CN116178570A - 一种猴痘病毒a35r抗原及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猴痘病毒A35R抗原及其制备方法。本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猴痘病毒A35R抗原及其制备方法。本发明提供的融合蛋白，为将氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽融合于猴痘病毒A35R抗原的N端得到的蛋白质，融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.5、SEQ ID No.5的第1‑141位或SEQ ID No.5的第1‑146位。本发明采用信号肽引导猴痘病毒A35R真核细胞分泌表达，其中荧光素酶信号肽Ga引导猴痘病毒A35R抗原分泌表达水平显著优于白蛋白信号肽Al和抗体轻链信号肽Lc，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

Description

一种猴痘病毒A35R抗原及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猴痘病毒A35R抗原及其制备方法。
背景技术
2022年5月，新一轮的“猴痘”疫情最先在英国发现，已经遍及英国、葡萄牙、西班牙、澳大利亚、德国、法国等多个国家。目前，“猴痘”病毒疫情仍趋于蔓延态势，因此受到多个国家卫生监管部门的关注。
猴痘病毒潜伏期约6-16天，症状为发热、剧烈头痛、淋巴结病、背痛、肌痛、重度疲乏无力。传播方式为动物传人和人际传播，其中，人际间传播因密切接触了感染的呼吸道分泌物、感染者的皮肤损伤或最近被病人体液或病变材料污染的物品而造成，通常需要长时间的面对面接触才会发生呼吸道飞沫传播。
猴痘病毒基本的感染形态为成熟病毒粒子(mature virion，MV)，除此之外，还有一种形态：成熟病毒粒子外还包绕有一层来源于内质网膜的脂质膜(extracellularenveloped，EV)。其中，A35R与牛痘病毒的A33R高度相似，是一种细胞外包膜病毒(EEV)特异性II型膜糖蛋白，在有效的EEV形成中起着关键作用，并有助于病毒颗粒的有效细胞间传播，是开发猴痘病毒治疗性抗体的潜在靶点。因此，制备A35R蛋白为猴痘病毒检测试剂或疫苗的关键产品研发的关键步骤。
发明内容
本发明所要解决的主要问题是如何制备猴痘病毒A35R抗原。
为了解决上述问题，本发明提供了一种荧光素酶信号肽(信号肽Ga，SEQ IDNo.1)，信号肽Ga可引导猴痘病毒A35R抗原分泌至培养上清，经过镍柱亲和层析即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于白蛋白信号肽(信号肽Al)和抗体轻链信号肽(信号肽Lc)。
本发明首先提供了一种融合蛋白。
本发明提供的融合蛋白为将为将氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽融合于猴痘病毒A35R抗原的N端得到的蛋白质。
进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.5、SEQ ID No.5的第1-141位或SEQ ID No.5第1-146位。
SEQ ID No.5的第1-17位为信号肽Ga(即SEQ ID No.1)，第18-141位为所述猴痘病毒A35R抗原，第142-146位为Linker接头，第147-152位为组氨酸标签。
本发明还提供了编码上述融合蛋白的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子自5’端到3’端依次由上述多肽的编码基因和猴痘病毒A35R抗原的编码基因组成。
更进一步地，所述多肽的编码基因可为如下任一：
(a1)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。
更进一步地，所述猴痘病毒A35R抗原的编码基因可为如下任一：
(b1)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码相同蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。
更加具体地，所述核酸分子可为编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.7、SEQ IDNo.7的第1-438位或SEQ ID No.7的第1-453位。
SEQ ID No.7的第1-6位为HindIII识别位点，7-15位为Kozak序列，16-66位为荧光素酶信号肽Ga编码基因，第67-438位为A35R抗原编码基因，第439-453位为连接肽(Linker，接头)基因，第454-471位为组氨酸标签基因，第472-474位为终止密码子，第475-482位为PacI识别位点。重组表达质粒pCGS3-Ga-A35R含有重组蛋白Ga-A35R的编码基因，重组蛋白Ga-A35R的编码基因的编码序列是SEQ ID No.7的第16位-474位，重组蛋白Ga-A35R的编码基因编码氨基酸序列是序列5的蛋白质。
上述核酸分子或编码基因中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述核酸分子或编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明还提供了上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述融合蛋白的DNA，该DNA不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.7所示DNA片段(SEQID No.5的第16-66位为信号肽Ga的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如HindIII和PacI)后得到的重组质粒。相应地，所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到Expi293F细胞后所得。
本发明还提供了氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：
