’；
引物5：5’-CCTTAATTAATTAGTGGTGGTGGTGGTGATGGTG-3’。
pCGS3载体经HindIII和PacI双酶切获得载体片段，全合成基因pUC57-Ha-HA以及扩增片段SP1-HA和Al-HA分别经HindIII和PacI双酶切，获得目标片段。采用DNA LigationKit Ver.2.1(TAKARA公司)将载体片段与各个目标片段进行连接，转化，提取质粒，鉴定是否获得重组表达质粒pCGS3-Ha-HA、pCGS3-SP1-HA和pCGS3-Al-HA。
所得三种重组表达质粒的酶切鉴定结果如图1所示。由图可见，第1泳道为pCGS3-Ha-HA表达质粒双酶切鉴定，第2泳道为pCGS3-SP1-HA表达质粒双酶切鉴定，第3泳道为pCGS3-Al-HA表达质粒双酶切鉴定。酶切后载体片段大小约7100bp，目标基因大小均约1650bp；酶切条带大小符合预期。
重组表达质粒pCGS3-Ha-HA的结构描述：在pCGS3载体的酶切位点HindIII和PacI之间插入SEQ ID No.6所示DNA片段后得到的重组载体。SEQ ID No.6的第1-6位为HindIII酶切位点，7-12位为Kozak序列，13-60位为天然信号肽Ha编码基因，61-1599位为HA抗原编码基因，1600-1614位为Linker接头，1615-1638位为组氨酸标签，1639-1641位为终止密码子，1642-1649位为PacI酶切位点。
重组表达质粒pCGS3-SP1-HA的结构描述：在pCGS3载体的酶切位点HindIII和PacI之间插入SEQ ID No.7所示DNA片段后得到的重组载体。SEQ ID No.7的第1-6位为HindIII酶切位点，7-12位为Kozak序列，13-69位为人工信号肽SP1编码基因，第70-1608位为HA抗原编码基因，1609-1623位为Linker接头，1624-1647位为组氨酸标签，1648-1650位为终止密码子，1651-1658位为PacI酶切位点。
重组表达质粒pCGS3-Al-HA的结构描述：在pCGS3载体的酶切位点HindIII和PacI之间插入SEQ ID No.8所示DNA片段后得到的重组载体。SEQ ID No.8的第1-6位为HindIII酶切位点，7-12位为Kozak序列，13-60位为白蛋白信号肽Al编码基因，第61-1599位为HA抗原编码基因，1600-1614位为Linker接头，1615-1638位为组氨酸标签，1639-1641位为终止密码子，1642-1649位为PacI酶切位点。
SEQ ID No.7编码SEQ ID No.5所示蛋白质。SEQ ID No.5的第1-19位为人工信号肽SP1，第20-532位为HA，第523-537位为Linker接头，第538-545位为组氨酸标签。
实施例2、蛋白电泳图灰度分析
电泳图灰度分析采用Image J软件。操作步骤为Image→Type→32-Bit转化为灰度图；Process→Subtract Background→OK去除背景色；矩形工具选择泳道→Analyze→Gel→Select First Lane确定分析泳道，重复选择多条泳道同时分析；Analyze→Gel→PlotLane生成峰面积；线性工具选择目标条带对应峰图，Wand工具计算对应峰图面积，即可求得目的蛋白表达量占总蛋白百分比。
实施例3、蛋白瞬转表达
一、宿主细胞
从液氮罐中取宿主细胞Expi293F的种子库细胞，于37℃水浴迅速解冻，将解冻后的细胞悬液无菌转移至装有30ml预热的完全生长培养基的125ml药瓶中，摇床培养条件：37℃，8％ CO2，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％。15-30min后取细胞悬液检测细胞密度与活率。
待细胞活率恢复90％以上，细胞密度达3-5×106cells/ml，按0.3-0.5×106cells/ml进行接种扩增。
二、细胞转染
将实施例1构建的pCGS3-Ha-HA，pCGS3-SP1-HA和pCGS3-Al-HA分别转染宿主细胞，分别记作信号肽Ha实验组，人工信号肽SP1实验组和信号肽Al实验组。
1、转染前一天
转染前24h将细胞以2.5-3×106cells/ml重新接种，培养24h。
2、转染当天
(1)细胞密度应达到4.5-5.5×106cells/ml，活率应≥95％。用新鲜预热的完全生长培养基将细胞稀释至3×106cells/ml。
(2)准备转染试剂和DNA复合物
1)DNA稀释
用无菌水将质粒(实施例1构建的pCGS3-Ha-HA，pCGS3-SP1-HA和pCGS3-Al-HA)稀释至1μg/μl，按照1ml细胞转染1μg质粒的量，取转染50ml细胞所需质粒的量，即50μl质粒加入3ml Opti-MEMTM I Reduced Serum medium备用。
2)转染试剂稀释
使用前将转染试剂ExpiFectamine293TM Reagent轻轻上下颠倒混匀，取转染50ml细胞所需转染试剂的量，即160μl ExpiFectamine293TM Reagent于2.8ml Opti-MEMTM IReduced Serum medium中轻轻上下颠倒混匀，室温静置5min。
3)将稀释好的转染试剂加入质粒中轻轻上下颠倒混匀，室温反应10～20min。将混合好的转染试剂和DNA复合物缓慢加入细胞培养物中。37℃，8％ CO2，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％条件培养。
3、转染后第一天
在转染后18-22h，按照转染50ml细胞的量添加增强剂。即，取300μlExpiFectamineTM 293Transfection Enhancer 1与3mlExpiFectamineTM293Transfection Enhancer 2混匀后缓慢加入细胞培养物中。
4、培养上清收集
转染后每天监测细胞活率，第4天当活率降至65％-75％时终止培养，收集培养物于3500g离心30min收集上清(各组之间按照完全相同的方法收集上清)，
SDS-PAGE鉴定(各组之间的上样体积一致)及按照实施例2方法灰度分析证明：信号肽Ha、信号肽SP1和信号肽Al实验组目的蛋白表达量占总蛋白的18.82％，22.16％和7.51％(图2和图3)。
综上可知：与天然信号肽Ha和白蛋白信号肽Al相比，本发明的人工信号肽SP1具有更高的流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的分泌表达效率(分泌表达效率指：分泌蛋白中，目标蛋白与总蛋白表达量的比值)。
实施例4、蛋白纯化
1、超滤浓缩
收样上清(即实施例3步骤4中“收集培养物于3500g离心30min”后所得上清)进行4℃，Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore公司)6000g离心20min超滤浓缩，最终细胞上清浓缩至20-30ml。
2、镍柱纯化
步骤1获得的超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer(Ni-NTA蛋白纯化试剂盒(生工))按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育。两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱。将超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱；如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中。两倍柱体积的Binding/wash buffer清洗柱子并收集流穿液，直到流穿液的吸光度280nm接近基线。两倍柱体积的Elution Buffer(Ni-NTA蛋白纯化试剂盒(生工))洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线，收集洗脱液待纯化。
3、超滤置换
镍柱纯化后的洗脱液加Amicon Ultra-0.5离心过滤装置(Millipore公司)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μl。轻轻加入300μl PBS(pH7.4)，10000g离心至剩余150μl，重复三次。PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约1-2ml，留样5μl用于蛋白浓度测定(NanoDrop分光光度计，A280紫外吸收法)和SDS-PAGE蛋白电泳检测。
目的蛋白分泌表达产量＝蛋白浓度×体积/细胞培养体积。
纯化后鉴定及按照实施例2方法灰度分析证明：信号肽Ha，人工信号肽SP1和信号肽Al实验组目的蛋白纯度分别为92.64％，92.79％和91.49％，分泌表达产量分别为65.38mg/L，99.92mg/L和27.40mg/L(图4和图5)。可见人工信号肽SP1实验组目的蛋白的分泌表达产量显著高于天然信号肽Ha和白蛋白信号肽Al。
采用铝盐；或CpG；或脂质体；或油性佐剂即可产生流感疫苗免疫组合物，用于预防流感。
综合以上各实施例的结果，本发明采用天然信号肽Ha，人工设计信号肽SP1(SEQID No.1)和白蛋白信号肽Al引导流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原真核细胞分泌表达。本发明人工信号肽SP1分泌表达产量以及分泌表达效率显著大于天然信号肽Ha和白蛋白信号肽Al，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：
P1、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达产量；
P2、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达效率；
P3、制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白制品；
所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述宿主细胞为真核宿主细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下任一：
(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。
4.融合蛋白，自N端到C端顺次包含SEQ ID No.1所示多肽和流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
6.根据权利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于：
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第1-532位或第1-537位所示或如SEQ IDNo.5所示。
7.编码权利要求4-6任一所述融合蛋白的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子自5’端到3’端依次包含SEQ ID No.1所示多肽的编码基因和流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的编码基因；
进一步地，所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因为如下任一：
(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
和/或，
进一步地，所述流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原的编码基因为如下任一：
(b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且相同蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子；
和/或，
更进一步地，所述核酸分子为SEQ ID No.7的第7-1608位所示DNA分子或第7-1623位所示DNA分子或第7-1650位所示DNA分子或SEQ ID No.7所示DNA分子。
9.含有权利要求7或8所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
或，权利要求4-6任一所述融合蛋白或权利要求7或8所述的核酸分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：
P1、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达产量；