P1、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达产量中的应用；
P2、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达效率中的应用；
P3、制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白制品中的应用；
所述相关生物材料为SEQ ID No.1所述多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.7所示DNA片段(SEQID No.5的第16-66位为信号肽Ga的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如HindIII和Pac I)后得到的重组质粒。
进一步地，所述宿主细胞可为真核宿主细胞，如：HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
进一步地，所述编码基因可为如下任一：
(a1)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。
上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％或98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％或94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％或89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％或84％的同一性。
本发明还提供了上述融合蛋白或所述的核酸分子或所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在如下任一中的应用：
P1、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达产量中的应用；
P2、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达效率中的应用；
P3、制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白制品中的应用。
所述猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.5。
其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。
进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白的方法也属于本发明要求保护的范围。
本发明要求保护的制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白的方法，可包括如下步骤：
(A1)将前文所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；
(A2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白。
其中，所述核酸分子可通过前文所述重组载体导入所述宿主细胞。
步骤(A1)中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。如：HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
步骤(A2)中，所述培养为培养至细胞活率降至65％-75％时终止培养。
步骤(A2)中，是按照包括如下步骤的方法从所述培养上清中获得猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白：收集培养物于3500g离心30min，收集上清进行超滤浓缩和镍柱纯化。
本发明采用白蛋白信号肽Al，荧光素酶信号肽Ga(SEQ ID No.1)和抗体信号肽Lc引导猴痘病毒A35R抗原真核细胞分泌表达。研究证明：荧光素酶信号肽Ga实验组的猴痘病毒A35R抗原分泌表达量显著优于白蛋白信号肽Al和抗体轻链信号肽Lc实验组，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。本发明采用真核细胞分泌表达方式制备A35R蛋白，具有以下优势：1)分泌上清蛋白背景低，易于纯化；2)可溶性表达，避免形成包涵体；3)信号肽酶精准切割，N端无冗余Met残基，产生符合预期的蛋白序列。本发明适用于疫苗开发中的抗原制备等应用。
附图说明
图1为重组表达质粒构建酶切鉴定图。其中，1为pCGS3-Al-A35R(Al为白蛋白信号肽)，2为pCGS3-Ga-A35R(Ga为荧光素酶信号肽)，3为pCGS3-Lc-A35R(Lc为抗体轻链信号肽)。
图2为猴痘病毒A35R抗原细胞分泌上清SDS-PAGE鉴定图。其中，1为白蛋白信号肽Al分泌上清(pCGS3-Al-A35R转染细胞培养上清液)，2为荧光素酶信号肽Ga分泌上清(pCGS3-Ga-A35R转染细胞培养上清液)，3为抗体轻链信号肽Lc分泌上清(pCGS3-Lc-A35R转染细胞培养上清液)，4为无转染表达质粒的阴性组(pCGS3载体转染细胞培养上清液)。
图3为猴痘病毒A35R抗原细胞分泌上清灰度分析图。其中，1为白蛋白信号肽Al分泌上清(pCGS3-Al-A35R转染细胞培养上清液)，2为荧光素酶信号肽Ga分泌上清(pCGS3-Ga-A35R转染细胞培养上清液)，3为抗体轻链信号肽Lc分泌上清(pCGS3-Lc-A35R转染细胞培养上清液)，4为无转染表达质粒的阴性组(pCGS3载体转染细胞培养上清液)。
图4为猴痘病毒A35R抗原蛋白纯化SDS-PAGE纯化鉴定。其中，1为白蛋白信号肽Al分泌表达纯化样品，2为荧光素酶信号肽Ga分泌表达纯化样品，3为抗体轻链信号肽Lc分泌表达纯化样品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：
pCGS3载体：Merck公司；
HindIII内切酶：NEB公司；
PacI内切酶：NEB公司；
Prime
Figure BDA0004038567160000051
GXL Premix：TAKARA公司；
DNA Ligation Kit Ver.2.1：TAKARA公司；
Expi293FTM Cells：Thermo Fisher公司；
Expi293TMExpression Medium：Thermo Fisher公司；
ExpiFectamineTM293 Transfection Kit：Thermo Fisher公司；
Opti-MEMTMI Reduced Serum Medium：Thermo Fisher公司；
Ni-NTA蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
Amicon Ultra-15离心过滤装置：Millipore公司；
Amicon Ultra-0.5离心过滤装置：Millipore公司；
PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；
凝胶成像系统：Protein Simple公司；
细胞计数仪：Roche公司；
超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；
电热恒温水浴锅：Fisher Scientific公司；
CO2恒温摇床：CRYSTAL公司；
HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；
DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；
DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；
微量移液器：Eppendorf公司。
实施例1、重组表达质粒构建
猴痘病毒选自2022年最新猴痘病毒(NCBI基因组登录号为ON563414.3)，其中，A35R抗原的NCBI登录号为URK20584.1。本发明选择A35R抗原序列胞外区，即第58-181位氨基酸序列。白蛋白信号肽Al，荧光素酶信号肽Ga和抗体轻链信号肽Lc的编码基因融合到猴痘病毒A35R抗原蛋白的编码基因5’端，对应片段名称分别为Al-A35R，Ga-A35R和Lc-A35R，克隆至pCGS3载体，构建真核重组表达质粒，具体操作流程如下文所述。
Al-A35R基因合成：白蛋白信号肽Al的碳端融合猴痘抗原A35R(猴痘抗原A35R氨基酸序列为SEQ ID No.3，编码基因的编码序列序列为SEQ ID No.4)，委托生工生物进行密码子优化，合成Al-A35R基因(核苷酸序列是SEQ ID No.6)，生工生物交付合成质粒为pUC57-Al-A35R(含有Al-A35R基因)。
采用pUC57-Al-A35R为模板，使用聚合酶Prime
Figure BDA0004038567160000061
GXL Premix(TAKARA公司)扩增Ga-A35R和Lc-A35R目的片段。具体如下：
1)Ga-A35R基因片段扩增：引物1和引物5扩增片段A，片段A作为第二轮模板，使用引物2和引物5进行第二轮扩增获得片段B，即为Ga-A35R目标片段；
2)Lc-A35R基因片段扩增：引物3和引物5扩增片段C，片段C作为第二轮模板，使用引物4和引物5进行第二轮扩增获得片段D，即为Lc-A35R目标片段。
上述PCR扩增使用引物序列如下：
引物1：5’-TGTTTGCTCTGATTTGTATTGCCGTGGCTGAGGCCAGACTGAACCAGTGTATGTC-3’；
引物2：5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGGGGTGAAGGTGTTGTTTGCTCTGATTTGTATTG-3’；
引物3：5’-CTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGACGCCAGATGCAGACTGAACCAGTGTATGTC-3’；
引物4：5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGAGCGTGCCAACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTG-3’；
引物5：5’-CCTTAATTAATCAGTGGTGGTGGTGATGGTGAGAG-3’。
pCGS3载体经HindIII(NEB公司)和PacI(NEB公司)双酶切获得载体片段，全合成基因pUC57-Al-A35R，扩增片段Ga-A35R和Lc-A35R经HindIII和PacI双酶切，获得目标片段。采用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA公司)进行连接，转化，提取质粒，鉴定。获得三种重组表达质粒pCGS3-Al-A35R、pCGS3-Ga-A35R和pCGS3-Ga-A35R。
上述三种重组表达质粒的酶切鉴定结果如图1所示，第1泳道为pCGS3-Al-A35R表达质粒双酶切鉴定，第2泳道为pCGS3-Ga-A35R表达质粒双酶切鉴定，第3泳道为pCGS3-Lc-A35R表达质粒双酶切鉴定。酶切后载体片段大小约7100bp，目标基因大小约480bp；酶切条带大小符合预期。
重组表达质粒pCGS3-Al-A35R的结构描述：用核苷酸序列是SEQ ID No.6的DNA分子替换pCGS3载体的限制性核酸内切酶HindIII识别位点和限制性核酸内切酶PacI识别位点之间的片段，保持pCGS3载体的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。SEQ ID No.6的第1-6位为HindIII识别位点，7-15位为Kozak序列，16-63位为白蛋白信号肽Al编码基因，第64-435位为A35R抗原编码基因，第436-450位为连接肽(Linker，接头)基因，第451-468位为组氨酸标签基因，第469-471位为终止密码子，第472-479位为PacI识别位点。重组表达质粒pCGS3-Al-A35R含有重组蛋白Al-A35R的编码基因，重组蛋白Al-A35R的编码基因的编码序列是SEQ ID No.6的第16位-471位，编码的重组蛋白Al-A35R是由Al信号肽和序列5的第18-152位融合得到的蛋白质，由151个氨基酸组成。
重组表达质粒pCGS3-Ga-A35R的结构描述：用核苷酸序列是SEQ ID No.7的DNA分子替换pCGS3载体的限制性核酸内切酶HindIII识别位点和限制性核酸内切酶PacI识别位点之间的片段，保持pCGS3载体的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。SEQ ID No.7的第1-6位为HindIII识别位点，7-15位为Kozak序列，16-66位为荧光素酶信号肽Ga编码基因，第67-438位为A35R抗原编码基因，第439-453位为连接肽(Linker，接头)基因，第454-471位为组氨酸标签基因，第472-474位为终止密码子，第475-482位为PacI识别位点。重组表达质粒pCGS3-Ga-A35R含有重组蛋白Ga-A35R的编码基因，重组蛋白Ga-A35R的编码基因的编码序列是SEQ ID No.7的第16位-474位，重组蛋白Ga-A35R的编码基因编码氨基酸序列是序列5的蛋白质。
重组表达质粒pCGS3-Lc-A35R的结构描述：用核苷酸序列是SEQ ID No.8的DNA分子替换pCGS3载体的限制性核酸内切酶HindIII识别位点和限制性核酸内切酶PacI识别位点之间的片段，保持pCGS3载体的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。SEQ ID No.8的第1-6位为HindIII识别位点，7-15位为Kozak序列，16-75位为信号肽Lc编码基因，第76-447位为A35R抗原编码基因，第448-462位为连接肽(Linker，接头)基因，第463-480位为组氨酸标签基因，第481-483位为终止密码子，第484-491位为PacI识别位点。重组表达质粒pCGS3-Lc-A35R含有重组蛋白Lc-A35R的编码基因，重组蛋白Lc-A35R的编码基因的编码序列是SEQID No.8的第16位-483位，编码的重组蛋白Lc-A35R是由Lc信号肽和序列5的第18-152位融合得到的蛋白质，由155个氨基酸组成。
实施例2、蛋白瞬转表达研究
A、细胞Expi293F转染实验
一、宿主细胞培养
从液氮罐中取宿主细胞Expi293F(Expi293FTM Cells)的种子库细胞，于37℃水浴迅速解冻，将解冻后的细胞悬液无菌转移至装有30mL预热的完全生长培养基的125mL药瓶中，摇床培养条件：37℃，8％CO2，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％。15-30min后取细胞悬液检测细胞密度与活率。
待细胞活率恢复90％以上，细胞密度达3-5×106cells/mL，按0.3-0.5×106cells/mL进行接种扩增。
二、细胞转染
将实施例1构建的重组载体pCGS3-Al-A35R，pCGS3-Ga-A35R，pCGS3-Lc-A35R和pCGS3载体分别单独转染宿主细胞。
1、转染前一天
转染前24h将细胞以2.5-3×106cells/mL重新接种，培养24h。
2、转染当天
(1)细胞密度应达到4.5-5.5×106cells/mL，活率应≥95％。用新鲜预热的完全生长培养基将细胞稀释至3×106cells/mL。
(2)准备转染试剂和DNA复合物
1)DNA稀释
用无菌水将质粒(实施例1构建的pCGS3-Al-A35R，pCGS3-Ga-A35R和pCGS3-Lc-A35R)稀释至1μg/μL，按照1mL细胞转染1μg质粒的量，取转染50mL细胞所需质粒的量，即50μL质粒加入3mL Opti-MEMTM I Reduced Serum medium备用。
2)转染试剂稀释
使用前将转染试剂ExpiFectamine293TM Reagent轻轻上下颠倒混匀，取转染50mL细胞所需转染试剂的量，即160μL ExpiFectamine293TM Reagent于2.8mL Opti-MEMTM IReduced Serum medium中轻轻上下颠倒混匀，室温静置5min。
3)将稀释好的转染试剂加入质粒中轻轻上下颠倒混匀，室温反应10～20min。将混合好的转染试剂和DNA复合物缓慢加入细胞培养物中。37℃，8％CO2，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％条件培养。
3、转染后第一天
在转染后18-22h，按照转染50mL细胞的量添加增强剂。即，取300μLExpiFectamineTM 293Transfection Enhancer 1与3mL ExpiFectamineTM293Transfection Enhancer 2混匀后缓慢加入细胞培养物中，分别得到pCGS3-Al-A35R转染细胞、pCGS3-Ga-A35R转染细胞、pCGS3-Lc-A35R转染细胞和pCGS3载体转染细胞。
4、培养上清收集
转染后每天监测细胞活率，第4天当活率降至65％-75％时终止培养，收集培养物于3500g离心30min收集上清液，分别得到pCGS3-Al-A35R转染细胞培养上清液、pCGS3-Ga-A35R转染细胞培养上清液、pCGS3-Lc-A35R转染细胞培养上清液和pCGS3载体转染细胞培养上清液。
B、SDS蛋白电泳及灰度分析
将上述上清液进行蛋白电泳分析，SDS蛋白电泳图灰度分析采用Image J软件。操作步骤为Image→Type→32-Bit转化为灰度图；Process→Subtract Background→OK去除背景色；矩形工具选择泳道→Analyze→Gel→Select First Lane确定分析泳道，重复选择多条泳道同时分析；Analyze→Gel→Plot Lane生成峰面积；线性工具选择目标条带对应峰图，Wand工具计算对应峰图面积，即可求得目标蛋白占总蛋白百分比。
SDS-PAGE鉴定及灰度分析结果证明：白蛋白信号肽Al分泌上清(pCGS3-Al-A35R转染细胞培养上清液)，荧光素酶信号肽Ga分泌上清(pCGS3-Ga-A35R转染细胞培养上清液)，抗体轻链信号肽Lc分泌上清(pCGS3-Lc-A35R转染细胞培养上清液)中目的蛋白表达量占总蛋白的2.62％，10.63％和2.33％(图2和图3)。综上可知：与信号肽Al和信号肽Lc相比，本发明的由荧光素酶信号肽引导的Ga猴痘病毒A35R抗原的具有更高的分泌表达量。
实施例3、A35R抗原的蛋白纯化
1、超滤浓缩
将实施例2的pCGS3-Al-A35R转染细胞培养上清液、pCGS3-Ga-A35R转染细胞培养上清液和pCGS3-Lc-A35R转染细胞培养上清液分别进行4℃，Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore公司)6000g离心20min超滤浓缩，最终细胞上清浓缩至20-30mL。
2、镍柱纯化
步骤1获得的超滤浓缩上清液和Binding/Wash Buffer按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育。两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱。将超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱；如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中。两倍柱体积的Binding/washbuffer清洗柱子并收集流穿液，直到流穿液的吸光度280nm接近基线。两倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线，收集洗脱液待纯化。
3、超滤置换
镍柱纯化后的蛋白溶液加Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore公司)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μL。轻轻加入300μL PBS(pH7.4)，10000g离心至剩余150μL，重复三次。PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约1-2mL，留样5μL用于蛋白浓度测定和SDS-PAGE蛋白电泳检测。
经Ni柱纯化后鉴定分析，pCGS3-Ga-A35R转染细胞培养上清液中重组蛋白Ga-A35R的产量为79.78mg/L，pCGS3-Lc-A35R转染细胞培养上清液中重组蛋白Lc-A35R的产量为18.13mg/L，pCGS3-Al-A35R转染细胞培养上清液中重组蛋白Al-A35R的产量为22.18mg/L(图4)，其中，信号肽Ga实验组纯化后产量最高。
采用铝盐；或CpG；或脂质体；或油性佐剂即可产生猴痘病毒免疫组合物，用于预防猴痘感染。
综合以上各实施例的结果，本发明采用信号肽Al，信号肽Ga和信号肽Lc三种信号肽引导猴痘病毒A35R抗原真核细胞分泌表达。本发明荧光素酶信号肽Ga分泌表达水平显著优于其他两种信号肽。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.融合蛋白，为将氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽融合于猴痘病毒A35R抗原的N端得到的蛋白质。
2.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNo.5、SEQ ID No.5的第1-141位或SEQ ID No.5的第1-146位。
3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由所述多肽的编码基因和所述猴痘病毒A35R抗原的编码基因组成；
所述多肽的编码基因为如下任一：
(a1)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子；
所述猴痘病毒A35R抗原的编码基因为如下任一：
(b1)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码相同蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子；
(b4)所述核酸分子为编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.7、SEQ ID No.7的第1-438位或SEQ ID No.7的第1-453位的DNA分子。
5.含有权利要求4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
6.权利要求1所述的多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：
P1、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达产量中的应用；
P2、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达效率中的应用；
P3、制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白制品中的应用；
所述相关生物材料为所述多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述宿主细胞为真核细胞。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下任一：
(a1)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。
9.权利要求1或2所述融合蛋白或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在如下任一中的应用：
P1、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达产量中的应用；
P2、提高猴痘病毒A35R抗原在宿主细胞中的分泌表达效率中的应用；
P3、制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白制品中的应用。
10.一种制备猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白的方法，包括如下步骤：
(A1)将权利要求3或4所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；
(A2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得猴痘病毒A35R抗原分泌蛋白。
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