P2、提高流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原在宿主细胞中的分泌表达效率；
P3、制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白制品。
10.一种制备流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白的方法，包括如下步骤：
(A1)将权利要求7或8所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；
(A2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得流感毒株A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原分泌蛋白。
CN202310431859.7A 2023-04-21 2023-04-21 一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法 Pending CN116731115A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310431859.7A CN116731115A (zh) 2023-04-21 2023-04-21 一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310431859.7A CN116731115A (zh) 2023-04-21 2023-04-21 一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116731115A true CN116731115A (zh) 2023-09-12

Family

ID=87912246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310431859.7A Pending CN116731115A (zh) 2023-04-21 2023-04-21 一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116731115A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112209995B (zh) 一种SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区制备方法
CN116102663A (zh) 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用
EP0118393B1 (en) Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products
CN116574172B (zh) 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法
CN114014940B (zh) 一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法
US5037744A (en) Process for the microbiological preparation of human serum albumin
CN116716329A (zh) 一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法
CN116731115A (zh) 一种A/Darwin/9/2021(H3N2)HA抗原制备方法
CN116239671A (zh) 一种B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata lineage)HA抗原制备方法
CN116375806A (zh) 一种B/Austria/1359417/2021(B/Victoria lineage)HA抗原制备方法
CN116478244A (zh) 一种A/Victoria/2570/2019(H1N1)pdm09 HA抗原制备方法
CN116496384A (zh) 一种A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)HA抗原制备方法
JPH0746988A (ja) 組換体ｄｎａ構造とこれを含むプラスミド媒介体とこのような組換体ｄｎａ構造を保持するグラム陰性菌
CN110819609B (zh) 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用
CN116410266A (zh) 一种B/Washington/02/2019(B/Victoria lineage)HA抗原制备方法
WO1987005935A1 (en) Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products
CN116240182A (zh) 荧光素酶信号肽的应用及含有荧光素酶信号肽的融合蛋白及其制备方法
CN116178570A (zh) 一种猴痘病毒a35r抗原及其制备方法
CN111575314A (zh) 尿激酶受体稳定突变体suPARcc在真核胞外蛋白表达中的应用
CN116120467A (zh) 含有猴痘病毒e8l抗原的融合蛋白及其制备方法
US5646010A (en) Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products
CN115925805B (zh) 一种人质膜膜泡关联蛋白pv-1融合蛋白及其制备方法
CN114957398A (zh) 一种α株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法
CN114957397A (zh) 一种δ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法
CN116024265A (zh) 制备猴痘病毒m1r抗原分泌蛋白的方法及其所用核酸分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination