CN104968795A - 增强蛋白表达的多肽 - Google Patents

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Abstract

描述了包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽的融合蛋白和编码这样的融合蛋白的核酸分子，其用于增强靶向的目标蛋白的表达和/或定位，用于修复细胞中丧失的功能，和用于治疗疾病。还公开了包含用融合配偶体修饰的目标靶蛋白的其它融合蛋白，所述融合配偶体包含增强蛋白表达的多肽。

Description

增强蛋白表达的多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月5日提交的美国临时申请号61/733,884和2012年12月5日提交的美国临时申请号61/733,743的权益。
技术领域
本发明属于经工程改造的蛋白的领域。具体地，本发明涉及用于增强蛋白的表达的多肽和编码这样的增强蛋白表达的多肽的核酸分子。也提供了增加目标蛋白的生产水平的方法。
背景技术
在遗传工程改造的细胞的培养物中在允许容易分离的水平以足够研究、开发或商业应用的量表达目标蛋白，需要多种重组技术和细胞培养方法的优化。这样的技术包括以下体外方法：分离和重组核酸分子以编码期望的蛋白分子，将期望的编码序列与适当的转录和翻译元件可操作地连接，将经工程改造的遗传物质插入适当的表达载体中，将得到的重组表达载体引入适合的宿主细胞中，和在允许表达期望的重组蛋白的条件下培养含有所述重组表达载体的宿主细胞。这样的方法的适当选择和优化已经允许来自多种宿主细胞的多种重组蛋白的表达和应用，所述宿主细胞包括细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物宿主细胞。
尽管在重组和细胞培养方法中有许多进展，确保适当蛋白折叠的问题仍然可以阻碍生产有用量的期望重组蛋白的最广泛努力。为了在它们的预期位置适当地起作用，所有蛋白必须完成适当的二维和三维构象。适当的构象会确保，蛋白将在它的预期位置(例如，细胞质、细胞核、细胞内结构、细胞器、细胞膜或细胞外的(分泌的)位置)给细胞或多细胞生物提供它的预期功能(例如，酶活性、信号转导或结构特征)。尽管适当结构和构象的信息存在于蛋白的氨基酸序列中，一般细胞内环境和多种刺激和环境应激（包括氧化性应激、营养物剥夺和高温）可以使得甚至内源产生的蛋白的适当折叠更难以达到，以致于许多蛋白分子呈现不希望的结构且因而不会给细胞提供它们的预期功能。为了处理不会达到或维持适当功能构象的持续风险，细胞具有一套充当分子伴侣的蛋白，所述分子伴侣辅助新生蛋白和成熟蛋白折叠和重折叠成它们的适当构象。热激70 kDa蛋白(在本文中被称作“Hsp70s”)构成多个物种的细胞中的伴侣蛋白质的最普遍存在的种类之一。Hsp70机制包括辅因子(或辅助伴侣蛋白)蛋白诸如J蛋白和核苷酸交换因子(NEF)的参与。
在关于折叠蛋白的Hsp70伴侣蛋白机制的当前模型中，Hsp70在ATP-和ADP-结合的状态之间循环。在该模型中，J蛋白结合至需要折叠或重折叠的蛋白(被称作“客户蛋白”)并与Hsp70的ATP-结合的状态(Hsp70-ATP)相互作用。J蛋白-客户复合物与Hsp70-ATP的结合会刺激ATP水解，这会造成封闭螺旋盖的Hsp70蛋白的构象变化，由此稳定客户蛋白与Hsp70-ADP之间的相互作用和J蛋白的释放，所述J蛋白然后自由地结合另一个客户蛋白。当与Hsp70-ADP结合时，客户蛋白会被提供允许折叠或重折叠成适当构象的环境。接着，核苷酸交换因子(NEF)结合至Hsp70-ADP，从而导致ADP的释放和ATP的结合。客户蛋白然后由于它对Hsp70-ATP的低亲和力(在没有J蛋白存在下)而被释放。如果客户蛋白尚未达到适当构象，它可能被J蛋白重新结合并再次进入循环中。参见，Kampinga等人, Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)。因而，根据该模型，J蛋白如下在Hsp70机制中起关键作用：与各个客户蛋白结合，以及与Hsp70伴侣蛋白质结合，以提供促进多种客户蛋白的捕获和呈递进Hsp70机制中的桥连功能，从而促进折叠或重折叠成适当构象。当Hsp70伴侣蛋白机制的尝试不会将蛋白折叠或重折叠成适当功能构象时，Hsp70伴侣蛋白机制也可以促进不适当地折叠的蛋白向细胞的蛋白水解系统(例如，蛋白酶体)的转移，从而实现氨基酸的降解和重复利用。关于Hsp70伴侣蛋白机制（包括J蛋白的关键作用）的综述，参见，Kampinga等人, Nature Rev., 11: 579-592 (2010)和Voisine等人, Neurobiol. Dis., 40: 12-20 (2010)。
表达的蛋白因而经历Hsp70机制的严格质量控制系统以便维持适当构象。在生产有用量的、在不同重组宿主细胞中表达的功能性外源(重组)蛋白的情况下，适当蛋白折叠的问题特别受到关注。该问题可以出现在真核和原核宿主细胞中。在细菌宿主细胞中表达适当地折叠的外源蛋白的失败，经常可以导致外源蛋白的无活性分子大型可能有毒的聚集体在细胞内的形成。这样的聚集体被称作“包涵体”，且被视作导致具有暴露的疏水结构域的无功能构象的无效蛋白折叠的结果，所述疏水结构域又促进与其它不适当地折叠的蛋白分子的结合和聚集。
当编码蛋白的野生型基因经历突变时，编码的突变体形式的蛋白仍然可能在细胞中表达。这样的表达的突变蛋白通常不会完成野生型蛋白的适当功能构象且可能形成无活性的聚集体。这样的不适当地折叠的突变蛋白物质通常被Hsp70机制引导进细胞蛋白水解系统中进行氨基酸的降解和重复利用。当然，不适当地折叠的突变蛋白的消除仍然会给细胞留下功能蛋白的缺失，且这样的功能丧失的后果对于细胞而言可以是致虚弱的或甚至致命的。实际上，适当地折叠的功能蛋白物质的丧失已经被证实或涉入许多疾病，包括朊病毒相关的疾病(传播性海绵状脑病)、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病和囊性纤维化。
在真核生物中发现的BAG蛋白家族的成员是具有多变的N-端结构域和保守的C-端Hsp70-结合结构域(BAG结构域)的核苷酸交换因子(NEF)，所述BAG结构域可以与Hsp70的ATP酶结构域相互作用。参见，例如，Kampinga等人, Nat. Rev. Biol., 11:579-592 (2010)。因而，BAG蛋白具有与被设计成参与募集Hsp70伴侣蛋白机制的蛋白一致的拓扑学、结合结构域和结合特异性。尽管BAG蛋白可能作为NEF参与Hsp70机制，但是许多研究提示，BAG蛋白可能主要涉入调节机制以控制多种活性，包括促进细胞生长、静止或细胞凋亡；调节转录复合物形成；和调节信号转导。参见，例如，Takayama等人, Nat. Cell Biol., 3: E237-E241 (2001)的综述。近年来，已经报道，当将期望的重组蛋白连接至BAG结构域时，得到的融合蛋白的表达水平大于单独蛋白的水平。参见，国际公开号WO 2012/087835 A2。
一般而言，随着细胞中的蛋白表达水平递增(这可以容易地发生在重组基因表达系统中)，存在递增的以下风险：这样的蛋白可能不会折叠或重折叠成适当功能构象。因此，与增加期望的外源或内源蛋白的表达的恒定期望一起，仍然需要增强在细胞中表达的外源和内源蛋白的适当折叠（即，增加适当地构造的功能蛋白的产率）的方式。
发明内容
本发明提供了用于增强由细胞产生的目标靶蛋白的表达水平的组合物和方法。具体地，本发明提供了增强蛋白表达的多肽，其可以掺入遗传工程改造的融合蛋白中，其当被宿主细胞表达时能够增强特定目标靶蛋白在它的预期位置的表达水平。
在一个实施方案中，本发明的增强蛋白表达的多肽选自：
(a) J蛋白的分离的J结构域；
(b) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段；
(c) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽类似物，所述J结构域类似物多肽包含式I的氨基酸序列：
(I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或甲硫氨酸(M)；
X2和X3各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是K或R；
X4是任意氨基酸，或者当X1至X3存在且X5至X9存在时，X4可以不存在；
X5是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
X6和X7各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者，当X6和X7中的一个是K或R时且当X1至X5存在且X8至X9存在时，X6和X7中的另一个可以不存在；和
X8和X9是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；或者，当X8和X9的一个是L或A时且当X1至X7存在时，X8和X9的另一个可以不存在；和
(d)分离的增强蛋白表达的多肽，其选自以下十肽：
。
根据本发明，与在没有增强蛋白表达的多肽存在下目标靶蛋白的表达水平相比，增强蛋白表达的多肽会增强在宿主细胞中表达的目标靶蛋白的表达水平。本发明的多肽的应用会提供就生产细胞而言增加期望的位置(隔室)中的期望的重组蛋白的量的方式。
在一个特定实施方案中，本发明的增强蛋白表达的多肽是分离的J结构域，其具有选自下文表1中阐述的任意J结构域序列的氨基酸序列。
优选地，本发明的增强蛋白表达的多肽是Erdj蛋白、SV40的大T抗原或哺乳动物半胱氨酸串联蛋白α(CSP-α)的分离的J结构域。本发明的Erdj蛋白的优选的分离的J结构域是Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6或Erdj7的分离的J结构域。特别优选的是Erdj3的分离的J结构域。
在另一个实施方案中，本发明的增强蛋白表达的多肽是具有选自以下任一个的氨基酸序列的J结构域的多肽片段：
。
在另一个实施方案中，增强蛋白表达的多肽是具有以上式I的氨基酸序列的J结构域类似物多肽。在特定实施方案中，本发明的增强蛋白表达的多肽包含具有以下序列的多肽：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是I、L、V、A或M；
所述二肽X2-X3选自：KR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ和RD；
X4是A、S、T、R、S、Q、E、F、C或I；
X5是Y或F；
所述二肽X6-X7选自：KR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK和KV；且
所述二肽X8-X9选自：LA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY和RA。
在特定实施方案中，本发明的J结构域类似物多肽包含下述氨基酸序列之一:
在另一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含与目标靶蛋白融合的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽融合配偶体是J蛋白的J结构域、具有增强目标蛋白融合配偶体的表达的能力的J结构域片段、或具有如上所述的式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)的J结构域类似物多肽。与不使用增强蛋白表达的多肽融合配偶体时目标靶蛋白的表达相比，该融合蛋白的表达会导致增加的融合的目标靶蛋白的表达。通过标准方法除去融合蛋白的增强蛋白表达的多肽部分，会导致增加的目标靶蛋白的回收率。
本发明的融合蛋白（其包含与目标靶蛋白连接的本文描述的增强蛋白表达的多肽）可以用在修复哺乳动物对象的细胞的蛋白功能的方法中，所述对象缺乏提供蛋白功能的天然分泌蛋白的分泌，所述方法包括下述步骤：将编码融合蛋白的外源核酸分子插入哺乳动物对象(诸如人、非人灵长类动物、啮齿动物或家畜)的细胞中，所述融合蛋白包含与分泌型蛋白连接的如上所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述融合蛋白的表达会提供天然分泌蛋白的功能，所述天然分泌蛋白的分泌在不存在所述外源核酸的对象的细胞中缺乏。
在一个优选的实施方案中，使用以上修复哺乳动物对象的细胞的蛋白功能的方法治疗具有与天然分泌蛋白在对象中的分泌缺乏有关的疾病的对象。这样的疾病包括、但不限于朊病毒相关的疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、囊性纤维化(CF)和α1-抗胰蛋白酶缺乏。在一个特别优选的实施方案中，使用用于修复蛋白功能的方法治疗缺乏囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白(CFTR)的分泌的人对象，且所述疾病是囊性纤维化。在该实施方案中，插入人对象的细胞中的外源核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与CFTR连接的上述增强蛋白表达的多肽。所述融合蛋白在人对象的细胞中的表达会修复CFTR功能的缺乏。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽元件是J蛋白的J结构域、具有增强目标蛋白融合配偶体的表达的能力的J结构域片段、或具有如上所述的式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)的J结构域类似物多肽，且所述靶蛋白结合结构域是当融合蛋白和目标靶蛋白在相同宿主细胞中共表达时能够结合所述目标靶蛋白的多肽。结合目标靶蛋白的融合蛋白会增强靶蛋白的表达水平和/或会增强靶蛋白在它的适当细胞位置或细胞外位置处的水平。因此，本文描述的融合蛋白可以用于为给定目的增强没有以适当量表达的目标靶蛋白的表达水平或目标靶蛋白在适当细胞位置或细胞外位置处的表达水平。本文描述的融合蛋白在其中有用的这样的情形包括、但不限于，在细胞培养物中不能表达期望的量的内源或异源(重组)目标蛋白，和在体内不能表达足够水平的蛋白，其中一种或多种功能蛋白的不适当表达会导致病理学状态(例如，但不限于，朊病毒相关的疾病(传播性海绵状脑病)；阿尔茨海默氏病；帕金森病；亨廷顿病；囊性纤维化；α1-抗胰蛋白酶缺乏)。
为了在期望的细胞位置或细胞外位置处增强的表达水平和/或增强的表达用本发明的融合蛋白靶向的蛋白可以是可溶性蛋白、膜相关的蛋白或分泌型蛋白。
本发明的融合蛋白的靶蛋白结合结构域是结合靶蛋白的多肽。优选地，所述靶标结合结构域对靶蛋白具有足够特异性的结合亲和力，从而排除其它蛋白以免于干扰靶蛋白的表达水平的增强。可以用作本发明的靶标结合结构域的多肽的例子包括、但不限于：结合靶蛋白的抗体或其抗原结合部分，结合靶免疫球蛋白或其片段的、免疫球蛋白特异性的结合蛋白(诸如蛋白A、蛋白L和蛋白G)，结合靶蛋白的Fc结构域的Fc结合蛋白(诸如蛋白A和蛋白G)，结合靶蛋白的Fc结构域的Fc结合肽，结合目标靶蛋白的受体蛋白的配体结合结构域，靶蛋白的蛋白配体(诸如受体的蛋白配体)，结合靶蛋白的PDZ结合结构域的、PDZ蛋白的PDZ结构域，等。
在本发明的一个实施方案中，当所述靶蛋白是细胞因子时，本发明的融合蛋白的靶标结合结构域可以包含结合靶细胞因子蛋白的细胞因子受体蛋白的配体结合结构域。
在另一个实施方案中，当所述靶蛋白是受体蛋白或其配体结合部分时，那么本发明的融合蛋白的靶标结合结构域可以包含被所述受体或其配体结合部分结合的蛋白配体。在一个优选的实施方案中，当所述靶蛋白是细胞因子受体蛋白或其细胞因子结合部分时，所述靶标结合结构域包含被细胞因子受体或这样的受体的细胞因子结合部分结合的细胞因子。
在一个实施方案中，其中所述靶蛋白诸如囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白具有PDZ结合结构域，那么本发明的融合蛋白的靶标结合结构域可以包含得自多种具有PDZ结构域的蛋白中的任一种的PDZ结构域。在一个优选的实施方案中，当靶蛋白具有PDZ结合结构域时，本发明的融合蛋白的靶标结合结构域包含得自NHERF家族的PDZ衔接蛋白的任意成员的PDZ结构域，包括、但不限于，NHERF1 (也被称作NHERF、EBP50或SLC9A3R1)、NHERF2 (也被称作E3KARP或SLC9A3R2)和PDZK1 (也被称作CAP70或NHERF3)。
本发明的结合靶蛋白的融合蛋白的特定实施方案包含J蛋白的J结构域、或其活性(增强表达的)片段、或式I的增强蛋白表达的多肽，它们用或不用接头肽与靶蛋白结合结构域融合。当接头肽存在于本发明的结合靶蛋白的融合蛋白中时，所述接头可以是一个或多个氨基酸，包括1-10个氨基酸、1-20个氨基酸和甚至1-50个氨基酸。通常，接头不会超过20个氨基酸，且被选择或设计成使得接头不会干扰(和有希望地增强)靶蛋白结合结构域或增强蛋白表达的多肽的功能。接头如果存在的话，优选地进行选择以优化融合蛋白的两个元件的贡献并由此增加目标靶蛋白的表达水平和/或适当位置。如果增强蛋白表达的多肽与靶蛋白结合结构域的直接连接不会不可接受地减少任一个元件的功能或不会不可接受地减少期望的靶蛋白的表达水平和/或定位的增强，则可以省略接头。
在本发明的融合蛋白中有用的接头可以包括酶促地可切割的肽，即，酶诸如肠激酶的切割位点，肠激酶、凝血酶、尿激酶、烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)、组织型纤溶酶原激活物、锌依赖性的内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、沙雷氏菌溶素、虾红素、蛇毒金属蛋白酶(adamalysin)、解聚素、ADAM、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶(cathespsin)、钙蛋白酶等的轻链。可切割的接头在本文描述的融合蛋白中的应用可以有利地停止或减慢融合蛋白的功能或消除它在细胞中的存在或在靶蛋白分子群体中的存在。有些细胞具有一种或多种细胞内蛋白酶，其可以切割含有对应的蛋白水解识别位点的多肽接头分子。因此，可以选择在本发明的融合蛋白中使用的可切割的接头，其允许细胞内蛋白酶切割在细胞中表达以后的融合蛋白。
本发明的融合蛋白可以进一步包含表位标签以辅助检测或分离融合蛋白。在本发明中有用的表位标签包括、但不限于聚组氨酸标签(诸如六His)、V5表位标签、Myc表位标签、Flag表位标签和HA (人流感血凝素)表位标签。
与单独靶蛋白（即，在没有融合蛋白存在下）的表达水平相比，本发明的融合蛋白经证实会增强靶蛋白的表达水平。按照本文所述的方法，可以使目标靶蛋白的表达水平增加至少约1.5倍和多达2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、25倍或更多。此外，本发明的融合蛋白也会增强靶蛋白在它们的适当细胞位置或细胞外位置处的水平。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含融合蛋白的组合物，其可用于给个体提供融合蛋白以增强靶蛋白的表达。本发明的组合物也包括包含融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，其用于治疗个体（包括人个体）中的疾病或障碍。包含如本文中所述的融合蛋白的药物组合物可以进一步包含一种或多种其它治疗活性化合物。可以掺入本发明的药物组合物中的、这样的其它治疗活性化合物的例子包括、但不限于：抗生素、抗病毒化合物、抗癌化合物、镇静剂、刺激物、局部麻醉剂、皮质类固醇、镇痛剂、抗组胺剂、非类固醇抗炎药(NSAID)和它们的适当组合。
本发明还提供了治疗人或动物对象的疾病状态的方法，所述疾病状态的特征在于由目标靶蛋白可以提供的功能或性能的缺失或减少，所述目标靶蛋白的表达用本文描述的融合蛋白类型之一增强。这样的方法可以包括给需要治疗的患者施用如本文中所述的融合蛋白。
本发明还提供了分离的核酸，其编码选自以下的增强蛋白表达的多肽：J蛋白的分离的J结构域，分离的具有增强目标靶蛋白的表达的能力的J结构域片段，或分离的具有如上所述的式I的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)的J结构域类似物多肽。
本发明还提供了核酸载体，其包含上述的分离的核酸。
在另一个实施方案中，本发明包括宿主细胞，其包含上述的分离的核酸或核酸载体。
本发明提供了分离的核酸分子，其编码本文描述的融合蛋白。还提供了重组载体分子，其中已经插入分离的编码本发明的融合蛋白的核酸分子。这样的重组载体分子包括用于在转染的宿主细胞中复制插入的核酸的克隆载体以及用于在适当的转染的宿主细胞中表达编码的融合蛋白的表达载体。在本领域中可得到的多种表达载体中的任一种可以用于生产本发明的融合蛋白。可用于表达本发明的融合体的表达载体的例子包括、但不限于：质粒pcDNA、pcDNA3.3 TOPO (Life Technologies, New York)、质粒pTT3、质粒pEF-BOS等。
本发明还提供了用于在适当宿主细胞中在体外表达本发明的融合蛋白的表达载体分子，其中已经插入分离的核酸，其编码分离的J结构域、活性J结构域片段、或式I的J结构域类似物。
本发明的表达载体也包括基因治疗载体，其用于在基因治疗中在体内表达本发明的融合蛋白以修复植物或动物(包括哺乳动物，诸如人类、非人灵长类动物、啮齿类动物和家畜)中缺失的或缺乏的靶蛋白功能。
在另一个方面，本发明提供了一种包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体用于表达本文所述的增强蛋白表达的多肽或本文描述的融合蛋白。在本发明中有用的宿主细胞包括、但不限于真核宿主细胞。优选的真核宿主细胞包括、但不限于，哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。优选地，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚胎肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞或MDCK细胞。优选的真菌宿主细胞包括曲霉菌属（Aspergillus）、脉孢菌属（Neurospora）、酵母属（Saccharomyces）、毕赤酵母属（Pichia）、汉逊酵母属（Hansenula）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、子囊菌酵母属（Yarrowia）和假丝酵母属（Candida）。更优选地，酵母属宿主细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞。
本发明提供了一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的J蛋白的J结构域、其增强蛋白表达的片段、或式I的J结构域类似物，所述方法包括，在足以生产所述融合蛋白的条件下，培养包含载体分子的宿主细胞，所述载体分子包含分离的编码所述融合蛋白的核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的如上所述的J蛋白的J结构域、其增强蛋白表达的片段、或式I的J结构域类似物，所述方法包括用包含编码所述融合蛋白的结构基因的表达载体转染宿主细胞，和在造成所述融合蛋白的表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。
本发明还提供了一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的本文描述的增强蛋白表达的多肽，所述方法包括下述步骤：
1)构建编码所述融合蛋白的重组基因序列；
2)将所述重组基因序列插入表达载体中以形成重组表达载体，其中所述重组基因序列与转录启动子序列可操作地连接；
3)将所述重组表达载体转染进与所述启动子序列相容的宿主细胞中；和
4)在允许表达所述融合蛋白的条件下培养所述转染的宿主细胞。
本发明还提供了一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的本文描述的分离的表达增强多肽，所述方法包括，在足以生产所述融合蛋白的条件下培养宿主细胞，其包含含有分离的编码所述融合蛋白的核酸的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种增强宿主细胞表达的目标靶蛋白的表达的方法，所述方法包括，用表达载体转染所述宿主细胞，所述表达载体包含编码融合蛋白的结构基因，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的J蛋白的分离的J结构域、分离的具有增强目标靶蛋白的表达的能力的J结构域片段、或分离的具有如上所述的式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)的J结构域类似物多肽，和在造成由所述结构基因编码的所述融合蛋白和所述目标靶蛋白的共表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。
本发明提供了一种增强目标靶蛋白的表达的方法，所述方法包括：(a)用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含编码融合蛋白的结构基因，其中所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的J蛋白的J结构域、其活性片段、或式I的J结构域类似物，且其中所述融合蛋白结合所述目标靶蛋白，和(b)在造成在所述结构基因上编码的融合蛋白的表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。所述结构基因也可以包括任选的编码接头肽的区段，所述接头肽连接所述J结构域/J结构域片段/J结构域类似物元件和所述靶蛋白结合结构域元件，且也可以包括编码表位标签、酶切割位点等的区段。所述方法可以有利地按照以下步骤实现：
1)构建编码融合蛋白的重组基因序列，所述融合蛋白包含与靶标结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽；
2)将所述重组基因序列插入表达载体中以形成重组表达载体，其中所述重组基因序列与转录启动子序列可操作地连接；
3)用所述重组表达载体转染与所述启动子序列相容的合适宿主细胞；和
4)在导致所述融合蛋白的表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。
在本发明的一个实施方案中，将编码本发明的融合蛋白的核酸插入植物或非人动物的细胞中以表达所述融合蛋白和增强靶蛋白的表达水平，从而给所述植物或非人动物提供缺失的或期望的功能。这样的方法包括生产转基因植物和转基因的非人动物，其中编码融合蛋白的核酸作为功能基因(转基因)永久地整合进基因组中，使得所述植物或非人动物不仅表达所述融合蛋白，而且将可表达的转基因的一个拷贝传递给后代。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种修复由对象的细胞中的靶蛋白提供的功能的方法，所述细胞缺乏所述靶蛋白的表达，所述方法包括将编码根据本发明的融合蛋白的外源核酸分子插入对象的细胞中，其中在将所述外源核酸分子插入所述细胞以后，所述融合蛋白被表达且增强所述靶蛋白的水平表达(所述增强可以是稳定内源性靶蛋白、增加适当地折叠的靶蛋白的量、改善靶蛋白向期望的细胞隔室或细胞外隔室的定位(例如，改善分泌型蛋白的分泌)等的结果)，从而提供所述靶蛋白的功能，在没有所述外源核酸存在下在所述对象的细胞中缺少所述靶蛋白的表达。在治疗具有与对象中的蛋白的缺乏表达有关的疾病的对象时，这样的方法是特别有用的。这样的疾病包括、但不限于朊病毒相关的疾病(传播性海绵状脑病)、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、囊性纤维化和α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。特别优选的是这样的方法的实施方案：其中所述对象是缺乏囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白的表达的人对象，且所述疾病是囊性纤维化，或其中所述对象是缺乏α1-抗胰蛋白酶的人对象，且所述疾病是α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。
附图说明
图1解释了在实施例2中描述的一系列实验，它们证实了处于修饰的排列（其中将靶蛋白连接至J结构域(得自Hsp40、SV40或CSP J蛋白)）的目标靶蛋白(IL13Rα2受体蛋白)与单独的蛋白(IL13Rα2WT)相比的表达水平的提高，或者表达为含有BAG结构域(得自BAG3、BAG4、BAG5或BAG6蛋白)的融合蛋白。图1A描绘了插入用于转染宿主细胞的表达载体质粒中的结构基因的简图。在3'末端处用编码“IL13Rα2WT”表达产物的V5表位标签的区段增强编码IL13Rα2蛋白(野生型蛋白, “WT”)的cDNA。关于BAG结构域融合蛋白，将编码IL13Rα2的cDNA在框架内连接至编码BAG结构域的区段，该区段又连接至编码V5表位标签的区段，以提供BAG结构域融合蛋白表达产物。关于本发明的J结构域融合蛋白，将编码IL13Rα2的cDNA在框架内连接至编码J结构域的区段，该区段又连接至编码V5表位标签的区段，以提供J结构域融合蛋白表达产物。图1B显示了细胞裂解物的蛋白质印迹(免疫印迹)分析的化学发光信号的x-射线胶片图像，其指示标记的IL13Rα2野生型(WT)蛋白或融合蛋白相应物在转染的细胞中的相对表达水平。可以看出，采用J蛋白Hsp40、SV40或CSP的J结构域作为IL13Rα2目标蛋白的融合配偶体，导致与以下蛋白相比显著更大的蛋白表达：野生型IL13Rα2蛋白(WT)，或包含BAG蛋白BAG3、BAG4、BAG5或BAG6的BAG结构域的任意BAG结构域融合相应物。用表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告质粒共转染所有转染子，以证实转染子的成功转染和操作性。参见，图1B的下图。图1C提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图1B的免疫印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图1C中的条形图清楚地显示与4种IL13Rα2-BAG结构域融合蛋白中的任一种或野生型IL13Rα2蛋白(IL13α2WT表达= 100%)的表达水平相比，所有3种分泌型IL13Rα2-J结构域融合蛋白的显著更高的表达水平。
图2显示了在实施例2中描述的实验的结果，该实验检验了处于修饰的排列（其中将截短形式(“TF”)的IL13Rα2受体蛋白(它是含有配体结合结构域的IL13Rα2受体蛋白的细胞外部分)连接至J结构域(J-IL13Rα2TF)）的分泌型目标靶蛋白与单独的截短受体蛋白(IL13Rα2TF)相比表达水平的提高。图2A描绘了插入用于转染宿主细胞的表达载体质粒中的结构基因构建体的简图。在3'末端处用编码IL13Rα2TF表达产物的V5表位标签的区段增强编码IL13Rα2TF的cDNA。在3'末端处用编码V5表位标签的区段扩大编码IL13Rα2TF的cDNA，并在5'末端处与编码本发明的J结构域融合蛋白表达产物(J-IL13Rα2TF)的J结构域(得自J蛋白Erdj3)的区段连接。图2B显示了蛋白质印迹中的化学发光信号的x-射线胶片图像，其指示细胞(细胞裂解物)中的相对表达水平，并分泌进V5-标记的IL13Rα2TF蛋白和J结构域融合蛋白相应物的培养用培养基(培养基)中。可以看出，采用J结构域作为IL13Rα2TF目标蛋白的融合配偶体，导致与不含J结构域的IL13Rα2TF蛋白相比显著更大的蛋白表达水平。用表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告质粒共转染所有转染子，以证实转染子的成功转染和操作性。参见，图2B的下图。假培养物含有用“空”载体（即，缺少用于表达任何蛋白的结构基因的表达载体）转染的细胞。
图3显示了在实施例2中描述的实验的结果，其对比了分泌进宿主细胞的培养用培养基中的蛋白的相对表达水平，所述宿主细胞用表达截短受体蛋白(IL13Rα2TF)、BAG结构域-IL13Rα2TF融合蛋白(BAG-IL13Rα2TF)和J结构域-IL13Rα2TF融合蛋白(J-IL13Rα2TF)的表达载体转染。图3A显示了分泌进转染的细胞的培养用培养基中的IL13Rα2TF、BAG结构域-IL13Rα2TF融合蛋白和J结构域-IL13Rα2TF融合蛋白的斑点印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像。所有蛋白携带V5表位标签以便用抗-V5抗体进行免疫检测。图3B提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图3A中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图3B中的条形图清楚地显示与IL13Rα2TF (条形图2)或BAG结构域- IL13Rα2TF融合蛋白(条形图3)的表达水平相比，分泌的J结构域-IL13Rα2TF融合蛋白(条形图4)的显著更高的表达水平。假培养物(条形图1)含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞。
图4显示了在实施例2中描述的实验的结果，其检验与单独的蛋白相比处于修饰的排列（其中α1AT与J结构域融合配偶体连接(融合)）的分泌型α1抗-胰蛋白酶(α1AT)的表达水平的提高，或者表达为含有BAG结构域的融合体。图4A描绘了插入用于转染宿主细胞的表达载体质粒中的结构基因构建体的简图。在3'末端处用编码α1AT表达产物的V5表位标签的区段扩大编码α1AT的cDNA。将编码α1AT的cDNA在框架内连接至编码BAG结构域的区段，该区段又连接至编码BAG结构域融合蛋白(α1AT-BAG)表达产物的V5表位标签的区段。将编码α1AT的cDNA在框架内连接至编码J结构域的区段，该区段又连接至编码本发明的J结构域融合蛋白(α1AT-J)表达产物的V5表位标签的区段。图4B显示了斑点印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像，其指示分泌进培养用培养基中的分泌型α1AT蛋白或分泌型融合蛋白相应物的相对表达水平。可以看出，采用J结构域作为α1AT目标蛋白(α1AT-J)的融合配偶体，导致与单独的α1AT蛋白或BAG结构域融合相应物(α1AT-BAG)相比分泌型蛋白(α1AT-J)的显著更大的表达。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞。图4C提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图4B中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图4C中的条形图清楚地显示与(未融合的)α1AT (条形图2)或BAG结构域-α1AT融合蛋白(条形图3)相比分泌型α1AT-J融合蛋白(条形图4)的显著更高的表达水平。
图5显示了在实施例2中描述的实验的结果，该实验证实与单独的蛋白(TNFR1TF)相比处于修饰的排列（其中将TNFR1TF连接至J结构域融合配偶体）的TNF-α受体1蛋白(TNFR1TF)的分泌型截短形式的表达水平的提高。图5A描绘了插入用于转染宿主细胞的表达载体质粒中的结构基因构建体的简图。在3'末端处用编码TNFR1TF表达产物的V5表位标签的区段扩大编码TNFR1TF的cDNA。将编码TNFR1TF的cDNA在框架内连接至编码J结构域的区段，该区段又连接至编码V5表位标签的区段，以提供本发明的J结构域融合蛋白表达产物。图5B显示了斑点印迹的化学发光信号的x-射线胶片图像，其指示分泌进培养用培养基中的TNFR1TF和TNFR1TF-J结构域融合蛋白的相对水平。可以看出，采用J结构域作为TNFR1TF目标蛋白(TNFR1TF-J)的融合配偶体，导致与(未融合的) TNFR1TF蛋白相比分泌型蛋白的显著更大的表达。图5C提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图5B的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图5C中的条形图清楚地显示与TNFR1TF (条形图2)相比分泌型TNFR1TF-J结构域融合蛋白(条形图3)的显著更高的表达水平。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞。
图6显示了在实施例2中描述的一系列实验的结果，其证实处于修饰的排列（其中将3种目标靶蛋白中的每一种连接至J结构域融合配偶体）的目标靶Fc融合蛋白的表达水平的提高。图6A描绘了在该实施例中使用的结构基因构建体的简图。对于Fc融合蛋白，在3'末端处用编码V5表位标签的区段扩大编码每种目标蛋白(TNFR1TF、IL13Rα2TF或α1AT)的cDNA，所述区段又连接至编码免疫球蛋白Fc区的恒定结构域的区段(“Fc”)。对于J结构域融合体，在编码每种目标蛋白的cDNA和编码V5表位标签的区段之间在框架内连接编码J结构域的cDNA。参见，图6A。图6B显示了得自转染的细胞的培养物的培养基中的分泌型蛋白的斑点印迹分析。如在图6B的每个图的中间泳道的斑点印迹中所示，每种Fc融合蛋白(TNFR1-V5-Fc、IL13Rα2TF-Fc和α1AT-Fc)在培养用培养基中表达。Fc融合蛋白的这种表达水平大于单独的每种目标蛋白(即，没有与Fc结构域融合；数据未显示)的表达水平。如在图6B的每个图的右泳道的斑点印迹中所示，当将J结构域连接至Fc融合蛋白内的目标蛋白区段时，在每种情况下得到显著更高的表达水平。在图6B中的斑点印迹的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图6C的对应图中，其中通过将图6C的每个图中的条形图2 (目标蛋白-Fc融合蛋白)与条形图3 (目标蛋白-J结构域-Fc融合蛋白)进行对比，清楚地证实J结构域融合蛋白的显著更高的表达水平。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞。
图7显示了在实施例2中描述的实验的结果，该实验证实与单独的p53蛋白相比处于修饰的排列（其中p53与J结构域融合配偶体连接(融合)）的细胞质p53蛋白的表达水平的提高。图7A描绘了在该实验中使用的构建体的简图。在它的5'末端用编码p53表达产物的V5表位标签的区段扩大编码p53的cDNA。将编码p53的cDNA在它的5'末端在框架内连接至编码SV40 J蛋白的J结构域的区段，该区段又在它的5'末端连接至编码本发明的J结构域融合蛋白(J-p53)表达产物的V5表位标签的区段。图7B显示了细胞裂解物的蛋白质印迹的化学发光信号的x-射线胶片图像，其指示标记的p53蛋白和J结构域融合蛋白相应物(J-p53)在细胞中的相对表达水平。可以看出，与不含J结构域的p53蛋白(p53)在转染的细胞中的表达水平相比，采用J结构域作为p53目标蛋白的融合配偶体(J-p53)，导致转染的细胞中显著更大的表达水平。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞。
图8显示了在实施例2中描述的一系列实验的结果，其证实与每种单独蛋白或每种被表达为含有BAG结构域的融合体的蛋白相比，处于修饰的排列（其中每种蛋白与J结构域融合配偶体连接(融合)）的两种目标靶蛋白即野生型CFTR蛋白和对应的CFTR∆508F突变蛋白(苯丙氨酸残基在位置508的缺失导致CFTR∆508F突变蛋白的缺陷性折叠和快速降解)的表达水平的提高。图8A描绘了插入用于转染宿主细胞的表达载体质粒的构建体的简图。在5'末端处用编码V5表位标签的区段扩大编码每种目标蛋白即野生型CFTR蛋白(CFTR WT)或CFTR∆508F突变蛋白(∆508F)的cDNA。对于BAG结构域融合体，在编码每种目标蛋白的cDNA和编码V5表位标签的5'区段之间在框架内连接编码BAG结构域的cDNA。对于本发明的J结构域融合蛋白表达产物，在编码每种目标蛋白的cDNA和编码J结构域的V5表位标签的5'区段之间在框架内连接编码SV40 J结构域的cDNA。参见，图8A。图8B显示了细胞裂解物的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像，其指示标记的目标蛋白(CFTR WT和CFTR∆508F)、BAG结构域融合蛋白(BAG-CFTR WT和BAG-CFTR∆508F)和J结构域融合蛋白(J-CFTR WT和J-CFTR∆508F)在细胞中的相对表达水平。可以看出，采用J结构域作为CFTR WT和CFTR∆508F蛋白的融合配偶体，导致与(未融合的) CFTR WT和突变体CFTR∆508F蛋白的表达水平或BAG结构域融合相应物的表达水平相比在转染的细胞中显著更大的表达水平。用表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告质粒共转染所有转染子，以证实转染子的成功转染和操作性(图8B的下图)。
图9描绘了用于增强目标靶蛋白的表达的、未修饰的排列的一般方案的简图，其中本发明的融合蛋白的共表达会增强如在实施例4中描述的目标靶蛋白的表达。在该方案中，本发明的融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽(PEEP)结构域，其中所述靶蛋白结合结构域会结合目标靶蛋白，由此使靶蛋白到达PEEP结构域附近紧邻处，这又会导致靶蛋白在它的适当细胞位置或细胞外位置处的表达水平的升高。
图9B是用于插入表达载体质粒中的、编码IL13Rα2TF融合蛋白(靶蛋白)的结构基因的简图，所述表达载体质粒用于转染宿主细胞，如在下面实施例4中所述。在3'末端处用编码V5表位标签的区段扩大编码IL13Rα2受体蛋白(IL13Rα2TF)的截短形式的cDNA，所述截短形式包含IL13Rα2的细胞外IL13配体结合结构域。
图9C描绘了一种构建体，其用于表达本发明的融合蛋白以增强在图9B中描绘的V5-标记的IL13Rα2TF靶蛋白的表达，且如在实施例4中所述。将编码Erdj3 J蛋白的J结构域(增强蛋白表达的多肽结构域)的cDNA连接至编码IL13蛋白(靶蛋白结合结构域)的区段。将编码Flag表位标签的区段连接至编码IL13靶蛋白结合结构域的区段的3'末端。
图10显示了如在实施例4中所述，当单独表达时(从左侧泳道2)，当与它的IL13配体共表达时(仅IL13，从左侧泳道3)，和当与本发明的J结构域-IL13融合蛋白以未修饰的排列共表达时(J-IL13, 从左侧泳道4)，表达IL13Rα2受体蛋白(IL13Rα2TF)的截短形式的转染的细胞的培养用培养基(上图)和细胞裂解物(中图)的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像。预期从转染的宿主细胞分泌适当地折叠的IL13Rα2TF蛋白(靶蛋白)。可以看出，与单独的IL13Rα2TF蛋白的表达(上图, 从左侧泳道2)或IL13Rα2TF蛋白与它的IL13配体的共表达(上图, 从左侧泳道3)相比，IL13Rα2TF蛋白与J结构域-IL13融合蛋白的共表达显著地增强分泌的IL13Rα2TF蛋白的表达水平(上图, 从左侧泳道4)。此外，与单独IL13Rα2TF蛋白的表达水平(中图, 从左侧泳道2)或IL13Rα2TF蛋白与它的IL13配体的共表达(中图, 从左侧泳道3)相比，IL13Rα2TF蛋白与J结构域-IL13融合蛋白的共表达显著增强细胞内IL13Rα2TF蛋白的表达水平(中图, 从左侧泳道4)。用表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告质粒共转染所有转染子，以证实转染子的成功转染和操作性。参见，图10的下图。假培养物含有用“空载体”（即，缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体）转染的细胞(无IL13Rα2TF蛋白，无共表达；从印迹的左侧，泳道1中的“无”)。但是，用GFP载体共转染空载体转染子，且通过GPF表达证实成功的共转染（在图10的下图中检测到）。
图11显示了插入表达载体质粒中的、编码蛋白的核酸构建体的示意图，所述表达载体质粒用于转染宿主细胞，所述宿主细胞用在下面实施例5描述的实验中。图11A描绘了编码Fc融合蛋白(靶蛋白)的DNA构建体，其包含在它的3'末端用编码V5表位标签的区段增强的、编码目标蛋白的cDNA，所述区段又连接至编码免疫球蛋白Fc结构域的恒定结构域的区段。对于下面的实施例5，Fc融合蛋白靶标包含连接至V5表位标签的IL13Rα2受体蛋白(IL13Rα2TF)的截短形式，所述V5表位标签又连接至Fc结构域，以产生期望的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白。图11B描绘了编码本发明的融合蛋白的DNA构建体，其中增强蛋白表达的多肽(PEEP)结构域(诸如J蛋白的J结构域)与靶蛋白结合结构域(诸如蛋白A，其已知会结合Fc结构域)连接。所述构建体在3'末端处用Flag表位标签的编码区段进一步增强，以便用标准抗-Flag抗体容易地鉴别和分离。
图12显示了在实施例5中描述的实验的结果，该实验证实处于未修饰的排列的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达的显著增强，其中靶蛋白与J结构域-蛋白A融合蛋白共表达，但是当靶蛋白与单独的蛋白A共表达时则没有显著增强。
图12A显示了如在实施例5中所述，当单独表达时(泳道2, 无)，当与单独蛋白A共表达时(泳道3, 仅蛋白A)，当与Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白共表达时(泳道4, J-蛋白A)，和当与Erdj5 J结构域-蛋白A融合蛋白共表达时(泳道5, J2-蛋白A)，得自表达IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(靶蛋白)的转染的细胞的培养物的培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(从左侧泳道1)。可以看出，与表达单独的IL13Rα2TF-Fc融合体靶蛋白(从左侧泳道2)或共表达IL13Rα2TF-Fc融合体靶蛋白和未融合蛋白A (从左侧泳道3)的转染子细胞中的表达水平相比，IL13Rα2TF-Fc融合体靶蛋白和任一种J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达(从左侧泳道4和5)导致分泌进培养用培养基中的IL13Rα2TF-Fc融合体靶蛋白的显著更大的表达水平。
图12B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序，图12A中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图12B的条形图1-5对应于图12A中的泳道1-5的信号。图12B中的条形图清楚地显示，与单独的IL13Rα2TF-Fc(条形图2)或IL13Rα2TF-Fc与(未融合的)单独蛋白A的共表达(条形图3)的表达相比，IL13Rα2TF-Fc靶蛋白与任一种J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达(条形图4和5)显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc的表达水平。
图12C显示了如在实施例5中所述，当与Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白共表达时(泳道2, J-蛋白A)，和当与单独蛋白A共表达时(泳道3, 仅蛋白A)，得自表达单独IL13Rα2TF (无Fc结构域)蛋白(泳道1, 无)的转染的细胞的培养物的培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像。结果表明，如果图12A和12B中的分泌的IL13Rα2TF-Fc融合体靶蛋白的增强的水平依赖于J结构域-蛋白A融合蛋白的靶蛋白结合结构域对IL13Rα2TF-Fc靶蛋白的Fc结构域的特异性，如预期的，观察到分泌型IL13Rα2TF蛋白的极少（如果有的话）表达。图12D提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图12C中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图12C和12D因而显示了对照实验结果，因为IL13Rα2TF蛋白没有被J结构域-蛋白A融合体(靶标结合结构域(蛋白A)的Fc配体缺失)识别，且因而可以由J结构域(增强蛋白表达的多肽结构域)提供的表达水平的增强没有靶向IL13Rα2TF，如结果所指示。
图13提供了一系列实验的结果，其证实当与本发明的对应融合蛋白共表达时，3种不同的Fc融合体靶蛋白的表达水平的显著增强，如在下面的实施例6中所述。图13A (左图)显示了关于IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达的蛋白质印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述融合蛋白分泌进表达单独IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(从左侧泳道1)的转染的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达IL13Rα2TF-Fc融合蛋白和J结构域-蛋白A融合蛋白(从左侧泳道2)的转染的细胞的培养物的培养基中，如在下面的实施例6.1中所述，且类似于在实施例5中描述的实验。图13A的右图提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图13A的左图中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图13A的右图中的条形图1和2 (从左至右)对应于图13A的左图中的泳道1和2(从左至右)的信号。结果表明，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，本发明的J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著升高(8倍)分泌进培养用培养基中的IL13Rα2TF-Fc靶蛋白的表达水平。结果与在实施例5和图12中描述的那些结果一致。
图13B (左图)显示了关于TNFR1TF-Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达的蛋白质印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述融合蛋白分泌进表达单独的TNFR1TF-Fc融合体靶蛋白(从左侧泳道1)的转染的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达TNFR1TF-Fc融合蛋白和J结构域-蛋白A融合体(从左侧泳道2)的转染的细胞的培养物的培养基中，如下面实施例6.2中所述。图13B的右图提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图13B的左图中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图13B的右图中的条形图1和2 (从左至右)对应于图13B的左图中的泳道1和2(从左至右)的信号。结果表明，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著升高(6倍)分泌进培养用培养基中的TNFR1TF-Fc靶蛋白的表达水平。
图13C (左图)显示了关于α1抗-胰蛋白酶(α1AT)-Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达的蛋白质印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述融合蛋白分泌进表达单独的α1AT-Fc融合体靶蛋白(从左侧泳道1)的转染的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达α1AT-Fc融合体靶蛋白和J结构域-蛋白A融合蛋白(从左侧泳道2)的转染的细胞的培养物的培养基中，如在实施例6.3中所述。图13C的右图提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图13C的左图中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图13C的右图中的条形图1和2 (从左至右)对应于图13C的左图中的泳道1和2(从左至右)的信号。结果表明，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著升高(3倍)分泌进培养用培养基中的α1AT-Fc融合体靶蛋白的表达水平。
图14提供了下面实施例7中描述的一系列实验的结果，其检验处于未修饰的排列的分泌型人源化的抗-IL8 IgG1抗体的表达水平的增强。图14A显示了关于抗-IL8抗体(靶蛋白)的表达的斑点印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述抗体分泌进转染的细胞的培养物的培养基中，所述细胞表达单独的抗-IL8抗体(泳道2)、共表达抗-IL8抗体和蛋白A (泳道3, 仅蛋白A)、共表达抗-IL8抗体和本发明的Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道4, J-蛋白A)、共表达抗-IL8抗体和蛋白L (泳道5, 仅蛋白L)、共表达抗-IL8抗体和本发明的Erdj3 J结构域-蛋白L融合蛋白(泳道6, J-蛋白L)、共表达抗-IL8抗体和它的IL8配体(泳道7, IL8)、共表达本发明的Erdj3 J结构域-IL8配体融合蛋白(泳道8, J-IL8)、表达单独的Erdj3 J-蛋白A融合蛋白(泳道9, J-蛋白A)、表达单独的Erdj3 J结构域-蛋白L融合蛋白(泳道10, J-蛋白L)和表达Erdj3 J结构域-IL8配体融合蛋白(泳道11, J-IL8)。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(无抗-IL8抗体, 泳道1)。使用抗-人IgG抗体(“抗-huIgG Ab”) (目录号AP112P, Millipore)在斑点印迹测定中分析了培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达。可以看出，与表达单独的抗-IL8抗体(泳道2)、共表达单独蛋白A (泳道3, 仅蛋白A)、共表达单独蛋白L (泳道5, 仅蛋白L)或共表达单独IL8配体蛋白(泳道7)的转染的细胞中表达的抗体的水平相比，转染的细胞中抗-IL8抗体与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道4)、与J结构域-蛋白L融合蛋白(泳道6)、或与J结构域-IL8融合蛋白(泳道8)的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达水平。在以下细胞的培养用培养基中没有检测到信号：表达单独J结构域-蛋白A融合蛋白的转染的细胞(泳道9, J-蛋白A)，表达单独J结构域-蛋白L融合蛋白的转染的细胞(泳道10, J-蛋白L)，或表达单独J结构域-IL8融合蛋白的转染的细胞(泳道10, J-IL8)，从而指示所有3种融合蛋白特异性地靶向和增强共表达的抗-IL8抗体靶蛋白的表达。
图14B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图14A的每个泳道中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图14B的条形图的编号对应于图14A的泳道编号。该序列实验的结果清楚地显示，相对于抗体与单独的未融合的靶蛋白结合结构域蛋白的共表达(仅蛋白G、仅蛋白L或仅IL8)，靶向的抗-IL8抗体与本发明的融合蛋白的共表达显著增强分泌的抗-IL8抗体的表达，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域(在这里，蛋白A、蛋白L或IL8)连接的增强蛋白表达的多肽(在这里，Erdj3 J结构域)。
图15提供的结果证实，根据本发明的融合蛋白可以用于增强在建立的商业上相关的细胞系中已经稳定地生产的靶蛋白的表达水平，如在下面的实施例8中所述。图15A显示了关于抗-IL8抗体(靶蛋白)的表达的斑点印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述抗体分泌进表达单独抗-IL8抗体(泳道2)的CHO-DP12细胞系(登记号CRL-124444, 美国典型培养物保藏中心, Manassas, Virginia)的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达抗-IL8抗体和Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道3, J-蛋白A)的转染的细胞的培养物的培养基中。使用抗-人IgG抗体(“抗-huIgG Ab”)，在斑点印迹测定中分析培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达。可以看出，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下表达的抗体的水平(泳道2, 无)相比，所述抗体与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗体的表达水平(泳道3)。泳道1是对照(仅培养基)。图15B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图15A的泳道的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果，其显示在图15B的各个条形图中。结果指示，与当在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下表达抗体时得到的表达相比，所述抗体与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达(条形图3)显著增强分泌型抗体的表达，提供表达水平的大约4-5倍的更大增强(条形图2)。结果指示，本发明的融合蛋白可以用于显著地增强在建立的生产细胞系中已经稳定地表达的靶蛋白的生产水平。
图16提供了一系列实验的结果，其检验多种包含与多种蛋白中的任一种连接的J蛋白的J结构域(作为增强蛋白表达的多肽结构域)的融合蛋白，如在下面的实施例9.1中所述。然后试验了多种J结构域融合蛋白和其它蛋白，并对比了它们的增强IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达水平的能力，所述融合蛋白分泌进转染的HEK293细胞的培养物的培养基中。图16A显示了转染的细胞的培养物的培养基的样品的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述细胞表达单独的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(靶蛋白) (泳道1)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2)、共表达IL13Rα2TF-Fc与单独蛋白A (泳道3, 仅蛋白A)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-蛋白G融合蛋白(泳道4)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-hFcR融合蛋白(泳道5, J-hFcR)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-vFcR融合蛋白(泳道6, J-vFcR)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-gI融合蛋白(泳道7, J-gI)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-gE融合蛋白(泳道8, J-gE)和共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-gI融合蛋白和J结构域-gE融合蛋白二者(泳道9, J-gI + J-gE)。使用NIH ImageJ图像处理程序对图16A的蛋白质印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图16B的各个条形图中。关于细节，参见实施例9.1。
图17提供了一系列实验的结果，其检验多种包含与6种Fc-结合肽(FcBP1至FcBP6)中的每一种连接的J蛋白的J结构域(作为增强蛋白表达的多肽结构域)的融合蛋白，所述融合蛋白用于增强具有如下面实施例9.2中所述的Fc结构域的蛋白的表达水平。Fc结合肽的氨基酸序列给出在图17的图A和B之间。图17A显示了转染的细胞的培养物的培养基的样品的蛋白质印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述细胞表达单独的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(靶蛋白)(泳道1和3)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2, J-蛋白A)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-FcBP1融合蛋白(泳道4, J-FcBP1)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-FcBP2融合蛋白(泳道5, J-FcBP2)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-FcBP3融合蛋白(泳道6, J-FcBP3)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-FcBP4融合蛋白(泳道7, J-FcBP4)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-FcBP5融合蛋白(泳道8, J-FcBP5)、共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-FcBP6融合蛋白(泳道9, J-FcBP6)、和共表达IL13Rα2TF-Fc与J结构域-蛋白G融合蛋白(泳道10, J-蛋白G)。如在图17A中所示，与单独IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平(泳道1和3)相比，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与6种J结构域-肽融合蛋白中的每一种在HEK293转染子中的共表达显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平(泳道4-9)。该实验也包括IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2)或与J结构域-蛋白G融合蛋白(泳道10)的共表达对分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达的影响的对比。如在图17A中所示，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2)或J结构域-蛋白G融合蛋白(泳道10)的共表达显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平，这也在实施例5 (图12)、6.1 (图13A)和9.1 (图16)中观察到。使用NIH ImageJ图像处理程序对图17A的蛋白质印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图17B的各个条形图中。
图18显示了斑点印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片图像，其显示了在实施例10中描述的、以未修饰的排列使用的3种多肽的增强靶蛋白表达的活性的相对水平的实施例。关于命名为“3 (J结构域)”、“3-45”和“3-72”(参见下表58)的多肽，确定在斑点印迹中指出的表达水平（即，高活性(HA)、活性(A)和无活性(NA)）。将每种多肽连接至蛋白A以形成融合蛋白，所述融合蛋白与V5-标记的IL13Rα2-Fc靶蛋白一起在转染的细胞中共表达。使用抗-V5抗体，在斑点印迹中确定培养用培养基中的V5-标记的IL13Rα2-Fc靶蛋白的表达水平。斑点印迹显示了以下细胞的培养物的培养基中的V5-标记的IL13Rα2-Fc靶蛋白的表达：表达单独靶蛋白(从左侧泳道2)的转染的细胞，共表达靶蛋白和多肽3-蛋白A融合蛋白(从左侧泳道3)的转染的细胞，共表达靶蛋白和多肽3-45-蛋白A融合蛋白(从左侧泳道4)的转染的细胞，和共表达靶蛋白和多肽3-72-蛋白A融合蛋白(从左侧泳道5)的转染的细胞。用于增强处于未修饰的排列的靶蛋白的表达的多肽的高活性(HA)，由斑点印迹的泳道3 (从左侧)中所示的表达水平表示。与用于增强靶蛋白的表达的多肽的阴性对照(A)相比提高的活性，由斑点印迹的泳道4 (从左侧)中所示的表达水平表示。用于增强靶蛋白的表达的多肽的无活性(NA)显示在斑点印迹的泳道5 (从左侧)中。斑点印迹的泳道1 (从左侧)显示，在不表达靶蛋白或任何多肽-Fc融合蛋白的细胞的假培养物的培养基中不表达靶蛋白。
图19显示了Erdj3的J结构域的氨基酸序列与一系列多肽的氨基酸序列的比对，所述多肽被制备为全长J结构域的N-和C-端缺失突变，如在实施例11中所述。用括号指示J结构域的α螺旋和环结构域。也显示了每种多肽的命名编号、长度(氨基酸残基)、增强蛋白表达的活性(HA、NA)和序列标识编号。(关于增强靶蛋白表达的高活性(HA)、提高的活性(A)和无活性(NA)的描述，参见图18和实施例10)。如在比对中所示，J结构域是命名的多肽3，具有61个氨基酸的长度，且具有增强处于未修饰的排列的靶蛋白的表达的高活性(HA)。
图20显示了在实施例12中描述的一系列实验的结果，其对比了以修饰的排列使用的2种多肽的增强靶蛋白表达的活性。图20A显示了插入用于转染细胞的表达载体中的核酸构建体的简图。IL13Rα2TF构建体编码包含IL13Rα2的截短形式的融合多肽，所述融合多肽含有与C-端V5表位标签融合的细胞外IL13结合结构域。IL13Rα2TF-BSC1构建体编码包含IL13Rα2的截短形式的融合多肽，所述截短形式与BSC1序列(多肽3-29, IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)融合，所述BSC1序列与C-端V5表位标签融合。IL13Rα2TF-BSC1MT构建体编码IL13Rα2的截短形式，所述截短形式与BSC1MT序列(多肽3-55, IAQAYRKLA, SEQ ID NO:298)融合，所述BSC1MT序列与C-端V5表位标签融合。多肽3-55的氨基酸序列与多肽3-29的氨基酸序列的差别在于2个位置，如图20A的底部所示。用含有IL13Rα2TF构建体的载体转染的细胞用作对照(没有与BSC1或BSC1MT多肽融合)。
图20B显示了使用抗-V5抗体时表达IL13Rα2TF、IL13Rα2TF-BSC1和IL13Rα2TF-BSC1MT蛋白的转染的细胞的培养物的培养基的斑点印迹分析的化学发光信号的X-射线胶片图像。图20B的泳道2 (从左侧)表明，在对照细胞的培养物的培养基中仅检测到非常低水平的IL13Rα2TF融合蛋白。图20B中的泳道3 (从左侧)表明，在用含有IL13Rα2TF-BSC1构建体的载体转染的细胞的培养物的培养基中表达显著水平的IL13Rα2TF-BSC1融合蛋白。图20B中的泳道4 (从左侧)表明，在用含有IL13Rα2TF-BSC1MT构建体的载体转染的细胞的培养物的培养基中仅表达非常低水平的IL13Rα2TF-BSC1MT融合蛋白。结果指示，多肽3-29对于增强处于修饰的排列的靶蛋白的表达而言具有“高活性”，而认为多肽3-55对于增强处于修饰的排列的靶蛋白的表达而言具有“无活性”。
图21的条形图表明如实施例13中所述以未修饰的排列与BSC1-蛋白A一起在HEK293细胞中共表达的IL13Rα2TF-Fc靶蛋白的IL13结合活性。BSC1-蛋白A蛋白是包含与蛋白A连接的多肽3-29 (IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)的融合蛋白，如在实施例13中所示。用于确定IL13结合活性的测定是夹心ELISA，其中当IL13被IL13Rα2TF-Fc蛋白捕获时，人IL13的检测减少。图21中的第一个条形图(从左侧)表明，在得自不表达IL13Rα2TF-Fc或BSC1-蛋白A融合蛋白的对照细胞的培养物的培养基中不存在IL13结合活性。图21中的条2 (中间)表明，在得自仅表达IL13Rα2TF-Fc蛋白的细胞的培养物的培养基中检测到一些低水平的IL13结合活性。相反，如在图21的条3(最右侧)中所示，在共表达IL13Rα2TF-Fc和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞的培养物的培养基中存在显著水平的人IL13结合活性。结果表明，在培养用培养基中以增强的水平以未修饰的排列表达的IL13Rα2TF-Fc靶蛋白保留它的IL13结合活性。
图22显示的实验结果证实了当以未修饰的排列与BSC1-蛋白G融合蛋白共表达时，分泌进培养用培养基中的因子VII (FVII)-Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达水平显著增强，所述BSC1-蛋白G融合蛋白包含与蛋白G连接的多肽3-29 (IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例14中所述。图22A显示了关于FVII-Fc融合蛋白的表达(上图)的蛋白质印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述FVII-Fc融合蛋白分泌进表达单独FVII-Fc融合蛋白(泳道2)的转染的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达FVII-Fc融合蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白(泳道3)的转染的细胞的培养物的培养基中。泳道1显示了无表达细胞培养物培养基作为对照。使用抗-Flag抗体分别检测细胞裂解物中的BSC1-蛋白G (中图)和分泌型BSC1-蛋白G (下图)。图22B提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图22A的上图中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图22B中的条形图1、2和3对应于图22A的上图的泳道1、2和3的信号。结果表明，与在没有BSC1-蛋白G融合蛋白存在下表达的靶蛋白的表达水平相比，FVII-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白的共表达显著升高分泌进培养用培养基中的FVII-Fc靶蛋白的表达水平。另外，BSC1-蛋白G融合蛋白没有分泌，而是保留在细胞中。将BSC1-蛋白G融合蛋白细胞裂解物的表达(图22A的中图)与培养基中的表达(图22A的下图)进行对比。
图23显示的实验结果证实了在有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下因子IX (FIX)-Fc融合蛋白(FIX-Fc)靶蛋白的表达水平的提高，所述BSC1-蛋白A融合蛋白包含与蛋白A连接的多肽3-29 (IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例15中所述。图23A显示了关于FIX-Fc融合蛋白的表达的蛋白质印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述FIX-Fc融合蛋白分泌进表达表达单独FIX-Fc融合蛋白(第2行)的转染的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达FIX-Fc融合蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白(第3行)的转染的细胞的培养物的培养基中。第1行显示了无表达细胞培养物培养基作为对照。图23B提供了使用NIH ImageJ图像处理程序对图23A的上图中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图23B中的条形图1、2和3对应于图23A的第1、2和3行的信号。结果表明，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，FIX-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著升高分泌进培养用培养基中的FIX-Fc靶蛋白的表达水平。
图24提供了一系列实验的结果，其证实当以未修饰的排列与BSC1-蛋白G融合蛋白共表达时，因子VIII (FVIII)-Fc融合蛋白(FVIII-Fc)的表达水平的显著增强，所述BSC1-蛋白G融合蛋白包含与蛋白G连接的多肽3-29 (IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例16中所述。从共表达FVIII-Fc融合蛋白(靶蛋白)和BSC1-蛋白G融合蛋白的转染的HEK293细胞或表达单独FVIII-Fc融合蛋白的细胞的培养物收获培养基。通过ELISA (VisuLizeTM FVIII Antigen Kit, Affinity Biologicals Inc.)测定培养基的FVIII活性。将其中转染了空载体的细胞培养物培养基用作阴性对照(从左侧第一条)。从左侧第二条显示，在得自表达单独FVIII-Fc靶蛋白的细胞的培养基中没有检测到FVIII。从左侧第三条表明，显著水平的FVIII-Fc靶蛋白分泌进共表达FVIII-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白的细胞的培养基中。人血清用作阳性对照(从左侧最后一个条)。结果表明，与在没有BSC1-蛋白G融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，FVIII-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白的共表达显著升高分泌进培养用培养基中的FVIII-Fc靶蛋白的表达水平。
图25显示的实验结果证实了当以未修饰的排列与BSC1-蛋白A共表达时，分泌进培养用培养基中的抗-IL8抗体(靶蛋白)的提高的表达水平，所述BSC1-蛋白A包含与蛋白A连接的3-29多肽(IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例17中所述。图25A显示了关于抗-IL8抗体(靶蛋白)的表达的斑点印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述抗-IL8抗体分泌进表达单独抗-IL8抗体(第2行)的转染的细胞的培养物的培养基中和分泌进共表达抗-IL8抗体和a BSC1-蛋白A融合蛋白(第3行, BSC1-蛋白A)的细胞的培养物的培养基中。使用抗-人IgG抗体，在斑点印迹测定中分析培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(无抗-IL8抗体, 第1行)。可以看出，与在表达单独抗-IL8抗体的转染的细胞中表达的抗体水平相比，抗-IL8抗体与BSC1-蛋白A融合蛋白在转染的细胞中的共表达(第3行)显著增强分泌进培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达水平(第2行)。
图25B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图25A的每行中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图25B的条的编号对应于图25A的行编号。该系列实验的结果清楚地显示，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下抗体的表达水平相比，靶向的抗-IL8抗体与BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌的抗-IL8抗体的表达。
图25C显示了ELISA的结果的条形图，所述ELISA用于检测表达的抗-IL8抗体(靶蛋白)的IL8结合活性。将96-孔板用重组的纯化的人IL8包被，并与抗-IL8抗体(靶蛋白)一起温育，所述抗-IL8抗体分泌进表达单独抗-IL8抗体(条形图2)或共表达抗-IL8抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白(条形图3, BSC1-蛋白A)的转染的细胞的培养物的培养基中。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(无抗-IL8抗体, 条形图1)。该系列实验的结果清楚地显示，以增强的水平表达且分泌进培养用培养基中的抗-IL8抗体保留它对人IL8的结合活性，从而指示抗体的适当构象。
图26显示了一系列实验的结果，其证实当与BSC1-蛋白A融合体共表达时，抗-VEGF抗体贝伐珠单抗的表达水平的显著增强，所述BSC1-蛋白A融合体包含与蛋白A连接的3-29多肽(IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例18中所述。图26A显示了关于抗-VEGF抗体的表达的斑点印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述抗-VEGF抗体分泌进表达单独抗-VEGF抗体(第2行)或共表达抗-VEGF抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白(第3行)的转染的细胞的培养物的培养基中。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(无抗-VEGF抗体，第1行)。使用抗-人IgG抗体在斑点印迹测定中分析培养用培养基中的抗-VEGF抗体的表达。可以看出，与表达单独抗-VEGF抗体的转染的细胞中表达的抗体的水平(第2行)相比，抗-VEGF抗体与BSC1-蛋白A融合蛋白在转染的细胞中的共表达(第3行)显著增强分泌进培养用培养基中的抗-VEGF抗体的表达水平。
图26B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图26A中的每一行中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图26B中的条形图的编号对应于图26A中的行编号。结果清楚地显示，与单独表达的抗体的水平相比，抗-VEGF抗体与BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌的抗-VEGF抗体的表达。
图26C显示了ELISA的结果，所述ELISA用于检测在转染的细胞的培养物的培养基中表达的抗-VEGF抗体的VEGF结合。将96-孔板用重组的纯化的人VEGF-A包被，并与抗-VEGF抗体(靶蛋白)一起温育，所述抗-VEGF抗体分泌进表达单独抗-VEGF抗体(条形图2)或共表达抗-VEGF抗体和本发明的BSC1-蛋白融合蛋白(条形图3)的转染的细胞的培养物的培养基中。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(无抗-VEGF抗体, 条形图1)。该系列实验的结果清楚地显示，以增强的水平表达且分泌进培养用培养基中的抗-VEGF抗体保留它对人VEGF-A的结合活性，从而指示分泌的抗体的适当构象。
图27显示了一系列实验的结果，其证实当与BSC1-蛋白A融合体共表达时，治疗性的抗-TNFα抗体阿达木单抗(Humira®, AbbVie)的表达水平的显著增强，所述BSC1-蛋白A融合体包含与蛋白A连接的3-29多肽(IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例19中所述。图27A显示了关于抗-TNFα抗体的表达的斑点印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述抗-TNFα抗体分泌进表达单独抗-TNFα抗体(第2行)或共表达抗-TNFα抗体和BSC1-蛋白A融合体(第3行)的转染的细胞的培养物的培养基中。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(第1行，无抗-TNFα抗体)。使用抗-人IgG抗体在斑点印迹测定中分析培养用培养基中的抗-TNFα抗体的表达。可以看出，与表达单独抗-TNFα抗体的转染的细胞中表达的抗体水平(中间)相比，抗-TNFα抗体与BSC1-蛋白A融合蛋白在转染的细胞中的共表达(底行)显著增强分泌进培养用培养基中的抗-TNFα抗体的表达水平。
图27B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图27A的每一行中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图27B的条形图的编号对应于图27A的行编号。该系列实验的结果清楚地显示，抗-TNFα抗体(靶蛋白)与BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌的抗-TNFα抗体的表达。
图27C显示了ELISA的结果，所述ELISA用于检测在转染的细胞的培养物的培养基中表达的抗- TNFα抗体的TNFα结合活性。将96-孔板用重组的纯化的人TNFα包被，并与抗-TNFα抗体(靶蛋白)一起温育，所述抗-TNFα抗体分泌进表达单独抗-TNFα抗体(条形图2)的转染的细胞的培养物的培养基中或共表达抗-TNFα抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白(条形图3)的细胞的培养物的培养基中。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(条形图1)。该系列实验的结果清楚地显示，以增强的水平表达且分泌进培养用培养基中的抗-TNFα抗体保留它对人TNFα的结合活性，从而指示分泌的抗体的适当构象。
图28提供的结果证实，当与BSC1-蛋白A融合体共表达时，可以增强在建立的商业上相关的细胞系中已经稳定地生产的蛋白的表达水平，所述BSC1-蛋白A融合体包含与蛋白A连接的3-29多肽(IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)，如在实施例20中所述。图28A显示了关于抗-IL8抗体(靶蛋白)的表达的斑点印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述抗-IL8抗体分泌进以下细胞的培养物的培养基中：表达单独抗-IL8抗体(第2行)的CHO-DP12细胞系(登记号CRL-124444, 美国典型培养物保藏中心, Manassas, Virginia)的细胞，和共表达抗-IL8抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白(第3行)的转染的细胞。可以看出，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下表达的抗体水平(第2行)相比，所述抗体与BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗体的表达水平(第3行)。第1行是对照(仅培养基)。图28B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图28A的行中的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果，显示在图28B的各个条形图中。结果指示，所述抗体与BSC1-蛋白A融合体分子的共表达(条形图3)显著增强分泌的抗体的表达，从而提供与在没有BSC1-蛋白A融合体分子存在下表达抗体所得到的表达水平相比大了大约4-5倍的表达水平增强(条形图2)。
图28C显示了ELISA的结果，所述ELISA用于检测在转染的细胞的培养物的培养基中表达的抗-IL8抗体的IL8结合活性。将96-孔板用重组的纯化的人IL8包被，并与抗-IL8抗体(靶蛋白)一起温育，所述抗-IL8抗体分泌进稳定地表达单独抗-IL8抗体(条形图2)或共表达抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白(条形图3)的培养物的培养基中。使用培养用培养基作为阴性对照(条形图1，无IL8结合活性)。该系列实验的结果清楚地显示，以增强的水平分泌进培养用培养基中的抗-IL8抗体保留它对人IL8的结合活性，从而指示分泌的抗体的适当构象。
图29提供了在实施例21中描述的实验的结果，其指示本发明的增强蛋白表达的多肽可以用于治疗由不会折叠成它的适当构象的突变蛋白造成的疾病。图29A显示了关于包含野生型α1-抗胰蛋白酶(AAT)或突变体α1-抗胰蛋白酶的融合蛋白的表达的蛋白质印迹测定的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述突变体α1-抗胰蛋白酶含有与得自人IgG的Fc结构域连接的Z突变(AATZ，其中在密码子342处的Glu被Lys替代)，共表达或不共表达包含与蛋白A连接的3-29多肽(IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)的BSC1-蛋白A。图29的上图显示了以下细胞的培养物的培养基中的Fc融合蛋白的表达：表达单独AAT-Fc融合蛋白(泳道2, 从左侧)的转染的细胞，表达单独AATZ-Fc融合蛋白(泳道3, 从左侧)的转染的细胞，和共表达AATZ-Fc融合蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白(泳道4, 从左侧)的转染的细胞。泳道1显示了无表达细胞培养物培养基作为对照。显然，没有AATZ-Fc融合蛋白分泌进表达单独AATZ-Fc融合蛋白(泳道3, 从左侧)的细胞的培养物的培养基中。如在图29的中图(细胞裂解物)中所示，关于表达单独AATZ-Fc融合蛋白的细胞，AATZ-Fc融合蛋白保留在细胞中(泳道3，从左侧)，据推测位于内质网中，如关于未融合的AATZ蛋白已知的。相反，AATZ-Fc融合蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的AATZ-Fc融合蛋白的水平，如在图29的上图(培养基)的泳道4 (从左侧)中所示。此外，如在图29的中图(细胞裂解物)的泳道4 (从左侧)中所示，基本上没有AATZ-Fc融合蛋白保留在细胞中。对于图29中的负载对照(下图)，用抗-微管蛋白抗体印迹相同膜。结果表明，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著升高分泌进培养用培养基中的AATZ-Fc靶蛋白的水平，基本上没有AATZ-Fc保留在细胞中。
具体实施方式
本发明提供了用于增强目标靶蛋白的表达水平的新多肽家族。本发明是基于下述发现：当以两种排列中的任一种与增强蛋白表达的多肽一起在宿主细胞中共表达时，可以以显著更高的水平和在适当细胞位置或细胞外位置表达目标靶蛋白，所述增强蛋白表达的多肽包含：
J蛋白的分离的J结构域，
J结构域的增强蛋白表达的多肽片段，或
包含下式的增强蛋白表达的J结构域类似物多肽：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或甲硫氨酸(M)；
X2和X3各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，至少一个是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X4是任意氨基酸；或者当X1至X3存在且X5至X9存在时，X4可以不存在；
X5是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
X6和X7各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，至少一个是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者当X6和X7之一是K或R时且当X1至X5存在且X8至X9存在时，X6和X7中的另一个可以不存在；且
X8和X9是任意氨基酸，前提条件是，至少一个是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；或者，当X8和X9的一个是L或A时且当X1至X7存在时，X8和X9的另一个可以不存在。
本发明的增强蛋白表达的多肽可以以两种排列中的任一种用于增强宿主细胞对目标靶蛋白的表达。在“修饰的”排列中，融合蛋白包含与目标靶蛋白连接(融合)的增强蛋白表达的多肽。所述融合蛋白因而是“修饰的”靶蛋白，其充当目标靶蛋白的功能替代物，且与单独的未修饰的靶蛋白的表达水平相比以增强的水平被宿主细胞表达。在“未修饰的”排列中，融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的、本发明的增强蛋白表达的多肽，所述结构域对常规的“未修饰的”目标靶蛋白具有亲和力且与其结合，其中与在没有根据本发明的结合靶蛋白的融合蛋白存在下的表达水平相比，所述融合蛋白和所述目标靶蛋白在宿主细胞中的共表达会增强未修饰的靶蛋白的表达。根据本发明，处于修饰的排列和未修饰的排列的蛋白表达的增强水平包括各种修饰的或未修饰的目标靶蛋白在所述目标靶蛋白的适当位置(细胞的或细胞外的)中的表达。
因此，本发明提供了当在细胞中不能表达期望量的内源或异源(重组)目标蛋白时的技术解决方案。本发明也提供了用于治疗个体的疾病或障碍的组合物和方法，在所述疾病或障碍中不能在体内表达足够水平的功能蛋白，其中蛋白或其功能形式的不足表达会导致病理学状态。在其中已经证实或暗示不适当地折叠的蛋白物质的疾病的例子包括、但不限于朊病毒相关的疾病(传播性海绵状脑病)、阿尔茨海默氏病；帕金森病；亨廷顿病；和囊性纤维化(CF)。
为了更清楚地描述本发明，以下术语的注解和定义适用。
除非在本文中另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。所述术语的含义和范围应当是清楚的；但是，如果有任何潜在歧义，本文中提供的定义优先于任何词典或外来定义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。在本申请中，术语“或”的应用是指“和/或”，除非另外说明。此外，术语“包括（including）”以及其它形式的使用，例如“包括（includes）”和“包括（included）”，不是限制性的。
通常，本文描述的蛋白和核酸化学(包括重组核酸和聚合酶链式反应(PCR)的方法)、细胞和组织培养、分子生物学、遗传学、微生物学、生物化学、蛋白组学、药理学和药物科学的技术以及结合它们使用的命名法是本领域众所周知和常用的那些。通常根据本领域中的常规方法且如在本领域中可得到的各种一般参考文献和更具体的参考文献所述，执行本发明的方法和技术。如本领域中通常实现的或如本文中所述的，根据本领域中（包括在实验室技术手册和生产商的说明书中）可得到的方案，执行测定和纯化技术。
除非另外指出，当术语“约”和“大约”与量、数目或值组合使用时，那么该组合描述了列举的单独量、数目或值以及所述量、数目或值加或减该量、数目或值的10%。作为例子，短语“约40%”和“大约40%”公开了“40%”和“从36%至44%，包括端点”。
术语“目标靶蛋白”、“靶蛋白”或“目标蛋白”表示需要或希望在它的预期细胞的(包括细胞内的和膜相关的)或细胞外的(分泌的)位置增强表达水平的任何蛋白。
如在“分离的分子”(例如，“分离的蛋白”或“分离的核酸”)中，术语“分离的”是这样的分子，其由于它的起源或衍生来源：它不伴有在它的天然状态伴随它的天然地伴随的组分；基本上不含有得自相同物种的其它种类的分子；由得自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因而，化学合成的或在不同于它的天然来源细胞的细胞系统中合成的蛋白或核酸分子将与它的天然地伴随的组分“分离”。通过分别使用本领域众所周知的蛋白或核酸纯化技术分离，也可以使得蛋白或核酸分子基本上不含有天然地伴随的组分。
本文中使用的术语“载体”意图表示能够运输它已经连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，它表示在其中可以插入额外核酸区段的圆形双链核酸(通常，DNA)环。另一类载体是病毒载体，其中可以将额外DNA区段插入病毒基因组内。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞的基因组内，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称作“重组表达载体”（或简单地称作“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意图包括其它形式的表达载体，例如起等价功能或可比较功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒衍生的载体和腺病毒衍生的病毒)。
术语“可操作地连接”表示，所述组分的并列连接，其中所述组分处于允许它们以它们的预期方式起作用的关系。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接：在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列可以包括与目标基因邻接的表达控制序列和以顺式起作用或在一定距离起作用以控制目标基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”表示这样的多核苷酸序列：其是实现其所连接的编码序列的表达和加工所必需的。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白分泌的序列。所述控制序列的性质因宿主生物体而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括其存在对于表达和加工而言是必需的组分，并且还可以包括其存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。除非另外说明，否则本文中将编码本发明的融合蛋白的核酸分子插入表达载体中的描述或陈述是指，当将含有插入的核酸分子的表达载体引入适合的宿主细胞或适合的生物细胞中时，插入的核酸还已经在所述载体内与编码的融合蛋白的表达所需的功能性启动子和其它转录和翻译控制元件可操作地连接。
当用作形容词时，本文中使用的术语“重组的”描述了通过操作分离的核酸(通常是DNA)和转染宿主细胞、或通过操作内源核酸以通过非内源核酸的引入改变表达，非天然地改变的或操作的核酸、用外源核酸转染的宿主细胞、或非天然地表达的多肽。“重组体”是具体地包括已经使用基因工程技术在体外构建的DNA分子的术语，且术语“重组的”作为形容词用于描述这样的分子、构建体、载体、细胞、蛋白、多肽、肽或多核苷酸：其特别排除处于它们各自的、未分离的、天然位置(例如，细胞内、组织或器官位置)的天然存在的(“内源性”)这类分子、构建体、载体、细胞、蛋白、多肽、肽和多核苷酸。
本文中使用的术语“重组宿主细胞”(或在上下文中简称“宿主细胞”)意图表示其中已经引入外源核酸的细胞。应该理解，所述术语不仅用来指特定的主题细胞而且指所述细胞的子代。因为由于突变或者环境影响而造成某些修饰可能在继代中存在，实际上所述子代可能不同于亲本细胞，但仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在本发明的不同方面有用的宿主细胞可以是原核和真核细胞。优选的原核宿主细胞包括多种细菌细胞，包括大肠杆菌（Escherichia coli）。尽管与本发明有关的核酸或编码的多肽的有些操作、构建、表达或复制可以使用原核或真核宿主细胞进行，对于目标靶蛋白（无论是处于本文描述的修饰的排列还是未修饰的排列）的增强的表达而言优选的宿主细胞是真核宿主细胞。优选的真核宿主细胞包括、但不限于，哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。优选地，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚胎肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞或MDCK细胞。优选的真菌宿主细胞包括曲霉菌属、脉孢菌属、酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、子囊菌酵母属和假丝酵母属。一种特别优选的酵母属宿主细胞是酿酒酵母细胞。一种特别优选的昆虫宿主细胞是Sf9细胞。
术语“异源的”和“外源的”是同义的，且作为形容词广泛地用于描述含有或表达分子的宿主细胞的非天然的任何分子(例如，蛋白、多肽、核酸)。因此，“异源的”和“外源的”包括如上定义的术语“重组的”。
本领域已知的和本文中使用的“转基因的生物体”表示具有含有转基因的细胞的生物体，其中引入生物体(或生物体的祖先)中的转基因表达这样的多肽：所述多肽在所述生物体中天然地不表达或不以给所述生物体提供所述多肽的预期功能的正常或适当水平天然地表达。“转基因”是这样的核酸构建体：其稳定地和可操作地整合进用于形成转基因生物体的细胞的基因组中，指导编码的基因产物在转基因生物体的一个或多个细胞类型或组织中表达。
术语“疾病”和“障碍”互换地用于指示根据本领域中可接受的医学标准和实践鉴别的病理学状态。
本文中使用的术语“有效量”表示这样的治疗量：其足以减轻或改善疾病或其一种或多种征状的严重程度和/或持续时间；预防有害或病理学状态的进展；造成病理学状态的消退；预防与病理学状态有关的一种或多种征状的复发、发展、发作或进展；检测障碍；或增强或改善治疗的预防或治疗效果(例如，另一种预防剂或治疗剂的施用)。
本文中使用的“生物样品”包括、但不限于得自活生物体或以前的活生物体的任意量的物质。这样的生物体包括、但不限于人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猴、狗、兔、反刍类动物和其它动物。这样的生物样品的物质可以包括、但不限于血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、粘液、滑液、奶、精液、细胞、器官(例如、心脏、脾、肺、肾、乳房、脑、眼、舌、胃、胰腺、肠、胆囊、生殖器官、盲肠)、组织(例如，骨、软骨、肌肉、皮肤)、骨髓和淋巴结。
本文描述为“包含”(或其“包含”)一个或多个提及的元件或步骤的组合物或方法是末端开放的，这意味着，提及的元件或步骤是必需的，但是在组合物或方法的范围内可以加入其它元件或步骤。为了避免冗长，还应当理解，被描述为“包含”(或其“包含”)一个或多个提及的元件或步骤的任何组合物或方法也描述了“基本上由相同提及的元件或步骤组成”(或其“基本上由它们组成”)的对应的、更有限的、组合物或方法，这意味着，所述组合物或方法包括提及的必需元件或步骤，且也可以包括不会实质上影响组合物或方法的基础和新颖特征的额外元件或步骤。还应当理解，本文描述为“包含”一个或多个提及的元件或步骤或“基本上由它们组成”的任何组合物或方法也描述了“由提及的元件或步骤组成”(或其“由它们组成”)的对应的、更有限的和末端封闭的组合物或方法，以排除任意其它未提及的元件或步骤。
本文中使用的术语“J结构域类似物”表示增强靶蛋白表达的多肽(或PEEP)，其包含式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。在掺入靶蛋白序列以形成修饰的靶蛋白的情况下或当用于构建增强蛋白表达的多肽-靶蛋白结合结构域融合蛋白时，这样的多肽可用于实现目标靶蛋白表达的增加。
术语“J结构域活性片段”或“J结构域的活性片段”表示这样的J蛋白的J结构域的片段：当以本文描述的两种类型的融合蛋白(PEEP/靶蛋白融合体或PEEP/靶蛋白结合结构域融合体)使用时，所述片段保留增加靶蛋白的表达水平的能力。下面的实施例指示，J结构域活性片段通常保留在α螺旋II的C-端末端处的J结构域区域。J结构域的较大部分同样可以是有活性的，但是α螺旋II的C-端9个氨基酸中的全部或部分的切除常常导致蛋白表达增强活性的丧失。
在本文公开的任意组合物或方法中，任何提及的必需元件或步骤的已知或公开等同物可以替换该元件或步骤。
除非特别指出，组合物或方法不受列出的元件或步骤的任何特定次序限制，除非特定方法步骤要求另一个步骤的在先执行。
还应当理解，“选自……”或“……中的任一个”(或等同短语)的元件或步骤表示在后面的列表中的一个或多个元件或步骤，包括任意两个或更多个列出的元件或步骤的组合。
在本发明中有用的 J 结构域
已经确定了多种J蛋白的J结构域。参见，例如，Kampinga等人, Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)；Hennessy等人, Protein Science,14:1697-1709 (2005)。可用于制备本发明的融合蛋白(无论处于修饰的排列还是未修饰的排列)的J结构域具有J蛋白家族的任何成员的J结构域的关键定义特征。因此，在本发明中有用的分离的J结构域包含得自J蛋白的多肽结构域，其特征在于4个α-螺旋(I、II、III、IV)且经常具有在螺旋II和III之间的高度保守的组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸的三肽序列(被称作“HPD基序”)。通常，J蛋白的J结构域的长度是在50至70个氨基酸之间，且认为J结构域与Hsp70-ATP伴侣蛋白质的相互作用(结合)位点是从螺旋II内延伸的区域，且包括HPD基序。代表性的J结构域包括、但不限于Erdj蛋白的J结构域(例如，ERdj3或ERdj5的J结构域)、SV40的大T抗原的J结构域、和哺乳动物半胱氨酸串联蛋白(CSP-α)的J结构域。在本发明的融合蛋白中可以使用的这些和其它J结构域的氨基酸序列提供在表1中。
表1. 代表性的分离的J结构域的氨基酸序列。
具有增强蛋白表达的活性的 J 结构域片段和类似物
使用序列分析（包括氨基端和羧基端缺失分析）的J结构域的进一步研究揭示，仅需要J结构域的相对小部分即可提供蛋白表达增强活性。令人惊奇地，所述分析确定，根据本发明的蛋白表达增强活性可以由从J结构域内分离的多肽片段提供，且其由少至9或10个氨基酸组成。参见，下文实施例10和11。与分离的J结构域一样，这样的J结构域多肽片段可以用在本文描述的方法和组合物中以增强目标靶蛋白在它的预期细胞的(细胞内的、膜相关的)或细胞外的(分泌的)位置中的表达。各个J结构域多肽片段在氨基酸序列上不都相同，但是除了以本文描述的修饰的排列或未修饰的排列提供蛋白表达增强活性以外还可能共有一些序列同源性和结构特征。
上述J结构域多肽片段的进一步缺失和置换突变分析提供了用于定义具有靶蛋白表达增强活性的J结构域类似物多肽的新家族的结构式的基础。该类似物多肽家族的成员包含8-9个氨基酸，其包括一些J结构域多肽片段以及以前在J结构域的当前文库中没有鉴别出的多肽。参见，实施例11。
J结构域多肽片段和J结构域类似物多肽相对于完整(全长) J结构域的更小尺寸，减小可以以本发明的修饰的排列和未修饰的排列构建和表达的、用于增强目标靶蛋白的表达的融合蛋白的大小。因而，编码这样的融合蛋白的重组核酸分子的大小可以相应地小于编码包含完整J结构域的融合蛋白的核酸分子。本发明的J结构域多肽片段和J结构域类似物多肽的相对小尺寸可以特别有益地降低修饰的排列的融合蛋白的免疫原性，其中将增强蛋白表达的多肽与目标靶蛋白连接(融合)以形成修饰的(融合)靶蛋白，其替代(未连接的)目标靶蛋白在对象中表达或者施用给对象。融合蛋白的免疫原性越低，融合蛋白可以在对象中持续的可能性越大，以便给对象提供融合蛋白的有益性能或作用，而不会被针对融合蛋白的免疫应答快速消除或抑制。
包含增强蛋白表达的多肽的融合蛋白
根据本发明，将本文描述的增强蛋白表达的多肽用作需要改善其在宿主细胞中的表达的、增强目标靶蛋白的表达的融合蛋白的组分。使用增强蛋白表达的多肽增强处于两种排列中的任一种的目标靶蛋白的表达，所述排列描述了表达的目标靶蛋白的一级结构(氨基酸序列)。
在用于增强蛋白表达的“修饰的”排列中，将增强蛋白表达的多肽与目标靶蛋白连接以形成融合蛋白，即，“修饰的”目标靶蛋白，其表达水平强于在没有增强蛋白表达的多肽存在下较差地表达的未修饰的靶蛋白的表达水平。因而，处于修饰的排列的融合蛋白是作为替代物表达和使用的目标靶蛋白的修饰形式，所述替代物替代较差地表达的未修饰的靶蛋白。
在用于增强蛋白表达的“未修饰的”排列中，目标靶蛋白的一级结构保持未改变(“未修饰”)，因为它没有与增强蛋白表达的多肽融合。本发明的增强蛋白表达的多肽与靶蛋白结合结构域连接，所述靶蛋白结合结构域对目标靶蛋白具有亲和力且与其结合。融合蛋白和未修饰的目标靶蛋白在宿主细胞中的共表达会导致目标靶蛋白与在没有结合靶蛋白的融合蛋白存在下的表达水平相比增强的表达水平。
由于目标靶蛋白的一级结构(氨基酸序列)在未修饰的排列中保持没有改变(没有连接在融合蛋白中)，对于许多应用而言，用于增强蛋白表达的未修饰的排列可能优于修饰的排列。但是，如下面解释的，也可能工程改造修饰的排列的融合蛋白，使得融合蛋白的增强蛋白表达的多肽组分被容易地切割以释放包含靶蛋白的原始氨基酸序列的靶蛋白组分，其不具有或仅具有几个得自融合蛋白的额外残余氨基酸。对于某些应用而言，这样的融合蛋白可能比未修饰的靶蛋白更合适的。
尽管使用直接合成(例如，固相肽合成、溶液相合成等)可能以任一种排列合成融合蛋白，但是在大多数情况下，使用标准的重组核酸技术（包括聚合酶链式反应(PCR)技术）以及细胞培养方法或转基因的方法可能更经济地生产本文描述的融合蛋白。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、细胞的转染(例如，但不限于，电穿孔、脂质体介导的转染、转化方法)和表达本发明的融合蛋白的细胞和组织培养方法。如本领域中通常实现的，如在生产商的说明书中所述或如本文中所述，可以执行酶反应和纯化技术。通常可以根据本领域众所周知的常规方法和如在贯穿本说明书引用和讨论的各种一般参考文献和更具体的参考文献中所述，执行前述技术和规程。参见例如，Sambrook等人, 编, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)和Ausubel等人(编), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 2012)，它们通过引用并入本文。
如上面所指出的，术语“修饰的”和“未修饰的”表示目标靶蛋白与或不与增强蛋白表达的多肽连接。应当理解，在修饰的排列和未修饰的排列的某些实施方案中，可能有益的是，将一个或多个额外结构域与融合蛋白或目标靶蛋白连接。例如，众所周知的表位标签肽(表位标签)中的任一种可以掺入蛋白中以促进表达的蛋白的检测和/或纯化。这样的表位标签包括、但不限于V5表位标签(GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO:110))、Flag表位标签(DYKDDDDK (SEQ ID NO:111))、六组氨酸表位标签(HHHHHH (SEQ ID NO:112))、血凝素表位标签(YPYDVPDYA (SEQ ID NO:113))、c-myc表位标签(EQKLISEEDL (SEQ ID NO:114))、VSV-G表位标签(YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO:115))和HSV表位标签(QPELAPEDPED (SEQ ID NO:116))。如下面解释的，也可能使用接头将蛋白与这样的表位标签连接，所述接头可以被蛋白水解酶切割且由此从蛋白除去(或基本上除去)。
接头
通过本领域已知的方法，可以将任何结构域连接至本发明的融合蛋白内的另一个结构域。例如，在本发明的修饰的排列中，融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽。因此，表达的融合蛋白是可以用作未融合的和较差表达的目标靶蛋白的替代物的修饰的靶蛋白。增强蛋白表达的多肽可以与目标靶蛋白直接连接或经由接头分子间接连接。在本发明的未修饰的排列中，融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽，所述靶蛋白结合结构域对目标靶蛋白具有亲和力且与其结合。与在没有融合蛋白存在下的表达水平相比，融合蛋白与目标靶蛋白的共表达会增强未修饰的(未融合的)目标靶蛋白的表达水平。增强蛋白表达的多肽可以与靶蛋白结合结构域直接连接或经由接头分子间接连接。其它结构域也可以连接至处于修饰的排列和未修饰的排列的融合蛋白或未融合蛋白，以提供一种或多种额外特征。例如，表位标签可以连接至融合蛋白或未融合蛋白以促进标记的蛋白的检测或纯化。
在氨基酸水平，接头可以是一个或多个氨基酸，包括1-10个氨基酸、1-20个氨基酸和甚至1-50个氨基酸。通常，关于将增强蛋白表达的多肽连接至目标靶蛋白(处于修饰的排列)或连接至靶蛋白结合结构域(处于未修饰的排列)，不一定使用超过20个氨基酸的接头，因为将增强蛋白表达的多肽直接连接至目标靶蛋白或连接至靶蛋白结合结构域似乎不会显著减小目标蛋白或靶蛋白结合结构域的必要生化和功能性能(数据未显示)。
选择一个或多个接头以产生根据本发明的融合蛋白是在本领域的知识和技能范围内。参见，例如，Arai等人, Protein Eng., 14(8): 529-532 (2001); Crasto等人, Protein Eng., 13(5): 309-314 (2000); George等人, Protein Eng., 15(11): 871-879 (2003); Robinson等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5929-5934 (1998)。关于使用特定接头将增强蛋白表达的多肽连接至目标靶蛋白或连接至靶蛋白结合结构域的一般考虑可以包括在制备其它融合蛋白（其中将一个功能结构域连接至另一个功能结构域）中的那些考虑，例如，如在以多种形式连接免疫球蛋白可变结构域和/或恒定结构域从而产生经工程改造的功能性结合蛋白中可能考虑的。显然，接头不应当干扰与增强蛋白表达的多肽连接的目标靶蛋白或靶蛋白结合结构域的折叠。如果接头存在于融合蛋白中的话，选择接头以优化增强蛋白表达的多肽的增加处于修饰的排列的融合蛋白或处于未修饰的排列的(未融合的)目标靶蛋白的表达水平或收率的贡献，且如果增强蛋白表达的多肽与目标靶蛋白或靶蛋白结合结构域的直接连接会实现期望的增强的表达水平，则可以省略接头。存在于本发明的融合蛋白中的接头分子可以包含一个或多个由核苷酸序列编码的氨基酸，所述核苷酸序列存在于表达载体的克隆位点内部或附近的核酸区段上，在所述表达载体中在框架内插入了编码蛋白结构域(例如，增强蛋白表达的多肽、目标蛋白、靶蛋白结合结构域)或整个融合蛋白的核酸区段。
接头分子（特别是4个氨基酸和更长的那些）优选地具有允许目标蛋白折叠成它的适当构象的弹性。多种相对柔性的接头在本领域中已知用于连接功能结构域。接头也可以用于将一个或多个额外结构域（诸如表位标签）连接至本发明的融合蛋白的增强蛋白表达的多肽或目标蛋白。可以用于制备根据本发明的融合蛋白的接头包括、但不限于：
。
在某些实施方案中，融合蛋白可以含有一个或多个可以被一种或多种蛋白酶切割的接头。这样的接头具有被蛋白酶识别的氨基酸序列，所述蛋白酶用于在识别序列处或附近切割蛋白。将一个或多个可切割的接头分子掺入融合蛋白中，会提供从表达的融合蛋白除去一个或多个结构域的选择。作为非限制性例子，在某些应用或制备中，可能合乎需要的是，除去与目标蛋白连接的增强多肽表达的多肽(例如，以降低潜在免疫原性)和/或除去已经掺入融合蛋白中以促进表达的融合蛋白的检测或纯化的表位标签。在另一个实施例中，如果分泌融合蛋白，通过向表达融合蛋白的培养物的培养基中直接添加适当的蛋白酶，可以除去通过可切割的接头与目标蛋白连接的增强多肽表达的多肽(或其它结构域)。可替换地，在执行一个或多个从培养用培养基纯化融合蛋白的步骤以后，可以除去通过可切割的接头连接的增强蛋白表达的多肽(或其它结构域)。
在某些情形中可能有用的是，除去与蛋白连接的结构域或表位标签。这可以如下完成：例如，在细胞中表达包含额外结构域或标签的蛋白，在所述细胞中调节可以切割蛋白接头的蛋白酶的表达，诸如在所述细胞中掺入在启动子控制下的适当蛋白酶的重组基因，所述启动子可以由在所述细胞已经表达融合蛋白以后可以施加于培养物的信号(例如，温度转换)或试剂(离子变化)调节。本领域中可得到多种用于调节原核或真核细胞中的基因表达的启动子。另外，有些细胞表达一种或多种可以切割含有对应的切割位点的接头分子的蛋白酶。确定可由宿主细胞表达的蛋白酶的应用是否可以用于切割由相同宿主细胞表达的融合蛋白中的接头，是在本领域从业人员的技能范围内。可替换地，可能将适当的蛋白酶加入样品（诸如培养用培养基或细胞裂解物）中，所述样品含有经由蛋白酶可切割的接头与额外结构域或标签连接的蛋白。
多种含有蛋白水解性切割位点的接头分子是本领域中已知的且可用于将一种蛋白或蛋白结构域与另一种蛋白或蛋白结构域连接。这样的接头包括、但不限于下述例子中的一种或多种，其中星号(*)指示蛋白水解性切割位点：
。
本领域已知多种可以用于切割在本发明的蛋白中采用的可切割的接头的蛋白水解酶。显然，被选择的切割包含目标靶蛋白的融合蛋白中的可切割的接头的蛋白酶不应当也切割在接头切割以后希望保留的目标靶蛋白或任意其它结构域。可以用于在融合蛋白内的接头中的位点处切割融合蛋白的蛋白水解酶包括、但不限于：肠激酶、因子Xa、凝血酶、PreScission、烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、锌依赖性的内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、沙雷氏菌溶素、虾红素、蛇毒金属蛋白酶(adamalysin)、解聚素、ADAM、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶(cathespsin)、钙蛋白酶等。
编码融合蛋白的核酸
使用本领域中可得到的标准方法，构建编码融合蛋白的核酸(通常是DNA)分子，所述融合蛋白以修饰的排列或未修饰的排列用于增强目标靶蛋白的表达。一个或多个额外结构域也可以掺入蛋白中，诸如用于促进蛋白的检测和/或纯化的标准表位标签。可以将编码期望的融合蛋白的核酸分子插入本领域中可得到的多种用于复制融合蛋白的重组结构基因的目的的克隆载体中的任一种中。为了表达融合蛋白，可以将编码融合蛋白的核酸分子插入本领域中可得到的多种表达载体中的任一种中。然后将具有编码融合蛋白的插入核酸的表达载体引入允许从表达载体表达融合蛋白的适合宿主细胞中。在未修饰的排列的情况下，如果宿主细胞不具有目标靶蛋白的功能基因，载体还可以含有编码未修饰的目标靶蛋白的功能性结构基因的拷贝。
本发明的表达载体包括这样的表达载体分子，其包含编码本文描述的增强蛋白表达的多肽的核酸区段和一个或多个位于增强蛋白表达的多肽编码序列的5'或3'侧的克隆位点(例如，独特限制性酶位点)，在所述编码序列中可以插入编码融合蛋白的另一个结构域的核酸分子：在修饰的排列，可以插入编码目标靶蛋白的核酸以形成期望的融合蛋白(修饰的靶蛋白)；而在未修饰的排列，可以插入编码靶蛋白结合结构域的核酸以形成能够结合未修饰的目标靶蛋白并增强其表达的融合蛋白。表达载体也可以具有多克隆位点，其允许插入一个或多个编码一种或多种其它期望结构域的额外核酸区段(例如，表位标签、Fc区等)以构建和表达期望的融合蛋白。编码期望的融合体的最终核酸融合构建体可操作地连接至表达载体上的启动子。将克隆位点工程构造进载体分子中并将插入的编码期望蛋白的核酸区段可操作地连接至在相容宿主细胞中表达蛋白所需的启动子和其它信号，是在本领域的技能范围内。
尽管本文中关于组装编码本发明的融合蛋白的核酸构建体的描述可能提示连接各种核酸分子、随后将完整组装的核酸构建体插入表达载体中的特定分步次序，但是应当理解和明白，连接核酸分子的区段以产生编码期望的融合蛋白的核酸构建体的确切次序是在本领域的从业人员的判断、技能和经验范围内。此外，尽管可能在插入表达载体中之前首先将所有区段连接到一起以形成编码融合蛋白的核酸分子，但是在某些情况下，编码一个或多个结构域的核酸区段可能已经适当地位于表达载体内，从而实用的是，将一个或多个核酸区段插入在已经位于表达载体内的区段附近，并由此在表达载体内组装本发明的期望融合蛋白的可操作地连接的结构基因。
编码本发明的融合蛋白的表达载体可以转染进多种适合用于从特定表达载体表达融合蛋白的宿主细胞中的任一种中。尽管可以在原核或真核细胞中进行构建编码本发明的融合蛋白的重组结构基因的方法的一些步骤，但是根据本发明的融合蛋白的增强表达的优选宿主细胞是真核细胞。在本发明中有用的真核宿主细胞包括、但不限于：哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。可用于表达本发明的融合蛋白的哺乳动物宿主细胞包括、但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚胎肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。可用于表达本发明的J结构域融合蛋白的真菌宿主细胞包括、但不限于：曲霉菌属、脉孢菌属、酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、子囊菌酵母属和假丝酵母属。一种特别有用的酵母属宿主细胞是酿酒酵母细胞。
为了以下目的，使用本领域中可得到的方法，可以将编码本发明的融合蛋白的核酸分子引入植物或非人动物的细胞中：以允许容易地纯化融合蛋白的水平或作为基因治疗而表达融合蛋白，以给植物、人或非人动物提供在表达的融合蛋白内的目标蛋白所提供的功能的益处。这样的方法可以用于提供表达融合蛋白的转基因植物或动物，所述融合蛋白由转移的编码所述融合蛋白的核酸(转基因)编码。在植物和非人动物的情况下，可得到用于将编码蛋白的可表达核酸掺入种系中使得转基因生物的后代也可以表达融合蛋白的技术。可得到多种用于将核酸引入植物或非人动物的细胞中的载体和方法，包括、但不限于，用注射器将裸露DNA注射进细胞中、弹道转移(例如，使用基因枪)、脂质体和病毒衍生的载体分子。
根据本发明用于治疗人对象的基因治疗可以采用编码融合蛋白的重组基因，所述融合蛋白包含本文描述的处于修饰的排列或未修饰的排列的表达增强多肽。这样的基因治疗在如下疾病中是特别有用的：其中不适当地折叠的蛋白物质导致功能的丧失或大幅丧失，从而造成临床上识别的病理学状况。已经证实或暗示其中不适当地折叠的蛋白物质导致功能丧失的疾病的例子，包括、但不限于朊病毒相关的疾病(传播性海绵状脑病)、阿尔茨海默氏病；帕金森病；亨廷顿病；囊性纤维化(CF)和α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。
在采用本发明的修饰的排列的基因治疗中，构建编码融合蛋白的重组基因，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽。将重组基因插入载体中，所述载体又整合进人对象的体细胞的基因组中。在大多数情况下，重组载体不一定被所有体细胞吸收和整合进基因组中，而是被仅仅可能与特定疾病有关的细胞亚群吸收和整合进基因组中。从整合进人对象的体细胞中的重组基因表达的融合蛋白通过修复以其它方式丧失、已经丧失或发生减少以致于在人对象中造成临床上识别的疾病的内源性目标靶蛋白的功能而治疗该疾病。
在采用本发明的未修饰的排列的基因治疗中，构建编码融合蛋白的重组基因，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽，所述靶蛋白结合结构域对目标靶蛋白具有亲和力且与其结合。将重组基因插入载体中，所述载体又整合进人对象的体细胞的基因组中。另外，在大多数情况下，重组载体不一定被所有体细胞吸收和整合进该基因组中，而是被仅仅可能与特定疾病有关的细胞亚群吸收和整合进该基因组中。从整合进人对象的细胞中的重组基因表达的融合蛋白会增强内源性目标靶蛋白的表达，使得所述蛋白可以给细胞提供由所述靶蛋白提供的所需功能以避免临床上识别的疾病。如果内源性目标靶蛋白的内源基因不是功能性的或已经被缺失，那么还必须构建编码目标靶蛋白的重组基因并插入载体中，所述载体用于整合进人对象的基因组中以实现与融合蛋白一起的表达。
多种载体、试剂和方法中的任一种可以用于将核酸分子引入人对象的体细胞中，包括、但不限于，经修饰的病毒(例如，经修饰的腺病毒、经修饰的慢病毒)、病毒相关的病毒(例如，腺病毒相关的病毒)、裸露DNA (诸如裸露质粒DNA)、在纳米颗粒中的紧凑DNA和脂质体(例如，使用多种阳离子脂质)。
处于修饰的排列的包含增强蛋白表达的多肽和目标靶蛋白的融合蛋白
本发明的处于修饰的排列的融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽(或PEEP，包括如本文中所述的分离的J结构域、活性J结构域多肽片段、或J结构域类似物多肽)。优选地，所述增强蛋白表达的多肽与目标靶蛋白的氨基(N)末端或羧基(C)末端连接。所述增强蛋白表达的多肽与目标蛋白之间也可以被一个或多个插入多肽序列（诸如接头、酶切割位点、表位标签等）隔开。增强蛋白表达的多肽在目标靶蛋白内的插入是可能的，但是，作为实用原因，这需要更复杂的重组DNA工程且具有干扰目标靶蛋白的适当折叠、期望功能或其它性能的高可能性，且因此通常是次优选的。可以用于制备根据本发明的处于修饰的排列的融合蛋白的目标靶蛋白可以是具有合乎需要的性能的任意蛋白或多肽，包括：通常位于细胞内位置的可溶性蛋白；膜相关的蛋白(包括跨膜蛋白)；分泌型蛋白；和遗传工程改造的、非天然存在的蛋白。这样的经工程改造的、非天然存在的蛋白可以包括、但不限于天然的膜相关的蛋白的重组可溶形式，例如，跨膜蛋白(例如，整联蛋白、补体调节蛋白)的细胞外结构域。可以用作处于修饰的排列的融合蛋白的靶蛋白组分的、经工程改造的非天然存在的蛋白的另一个例子是包含重组可溶性受体分子的重组融合蛋白，其中细胞表面受体的细胞外结合结构域与免疫球蛋白Fc结构域或免疫球蛋白支架融合。这样的非天然存在的融合蛋白的一个非限制性例子是依那西普，其中p75人TNFα受体分子的细胞外结构域与IgG1免疫球蛋白的铰链和Fc结构域连接。可以用作本发明的处于修饰的排列的融合蛋白中的目标靶蛋白的其它蛋白包括、但不限于：抗体及其抗原结合部分、细胞因子、肽激素、酶(例如，凝血酶、乳糖酶、蛋白酶、转移酶、激酶等)和形态发生蛋白。
处于未修饰的排列的包含增强蛋白表达的多肽和靶蛋白结合结构域的融合蛋白
增强蛋白表达的多肽(包括如本文中所述的分离的J结构域、活性J结构域多肽片段或J结构域类似物多肽)也可以用在未修饰的排列中以增强目标靶蛋白在它的预期位置的表达。在根据本发明的未修饰的排列中，融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽，所述靶蛋白结合结构域对目标靶蛋白具有亲和力且与其结合。因而，在本发明的未修饰的排列中，目标靶蛋白不是融合蛋白的组分，且因此保留它的未改变的一级结构(氨基酸序列)。尽管不希望受任何特定机理约束，目标靶蛋白与融合蛋白的靶蛋白结合结构域的结合似乎会使目标靶蛋白到达增强蛋白表达的多肽(也存在于融合蛋白中)的相对紧密附近处，以与在没有融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，提供靶蛋白在它的预期细胞位置或细胞外位置的增强的表达水平。这可能涉及增加的伴侣蛋白质募集或涉入蛋白折叠、区室化或分泌中的其它翻译后细胞机制，或可能涉及细胞降解途径的避免的增加。该效应通过在期望的细胞内或细胞外位置表达的蛋白的出现的显著增加而证实。
在未修饰的排列中有用的靶蛋白结合结构域
处于本发明的未修饰的排列的融合蛋白包含结合目标靶蛋白的靶蛋白结合结构域，所述目标靶蛋白在它的适当细胞位置或细胞外位置的表达的升高是期望的。本发明的结合靶蛋白的融合蛋白的靶蛋白结合结构域可以是已知的结合靶蛋白的任意蛋白或其结合结构域。蛋白或其结合结构域对靶蛋白的结合亲和力越有特异性，其它蛋白可能潜在地干扰目标靶蛋白期望的表达水平的增强的可能性越低。
靶蛋白结合结构域的例子包括从天然的和遗传工程改造的抗体及其抗原结合片段分离的抗原结合位点，其中抗体或抗原结合片段的抗原结合位点结合希望升高其表达的靶蛋白。在该背景下，使用本领域中可得到的标准方法，可以容易地产生结合目标靶蛋白的抗体和抗原结合片段。多种遗传工程改造的抗体形式是本领域已知的，其可以用作处于本发明的未修饰的排列的融合蛋白的靶蛋白结合结构域的来源。这样的形式包括、但不限于，Fab片段、F(ab')2片段、单链Fv (scFv)抗体和单结构域抗体(dAb)。参见，例如，在以下文献中在本领域中可得到的功能性遗传工程改造抗体结合形式的种类的综述：Marvin等人, Acta Pharmacol. Sin., 26(6): 649-658 (2005)；Kufer等人, Trends Biotechnol., 22(5): 238-244 (2004)；Kontermann, Acta Pharmacol. Sin., 26(1): 1-9 (2005),和Chan等人, Nat. Rev, 10: 301-316 (2010)。
在本发明中特别有用的是这样的抗体分子或片段：其中将针对靶蛋白的抗原结合结构域提供在单个多肽中，因为这样的多肽可以使用标准体外DNA方法容易地连接至增强蛋白表达的多肽以形成本发明的融合蛋白。例如，单链Fv抗体(scFv)包含在单个多肽中连接的抗原结合位点的VH和VL结构域。单链抗原结合位点的另一个来源是单结构域抗体(dAb)，其中整个抗原结合位点存在于单个重链可变结构域中。参见，例如，Ward等人, Nature, 341: 544-546 (1989); Muyldermans等人, Protein Eng., 7: 1129-1135 (1994); Vu等人, Mol. Immunol., 34: 1121-1131 (1997); Muyldermans等人, Trends Biochem. Sci., 26: 230-235 (2001); Nguyen等人, Immunogenetics, 54: 39-47 (2002)。
对于具有免疫球蛋白Fc结构域的靶蛋白，靶蛋白结合结构域可以是如上面讨论的抗体或其抗原(Fc结构域)结合片段。抗体或其抗原结合结构域的一种替代物是已知特异性地结合Fc结构域的多种非免疫球蛋白蛋白质和多肽中的任一种。具有Fc结合结构域的蛋白包括、但不限于蛋白A、蛋白G、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的gE蛋白等。还已经鉴别出许多结合Fc结构域的合成肽。参见，例如，DeLano等人, Science, 287:1279-1283 (2000); Yang等人, J. Peptide Res., 66(增刊1): 120-137 (2006)。如在下面的实施例中所示，这样的Fc-结合蛋白和肽容易用作本发明的融合蛋白的靶标结合结构域，所述融合蛋白针对包含Fc结构域的目标靶蛋白。
在其中目标靶蛋白是结合蛋白配体的受体或其功能部分的情况下，所述蛋白配体可以用作本发明的融合蛋白中的靶标结合结构域。受体的功能部分包括、但不限于膜相关的受体的细胞外结构域，其包括功能性配体结合结构域。通常，这样的包含功能性配体结合结构域的细胞外部分被称作“截短的受体”，因为受体的跨膜结构域和细胞质结构域已经被除去。根据本发明，通过与包含受体的蛋白配体的本发明的融合蛋白的共表达，可以升高这样的截短的受体分子的表达。因此，特别适合用作本发明的处于修饰的排列的融合蛋白的靶标结合结构域的是作为单个多肽的配体蛋白，诸如如在下面的实施例中所示的某些细胞因子多肽(例如，IL8、IL13等)。可以用在融合蛋白中以结合靶受体蛋白或其配体结合部分的其它蛋白配体包括多肽共受体、多肽辅阻遏物和多肽辅因子。
在其中所述靶蛋白是已知受体分子结合的蛋白配体(例如，细胞因子)的情况下，本发明的处于未修饰的排列的融合蛋白的靶蛋白结合结构域可以包含结合靶蛋白的受体的同源受体或细胞外配体结合部分。
在本领域中已经提出BAG结构域作为用于增强靶蛋白表达的融合配偶体。已经确定了多种BAG蛋白的BAG结构域。参见，例如，Takayama等人, Nat. Cell Biol., 3: E237-E241 (2001)。BAG结构域具有BAG蛋白家族的任意成员的BAG结构域的关键定义特征。因此，BAG结构域包含BAG蛋白的这样的多肽结构域：其长度通常是85-124个氨基酸，结合Hsp70伴侣蛋白质的ATP酶结构域，且特征在于3个反向平行的α-螺旋(I、II、III、IV)，其中螺旋III和IV与Hsp70伴侣蛋白质的ATP酶结构域相互作用。近年来，已经报道，当将期望的重组蛋白连接至BAG结构域时，得到的融合蛋白的表达水平大于单独蛋白的表达水平。参见，国际公开号WO 2012/087835 A2。
从下面的实施例，在未修饰的排列中采用的BAG结构域不会提供目标靶蛋白的表达水平的显著增强。相反，本文描述的增强蛋白表达的多肽显著地增强处于修饰的排列和未修饰的排列的目标靶蛋白的表达水平。如在下面的实施例中所示，包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽(诸如分离的J结构域、活性J结构域片段、或J结构域类似物多肽，例如，式I或本文中公开的其特定10-12个氨基酸同源物)的融合蛋白(本发明的处于修饰的排列)的表达水平显著大于对照细胞(非融合蛋白)的表达水平。其它研究表明，与在没有这样的融合蛋白(对照)或包含与靶蛋白结合结构域连接的BAG结构域的融合蛋白存在下的水平相比，包含与靶蛋白结合结构域连接的本文描述的增强蛋白表达的多肽的融合蛋白(处于未修饰的排列)可有效地提供未修饰的目标靶蛋白的显著更大的表达水平。因此，如本文中所述的增强蛋白表达的多肽会提供新多肽家族，其用于增强处于修饰的排列和未修饰的排列的目标靶蛋白的表达。
用于治疗囊性纤维化的基因治疗方案
囊性纤维化(CF)是由编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白（一种调节cAMP的氯离子通道和通道调节剂）的基因中的突变造成的一种常染色体隐性的病症。在CFTR中在位置508处的苯丙氨酸的缺失(∆508F)是改变CFTR蛋白的构象的最常见突变，其然后被内质网(ER)质量系统快速地降解。一种普遍共识是，仅需要野生型CFTR蛋白功能的部分恢复即可给CF患者提供有益的治疗。因此，已经尝试了许多使用CFTR的基因治疗试验，但是由于CFTR基因的无效递送和对媒介物(例如，病毒载体)的免疫原性尚未取得成功。考虑到已知野生型CFTR难以进行适当蛋白折叠的事实，如果可以改善CFTR蛋白的蛋白折叠，将是非常有用的。
自从20多年前CFTR基因的鉴别和分离以来，已经进行了超过20个治疗囊性纤维化(CF)的基因治疗的临床试验。参见Davies等人, Proc. Am. Thor. Soc., 7: 408-414 (2010)中关于囊性纤维化的基因治疗的综述。这样的临床试验已经建立了概念证据以提供替代囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白，但是，替代CFTR蛋白在人对象细胞中的有效表达水平的持久性仍然是开发治疗CF的有效基因治疗中的最持久挑战。CFTR野生型蛋白是由于它的不稳定性而众所周知的蛋白。超过90%的CF患者具有至少一个拷贝的突变的CFTR基因(CFTR ∆ 508F)，其中在位置508处的苯丙氨酸的缺失会产生在细胞中快速地降解的高度不稳定的蛋白。这提示用于治疗CF的融合基因治疗方案，其会给CF患者导致增加的CFTR功能或修复的CFTR功能。这样的基因治疗提供编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白处于本发明的修饰的排列或未修饰的排列。
如在下面的实施例中所示，处于修饰的排列的融合蛋白（其中野生型CFTR蛋白或CFTR∆508F蛋白与增强蛋白表达的多肽(诸如J结构域)融合）以比未融合蛋白显著更高的水平表达。这提示，用于治疗CF的J结构域融合基因治疗方案会给CF患者导致增加的CFTR功能或修复的CFTR功能。因此，本发明的修饰的排列会提供基因治疗的新形式，其使用以显著更高的水平表达的融合蛋白且因此比过去的疗法更有效，以替代或修复与多种疾病有关的缺失的或丧失的蛋白功能。
对于未修饰的排列，融合蛋白包含与结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽，所述结合结构域结合野生型CFTR蛋白或CFTR∆508F蛋白。已知许多蛋白含有结合CFTR的高度保守的羧基端PDZ结合区域的PDZ结构域。可以用作PDZ结构域（其用作本发明的处于未修饰的排列的融合蛋白中的靶蛋白结合结构域）的来源的蛋白包括、但不限于NHERF家族的PDZ衔接蛋白的任意成员，包括、但不限于，NHERF1 (也被称作NHERF、EBP50或SLC9A3R1)、NHERF2 (也被称作E3KARP或SLC9A3R2)和PDZK1 (也被称作CAP70或NHERF3)。参见，例如，Haggie等人, J. Biol. Chem., 279(7): 5494-5500 (2004)；Guggino, W.B., Proc. Am. Thorac. Soc., 1: 28-32 (2004)；和Singh等人, J. Clin. Investig., 119(3): 540-550 (2009)。因此，PDZ蛋白的PDZ结构域作为融合蛋白中的靶蛋白结合结构域可以是特别有用的，所述融合蛋白被设计成在本发明的基因治疗中靶向CFTR∆508F和野生型CFTR蛋白中的任一种或二者。
因此，本发明提供了提供融合蛋白的新基因治疗形式，所述融合蛋白显著地升高内源性不稳定蛋白(诸如不稳定的CFTR∆508F)的表达水平和/或期望的异源蛋白(诸如野生型CFTR)的表达水平且因此比过去的疗法更有效以替代或修复与多种疾病有关的缺失的或丧失的蛋白功能。
从下述非限制性实施例会明白本发明的其它实施方案和特征。
实施例
实施例1. 使用修饰的排列增强目标靶蛋白的表达的组合物和方法
构建了表达载体质粒，其用于表达与本文描述的增强蛋白表达的多肽连接的目标靶蛋白，所述增强蛋白表达的多肽又可以连接至标准表位标签，所述标准表位标签经常附着在蛋白构建体的羧基(C)末端或氨基(N)末端，以使用对应的抗-标签抗体和标准免疫印迹测定容易地鉴别或分离。
通过退火2个具有下示序列(5'至3')的单链DNA分子，生产DNA接头分子，其具有含有不同限制性酶位点的核苷酸序列：
。
然后将退火的接头分子插入用HindIII和ApaI消化的质粒pcDNA3 (目录号V790-20, Invitrogen)中以产生质粒pcDNA'。
将编码V5表位标签(GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO:47))或Flag表位标签(DYKDDDDK (SEQ ID NO:111))的DNA分子插入质粒pcDNA'中。将具有V5表位标签以及N-端甲硫氨酸的编码序列（即，ATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG (SEQ ID NO:189)）的双链DNA分子插入用XhoI和XbaI消化（以产生质粒V5(C)-pcDNA'）或用HindIII和KpnI消化（以产生质粒V5(N)-pcDNA'）的pcDNA'中。
将具有Flag表位标签的编码序列（即，GATTACAAGGATGACGATGACAAG (SEQ ID NO:190)）的DNA分子插入用XhoI和XbaI消化的质粒pcDNA'中以产生质粒Flag(N)-pcDNA'。
DNA 分子的制备
使用标准方案，通过聚合酶链式反应(PCR)、基因合成或互补DNA分子的退火，得到编码蛋白序列的DNA分子。通过标准寡核苷酸合成，生成编码免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列的DNA分子。通过退火从标准方法合成的互补单链，生成具有编码甘氨酸-丝氨酸接头序列GGGSGGSGGSGG (SEQ ID NO:121)的DNA序列GGAGGCGGAAGTGGT GGGAGCGGTGGAAGCGGAGGC (SEQ ID NO:191)的DNA分子。
用于表达 J 结构域融合蛋白的表达载体质粒的制备
为了表达在C-端V5-标记的IL13Rα2受体蛋白(参见，图1A)，将编码IL13Rα2受体蛋白的DNA分子插入用HindIII和KpnI消化的质粒V5(C)-pcDNA'中。
为了表达其中将J结构域或BAG结构域连接至IL13Rα2受体蛋白的N-端的融合蛋白(参见，图3A)，将缺失了它的信号序列的截短的IL13Rα2受体蛋白插入用NotI和XhoI消化的质粒V5(C)-pcDNA’中。
为了表达V5-标记的、截短的TNR1受体蛋白(参见，图5A)，将编码截短的(仅细胞外结构域) TNR1受体蛋白的DNA分子插入用HindIII和KpnI消化的质粒V5(C)-pcDNA'中。
为了表达V5-标记的α1抗-胰蛋白酶(“α1AT”) (参见，图4A)，将编码α1抗-胰蛋白酶的DNA分子插入用HindIII和KpnI消化的质粒V5(C)-pcDNA'中。
为了表达在N-端V5-标记的p53蛋白(参见，图7A)，将编码p53蛋白的DNA分子插入用NotI和XhoI消化的质粒V5(N)-pcDNA' 中。
为了表达V-标记的CFTR和V5-标记的突变体CFTRΔ508F (参见，图8A)，将编码CFTR蛋白或CFTRΔ508F蛋白的DNA分子插入用NotI和XhoI消化的质粒V5(N)-pcDNA' 中。
为了表达包含与J结构域融合的目标蛋白的融合蛋白，将编码J结构域的DNA分子亚克隆进质粒V5(C)-pcDNA'或EcoRV质粒V5(N)-pcDNA' 的EcoRI位点中以分别产生质粒载体J-V5(C)-pcDNA'或V5(N)-J-pcDNA'。使用Hsp40、SV40和CSP J结构域生产融合蛋白。
为了表达包含与BAG结构域融合的目标蛋白的融合蛋白，将编码BAG结构域的DNA分子亚克隆进质粒V5(C)-pcDNA'或质粒V5(N)-pcDNA'的EcoRI和EcoRV位点中以分别产生质粒载体BAG-V5(C)-pcDNA'或V5(N)-BAG-pcDNA'。如下面指出的，使用BAG3、BAG4、BAG5和BAG6结构域生产融合蛋白。
然后将编码IL13Rα2、TNFR1、α1AT、p53或CFTR (野生型或Δ508F突变体)的DNA分子与J结构域(或者，在某些情况下，BAG结构域)序列一起在框架内插入一种或多种表达载体中以表达得到的融合蛋白，所述融合蛋白也具有N-端或C-端V5表位标签以便于鉴别编码的蛋白。
蛋白在 HEK293 细胞中的表达和检测
用X-tremeGENE HP转染试剂(目录号06365752001, Roche)将编码多种蛋白构建体的表达载体质粒转染进HEK293细胞中。如在下面的实施例中指出的，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的单独质粒与每种编码本发明的融合蛋白的表达载体质粒共转染以监测转染效率。将转染子细胞的培养物温育2天，并使用斑点印迹或蛋白免疫印迹测定针对表达的蛋白分析培养用培养基和/或细胞裂解物。在分析之前将培养用培养基的样品离心以除去碎片。对于细胞裂解物，在含有2 mM PMSF的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2%SDS)中裂解细胞。在简短超声处理以后，使用斑点印迹或蛋白免疫印迹测定针对表达的蛋白分析样品。对于蛋白质印迹分析，将样品在SDS-样品缓冲液中煮沸并在聚丙烯酰胺电泳上泳动，随后将分离的蛋白带转移至膜(PVDF膜)。
使用抗-GFP抗体检测作为内部转染对照的GFP的表达。使用化学发光信号检测斑点印迹和蛋白质印迹中表达的蛋白。简而言之，使印迹与第一抗体反应，所述第一抗体结合蛋白承载的特定表位标签(例如，V5或Flag)。在冲洗掉未反应的第一抗体以后，使酶连接的第二抗体(例如，辣根过氧化物酶连接的抗-IgG抗体)与结合至印迹的第一抗体分子反应。冲洗以后，加入生产商的化学发光的试剂。将印迹中的化学发光信号捕获在x-射线胶片上。在指出的情况下，将化学发光信号的图像用光密度计扫描，并使用NIH ImageJ图像处理程序分析。
蛋白活性测定
可得到用于检测在制备本文描述的J结构域融合蛋白中使用的目标蛋白的活性的标准测定。
实施例 2. 处于修饰的排列的靶蛋白的表达的增强
图1A显示了在C-端V5表位标记的、全长IL13Rα2蛋白(“IL13Rα2WT”)和在C-端V5表位标记的融合蛋白（其包含与BAG或与J结构域融合的IL13Rα2）的构建体的一般简图。
V5-标记的IL13Rα2WT蛋白包含在C末端连接至V5表位标签的全长IL13Rα2蛋白的氨基酸序列，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。V5-标记的IL13Rα2WT的氨基酸序列显示在下表中。
表2. V5-标记的IL13Rα2WT蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-BAG3结构域融合蛋白包含与得自BAG3蛋白的BAG结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述BAG结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2WT-BAG3结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表3. IL13Rα2WT-BAG3结构域融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-BAG4结构域融合蛋白包含与得自BAG4蛋白的BAG结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述BAG结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2WT-BAG4结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表4. IL13Rα2WT-BAG4结构域融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-BAG5结构域融合蛋白包含与得自BAG5蛋白的BAG结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述BAG结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2WT-BAG5结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表5. IL13Rα2WT-BAG5结构域融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-BAG6结构域融合蛋白包含与得自BAG6蛋白的BAG结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述BAG结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2WT-BAG6结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表6. IL13Rα2WT-BAG6结构域融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-Hsp40 J结构域融合蛋白包含与得自Hsp40蛋白的J结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述J结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2-Hsp40 J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表7. IL13Rα2WT-Hsp40 J结构域融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-SV40 J结构域融合蛋白包含与得自SV40 J蛋白的J结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述J结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2-SV40 J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表8. IL13Rα2WT-SV40 J结构域融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的IL13Rα2WT-CSP J结构域融合蛋白包含与得自CSP蛋白的J结构域连接的全长IL13Rα2蛋白的氨基(N)-端氨基酸序列，所述J结构域又连接至V5表位标签，所述V5表位标签又连接至得自表达载体的克隆位点的12个C-端氨基酸残基。IL13Rα2WT-CSP J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表9. IL13Rα2WT-CSP J结构域融合蛋白的氨基酸序列。
使用上述的表达载体，将IL13Rα2-V5的表达水平与转染的HEK293细胞中包含BAG结构域或J结构域的各种IL13Rα2融合蛋白的表达水平进行对比。细胞中各种融合蛋白的表达水平显示在图1B的蛋白质印迹中。第一行显示了加载等量细胞裂解物蛋白的凝胶的泳道。第二行显示了作为内部转染对照的GFP的表达。如在图1B的第一行中所示，关于V5-标记的IL13Rα2（其用于代表野生型(WT) IL13Rα2蛋白的表达）仅检测到模糊带，从而指示较差的表达。包含IL13Rα2和BAG结构域(BAG3、BAG4、BAG5、BAG6)的融合蛋白以稍微更高的水平表达。相反，包含IL13Rα2和任意J结构域的融合蛋白都以比V5标记的IL13Rα2或包含IL13Rα2和BAG结构域的融合蛋白显著更高的水平表达。图1B中的信号的密度测定法分析的结果显示在图1C中。包含IL13Rα2和任意J结构域的融合蛋白的表达水平高达V5表位标记的IL13Rα2(取作100%)的25倍。参见，图1C中的条形图。
IL13R α 2 的截短形式的表达和分泌
IL13Rα2是结合白介素-13 (IL13)并介导变应性炎症的膜受体蛋白。IL13与膜相关的IL13Rα2受体的结合会将信号转导至细胞质，其引发炎症应答。在哮喘的情况下，这样的应答是特别有害的。表达的膜相关的IL13Rα2分子的一部分在细胞表面上被切割，从而将可溶性截短形式的IL13Rα2 (IL13Rα2TF)释放进细胞外空间中。截短形式的IL13Rα2保留结合IL13的能力，但是由于在全长的膜相关蛋白中发现的跨膜区域和细胞质区域的缺失而不可以将信号传递给细胞。因此，已经采用截短形式的IL13Rα2作为诱饵受体通过结合IL13分子来治疗哮喘，而不将信号转导至细胞以引发炎症应答。关于这样的治疗用途，已经将遗传工程改造的截短形式的IL13Rα2在哺乳动物细胞中表达，并作为分泌型蛋白从培养用培养基中纯化。但是，由于蛋白的表达和分泌的困难，截短形式的IL13Rα2的生产是无效的。
研究了J结构域的增强可溶性的截短形式的IL13Rα2 (IL13Rα2TF)的表达的能力。为了证实J结构域与截短形式的IL13Rα2的缀合是否会增强分泌型蛋白的表达，构建了质粒，其表达IL13Rα2TF或包含IL13Rα2TF和得自Erdj3的N-端J结构域的融合蛋白。所述蛋白也具有V5表位标签以易于鉴别。参见，图2A中的构建体的简图。
在该实验中使用的V5标记的IL13Rα2TF的氨基酸序列显示在下表中。
表10. V5-标记的IL13Rα2TF融合蛋白的氨基酸序列。
包含Erdj3 J蛋白的N-端J结构域、成熟的(即，无信号序列)和截短的IL13Rα2 (IL13Rα2TF)和V5表位标签的J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表11. V5-标记的Erdj3 J结构域-IL13Rα2TF蛋白的氨基酸序列。
包含信号序列、BAG3的BAG结构域、成熟的(即，无信号序列)和截短的IL13Rα2 (IL13Rα2TF)和V5表位标签的BAG结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表12. V5-标记的BAG结构域-IL13Rα2TF融合蛋白的氨基酸序列。
将表达质粒转染进HEK293细胞中。针对IL13Rα2TF或IL13Rα2TF-J结构域融合蛋白的表达，通过免疫印迹法用抗-V5抗体分析得自转染的细胞的2天培养物的细胞裂解物和培养用培养基的样品。如在图2B中所示，在细胞裂解物中几乎没有检测到IL13Rα2TF蛋白的表达(泳道2)，且在培养基中没有观察到检测。相反，IL13Rα2TF-J结构域融合蛋白的表达水平在细胞内部(细胞裂解物样品)以及分泌进培养基中都显著更高。参见，图2B。当将J结构域连接至截短形式的IL13Rα2的C-端时，观察到类似的效应(数据未显示)。
使用斑点印迹免疫测定进行了另一个实验以更好地定量分泌的蛋白。用表达载体质粒转染HEK293细胞，所述表达载体质粒表达IL13Rα2TF、与IL13Rα2TF融合的BAG结构域(BAG-IL13RαTF)、或与IL13Rα2TF融合的J结构域(J-IL13RαTF)。将转染的细胞培养2天，并针对分泌的蛋白使用斑点印迹免疫测定分析细胞培养物培养基的样品。结果显示在图3A和3B中。图3A显示了分泌进培养用培养基中的V5-标记的蛋白的化学发光信号的x-射线胶片图像。如在图3A中所示，尽管包含与IL13Rα2TF连接的BAG结构域的融合蛋白(泳道3)与未融合的IL13Rα2TF (泳道2)相比可能已经提供分泌的蛋白的水平的某种微小增强，但是包含与IL13Rα2TF连接的J结构域的融合蛋白(泳道3)与未融合的IL13Rα2TF (泳道2)或所述或BAG结构域-IL13Rα2TF融合蛋白(泳道3)相比表现出显著增强的分泌的蛋白的水平。使用NIH ImageJ图像处理程序对图3A的斑点印迹的信号的密度测定法分析的结果显示在图3B中。图3B中的条形图清楚地显示了分泌的J结构域-IL13Rα2TF融合蛋白(条形图4)与IL13Rα2TF (条形图2)或BAG结构域-IL13Rα2TF融合蛋白(条形图3)相比显著更高的表达水平。与被转化以表达单独的IL13Rα2TF蛋白的细胞的表达水平相比，J结构域融合体的应用导致转化的细胞分泌的IL13Rα2TF的量的约3.5倍增加。
人细胞中处于修饰的排列的 J 结构域 - α 1 抗 - 胰蛋白酶融合蛋白
α1抗-胰蛋白酶(α1AT)蛋白从肝脏分泌，并在血管中循环。α1AT的功能是保护组织、特别是肺组织免于多余的蛋白酶。在被称作α1抗-胰蛋白酶缺乏的疾病中蛋白酶会损伤肺。受α1抗-胰蛋白酶缺乏影响的对象可能发展肺气肿、哮喘和/或慢性阻塞性肺疾病(COPD)。目前，α1AT (从人血清纯化)用于治疗具有α1抗-胰蛋白酶缺乏的患者。该治疗是昂贵的，且接受人血清的对象处于接触存在于人血清中的病原体的风险中。
研究了将J结构域与α1抗-胰蛋白酶(α1AT)融合的影响，作为增强期望的治疗上有用的蛋白在转染的细胞中的表达水平和分泌的可能策略。如在图4A中所示，制备了编码V5-标记的α1AT、V5-标记的α1AT-BAG结构域融合蛋白和V5-标记的α1AT-J结构域融合蛋白的DNA构建体。
V5-标记的α1AT蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表13. V5-标记的α1AT蛋白的氨基酸序列。
包含α1AT、BAG3的BAG结构域和V5表位标签的BAG结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表14. α1AT-BAG融合蛋白的氨基酸序列。
包含α1AT、Erdj3 J结构域和V5表位标签的J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表15. α1AT-J结构域蛋白的氨基酸序列。
将编码以上3种重组α1AT蛋白构建体的表达载体质粒转染进HEK293细胞中。收获得自转染的细胞的2天培养物的培养用培养基，并通过斑点印迹免疫测定确定分泌进培养基中的重组α1AT蛋白的水平。图4B显示了斑点印迹测定的化学发光信号的x-射线胶片。尽管可检测的量的未融合的α1AT (泳道2)和α1AT-BAG结构域融合蛋白(泳道3)分泌进培养用培养基中，对于分泌型α1AT-J结构域融合蛋白(泳道3)得到甚至更高的表达水平。使用NIH ImageJ图像处理程序对图4B的斑点印迹的信号的密度测定法分析的结果显示在图4C中。图4C中的条形图清楚地显示分泌型α1AT-J结构域融合蛋白(条形图4)与α1AT (条形图2)或α1AT-BAG结构域融合蛋白(条形图3)的表达水平相比显著更高的表达水平。与被转化成表达单独α1AT蛋白或α1AT-BAG融合蛋白的细胞的表达水平相比，J结构域融合体的应用导致转化的细胞分泌的IL13Rα2TF的量的大于1.5倍增加。
处于修饰的排列的截短形式的 TNFR1 蛋白
一种用于设计治疗活性的融合蛋白的形式组合了与免疫球蛋白Fc区连接的结合结构域，所述结合结构域特异性地结合期望的靶分子，所述免疫球蛋白Fc区给融合蛋白赋予增强的体内半衰期。这类药物的一个例子是依那西普，其结合并抑制肿瘤坏死因子(TNFα)的作用，所述肿瘤坏死因子是涉入许多自身免疫疾病的免疫系统的关键蛋白。例如，依那西普具有与免疫球蛋白Fc结构域连接的截短形式的肿瘤坏死因子α受体(TNFR1TF)。依那西普的TNFR1TF部分提供对药物靶标(TNFα)的特异性，且认为Fc结构域会添加药物在体内的稳定性和可递送性。尽管如此，还已知Fc结构域具有在某些疾病的治疗方案中可能不期望的某些效应子功能。
研究了将J结构域与截短形式的受体分子融合的影响，作为用于增强期望的基于受体的分子的表达水平和分泌的可能策略。这样的J结构域融合蛋白可能提供先前药物设计的可能替代方案，所述先前药物设计涉及与免疫球蛋白Fc结构域连接的截短形式的受体分子。使用表达载体质粒TNFR1TF-V5-pcDNA'和TNFR1TF-J结构域-V5-pcDNA'，研究了有或没有J结构域的截短形式的肿瘤坏死因子受体(TNFR1TF)的表达。表达载体为两种蛋白添加V5表位标签，以易于用抗-V5抗体检测。参见，图5A中的构建体的简图。
V5-标记的TNFR1TF的氨基酸序列显示在下表中。
表16. V5-标记的TNFR1TF蛋白的氨基酸序列。
包含TNFR1TF、Erdj3 J结构域和V5表位标签的J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表17. V5-标记的TNFR1TF-Erdj3 J结构域融合蛋白的氨基酸序列。
将表达质粒转染进HEK293细胞中。针对TNFR1TF或TNFR1TF-J结构域融合蛋白的表达，通过免疫印迹法用抗-V5抗体分析得自转染的细胞的2天培养物的细胞裂解物和培养用培养基的样品。如在图5B的斑点印迹中所示，在培养基中检测到一些TNFR1TF (泳道2)，但是，在培养基中检测到的TNFR1TF-J结构域融合蛋白的水平显著更大(泳道3)。使用NIH ImageJ图像处理程序对图5B的斑点印迹的信号的密度测定法分析的结果显示在图5C中。显然，分泌的TNFR1TF-J结构域融合蛋白(条形图3)的表达水平显著高于(未融合的) TNFR1TF蛋白(条形图2)的表达水平，即，与单独的TNFR1TF的水平相比约6倍增加。
处于修饰的排列的 Fc- 融合蛋白的分泌
考虑到以上证实J结构域的缀合会增强分泌的截短形式的TNFR1的表达水平的结果(图5B和5C)，感兴趣的是，检验J结构域是否会增强与免疫球蛋白Fc结构域融合的目标蛋白（诸如TNF1TF-Fc融合蛋白）的表达。这样的Fc-融合分子是以用药物依那西普(作为ENBREL®商购可得)举例说明的一类药物形式，所述依那西普是被批准用于治疗许多自身免疫疾病的TNF1TF-Fc融合蛋白，诸如严重的类风湿性关节炎、多关节的青少年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和斑块状银屑病。
关于该研究，在3'末端用编码V5表位标签的区段扩大编码每种目标蛋白(TNFR1TF、IL13Rα2TF或α1AT)的cDNA，所述区段又连接至编码免疫球蛋白Fc区的恒定结构域的区段。对于J-结构域融合体，将编码J结构域的cDNA在编码每种目标蛋白的cDNA和编码V5表位标签的区段之间在框架内连接。参见，图6A的构建体的图解。将对应的表达载体质粒转染进HEK293细胞中。通过斑点印迹测定，针对分泌的蛋白测定培养用培养基。
TNFR1TF-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表18. V5-标记的TNFR1TF-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
TNFR1TF-J结构域-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表19. V5-标记的TNFR1TF-Erdj3 J结构域-Fc蛋白的氨基酸序列。
IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表20. V5-标记的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
IL13Rα2TF-J结构域-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表21. V5-标记的IL13Rα2TF-Erdj3 J结构域-Fc蛋白的氨基酸序列。
α1AT-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表22. V5-标记的α1AT-Fc蛋白的氨基酸序列。
α1AT-J结构域-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表23. V5-标记的α1AT-Erdj3 J结构域-Fc蛋白的氨基酸序列。
如在图6B的每个图的中间泳道的斑点印迹中所示，在培养用培养基中表达每种Fc融合蛋白(TNFRI-V5-Fc、IL13Rα2TF-Fc、α1AT-Fc)。Fc融合蛋白的这种表达水平大于单独的每种目标蛋白(即，没有与Fc结构域融合；数据未显示)的表达水平。但是，如在图6B的每个图的右泳道的斑点印迹中所示，当将J结构域连接至Fc融合蛋白内的目标蛋白区段时，在每种情况下得到显著更高的表达水平。图6B的斑点印迹的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图6C的对应图中，其中J结构域融合蛋白的显著更高的表达水平是显然明显的。
人细胞中处于修饰的排列的 p53 蛋白的增强的表达
蛋白诸如IL13Rα2、TNFR和α1AT是在内质网(ER)中合成，用于递送至细胞膜或从细胞分泌。为了确定J结构域的存在对细胞质蛋白的表达的影响，研究了p53蛋白和J结构域的融合体的表达。p53蛋白是在基因组稳定性中起关键作用的转录因子。超过半数的癌症患者具有在涉及p53的途径中的某些异常。因此，已经尝试p53在癌症患者中的过表达作为癌症的治疗。
将编码p53的cDNA插入表达质粒V5(N)-pcDNA'中以产生质粒V5(N)-p53-pcDNA'，其表达含有N-端V5表位标签的p53蛋白。为了表达p53-J结构域融合蛋白，然后将编码SV40大T抗原的J结构域的cDNA在V5和p53编码区之间插入V5(N)-p53-pcDNA'载体中。参见，图7A中的构建体的简图。
V5-标记的p53蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表24. V5-标记的p53蛋白的氨基酸序列。
包含V5表位标签、SV40 J结构域和p53蛋白的J结构域融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表25. V5-标记的SV40 J结构域-p53融合蛋白的氨基酸序列。
将质粒V5(N)-p53-pcDNA'和V5(N)-J-p53-pcDNA'转染进MCF细胞中并温育2天。在裂解缓冲液中裂解细胞，并使用抗-V5抗体通过蛋白免疫印迹测定来检测蛋白。如在图7B中所示，p53-J结构域融合蛋白(泳道3)的表达水平显著大于没有J结构域的p53蛋白的表达水平。因此，结果指示，与J结构域的融合不仅可以增加膜相关蛋白和分泌的蛋白，而且也可以增加细胞质蛋白。
人细胞中处于修饰的排列的 CFTR 表达
囊性纤维化(CF)是由编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白（一种调节cAMP的氯离子通道和通道调节剂）的基因中的突变造成的一种常染色体隐性的病症。在CFTR中在位置508处的苯丙氨酸的缺失(∆508F)是改变CFTR蛋白的构象的最常见突变，其然后被内质网(ER)质量系统快速地降解。一种普遍共识是，仅需要野生型CFTR蛋白功能的部分恢复即可给CF患者提供有益的治疗。因此，已经尝试了许多使用CFTR的基因治疗试验，但是由于CFTR基因的无效递送和对媒介物(例如，病毒载体)的免疫原性尚未取得成功。考虑到已知野生型CFTR难以进行适当蛋白折叠的事实，如果可以改善CFTR蛋白的蛋白折叠，将是非常有用的。
将cftr基因或它的Phe508缺失突变体(cftr∆508F)插入质粒V5(N)-pcDNA'中。将编码BAG3蛋白的BAG结构域的DNA或编码得自Hsp40 J蛋白的J结构域的DNA在V5和cftr编码序列之间插入所述质粒中以产生这样的质粒，其表达与N-端V5表位标签连接的野生型CFTR或突变体CFTR(∆508F)蛋白，或表达在它的N-端与BAG或J结构域融合的野生型或突变体CFTR蛋白，所述BAG或J结构域又与N-端V5表位标签融合。在该实验中使用的各种构建体的简图显示在图8A中。
V5-标记的野生型CFTR (CFTR WT)的氨基酸序列显示在下表中。
表26. V5-标记的CFTR蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的BAG-CFTR (野生型)蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表27. V5-标记的BAG结构域-CFTR蛋白的氨基酸序列。
包含V5表位标签、SV40 J结构域和CFTR野生型蛋白的J结构域融合体的氨基酸序列显示在下表中。
表28. V5-标记的SV40 J结构域-CFTR蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的CFTR(∆508F)蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表29. V5-标记的CFTR(Δ508F)蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的BAG结构域-CFTR(∆508F)融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表30. V5-标记的BAG结构域-CFTR(Δ508F)融合蛋白的氨基酸序列。
V5-标记的J结构域-CFTR(∆508F)融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表31. V5-标记的SV40 J结构域-CFTR(Δ508F)融合蛋白的氨基酸序列。
为了研究各种CFTR蛋白构建体的表达，将质粒转染进HEK293细胞。通过免疫印迹法用抗-V5抗体分析得自转染的细胞的2天培养物的细胞裂解物的样品。如在图8B中所示，野生型CFTR蛋白和突变体CFTR(∆508F)蛋白都没有在转染的细胞中较好地表达。任一种蛋白与BAG3结构域的融合(BAG-CFTR WT, BAG-CFTR∆508F)会提供表达的某种增强。相反，与J结构域的融合显著增强野生型和突变蛋白(J-CFTR WT, J-CFTR∆508F)的表达水平。参见，图8B。
结果的结论
以上实验的结果清楚地显示，与J结构域的融合显著增强目标蛋白（包括治疗上有用的蛋白）的表达水平。
实施例3. 使用未修饰的排列增强目标靶蛋白的表达的组合物和方法
构建了用于表达融合蛋白的表达载体质粒，所述融合蛋白用于增强特定蛋白(靶蛋白)的表达。如下所述，经常将融合蛋白连接至标准表位标签，以易于使用对应的抗-标签抗体和标准免疫印迹(诸如斑点印迹、蛋白质印迹)测定鉴别或分离。
通过退火2个具有下示序列(5'至3')的单链DNA分子，生产DNA接头分子，其具有含有用于克隆异源DNA分子的不同限制性酶位点的核苷酸序列：
AGCTTGGTACCGGATCCGAATTCGATATCGCGGCCGCTCTCGAGTCTAGAGGGCC (SEQ ID NO:187)和
CTCTAGACTCGAGAGCGGCCGCGATATCGAATTCGGATCCGGTACCA (SEQ ID NO:188)。
然后将退火的接头分子插入在CMV启动子下游用HindIII和ApaI消化的质粒pcDNA3 (目录号V790-20, Invitrogen)中，以产生用在哺乳动物宿主细胞中的表达载体质粒pcDNA'。
合成了编码V5表位标签(GKPIPNPLLGLDST; SEQ ID NO:110)或Flag表位标签(DYKDDDDK; SEQ ID NO:111)的DNA分子，并插入用HindIII和KpnI消化的质粒pcDNA'中。将具有含有N-端甲硫氨酸的V5表位标签的编码序列（即，ATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG (SEQ ID NO:189)）的双链DNA分子插入用XhoI和XbaI消化的pcDNA' 中以产生质粒V5-pcDNA'。
将具有Flag表位标签的编码序列（即，GATTACAAGGATGACGATGACAAG (SEQ ID NO:190)）的DNA分子插入用XhoI和XbaI消化的质粒pcDNA'中以产生质粒Flag-pcDNA'。
为了表达IL13Rα2受体蛋白，将编码IL13Rα2受体蛋白的DNA分子插入用HindIII和KpnI消化的质粒V5-pcDNA'中。
为了表达TNR1受体蛋白，将编码TNRI受体蛋白的DNA分子插入用HindIII和KpnI消化的质粒V5-pcDNA'中。
为了表达α1抗-胰蛋白酶(“α1AT”)，将编码α1抗-胰蛋白酶的DNA分子插入用HindIII和KpnI消化的质粒V5-pcDNA'中。
合成了编码人IgG1分子的Fc区多肽的DNA分子，并插入用XbaI和ApaI消化的V5-pcDNA'中。
除非另外指出，否则将编码特定增强蛋白表达的多肽的DNA分子克隆进用EcoRI和EcoRV消化（以插入编码Erdj3 J蛋白的J结构域的DNA区段）或用KpnI和BamHI消化（以插入编码Erdj5 J蛋白的J结构域的DNA区段）的质粒Flag-pcDNA'中，产生质粒(J结构域)-Flag-pcDNA'，其中“(J结构域)”表示在下面的实施例中详细说明的特定增强蛋白表达的多肽。
除非另外指出，将编码下面实施例中的对应靶蛋白的靶标结合结构域的每个DNA分子插入用NotI和XhoI消化的质粒Flag-pcDNA'中。
HEK293 细胞中靶蛋白的表达和检测
用X-tremeGENE HP转染试剂(目录号06365752001, Roche)将编码不同蛋白构建体的表达载体质粒转染进HEK293细胞中。如在下面的实施例中指出的，将编码绿色荧光蛋白(GFP)的单独质粒与编码本发明的融合蛋白的每种表达载体质粒一起共转染以监测转染效率。将转染子细胞的培养物温育2天，并在含有2 mM PMSF的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl、pH8.0、150 mM NaCl、10 mM EDTA、2%SDS)中裂解细胞。在简短超声处理以后，使用斑点印迹或蛋白免疫印迹测定针对表达的蛋白分析样品。对于蛋白质印迹分析，将样品在SDS-样品缓冲液中煮沸并在聚丙烯酰胺电泳上泳动，随后将分离的蛋白带转移至膜(PVDF膜)。使用抗-GFP抗体检测作为内部转染对照的GFP的表达。
使用化学发光信号检测斑点和蛋白质印迹中表达的蛋白。简而言之，使印迹与第一抗体反应，所述第一抗体结合蛋白承载的特定表位标签(例如，V5或Flag)。在冲洗掉未反应的第一抗体以后，使酶连接的第二抗体(例如，辣根过氧化物酶连接的抗-IgG抗体)与结合至印迹的第一抗体分子反应。冲洗以后，加入生产商的化学发光的试剂。将印迹中的化学发光信号捕获在x-射线胶片上。在指出的情况下，将化学发光信号的图像用光密度计扫描，并使用NIH ImageJ图像处理程序分析。
表达人源化的抗-IL-8抗体的细胞(CHO DP-12克隆, 克隆号1933；目录号CRL-12444)和质粒p6G425V11N35A.choSD (目录号209552)购自美国典型培养物保藏中心(Manassas, Virginia)。
实施例4. 处于未修饰的排列的分泌型IL13Rα2TF蛋白的增强的表达
IL13受体IL13Rα2是结合白介素-13 (IL13)并介导变应性炎症的膜蛋白。由于蛋白折叠的困难，已知IL13Rα2受体蛋白是在哺乳动物细胞中不稳定的蛋白(Genetic Engineering & Biotechnology News, 28(5) (2008))。表达的IL13Rα2蛋白的一部分在细胞表面上被消化并脱落进细胞外空间中。该截短形式的IL13Rα2 (也被称作“IL13Rα2TF”)仍然具有结合IL13的能力，但是由于全长IL13Rα2蛋白的跨膜区域和细胞质区域的缺失而不可以将信号传递给细胞。因此，已经使用截短形式的IL13Rα2作为一类诱饵受体通过结合IL13分子来治疗哮喘，而不将信号转导至细胞以引发炎症应答(Zhang, 等人, J. Biol. Chem., 272(14): 9474-80 (1997))。已经在细胞中表达遗传工程改造的截短形式的IL13Rα2，但是，所述蛋白聚集成包涵体，从其纯化蛋白(Tang等人, Molec. Immunol. 39: 719-727 (2003))。但是，已知的是，转染的细胞对IL13Rα2TF蛋白的表达的一个限制已经归因于向它们的适当功能构象的无效折叠。当蛋白不可折叠成它们的适当构象时，它们被引导至蛋白酶体进行降解和氨基酸的清除。因此，IL13Rα2TF分子在转染的细胞中的产生已经识别出蛋白的表达和分泌的伴随限制(Lee等人, Cell Technol. for Cell Products, 29-39 (2007))。
本实验使用在实施例1-3中描述的“修饰的”排列的替代排列（其中通过与本发明的增强蛋白表达的多肽融合来修饰目标靶蛋白），研究了IL13Rα2TF蛋白的水平和分泌的增强。在“未修饰的”排列中，目标靶蛋白是“未修饰的”，因为它没有与本发明的增强蛋白表达的多肽融合，而是与包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽的融合蛋白一起共表达。图9A显示了用于增强目标靶蛋白的表达的该未修饰的排列的示意图。根据该方案，目标靶蛋白被融合蛋白的靶蛋白结合结构域结合，所述融合蛋白也包含增强蛋白表达的多肽结构域。据推测，靶蛋白与融合蛋白的结合会使靶蛋白到达增强蛋白表达的多肽结构域紧密附近处，这又会导致目标靶蛋白的增强的表达。
图9B显示了核酸构建体的简图，其中编码IL13Rα2TF蛋白的cDNA在它的3'末端用编码V5表位标签的核酸扩大。图9C显示了本发明的融合蛋白的核酸构建体的简图。对于该实验，根据本发明的融合蛋白包含与IL13蛋白（作为靶标结合结构域）连接的Erdj3 J蛋白的J结构域（作为增强蛋白表达的多肽）。
V5-标记的IL13Rα2TF蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表32. V5-标记的IL13Rα2TF蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的IL13蛋白的氨基酸序列包括Flag表位标签、信号序列和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表33. Flag-标记的IL13蛋白的氨基酸序列。
J结构域-IL13融合蛋白的氨基酸序列包括如在下表中所示的Flag表位标签。
表34. Flag-标记的Erdj3 J结构域-IL13融合蛋白的氨基酸序列。
用表达载体共转染HEK293细胞，所述表达载体用于表达V5-标记的IL13Rα2TF和用于表达J结构域-IL13融合蛋白。将转染的细胞培养2天，并将细胞裂解物和细胞培养基样品收获，并使用抗-V5抗体通过蛋白质印迹(免疫印迹)测定进行分析，以检测分泌的V5-标记的IL13Rα2TF。如在图10中所示，用表达单独IL13Rα2TF蛋白的表达载体转染的细胞在细胞中表达某种蛋白(中图, 泳道2, 从左侧)，但是在培养用培养基中仅检测到非常少的（如果有的话）IL13Rα2TF蛋白(上图, 泳道2, 从左侧)。IL13Rα2TF蛋白和它的IL13蛋白配体的共表达导致IL13Rα2TF蛋白在转染的细胞中(中图, 泳道3, 从左侧)和在培养用培养基中(上图, 泳道3, 从左侧)的某些可检测的表达。该结果与早前的以下报道相一致：IL13Rα2TF与它的IL13配体的共表达会改善IL13Rα2TF的分泌(Lee等人, Cell Technol. for Cell Products, 29-39 (2007))。但是，与单独IL13Rα2TF的表达(上图, 泳道2, 从左侧)或IL13Rα2TF和IL13配体的共表达(上图, 泳道3, 从左侧)相比，IL13Rα2TF与根据本发明的J结构域-IL13融合蛋白的共表达会进一步增强细胞内IL13Rα2TF的表达水平(中图, 泳道4, 从左侧)和急剧增强分泌的IL13Rα2TF蛋白的表达水平(上图, 泳道4, 从左侧)。结果指示，与本发明的J结构域-IL13融合蛋白的共表达会改善IL13Rα2TF蛋白的稳定性和分泌。
实施例5. 处于未修饰的排列的分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的增强的表达
如上面所指出的，截短形式的IL13Rα2 (IL13Rα2TF)包含IL13Rα2受体蛋白的细胞外结构域，包括功能性的IL13配体结合结构域。但是，由于蛋白的表达和分泌的困难，IL13Rα2TF的生产也是无效的。已经用于制备更稳定形式的治疗相关蛋白和特别是受体蛋白的一个策略是制备这样的融合蛋白：其中目标蛋白的所有部分或功能部分与免疫球蛋白Fc结构域的恒定结构域连接。这样的Fc融合蛋白形式已经用于设计潜在有用的药物的家族，所述药物会提供期望的治疗上有关的活性，且由于Fc结构域，也表现出增加的体内血清半衰期，这又会降低给药频率。在这样的Fc融合蛋白内，“目标蛋白”结构域(例如，受体蛋白的细胞外配体结合结构域)保留它的期望的功能性质(例如，配体结合)。
该实验检验了当将Fc融合蛋白与处于未修饰的排列的本发明的融合蛋白共表达时，对Fc融合蛋白(靶蛋白)的表达水平的影响。使用IL13Rα2TF-Fc融合蛋白作为Fc融合蛋白药物的一个代表性例子。IL13Rα2TF-Fc融合蛋白也具有在IL13Rα2TF (“目标蛋白”)结构域和Fc结构域之间的V5表位标签，以易于用抗-V5表位抗体鉴别。参见，图11A中IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的DNA构建体的图解。对于该实验，根据本发明的融合蛋白的实施例包含与蛋白A（其结合免疫球蛋白Fc结构域，作为靶标结合结构域）连接的J蛋白的J结构域（作为增强蛋白表达的多肽结构域）。参见，图11B。
在该实验中使用的V5-标记的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表35. V5-标记的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验的一个方面，检验了当与蛋白A分子共表达时IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平。用Flag表位标签标记蛋白A分子，以易于用标准的抗-Flag抗体鉴别。Flag-标记的蛋白A的氨基酸序列显示在下表中。
表36. Flag-标记的蛋白A的氨基酸序列。
用于增强IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达的融合蛋白的一个例子具有与蛋白A连接的得自Erdj3蛋白的J结构域。将Flag表位标签连接至蛋白A结构域的C-端。参见图11B中DNA构建体的图解。J结构域-蛋白A融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表37. Flag-标记的Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白的氨基酸序列。
用于增强IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达的融合蛋白的另一个例子具有与蛋白A连接的得自Erdj5蛋白的J结构域。将Flag表位标签连接至蛋白A结构域的C-端。参见图11B中DNA构建体的图解。Flag-标记的Erdj5 J结构域-蛋白A融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表38. Flag-标记的Erdj5 J结构域-蛋白A融合蛋白的氨基酸序列。
用表达载体质粒转染HEK293细胞，以对比培养用培养基中的以下蛋白的表达水平：单独表达的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白，与蛋白A共表达的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(“仅蛋白A”)，与Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白共表达的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(“J-蛋白A”)，和与Erdj5 J结构域-蛋白A融合蛋白共表达的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(“J2-蛋白A”)。将转染的细胞培养2天，并将细胞培养基的样品收获，并使用抗-V5抗体通过蛋白质印迹(免疫印迹)测定进行分析以检测分泌的V5-标记的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白。图12A显示了培养用培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像。图12A的泳道1是用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体(空载体)转染的细胞的“假”培养物的培养用培养基。当单独表达时(泳道2)，在培养基中检测到一些IL13Rα2TF-Fc融合蛋白。如在图12A的泳道3中所示，与蛋白A的共表达(仅蛋白A)没有提供分泌进培养基中的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的水平的显著增强。但是，与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养基中的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平(图12A的泳道4和5)。重要的是，IL13Rα2TF-Fc与单独蛋白A的共表达没有影响IL13Rα2TF-Fc的分泌(泳道3)的事实指示：(1) J结构域-蛋白A融合蛋白的J结构域是增强分泌的IL13Rα2TF-Fc的表达水平所必需的，和(2) J结构域-蛋白A融合蛋白的蛋白A结构域是提供靶标特异性从而增强分泌的IL13Rα2TF-Fc靶蛋白的表达水平所必需的。
使用NIH ImageJ图像处理程序对图12A的泳道中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图12B的各个条形图中。图12B中的条形图清楚地显示，与单独的IL13Rα2TF-Fc的表达(条形图2)或IL13Rα2TF-Fc和单独蛋白A的共表达(条形图3)相比，IL13Rα2TF-Fc与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达(条形图4和5)显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc的表达水平。
图12C中显示的结果支持图12A和12B中分泌的IL13Rα2TF-Fc蛋白的增强的表达水平依赖于J结构域-蛋白A融合蛋白的靶标结合结构域对Fc结构域的特异性。如在图12C的左图中的培养用培养基的蛋白质印迹分析所示，当转染的细胞表达单独的IL13Rα2TF蛋白(泳道1)、共表达IL13Rα2TF蛋白和J-蛋白A融合蛋白(泳道2)、或共表达IL13Rα2TF蛋白和单独蛋白A (仅蛋白A, 泳道3)时，在培养用培养基中没有检测到分泌的IL13Rα2TF (无Fc结构域)的显著表达。使用NIH ImageJ图像处理程序对图12C的左图的泳道中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图12C的右图的各个条形图中。
实施例6. 处于未修饰的排列的额外的分泌的Fc融合蛋白的增强的表达
进行了一系列实验以试验和对比本发明的J结构域-蛋白A融合蛋白的增强几种不同Fc融合蛋白的有效性。得自转染的细胞的培养物的培养用培养基的蛋白质印迹分析的结果显示在图13中。
实施例 6.1. 分泌的 IL13R α 2TF-Fc 融合蛋白的增强的表达
与以上实施例5中的结果一致，相对于关于表达单独IL13Rα2TF-Fc蛋白的转染的细胞所观察到的表达水平(图13A的左图的泳道1)，IL13Rα2TF-Fc蛋白与Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白在转染的细胞中的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的IL13Rα2TF-Fc蛋白的表达水平(参见，图13A的左图的泳道2)。分泌的IL13Rα2TF-Fc蛋白的表达水平的显著增强，也从使用NIH ImageJ图像处理程序对图13A的左图中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显而易见，所述结果显示在图13A的右图的各个条形图中。
实施例 6.2. 分泌的 TNFRITF-Fc 融合蛋白的增强的表达
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种结合TNF-α受体(TNFR1)并诱导炎症应答的重要细胞因子，所述炎症应答涉入许多自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎、克罗恩氏病和银屑病。使用TNF-α受体的截短蛋白(TNFR1TF)作为诱饵受体以结合TNF-α并由此抑制TNF-α活性。依那西普(可作为ENBREL®商购得到, Amgen)是一种TNF-α阻滞剂，其中将截短形式的TNFR与Fc结构域融合(TNFR1TF-Fc)。该分子的TNFR1TF结构域会提供期望的TNF-α结合特异性，且认为免疫球蛋白Fc结构域会给在患者中循环的药物添加体内稳定性。
在该实验中使用的TNFR1TF-Fc融合体靶蛋白也具有在TNFR1和Fc结构域之间的V5表位标签。在该实验中使用的TNFR1TF- Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表39. TNFR1TF-Fc蛋白的氨基酸序列。
图13B的左图显示了得自转染的细胞的培养用培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的x-射线胶片图像，所述细胞表达单独的TNFR1TF-Fc融合蛋白(泳道1)或共表达TNFR1TF-Fc融合蛋白和上述的Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2)。结果表明，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下表达的TNFR1TF-Fc融合蛋白的水平相比，分泌的TNFR1TF-Fc融合蛋白在共表达TNFR1TF-Fc融合蛋白和Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白的转染细胞中的表达水平显著增强。分泌的TNFR1TF-Fc融合蛋白的表达水平的显著增强也从使用NIH ImageJ图像处理程序对图13B的左图的泳道中的信号的密度测定法分析的结果显而易见，所述结果显示在图13B的右图的各个条形图中。
实施例 6.3. 分泌的α 1AT-Fc 融合蛋白的增强的表达
α1抗-胰蛋白酶蛋白(α1AT)从肝脏分泌进循环系统中。α1AT的功能是保护组织、特别是肺组织免于多余的蛋白酶活性。具有α1抗-胰蛋白酶缺乏的患者的肺组织可以被蛋白酶严重地损伤。这样的患者可以发展肺气肿、哮喘和/或慢性阻塞性肺疾病(COPD)。目前，将α1AT (从人血清纯化)用于治疗具有α1抗-胰蛋白酶缺乏的患者。该治疗是昂贵的，且接受纯化的α1AT的患者可能处于接触存在于人血清中的病原体的风险中。
在该实验中使用的靶标α1AT-Fc融合蛋白也具有在α1AT和Fc结构域之间的V5表位标签。在该实验中使用的α1AT-Fc融合蛋白(α1AT-Fc)的氨基酸序列显示在下表中。
表40. V5-标记的α1AT-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
图13C的左图显示了得自转染的细胞的培养用培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的X-射线胶片图像，所述细胞表达单独的α1AT-Fc融合蛋白(泳道1)或共表达α1AT-Fc融合蛋白和上述的Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2)。结果表明，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下表达的α1AT-Fc融合蛋白的水平(泳道1)相比，分泌的α1AT-Fc融合蛋白的水平(泳道2)显著增强。分泌的α1AT-Fc融合蛋白的表达水平的显著增强也从使用NIH ImageJ图像处理程序对图13C的左图的泳道中的信号的密度测定法分析的结果显而易见，所述结果显示在图13C的右图的各个条形图中。
实施例7. 处于未修饰的排列的分泌的IgG1抗体分子的表达的增强
以上研究表明，J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强Fc-融合蛋白的表达和分泌。蛋白A是众所周知的结合免疫球蛋白Fc区的蛋白的例子。该研究检验了已知结合免疫球蛋白结构域的其它蛋白与J蛋白的J结构域的融合是否可以增强分泌的靶抗体的表达水平。
在该研究中，使用人源化的IgG1抗-IL8抗体作为靶抗体蛋白。在有和没有如下面解释的不同J结构域融合蛋白存在下，检验了分泌的抗-IL8抗体的表达水平。
在该实验的一个方面，检验了抗-IL8抗体当与蛋白A分子共表达时的表达水平，已知所述蛋白A分子结合免疫球蛋白Fc结构域。蛋白A分子是上面在实施例5中描述的相同Flag-标记的蛋白A。
在该实验的另一个方面，检验了抗-IL8抗体当与蛋白L分子共表达时的表达水平，已知所述蛋白L分子结合抗体轻链。与上述的蛋白A分子一样，用Flag表位标签标记在该实验中使用的蛋白L分子，以易于用标准抗-Flag抗体鉴别。Flag-标记的蛋白L的氨基酸序列显示在下表中。
表41. Flag-标记的蛋白L的氨基酸序列。
Erjd3 J结构域-蛋白L融合蛋白的氨基酸序列包括如在下表中所示的Flag表位标签。
表42. Flag-标记的Erdj3 J结构域-蛋白L融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的IL8蛋白的氨基酸序列包括Flag表位标签、信号序列和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表43. Flag-标记的IL8蛋白的氨基酸序列。
Erdj3 J结构域-IL8融合蛋白的氨基酸序列包括如在下表中所示的Flag表位标签。
表44. Flag-标记的Erdj3 J结构域-IL8融合蛋白的氨基酸序列。
用表达质粒转染HEK293细胞，所述表达质粒用于表达单独的抗-IL8抗体、共表达抗-IL8抗体和蛋白A (仅蛋白A)、共表达抗-IL8抗体和本发明的Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白(J-蛋白A)、共表达抗-IL8抗体和蛋白L (仅蛋白L)、共表达抗-IL8抗体和本发明的Erdj3 J结构域-蛋白L融合蛋白(J-蛋白L)、共表达抗-IL8抗体和它的IL8配体(IL8)、共表达本发明的Erdj3 J结构域-IL8配体融合蛋白(J-IL8)、表达单独的本发明的Erdj3 J-蛋白融合蛋白(J-蛋白A)、表达单独的本发明的Erdj3 J结构域-蛋白L融合蛋白(J-蛋白L)和表达单独的本发明的Erdj3 J结构域-IL8配体融合蛋白(J-IL8)。使用抗-人IgG抗体(抗-hIgG抗体, 目录号AP112P, Millipore)通过斑点印迹测定分析培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达。
如在图14A的培养用培养基的斑点印迹中所示，与在表达单独的抗-IL8抗体(泳道2)、共表达单独的蛋白A (泳道3, 仅蛋白A)、共表达单独的蛋白L (泳道5, 仅蛋白L),或共表达单独的IL8配体(泳道7)的转染细胞中表达的抗体水平相比，抗-IL8抗体与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道4)、与J结构域-蛋白L融合蛋白(泳道6)或与J结构域-IL8融合蛋白(泳道8)在转染的细胞中的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗-IL8抗体的表达水平。在表达单独的J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道9、J-蛋白A)、单独的J结构域-蛋白L融合蛋白(泳道10、J-蛋白L)或表达单独的J结构域-IL8融合蛋白(泳道10、J-IL8)的转染细胞的培养用培养基中没有检测到信号，从而指示所有3种融合蛋白特异性地靶向和增强共表达的抗-IL8抗体。
使用NIH ImageJ图像处理程序对图14A中的泳道的信号的密度测定法分析的结果显示在图14B的各个条形图中。该系列实验的结果清楚地显示，相对于靶向的抗-IL8抗体与单独的未融合的靶标结合结构域蛋白(仅蛋白G、仅蛋白L或仅IL8)的共表达，靶向的抗-IL8抗体与本发明的融合蛋白的共表达显著增强分泌的抗-IL8抗体的表达，所述融合蛋白包含与靶标结合结构域(在这里：蛋白A、蛋白L或IL8)连接的增强蛋白表达的多肽(在这里：Erdj3 J结构域)。
实施例8. 使用未修饰的排列增强在CHO-DP12生产细胞系中建立的表达
本实施例检验了本发明的融合蛋白是否可以用于提高靶蛋白的表达水平，所述靶蛋白已经在建立的商业上相关的生产细胞系中生产。对于该实验，使用从美国典型培养物保藏中心(登记号CRL-124444, 美国典型培养物保藏中心, Manassas, Virginia)得到的稳定表达人源化的抗-IL8 IgG1抗体的CHO-DP12细胞系以及用于表达抗-IL8抗体的表达载体质粒(登记号209552, ATCC, Manassas, Virginia)。本发明的融合蛋白是上述的Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白。用表达载体转染CHO-DP12生产细胞系的细胞，所述表达载体承载可操作地连接的编码Erdj3 J结构域-蛋白A融合蛋白的结构基因。与HEK293细胞相比，CHO-DP12细胞的转染效率没有如此高。尽管如此，如在图15A的斑点印迹测定中所示，与在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下表达的抗体的水平(泳道2, 无)相比，人源化抗体与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗体的表达水平(泳道3)。
使用NIH ImageJ图像处理程序对图15A的泳道的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图15B的各个条形图中。结果指示，与当在没有J结构域-蛋白A融合蛋白存在下表达抗体时得到的表达相比，所述抗体与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达(条形图3)显著增强分泌的抗体的表达，从而提供大了大约4-5倍的表达水平增强(条形图2)。
结果指示，本发明的融合蛋白可以用于显著地增强蛋白的生产水平，所述蛋白已经在建立的生产细胞系中稳定地表达。
实施例9. 用于增强处于未修饰的排列的分泌的含有Fc的分子的表达的其它融合蛋白
实施例 9.1. 包含得自额外蛋白物质的 Fc 结合结构域的融合蛋白
本实施例提供了一系列实验来试验多种融合蛋白，所述融合蛋白包含与多种多肽(作为靶标结合结构域)中的任一种连接的J结构域(作为增强蛋白表达的多肽结构域)，所述多肽已经被报道会结合抗体分子的Fc区。然后试验了多种J结构域融合蛋白，并对比了它们的增强如在上面实施例5中所述的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白（其分泌进转染的HEK293细胞的培养基中）的表达水平的能力。
在该实施例中使用的本发明的J-蛋白融合蛋白是在上面实施例5中描述的Erdj3-蛋白A融合蛋白。
在本文描述的实验所使用的另一种融合蛋白中，得自Erdj3 J蛋白的J结构域连接至蛋白G，已知所述蛋白G结合某些免疫球蛋白Fc结构域。将Flag表位标签连接至蛋白G结构域的C-端，如在实施例5和图11B中关于J-蛋白A融合蛋白所示。本发明的Flag-标记的J结构域-蛋白G融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表45. Flag-标记的Erdj3 J结构域-蛋白G融合蛋白的氨基酸序列。
在本文描述的实验所使用的另一种融合蛋白中，将得自Erdj3 J蛋白的J结构域连接至人FcR (hFcR)受体蛋白，所述人FcR (hFcR)受体蛋白是结合某些免疫球蛋白Fc结构域的受体。将Flag表位标签连接至hFcR结构域的C-端，如在实施例5和图11B中关于J-蛋白A融合蛋白所示。Flag-标记的J结构域-hFcR融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表46. Flag-标记的Erdj3 J结构域-hFcR融合蛋白的氨基酸序列。
在本文描述的实验所使用的另一种融合蛋白中，将得自Erdj3 J蛋白的J结构域连接至恒河猴（Macaca mulatta）棒状病毒FcR受体蛋白(vFcR)，所述vFcR是结合某些免疫球蛋白Fc结构域的受体。将Flag表位标签连接至vFcR结构域的C-端，如在实施例5和图11B中关于J-蛋白A融合蛋白所示。Flag-标记的J结构域-vFcR融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表47. Flag-标记的Erdj3 J结构域-vFcR融合蛋白的氨基酸序列。
在本文描述的实验所使用的另一种融合蛋白中，将得自Erdj3 J蛋白的J结构域连接至单纯疱疹病毒1型gI蛋白，所述gI蛋白不具有显著的Fc结合活性。将Flag表位标签连接至gI结构域的C-端，如在实施例5和图11B中关于J-蛋白A融合蛋白所示。Flag-标记的J结构域-gI融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表48. Flag-标记的Erdj3 J结构域-gI融合蛋白的氨基酸序列。
在本文描述的实验所使用的另一种融合蛋白中，将得自Erdj3 J蛋白的J结构域连接至单纯疱疹病毒1型gE蛋白，所述gE蛋白对免疫球蛋白Fc结构域具有相对弱的亲和力。将Flag表位标签连接至gE结构域的C-端，如在实施例5和图11B中关于J-蛋白A融合蛋白所示。Flag-标记的J结构域-gE融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表49. Flag-标记的Erdj3 J结构域-gE融合蛋白的氨基酸序列。
用表达载体质粒转染HEK293细胞，以对比IL13Rα2TF-Fc融合蛋白在培养用培养基中的表达水平，所述IL13Rα2TF-Fc融合蛋白单独表达、与J结构域-蛋白A融合蛋白共表达(如上面在实施例5中所述)、与蛋白A共表达(“仅蛋白A”, 如在实施例5中所述)、与J结构域-蛋白G融合蛋白共表达(J-蛋白G)、与其中将J结构域与人FcR受体蛋白连接的J结构域融合蛋白共表达(“J-hFcR”)、与其中将J结构域与病毒FcR受体蛋白连接的J结构域融合蛋白共表达(“J-vFcR”)、与其中将J结构域与单纯疱疹病毒1型gI蛋白连接的J结构域融合蛋白共表达(“J-gI”)、与其中将J结构域与单纯疱疹病毒1型gE蛋白连接的J结构域融合蛋白共表达(“J-gE”)和与J-gI和J-gE融合蛋白二者共表达(“J-gI + J-gE”)。将转染的细胞培养2天，并将细胞培养基的样品收获，并使用抗-V5抗体通过蛋白质印迹(免疫印迹)测定进行分析以检测分泌的V5-标记的IL13Rα2TF。
图16A显示了得自转染的细胞的培养物的培养用培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的X-射线胶片图像。图16A的泳道1是得自用表达载体转染的细胞的培养物的培养基，所述表达载体表达单独的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白。当单独表达时，在培养基中检测到一些IL13Rα2TF-Fc融合蛋白(图16A的泳道1)。当仅与蛋白A一起表达时，也检测到一些IL13Rα2TF-Fc蛋白(图16A的泳道3)，如以前在上面关于在实施例5和图12A中描述的结果所指出的。也如以前在上面实施例5和图12A中所述，与单独IL13Rα2TF的表达水平(图16A的泳道1)或IL13Rα2TF-Fc与单独蛋白A的共表达(图16A的泳道3)相比，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平(图16A的泳道2)。与单独IL13Rα2TF的表达水平(图16A的泳道1)或IL13Rα2TF-Fc与单独蛋白A的共表达(图16A的泳道3)相比，IL13Rα2TF-Fc蛋白与J结构域-蛋白G融合蛋白的共表达也显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc蛋白的表达水平(图16A的泳道4)。
已知得自单纯疱疹病毒1型的病毒蛋白gI和gE会形成异源二聚体，其中所述gE蛋白较弱地结合抗体分子。另外，尽管单独的gE蛋白较弱地结合抗体分子，但是单独的gI不会结合抗体分子。与这些先前的发现相一致，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-gI融合蛋白的共表达(图16A的泳道7)导致分泌的IL13Rα2TF-Fc的相对较低的表达水平，其与在表达单独的IL13Rα2TF-Fc的细胞中观察到的表达水平类似(图16A的泳道1)。相反，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-gE融合蛋白的共表达显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc的表达水平(图16A的泳道8)。当IL13Rα2TF-Fc与J-gI和J-gE融合蛋白二者共表达时，观察到分泌的IL13Rα2TF-Fc的水平的类似增强(图16A的泳道9)，从而指示J-gI融合蛋白不会显著地增强分泌的IL13Rα2TF-Fc的表达水平，这与以前发现的gI蛋白不会结合Fc结构域相一致。
人Fc结合受体(hFcR)和恒河猴棒状病毒Fc结合受体(vFcR)是确定地表征的结合抗体分子的Fc区的受体。制备了包含这些FcR分子的J结构域融合体，并试验了增强IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达的能力。如在图16A中所示，IL13Rα2TF-Fc蛋白与J结构域-hFcR融合蛋白或J结构域-vFcR融合蛋白的共表达不仅没有增强分泌的IL13Rα2TF-Fc的表达(图16A的泳道5和6)，而且实际上似乎甚至抑制在表达单独IL13Rα2TF-Fc蛋白的细胞中观察到的分泌蛋白的低表达水平(图16A的泳道1)。甚至基线分泌的这种明显抑制的一种可能的解释可能是，在这些实验中采用的J结构域-FcR融合蛋白变得捕获在内质网(ER)中。需要进一步工作来发现含有FcR区域的功能构建体，以靶向和增强具有Fc区的蛋白的表达。
使用NIH ImageJ图像处理程序对图16A的蛋白质印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图16B的各个条形图中。
实施例9.2.用于增强处于未修饰的排列的靶蛋白的表达的包含Fc靶向肽的融合蛋白
已知多种肽结合免疫球蛋白分子的Fc结构域。该实验试验了多种用于增强具有Fc结构域的蛋白的表达水平的融合蛋白，其包含与几种代表性Fc-结合肽中的每一种(作为靶标结合结构域)连接的J结构域(作为增强蛋白表达的多肽)。用于构建融合蛋白的6种肽显示在下表中。
表50. 结合Fc结构域的代表性肽的的氨基酸序列。
制备了表达载体质粒，其用于表达包含与6种肽中的每一种连接的J结构域(得自Erdj3蛋白)的J结构域融合蛋白。使用IL13Rα2TF-Fc融合蛋白作为包含Fc结构域的代表性靶蛋白。
在该实验中使用的J结构域融合蛋白（其包含与FcBP1肽连接的Erdj3 J蛋白的J结构域）的氨基酸序列包括Flag表位标签和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表51. Flag-标记的Erdj3 J结构域-FcBP1融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的J结构域融合蛋白（其包含与FcBP2肽连接的Erdj3 J蛋白的J结构域）的氨基酸序列包括Flag表位标签和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表52. Flag-标记的Erdj3 J结构域-FcBP2融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的J结构域融合蛋白（其包含与FcBP3肽连接的Erdj3 J蛋白的J结构域）的氨基酸序列包括Flag表位标签和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表53. Flag-标记的Erdj3 J结构域-FcBP3融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的J结构域融合蛋白（其包含与FcBP4肽连接的Erdj3 J蛋白的J结构域）的氨基酸序列包括Flag表位标签和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表54. Flag-标记的Erdj3 J结构域-FcBP4融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的J结构域融合蛋白（其包含与FcBP5肽连接的Erdj3 J蛋白的J结构域）的氨基酸序列包括Flag表位标签和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表55. Flag-标记的Erdj3 J结构域-FcBP5融合蛋白的氨基酸序列。
在该实验中使用的J结构域融合蛋白（其包含与FcBP6肽连接的Erdj3 J蛋白的J结构域）的氨基酸序列包括Flag表位标签和得自用于表达蛋白的表达载体的13个额外C-端氨基酸残基，如在下表中所示。
表56. Flag-标记的Erdj3 J结构域-FcBP6融合蛋白的氨基酸序列。
将转染的细胞培养2天，并将细胞培养基的样品收获，并使用抗-V5抗体通过蛋白质印迹测定进行分析以检测分泌的V5-标记的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白。图17A显示了培养用培养基的蛋白质印迹分析的化学发光信号的X-射线胶片图像。如在图17A中所示，与单独IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平(泳道1和3)相比，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与6种J结构域-肽融合蛋白中的每一种在HEK293转染子中的共表达显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平(泳道4-9)。该实验也包括IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-蛋白A融合蛋白的共表达(泳道2)或与J结构域-蛋白G融合蛋白的共表达(泳道10)对分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达的影响的对比。如在图17A中所示，IL13Rα2TF-Fc融合蛋白与J结构域-蛋白A融合蛋白(泳道2)或J结构域-蛋白G融合蛋白(泳道10)的共表达显著增强分泌的IL13Rα2TF-Fc融合蛋白的表达水平。
使用NIH ImageJ图像处理程序对图17A的蛋白质印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图17B的各个条形图中。
实验结果的结论
上述实验的结果指示，与靶蛋白在没有融合蛋白存在下的表达水平相比，目标靶蛋白和融合蛋白（其包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽结构域，所述靶蛋白结合结构域结合靶蛋白）的共表达显著地增强靶蛋白在它的适当细胞位置或细胞外位置中的表达水平。
实施例 10. 增强蛋白表达的多肽的最小序列要求
进行进一步分析以确定当以未修饰的排列或修饰的排列采用时有效地增强目标靶蛋白的表达水平的最小氨基酸序列。
使用BLAST对J结构域序列的现有文库进行序列同源性分析，以确定J结构域是否共有可以增强蛋白表达水平的类似最小“核心”序列。分析指示，Erdj3蛋白的J结构域是其它J蛋白的J结构域的典型。由于已知Erdj3的J结构域在修饰的排列和未修饰的排列可有效地增强蛋白表达(参见，上面的实施例)，选择它进行进一步缺失和置换突变分析以确定是否可以鉴别出保留增强蛋白表达的活性的最小多肽序列。
在该研究中，针对增强经工程改造的IL13Rα2TF-V5-Fc蛋白（作为目标靶蛋白）的表达，评估了Erdj3的J结构域的多种缺失和置换突变。该经工程改造的蛋白具有在IL13Rα2TF多肽和Fc结构域之间的V5表位标签，从而易于用抗-V5抗体检测。构建了融合蛋白，其包含Erdj3的全长J结构域或与蛋白A连接的多种突变多肽，所述蛋白A结合经工程改造的IL13Rα2-Fc靶蛋白的Fc结构域(从而充当靶蛋白结合结构域)。因而，关于每种突变的多肽，在研究中使用的对应融合蛋白的通式是：
信号序列-接头1-(J结构域、片段或J结构域类似物多肽序列-接头2-蛋白A-接头3-Flag表位标签。
这些融合蛋白的结构域（不包括插入的J结构域、J结构域片段或J结构域类似物序列）的氨基酸序列显示在下表中。
表57. 实验Flag-标记的蛋白A融合体的氨基酸结构。
使用可检测的抗-V5抗体通过斑点印迹测定确定每种融合蛋白的增强蛋白表达的活性。将IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白与或不与含有每个突变多肽序列的融合蛋白一起表达，并将细胞培养物培养基收获和简短离心以除去碎片。将样品印迹到硝酸纤维素膜上，并将干燥的膜加工用于免疫印迹测定。针对蛋白表达增强活性试验的缺失和置换多肽与通过免疫印迹法确定的增强蛋白表达的活性一起显示在下表中。
表58. 针对增强蛋白表达的活性试验的多肽的氨基酸序列.
* “HA”= 高活性，即，与阴性对照(没有使用融合蛋白)相比，蛋白表达增强活性显著地增强，例如，类似于由Erdj3蛋白的全长J结构域提供的增强；“A”=与阴性对照(没有使用融合蛋白)相比提高的蛋白表达增强活性；蛋白生产水平通常小于由Erdj3的全长J结构域提供的水平；“NA”= 与阴性对照相比无活性。
如在上表中指出的，针对当与IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白共表达时的表达增强活性，评估了每种突变的多肽。将表达水平分类为高活性(“HA”)、活性(“A”)或无活性(“NA”)。这些表达水平的例子显示在图18的免疫印迹中。在没有融合蛋白存在下IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白的表达水平作为“无活性”。参见，图18中的泳道2 (从左侧))。包含与蛋白A连接的Erdj3的完整J结构域（在上面的表58中命名为多肽3）的融合蛋白的共表达急剧地增强分泌的IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白的表达水平。参见，图18中从左侧的泳道3。该表达水平增强被命名为“高活性”。如在图18的泳道4中所示，包含与蛋白A连接的内部缺失突变多肽（命名为3-45）的融合蛋白的共表达显然提供与对照(无融合蛋白，图18的泳道2)相比显著增强的分泌的IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白的表达水平，但是所述表达水平稍微小于图18的泳道3中所示的高活性。该表达水平增强被命名为“活性”。相反，如在图18的泳道5中所示，包含与蛋白A连接的最小多肽序列（命名为3-72）内的置换突变的融合蛋白的共表达提供的表达水平不超过关于图18的泳道2中的对照所检测的表达水平。这被命名为“无活性”。
该分析的结果指示，Erdj3的J结构域的内部多肽片段（命名为3-29）具有提供增强蛋白表达的高活性的最小多肽序列(IKKAYRKLA; SEQ ID NO:48)。多肽3-29序列位于J结构域的α螺旋II内，但是不包括邻近(C-近侧)环结构域的任何残基。
制备了J结构域片段3-29序列的多种突变，并针对增强蛋白表达的活性进行了评估。突变的序列显示在上表中，参见多肽编号3-44至3-88。
还针对位于与Erdj3的J结构域内的3-29多肽的位置类似的位置的内部多肽序列，评估了其它J蛋白的J结构域。这样的序列在上表中被命名为3-89至3-99。这些多肽中的大多数在分泌的IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白的增强表达的测定中提供完全或部分活性。但是，2种多肽（命名为3-98和3-99）的氨基酸序列显著不同于多肽3-29的氨基酸序列，并且这些多肽也缺少增强蛋白表达的活性。
实施例11. 定义增强蛋白表达的多肽的新家族的结构式
下面是多肽序列突变数据的分析的概要，其不仅导致提供增强蛋白表达的活性的、Erdj3的J结构域的多肽片段的最小序列(多肽3-29, SEQ ID NO:48)的发现，而且导致如下所示的定义增强蛋白表达的多肽的新家族的结构式。
图19显示了Erdj3的J结构域的与一系列缺失突变多肽的氨基酸序列比对，以及使用未修饰的排列确定的它们的增强蛋白表达的活性，其中使用每种多肽构建如上所述的Flag-标记的蛋白A融合蛋白。使用如上所述的抗-V5抗体通过免疫印迹确定共表达每种Flag-标记的蛋白A融合体和IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白的细胞的培养物的培养基中分泌的IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白的表达水平。
在图19中被命名为3-6、3-7、3-8和3-9的缺失突变多肽都缺少增强蛋白表达的活性(无活性)，从而指示α螺旋II氨基酸序列是活性所必需的。在图19中被命名为3-15和3-17的缺失突变多肽保留高活性，从而指示序列DIKKAYRKLALQL (SEQ ID NO:274)足以提供较高增强蛋白表达的活性。然后对该多肽进行进一步突变分析，如在下表中所示。
表59. 突变多肽的氨基酸序列和增强蛋白表达的活性。
如上面所指出的，命名为3-21的多肽(高活性, HA)和命名为3-22的多肽(无活性, NA)之间的活性差异指示，C-端亮氨酸(L)残基是增强蛋白表达的活性所必需的。类似地，多肽3-25和多肽3-26之间的活性差异指示，N-端异亮氨酸(I)是活性所必需的。如以前指出的，多肽3-29定义了用于提供完整增强蛋白表达的活性的Erdj3的J结构域的最小多肽序列。
除了上述的结果以外，如下所述的额外分析导致本发明的增强蛋白表达的多肽的必需氨基酸共有序列的鉴别。
为了鉴别用于提供增强蛋白表达的活性的必需氨基酸序列，将3-29序列的每个氨基酸缺失，并使用处于上述的未修饰的排列的IL13Rα2-V5-Fc靶蛋白试验了所述多肽的增强蛋白表达的活性。
从Erdj3的J结构域的多肽片段的最小序列开始，在9个氨基酸位置中的每一处对多肽3-29序列(IKKAYRKLA; SEQ ID NO:48)进行下述突变分析：
(a) 3-29: IKKAYRKLA (SEQ ID NO:48)，关于位置1，参见下面的总结分析(1)，
(b) 3-44: IK_AYRKLA (SEQ ID NO:295), 无活性，关于位置3，参见下面的总结分析(2)，
(c) 3-45: IKK_YRKLA (SEQ ID NO:53), 一些活性，关于位置4，参见下面的总结分析(3)，
(d) 3-39: IKKA_RKLA (SEQ ID NO:294), 无活性，关于位置5，参见下面的总结分析(4)，
(e) 3-46: IKKAY_KLA (SEQ ID NO:54), 一些活性，关于位置6，参见下面的总结分析(5)，
(f) 3-47: IKKAYR_LA (SEQ ID NO:55), 一些活性，关于位置7，参见下面的总结分析(5)，
(g) 3-48: IKKAYRK_A (SEQ ID NO:56), 一些活性，关于位置8，参见下面的总结分析(6)，
(h) 3-29: IKKAYRKLA (SEQ ID NO:48), 高活性，关于位置9，参见下面的总结分析(6)。
总结分析
(1) IKKAYRKLA (SEQ ID NO:48)
第一个氨基酸是活性所必需的。
J成员(47种J蛋白)之间的第一个氨基酸的对比结果指示在位置1处的氨基酸的下述发生率：
I (34), L (6), V (4), M (1), A (1), R (1)
除了Arg (R)以外，所有这些氨基酸具有非极性侧链基团。
制备和试验了从其它J成员衍生出的下述构建体：
3-49: LKKAYRKLA (SEQ ID NO:57), 高活性
3-50: VKKAYRKLA (SEQ ID NO:58), 高活性
3-51: MKKAYRKLA (SEQ ID NO:59), 高活性
3-52: AKKAYRKLA (SEQ ID NO:60), 高活性
3-53: SKKAYRKLA (SEQ ID NO:296), 无活性
3-54: FKKAYRKLA (SEQ ID NO:297), 无活性。
因此，第一个位置优选地是具有非极性氨基酸侧基的氨基酸，其为I、L、V、A和M。
(2) IK_AYRKLA (SEQ ID NO:295)；无活性
这暗示两种可能性：
a)在该位置需要2个氨基酸
3-55: IAQAYRKLA (SEQ ID NO:298), 无活性
3-56: ILAAYRKLA (SEQ ID NO:299), 无活性
从而指示需要某个特定氨基酸，
b)需要2个赖氨酸，或仅一个足够。
通过在J成员(47种J蛋白)之间对比这2个位置，这2个位置是非常保守的，如下述发生率所指示的：
KK (26), KR (5), RK (3), AR (3), KA (2), KQ (2), KL (1), IK (1), NK (1), RQ (1), RD (1), LA (1)
除了一个以外，所有这些携带至少一个具有碱性氨基酸侧链的氨基酸。
因此，制备并试验了下述置换突变：
3-57: IAKAYRKLA (SEQ ID NO:61), 一些活性
3-58: IKAAYRKLA (SEQ ID NO:62), 一些活性。
因此，结论是，至少一个在位置2和3处的氨基酸是碱性氨基酸K或R。
(3) IKK_YRKLA (SEQ ID NO:53), 一些活性
该结果指示，在该位置具有某种氨基酸更好，但是并非绝对必需的。
通过在J成员(47种J蛋白)之间对比该位置，该位置也是非常保守的，如下述发生率所指示的：
A (36), K (2), R (2), S (2), Q (2), T (1), I (1), E (1)
构建和试验了下述多肽：
碱性氨基酸 3-59 IKKRYRKLA (SEQ ID NO:63)；高活性
极性的不带电荷的氨基酸 3-60 IKKSYRKLA (SEQ ID NO:64)；一些活性
极性的不带电荷的氨基酸 3-61 IKKQYRKLA (SEQ ID NO:65)；一些活性
酸性氨基酸 3-62 IKKEYRKLA (SEQ ID NO:66)；一些活性
芳族氨基酸 3-63 IKKFYRKLA (SEQ ID NO:67)；一些活性
极性的不带电荷的氨基酸 3-64 IKKCYRKLA (SEQ ID NO:68)；一些活性。
从以上置换突变，结论是，20种天然存在的氨基酸中的任一种可以占据位置4，因为在该位置处的缺失仍然保留活性。
(4) IKKA_RKLA (SEQ ID NO:312)；无活性
该结果暗示，在位置5的某种氨基酸是必需的。
通过在J成员(47种J蛋白)之间对比该位置，下面给出了氨基酸分布。
Y (34), F (10), H (2), I (1)
因此，制备和试验了下述多肽：
芳族氨基酸 3-65 IKKAFRKLA (SEQ ID NO:69), 高活性
带正电荷的氨基酸 3-66 IKKAHRKLA (SEQ ID NO:300), 无活性
非极性氨基酸 3-67 IKKAIRKLA (SEQ ID NO:301), 无活性
芳族氨基酸 3-68 IKKAWRKLA (SEQ ID NO:70), 高活性
非极性氨基酸 3-69 IKKAARKLA (SEQ ID NO:302), 无活性
非极性氨基酸 3-70 IKKASRKLA (SEQ ID NO:303), 无活性。
因此，在位置5的氨基酸是芳族氨基酸，其为Y、F或W。
(5) IKKAY_KLA (SEQ ID NO:313), 一些活性
IKKAYR_LA (SEQ ID NO:314)一些活性
通过在J成员(47种J蛋白)之间对比该位置，至少一个氨基酸是碱性氨基酸的情况是43/47 (都是23，和任一个是20)。
下述突变的多肽具有在位置6和7处替换的2个氨基酸：
3-71 IKKAYHQLA (SEQ ID NO:304), 无活性
3-72 IKKAYYQLA (SEQ ID NO:305), 无活性
3-73 IKKAYFSLA (SEQ ID NO:306), 无活性。
因此，在位置6和7处的氨基酸中的至少一个是碱性氨基酸K或R。
(6) IKKAYRK_A (SEQ ID NO:56), 一些活性
IKKAYRKL (SEQ ID NO:315), 一些活性
通过在J成员(47种J蛋白)之间对比这些位置，2个位置都被L和A占据的情况是25/47，其中它们都是L-A。在这些位置处的至少一个氨基酸是L或A的情况是14，且8种情况指示既非L又非A。
制备下述突变的多肽，其中替换2个氨基酸，并试验活性：
3-74 IKKAYRKQS (SEQ ID NO:307), 无活性
3-75 IKKAYRKQC (SEQ ID NO:308), 无活性
3-76 IKKAYRKDI (SEQ ID NO:309), 无活性。
如指示的，下述突变的多肽具有被替换的位置8：
极性氨基酸 3-77 IKKAYRKQA (SEQ ID NO:71), 高活性
非极性氨基酸 3-78 IKKAYRKMA (SEQ ID NO:72), 高活性
非极性氨基酸 3-79 IKKAYRKIA (SEQ ID NO:73), 一些活性
非极性氨基酸 3-80 IKKAYRKAA (SEQ ID NO:74), 一些活性
非极性氨基酸 3-81 IKKAYRKVA (SEQ ID NO:75), 一些活性
碱性氨基酸 3-82 IKKAYRKRA (SEQ ID NO:76), 一些活性。
如指示的，下述突变的多肽具有被替换的位置9：
非极性氨基酸 3-83 IKKAYRKLM (SEQ ID NO:77), 高活性
非极性氨基酸 3-84 IKKAYRKLI (SEQ ID NO:78), 高活性
非极性氨基酸 3-85 IKKAYRKLV (SEQ ID NO:79), 高活性
极性的不带电荷的氨基酸 3-86 IKKAYRKLC (SEQ ID NO:80), 一些活性
极性的不带电荷的氨基酸 3-87 IKKAYRKLS (SEQ ID NO:81), 高活性
芳族氨基酸 3-88 IKKAYRKLY (SEQ ID NO:82), 一些活性。
其它突变的多肽的结果：
替换L和A 3-42 IKKAYRKALQ (SEQ ID NO:51), 高活性
双L 3-43 IKKAYRKLLQ (SEQ ID NO:52), 高活性。
因此，在X8和X9处的氨基酸中的至少一个是L或A。
通过这些研究，结论是，分离的增强蛋白表达的J结构域类似物多肽包含下式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或甲硫氨酸(M)；
X2和X3各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；
X4是任意氨基酸，或者当X1至X3存在且X5至X9存在时，X4可以不存在；
X5是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
X6和X7各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者，当X6和X7中的一个是K或R时且当X1至X5存在且X8至X9存在时，X6和X7中的另一个可以不存在；和
X8和X9是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；或者，当X8和X9的一个是L或A时且当X1至X7存在时，X8和X9的另一个可以不存在。
上式可适用于得自其它J蛋白的下述多肽片段的序列，且所有这些多肽都具有活性：
Erdj1 3-89 IRKAYRKLSLTL (SEQ ID NO:83), 一些活性
Erdj2 3-90 IKKQYRLLSLKY (SEQ ID NO:84), 一些活性
Erdj4 3-91 IKKAFHKLAMKY (SEQ ID NO:85), 高活性
Erdj5 3-92 IRQAFKKLALKL (SEQ ID NO:86), 一些活性
Erdj6 3-93 IIKAYRKLALQW (SEQ ID NO:87), 一些活性
Erdj7 3-94 IARAYRQLARRY (SEQ ID NO:88), 高活性
Hsp40 3-95 IKRAYRRQALRY (SEQ ID NO:89), 高活性
CSP 3-96 IKKSYRKLALKY (SEQ ID NO:90), 高活性
DnaJ 3-97 IKKAYKRLAMKY (SEQ ID NO:91), 高活性
下面得自其它J蛋白的序列不匹配上式，且这些多肽不具有增强蛋白表达的活性：
得自SV40 J蛋白 3-98 MRKAYLKKC (SEQ ID NO:310), 无活性
得自Dnaj同系物亚家族C成员12 3-99 ILAEFKVRAL (SEQ ID NO:311), 无活性。
上面总结的分析和结果指示，上式定义了提供增强蛋白表达的活性的新多肽家族。
实施例12. J结构域的最小多肽增强处于修饰的排列的靶蛋白表达
如上面所解释的，Erdj3的J结构域的突变分析的结果指示，使用以上测定以未修饰的排列，被命名为3-29的内部多肽序列对于多肽提供增强蛋白表达的高活性是具有J结构域的最小序列(IKKAYRKLA; SEQ ID NO:48)。还以修饰的排列检验了3-29多肽的增强蛋白表达的活性。
在该实验中，第一种融合蛋白包含IL13Rα2TF作为与BSC1多肽(SEQ ID NO:48)连接的目标靶蛋白，所述BSC1多肽又连接至V5表位标签。该融合蛋白被命名为IL13Rα2TF-BSC1，其显示在下表中。
表60. V5-标记的IL13Rα2TF-BSC1融合蛋白的氨基酸序列。
第二种融合蛋白包含IL13Rα2TF作为与BSC1多肽的突变形式连接的目标靶蛋白，被命名为“IL13Rα2TF-BSC1MT”，在所述突变形式中，BSC1多肽的第二个和第三个位置从K-K突变为A-Q，如在下表中所示。BSC1MT多肽被命名为3-55。
表61. V5-标记的IL13Rα2TF-BSC1MT融合蛋白的氨基酸序列。
IL13Rα2TF (单独的靶蛋白)、IL13Rα2TF-BSC1和IL13Rα2TF-BSC1MT蛋白的示意图显示在图20A中。用载体转染细胞并如上所述在单独的培养物中培养，所述载体包含编码IL13Rα2TF (对照)、IL13Rα2TF-BSC1或IL13Rα2TF-BSC1MT的重组基因。如上所述通过免疫印迹使用抗-V5抗体针对所述蛋白的存在测定得自每种培养物的培养用培养基。
如在图20B中所示，在对照细胞培养物的培养用培养基中检测到相对较少的IL13Rα2TF蛋白。参见，图20B的泳道2。相反，在用包含编码IL13Rα2TF-BSC1融合蛋白的基因的载体转染的细胞的培养用培养基中检测到显著更高的IL13Rα2TF-BSC1融合蛋白水平。参见，图20B的泳道3。在培养用培养基中检测到的IL13Rα2TF-BSC1融合蛋白的量也显著高于在用编码IL13Rα2TF-BSC1MT融合蛋白的载体转染的细胞的培养用培养基中检测到的蛋白的水平。该后一种蛋白以与关于对照细胞中的IL13Rα2TF蛋白所检测到的水平大约相同的低水平表达。参见，图20B的泳道4。结果表明，BSC1多肽(IKKAYRKLA; SEQ ID NO:48)与本发明的处于修饰的排列的增强蛋白表达的多肽一样有效，并且内部K-K二肽的改变可以破坏这样的活性。
实施例13. BSC1-蛋白A融合蛋白增强处于未修饰的排列的IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白的表达
使用BSC1多肽(IKKAYRKLA, SEQ ID NO:48)（即上述的Erdj3的J结构域的最小多肽片段）构建在下表中显示的BSC1-蛋白A融合蛋白，以确定BSC1-蛋白A融合蛋白是否可以以未修饰的排列用于增强上述IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白的表达。
表62. Flag-标记的BSC1-蛋白A融合蛋白的氨基酸序列
将IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白与或不与BSC1-蛋白A融合蛋白一起在HEK293细胞中表达。将培养物培养2天，并将培养基收获和离心以除去碎片。与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，在共表达靶蛋白和BSC1-蛋白A融合体的细胞的培养基中，IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白的表达显著增强(数据未显示)。
为了确定在培养用培养基中表达的IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白是否保留IL13结合活性，进行下述结合测定。将重组人IL13加入得自以下细胞的培养物的培养基的样品中：不表达两种蛋白中的任一种的细胞(对照)，仅表达IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白的细胞，和共表达IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞。将样品与IL13一起温育2小时。在IL13检测测定(RayBio®人IL13 ELISA试剂盒; ELH-IL13-001)中使用样品。在该测定中，当人IL13被IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白捕获时，人IL13的检测下降。如在图21B中所示，得自不表达两种蛋白中的任一种的细胞的培养物的培养基显然没有结合IL13，如高水平吸光度所指示的(图21的泳道1)。得自仅表达IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白的细胞的培养物的培养基结合一些IL13 (泳道2)，但是得自共表达IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞的培养物的培养基结合显著更大量的IL13 (泳道3)。结果清楚地显示，在含有增强的表达水平的IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白的培养基中结合更多的人IL13。因此，在培养用培养基中以增强的水平表达的IL13Rα2TF-V5-Fc靶蛋白保留它的IL13结合活性。
实施例14. BSC1-蛋白G融合蛋白增强处于未修饰的排列的因子VII-V5-Fc靶蛋白的表达
因子VII (FVII)是外因性凝血途径的丝氨酸酯酶，并且广泛地用于治疗多种出血并发症。参见，Hedner, Semin. Hematol., 43(增刊1): S105-S107 (2006)。FVII和组织因子(TF)的复合物在有磷脂和钙存在下会将因子X活化为因子Xa。
使用BSC1多肽构建BSC1-蛋白G融合蛋白，以确定该融合蛋白是否可有效地增强处于未修饰的排列的FVII-V5-Fc靶蛋白。
V5-标记的FVII-Fc靶蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表63. V5-标记的FVII-Fc靶蛋白的氨基酸序列。
Flag-标记的BSC1-蛋白G融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表64. Flag-标记的BSC1-蛋白G融合蛋白的氨基酸序列。
通过免疫印迹测定使用抗-Flag抗体确定在以下细胞的培养用培养基和裂解物中的FVII-Fc靶蛋白的表达水平：不表达两种蛋白中的任一种的细胞，仅表达FVII-Fc靶蛋白的细胞，和共表达FVII-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白的细胞。结果显示在图22A中。如在图22A的上图中所示，与在表达单独FVII-Fc靶蛋白的细胞的培养物中(泳道3)相比，在共表达FVII-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白的细胞的培养物中分泌进培养用培养基中的FVII-Fc靶蛋白的表达水平显著更大(泳道2)。图22A的中图是使用抗-Flag抗体的细胞裂解物的免疫印迹。免疫印迹表明，在表达FVII-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白G融合蛋白的细胞中表达BSC1-蛋白G融合蛋白。如在图22A的下图中所示，没有显著量的BSC1-蛋白G融合蛋白与FVII-Fc靶蛋白一起分泌进培养基中(参见，泳道3)。
图22B显示了在图22A的顶免疫印迹中显示的培养用培养基中的FVII-Fc靶蛋白表达的信号的密度测定法分析的条形图。图22B的条形图1、2和3对应于图22A中的顶免疫印迹的泳道1、2和3的信号。
结果表明，与在没有BSC1-蛋白G融合蛋白存在下的水平相比，BSC1-蛋白G融合蛋白和FVII-Fc靶蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的靶蛋白的表达水平。
实施例15. BSC1-蛋白A融合蛋白增强处于未修饰的排列的因子IX-V5-Fc靶蛋白的表达
因子IX已经被广泛地用于治疗血友病B，且它的Fc融合蛋白(FIX-Fc)目前在临床试验(III期)中具有积极结果(延长的作用)。
在该实验中，确定了上述的BSC1-蛋白A融合蛋白对处于未修饰的排列的FIX-Fc靶蛋白的表达水平的影响。
V5-标记的FIX-Fc靶蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表65. V5-标记的FIX-Fc靶蛋白的氨基酸序列。
图23A显示了分泌进以下细胞的培养物的培养基中的FIX-Fc靶蛋白的表达：表达单独FIX-Fc靶蛋白的转染的细胞(泳道2)，和共表达FIX-Fc融合蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的转染的细胞(泳道3)。图23A的泳道1显示了得自无表达细胞的培养物的培养基作为对照。如在图23A的泳道2中所示，表达单独FIX-Fc靶蛋白的细胞分泌一些FIX-Fc靶蛋白。但是，如在图23A的泳道3中清楚地显示的，在表达FIX-Fc靶蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞中显著增强分泌进培养基中的靶蛋白的表达水平。图23B显示了图23A的免疫印迹中的信号的密度测定法分析的条形图。图23B的条形图1、2和3对应于图23A中的泳道1、2和3的信号。
结果清楚地显示，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下的水平相比，BSC1-蛋白A融合蛋白和FIX-Fc靶蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的靶蛋白的表达水平。
实施例16. BSC1-蛋白G融合蛋白增强处于未修饰的排列的因子VIII-V5-Fc靶蛋白的表达
在血友病A（一种主要发生在男性中的先天性出血障碍，其源自X-染色体相关的FVIII缺乏）中证实了因子FVIII的生物学重要性。标准治疗包括替换缺失的FVIII以停止出血。开发了FVIII-Fc融合蛋白以提供延长的FVIII活性在血友病A患者中的半衰期(Powell等人, Blood, 119(13): 3031-3037 (2012))。该融合蛋白在2013年被美国食品和药品管理局批准(ELOCTATE™; Biogen Idec)。
该实验检验了上述BSC1-蛋白G融合蛋白对处于未修饰的排列的V5-标记的FVIII-Fc靶蛋白的表达水平的影响。V5-标记的FVIII-Fc靶蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表66. V5-标记的FVIII-Fc靶蛋白的氨基酸序列。
在该实验中，确定了在有和没有BSC1-蛋白G融合蛋白存在下FVIII-Fc靶蛋白的表达水平。使用商购可得的酶联免疫吸附测定(ELISA) (Visulize™FVIII Antigen Kit, Affinity Biologics Inc.)，针对FVIII测定得自以下细胞(HEK293)的培养物的培养基：不表达两种蛋白中的任一种的细胞，仅表达FVIII-Fc靶蛋白的细胞，和共表达BSC1-蛋白G融合蛋白和FVIII-Fc靶蛋白的细胞。在图24中将结果显示为在450 nm的吸光度的条形图。得自用空载体转染并且不表达两种蛋白中的任一种的细胞的培养用培养基用作阴性对照(图24中从左侧的第一个条形图)，并将人血清用作阳性对照(图24的右侧的最后一个条形图)。结果表明，与在没有BSC1-蛋白G融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平(图24中从左侧的第二个条形图)相比，BSC1-蛋白G融合蛋白与FVIII-Fc靶蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的FVIII-Fc靶蛋白的表达水平(图24中从左侧的第三个条形图)。
实施例17. BSC1-蛋白A融合蛋白增强处于未修饰的排列的抗-IL-8抗体靶蛋白的表达
该实验检验了如上所述的BSC1-蛋白A融合蛋白是否可以以未修饰的排列用于提高在转染的HEK293细胞中表达的抗-IL-8抗体靶蛋白的表达水平。
通过免疫斑点印迹使用抗-IgG抗体确定培养用培养基中的抗-IL-8抗体的表达。如在图25A的免疫斑点印迹中所示，与在表达单独抗体的细胞中表达的抗体的水平(图25A的中间行2)相比，抗-IL8抗体靶蛋白与BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗体的表达水平(图25A的底行3)。图25A的顶行显示没有抗体分泌进得自不表达两种蛋白中的任一种的对照细胞的假培养物的培养基。
使用NIH ImageJ图像处理程序对图25A的各行的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果显示在图25B的各个条形图中。图25B的条的编号对应于图25A的行编号。该系列实验的结果清楚地显示，抗-IL8抗体靶蛋白与本发明的融合蛋白（其包含与蛋白A (靶蛋白结合结构域)连接的BSC1多肽）的共表达显著增强分泌的抗-IL8抗体的表达。
图25C显示了ELISA测定的结果。将96-孔板包被重组的纯化的人IL8，并与抗-IL-8抗体(靶蛋白)一起温育，所述抗-IL-8抗体分泌进以下细胞的培养物的培养基中：表达单独抗-IL8抗体的转染的细胞(泳道2)，和共表达抗-IL8抗体靶蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞(泳道3, BSC1-蛋白A)。假培养物含有用缺乏表达任何蛋白的结构基因的表达载体转染的细胞(无抗-IL8抗体, 第一泳道)。结果清楚地显示，当与BSC1-蛋白A融合蛋白共表达时以增强的水平表达的分泌的抗-IL8抗体保留它对人IL8的结合活性。
实施例18. BSC1-蛋白A融合蛋白增强处于未修饰的排列的治疗性抗 -VEGF 抗体 ( 贝伐珠单抗 ) 靶蛋白的表达
该实验检验了如上所述的BSC1-蛋白A融合蛋白是否可以以未修饰的排列用于提高治疗性抗体的表达水平。
贝伐珠单抗(阿伐他汀®, Genentech/Roche)是一种人源化的单克隆抗体，其通过抑制血管内皮生长因子A (VEGF-A)而抑制血管生成。贝伐珠单抗在2010年的销售额接近70亿美元，并且超过所有其它抗体药物。贝伐珠单抗向标准治疗的添加可以使乳腺癌和肺癌患者的寿命延长几个月，目前在美国每年的花费是大约100,000亿美元。
贝伐珠单抗的轻链和重链的氨基酸序列显示在下表中。
表67. 贝伐珠单抗的轻链和重链的氨基酸序列。
在有和没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下在人细胞中表达抗-VEGF抗体贝伐珠单抗(靶蛋白)。假培养物含有不表达两种蛋白中的任一种的细胞。通过免疫斑点印迹测定使用抗-人IgG抗体测定得自细胞培养物的培养基的样品的抗体。
图26A显示了关于分泌进转染的细胞（其表达单独的贝伐珠单抗(中间行)，和共表达贝伐珠单抗和BSC1-蛋白A融合蛋白(底行)）的培养物的培养基中的贝伐珠单抗(抗-VEGF抗体)的表达的斑点印迹测定。图26A的顶行表明，没有抗体分泌进得自缺少任一种蛋白的结构基因的对照细胞的假培养物的培养基中。结果表明，与分泌进表达单独贝伐珠单抗的细胞的培养物的培养基中的抗体的水平相比，贝伐珠单抗靶蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白在转染的细胞中的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的贝伐珠单抗的表达水平。
图26B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图26A的每一行斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图26B的条形图的编号对应于图26A的行编号。该系列实验的结果清楚地显示，抗-VEGF抗体靶蛋白与BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗-VEGF抗体的表达水平。
图26C显示了ELISA的结果，所述ELISA用于检测培养用培养基中的VEGF结合活性。将96-孔板包被重组的纯化的人VEGF-A，并与分泌进以下细胞的培养物的培养基中的贝伐珠单抗(抗-VEGF抗体靶蛋白)一起温育：表达单独的抗-VEGF抗体的转染的细胞(条形图2)，或共表达抗-VEGF抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白的转染的细胞(条形图3)。图26C的条形图1表明，在得自用表达载体（其缺少表达任一种蛋白的结构基因）转染的细胞的假培养物的培养基中不存在显著的VEGF结合活性。结果清楚地显示，当与BSC1-蛋白A融合蛋白共表达时以增强的水平表达的分泌的抗-IL8抗体保留它对人VEGF-A的结合活性。
实施例19. BSC1-蛋白A融合蛋白增强处于未修饰的排列的治疗性抗-TNFα抗体(阿达木单抗)靶蛋白的表达
该实验检验了如上所述的BSC1-蛋白A融合蛋白是否可以以未修饰的排列用于提高治疗性抗-TNFα抗体(阿达木单抗; Humira®, AbbVie)的表达水平。
表68. 阿达木单抗的轻链和重链的氨基酸序列。
图27A显示了关于分泌进以下细胞的培养物的培养基中的抗-TNFα抗体(靶蛋白)的表达的斑点印迹测定，表达单独抗-TNFα抗体的转染的细胞(中间行)，和共表达抗-TNFα抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白的转染的细胞(图27A的底行)。在含有用表达载体（其缺少表达任一种蛋白的结构基因）转染的细胞的假培养物的培养基中没有检测到抗-TNFα抗体(图27A的顶行)。使用抗-人IgG抗体在斑点印迹测定中分析了培养用培养基中的抗-TNFα抗体的表达。可以看出，与在表达单独抗-TNFα抗体的转染的细胞中表达的抗体的水平相比，抗-TNFα抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白在转染的细胞中的共表达(底行)显著增强分泌进培养用培养基中的抗-TNFα抗体的表达水平(中间行)。
图27B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图27A的每一行的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图27B的条形图的编号对应于图27A的行编号。该系列实验的结果清楚地显示，抗-TNFα抗体靶蛋白与融合蛋白（其包含与靶标结合结构域(蛋白A)连接的BSC1多肽）的共表达显著增强分泌的抗-TNFα抗体的表达水平。
图27C显示了关于表达的抗-TNFα抗体的TNFα结合活性的ELISA结果。将96-孔板包被重组的纯化的人TNFα，并与分泌进以下细胞的培养物的培养基中的抗-TNFα抗体(靶蛋白)一起温育：表达单独抗-TNFα抗体(条形图2)或共表达抗-TNFα抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白(条形图3)的转染的细胞。在得自假培养物的培养基中没有检测到TNFα结合活性(条形图1)，所述假培养物含有用表达载体（其缺少表达任一种蛋白的结构基因）转染的细胞。该系列实验的结果清楚地显示，当与BSC1-蛋白A融合蛋白共表达时以增强的水平表达的分泌的抗-TNFα抗体保留它对人TNFα的结合活性。
实施例20. BSC1-蛋白A融合蛋白以未修饰的排列增强建立的CHO-D12细胞系中的抗-IL8抗体的表达
在设计上类似于上面的实施例8，该实验检验了BSC1-蛋白A融合蛋白是否可以增强已经在建立的商业上相关的生产CHO-DP12细胞系(美国典型培养物保藏中心登记号CRL-124444, 美国典型培养物保藏中心, Manassas, Virginia)中生产的抗-IL8抗体的表达水平。
图28A显示了分泌进以下细胞的培养物的培养基中的抗-IL8抗体(靶蛋白)的表达的免疫斑点印迹测定的结果：表达单独抗-IL8抗体的CHO-DP12细胞系的细胞(中间行2)，和共表达抗-IL8抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞(底行3)。可以看出，与在没有BSC1-蛋白A融合体分子存在下表达的抗体的水平(第2行)相比，所述抗体与BSC1-蛋白A融合体分子的共表达显著增强分泌进培养用培养基中的抗体的表达水平(底行3)。在单独的培养基中没有检测到抗体(图28A的顶行)。
图28B显示了使用NIH ImageJ图像处理程序对图28A的各行的斑点印迹中的化学发光信号的密度测定法分析的结果。图28B中的条形图的编号对应于图28A中的各行。结果指示，所述抗体与BSC1-蛋白A融合体分子的共表达(条形图3)显著增强分泌的抗体的表达，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下表达所述抗体时得到的水平相比，提供大了大约4-5倍的表达水平增强(条形图2)。
图28C显示了IL8结合的ELISA结果。将96-孔板包被重组的纯化的人IL8，并与分泌进以下细胞的培养物的培养基中的抗-IL8抗体(靶蛋白)一起温育：稳定表达单独的抗-IL8抗体的细胞(条形图2)，或共表达抗-IL8抗体和BSC1-蛋白A融合蛋白的细胞(条形图3)。使用细胞培养物培养基作为阴性对照(条形图1, 无抗-IL8抗体)。该系列实验的结果清楚地显示，当与BSC1-蛋白A融合蛋白共表达时以增强的水平表达的分泌的抗-IL8抗体保留它对IL8的结合活性。
结果指示，BSC1-蛋白A融合蛋白可以以未修饰的排列用于显著增强已经在建立的生产细胞系中稳定表达的靶蛋白的生产水平。
实施例 21. 分泌的α -1 抗胰蛋白酶 Z 蛋白的表达的增强
该实验指示，根据本发明的蛋白表达的增强具有治疗由关键蛋白的不适当构象引起的疾病的潜力。
α1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏是影响两种性别的常染色体遗传性障碍。AAT是主要在肝脏中产生的52-kDa丝氨酸蛋白酶抑制剂。已经在与AAT缺乏有关的染色体14上的蛋白酶抑制剂1 (PI)基因中鉴别出超过90种遗传变体。AAT缺乏的最常见基础是Z突变，即将密码子342处的Glu改变为Lys (Glu342Lys)的单个碱基对置换。具有Z突变的突变体AAT蛋白(AATZ蛋白)保留野生型AAT蛋白的大约80%的丝氨酸蛋白酶活性。AATZ蛋白也不可以折叠以建立正常的构象，且由此积累在内质网(ER)内的聚集体中。聚集的AATZ在肝细胞中的积累导致肝毒性和肝硬化。
关于该实验，靶蛋白是经工程改造的AAT-Fc融合蛋白和经工程改造的V5-标记的α1ATZ-Fc融合蛋白。AAT-Fc融合蛋白的氨基酸序列与在上面实施例4.3中所述相同。AATZ-Fc融合蛋白的氨基酸序列显示在下表中。
表69. V5-标记的α1AATZ-Fc靶蛋白的氨基酸序列。
图29A显示了蛋白质印迹测定的化学发光信号的图像，其中使用抗-V5抗体检测V5-标记的AAT-和AATZ-Fc融合蛋白的表达。图29A的上图中的泳道1显示了无表达细胞培养物培养基作为对照。上图的泳道2显示了表达单独AAT-Fc的细胞的培养用培养基。如关于野生型AAT蛋白所预期的，AAT-Fc融合体分泌进培养用培养基中。图29A的上图的泳道3表明，极少（如果有的话）AATZ-Fc蛋白分泌进表达单独AATZ-Fc融合蛋白的转染的细胞的培养物的培养基中。如关于AATZ蛋白（已知其停留在内质网中）所预期的，在表达单独AATZ-Fc蛋白的细胞的细胞裂解物中检测到AATZ-Fc融合蛋白。参见，中图的泳道3 (细胞裂解物)。令人惊奇地，如在图29A的上图的泳道4中所示，AATZ-Fc蛋白和BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达导致分泌进培养物培养基中的AATZ-Fc蛋白的表达水平的急剧增加。此外，在细胞裂解物中检测到极少（如果有的话）AATZ-Fc融合蛋白(泳道4，图29A的中图)。关于负载对照，用抗-微管蛋白抗体对相同膜进行印迹。
结果清楚地显示，与在没有BSC1-蛋白A融合蛋白存在下靶蛋白的表达水平相比，BSC1-蛋白A融合蛋白的共表达显著升高分泌进培养用培养基中的AATZ-Fc靶蛋白的表达水平。此外，在细胞裂解物中检测到极少（如果有的话）AATZ-Fc蛋白，从而指示AATZ-Fc蛋白没有保留在内质网中。因此，这些数据首次提示，可以提供包含AATZ-结合结构域的融合蛋白和本发明的增强蛋白表达的多肽的基因治疗可如下有效地治疗由Z突变引起的个体的AAT缺乏：增强从个体的细胞分泌的AATZ蛋白的表达，消除或降低由AATZ在内质网中的停留引起的肝毒性，和给个体修复细胞外AAT丝氨酸蛋白酶活性所需的水平。
在以上文本中引用的所有专利、申请和出版物通过引用并入本文。
现在本领域技术人员会明白本文描述的发明的其它变化和实施方案，而不脱离本发明的公开内容或下面的权利要求。

Claims (61)

1.一种分离的增强蛋白表达的多肽，其选自：
(a) J蛋白的分离的J结构域；
(b) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段；
(c) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽类似物，所述J结构域类似物多肽包含式I的氨基酸序列：
(I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或甲硫氨酸(M)；
X2和X3各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是K或R；
X4是任意氨基酸，或者当X1至X3存在且X5至X9存在时，X4可以不存在；
X5是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
X6和X7各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者，当X6和X7之一是K或R时且当X1至X5存在且X8至X9存在时，X6和X7中的另一个可以不存在；和
X8和X9是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；或者，当X8和X9之一是L或A时且当X1至X7存在时，X8和X9的另一个可以不存在；和
(d)分离的增强蛋白表达的多肽，其选自以下十肽：
。
2.根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽是J蛋白的分离的J结构域。
3.根据权利要求2所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述分离的J结构域是Erdj蛋白、SV40的大T抗原或哺乳动物半胱氨酸串联蛋白α(CSP-α)的分离的J结构域。
4.根据权利要求3所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述分离的J结构域是选自Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6和Erdj7的Erdj蛋白的分离的J结构域。
5.根据权利要求4所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述分离的J结构域是Erdj3的分离的J结构域。
6.根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽是J结构域的分离的多肽片段。
7.根据权利要求6所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽是选自以下的J结构域的分离的多肽片段：
。
8.根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽是J结构域类似物多肽，其中所述多肽类似物包含式I的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的增强蛋白表达的多肽，其中：
X1是I、L、V、A或M；
所述二肽X2-X3选自：KR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ和RD；
X4是A、S、T、R、S、Q、E、F、C或I；
X5是Y或F；
所述二肽X6-X7选自：KR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK和KV；且
所述二肽X8-X9选自：LA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY和RA。
10.根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述增强蛋白表达的多肽包含下述氨基酸序列之一:
。
11.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1-10中的任一项所述的增强蛋白表达的多肽的核酸序列。
12.一种核酸载体分子，其包含根据权利要求11所述的分离的核酸分子。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的核酸载体分子。
14.一种融合蛋白，其包含：
与目标靶蛋白连接的、分离的增强蛋白表达的多肽，
其中所述分离的增强蛋白表达的多肽选自：
(a) J蛋白的分离的J结构域；
(b) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段；
(c) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽类似物，所述J结构域类似物多肽包含式I的氨基酸序列：
(I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或甲硫氨酸(M)；
X2和X3各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是K或R；
X4是任意氨基酸，或者当X1至X3存在且X5至X9存在时，X4可以不存在；
X5是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
X6和X7各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者，当X6和X7之一是K或R时且当X1至X5存在且X8至X9存在时，X6和X7中的另一个可以不存在；和
X8和X9是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；或者，当X8和X9之一是L或A时且当X1至X7存在时，X8和X9的另一个可以不存在；和
(d)分离的增强蛋白表达的多肽，其选自以下十肽：
。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是分离的J结构域。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述分离的J结构域是Erdj蛋白、SV40的大T抗原或哺乳动物半胱氨酸串联蛋白α(CSP-α)的分离的J结构域。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述分离的J结构域是选自Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6和Erdj7的Erdj蛋白的分离的J结构域。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述分离的J结构域是Erdj3的分离的J结构域。
19.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段。
20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是选自以下的J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段：
。
21.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是J结构域类似物多肽，其中所述多肽类似物包含式I的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中：
X1是I、L、V、A或M；
所述二肽X2-X3选自：KR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ和RD；
X4是A、S、T、R、S、Q、E、F、C或I；
X5是Y或F；
所述二肽X6-X7选自：KR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK和KV；且
所述二肽X8-X9选自：LA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY和RA。
23.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽包含下述氨基酸序列之一:
。
24.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求14-23中的任一项所述的融合蛋白的核酸序列。
25.一种核酸载体分子，其包含根据权利要求24所述的分离的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的核酸载体分子。
27.一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽，所述方法包括，在足以生产所述融合蛋白的条件下培养根据权利要求26所述的宿主细胞。
28.一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽，所述方法包括用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含编码根据权利要求14所述的融合蛋白的结构基因，和在造成所述融合蛋白的表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。
29.一种表达融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与目标靶蛋白连接的增强蛋白表达的多肽，所述方法包括下述步骤：
1)构建编码根据权利要求14所述的融合蛋白的重组基因序列；
2)将所述重组基因序列插入表达载体中以形成重组表达载体，其中所述重组基因序列与转录启动子序列可操作地连接；
3)将所述重组表达载体转染进与所述启动子序列相容的宿主细胞中；和
4)在允许表达所述融合蛋白的条件下培养所述转染的宿主细胞。
30.一种修复哺乳动物对象的细胞的蛋白功能的方法，所述细胞缺乏提供所述蛋白功能的天然分泌蛋白的分泌，所述方法包括，在对象的细胞中插入编码融合蛋白的外源核酸分子，所述融合蛋白包含与所述分泌蛋白连接的根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，其中所述融合蛋白的表达会在没有所述外源核酸存在下提供天然分泌蛋白的功能，所述天然分泌蛋白的分泌在对象的细胞中缺乏。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述对象具有与天然分泌蛋白在对象中的分泌缺乏有关的疾病。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病选自朊病毒相关的疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、囊性纤维化(CF)和α1-抗胰蛋白酶缺乏。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述对象是缺乏囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白的分泌的人对象，且所述疾病是囊性纤维化。
34.一种融合蛋白，其包含：
与靶蛋白结合结构域连接的、分离的增强蛋白表达的多肽，
其中所述分离的增强蛋白表达的多肽选自：
(a) J蛋白的分离的J结构域；
(b) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段；
(c) J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽类似物，所述J结构域类似物多肽包含式I的氨基酸序列：
(I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:47)，其中：
X1是异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)或甲硫氨酸(M)；
X2和X3各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是K或R；
X4是任意氨基酸，或者当X1至X3存在且X5至X9存在时，X4可以不存在；
X5是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)；
X6和X7各自独立地是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；或者，当X6和X7之一是K或R时且当X1至X5存在且X8至X9存在时，X6和X7中的另一个可以不存在；和
X8和X9是任意氨基酸，前提条件是，一个或二者是亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；或者，当X8和X9之一是L或A时且当X1至X7存在时，X8和X9的另一个可以不存在；和
(d)分离的增强蛋白表达的多肽，其选自以下十肽：
。
35.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是分离的J蛋白。
36.根据权利要求35所述的融合蛋白，其中所述分离的J结构域是Erdj蛋白、SV40的大T抗原或哺乳动物半胱氨酸串联蛋白α(CSP-α)的分离的J结构域。
37.根据权利要求35所述的融合蛋白，其中所述分离的J结构域是选自Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6和Erdj7的Erdj蛋白的分离的J结构域。
38.根据权利要求37所述的融合蛋白，其中所述分离的J结构域是Erdj3的分离的J结构域。
39.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段。
40.根据权利要求39所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是选自以下的J结构域的分离的增强蛋白表达的多肽片段：
。
41.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽是J结构域类似物多肽，其中所述J结构域类似物多肽包含式I的氨基酸序列。
42.根据权利要求41所述的融合蛋白，其中：
X1是I、L、V、A或M；
所述二肽X2-X3选自：KR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ和RD；
X4是A、S、T、R、S、Q、E、F、C或I；
X5是Y或F；
所述二肽X6-X7选自：KR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK和KV；且
所述二肽X8-X9选自：LA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY和RA。
43.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述增强蛋白表达的多肽包含下述氨基酸序列之一:
。
44.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述靶蛋白结合结构域是抗体或其抗原结合片段、抗体结合蛋白、受体蛋白的配体结合结构域、受体蛋白的蛋白配体、被抗体或其抗原结合片段结合的蛋白抗原、或PDZ结构域。
45.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述靶蛋白结合结构域是抗体结合蛋白。
46.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中所述抗体结合蛋白是Fc结合蛋白。
47.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述Fc结合蛋白是蛋白A或蛋白G。
48.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中所述抗体结合蛋白是蛋白L。
49.根据权利要求43所述的融合蛋白，其中所述靶蛋白结合结构域是受体蛋白的配体结合结构域，其中所述受体蛋白是细胞因子受体。
50.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述靶蛋白结合结构域是受体蛋白的蛋白配体，其中所述蛋白配体是细胞因子。
51.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求34-50中的任一项所述的融合蛋白的核酸序列。
52.一种核酸载体分子，其包含根据权利要求51所述的分离的核酸分子。
53.一种宿主细胞，其包含根据权利要求52所述的核酸载体分子。
54.一种表达融合蛋白的方法，所述方法包括，在足以生产所述融合蛋白的条件下培养根据权利要求53所述的宿主细胞。
55.一种增强宿主细胞表达的目标靶蛋白的表达的方法，所述方法包括：用表达载体转染所述宿主细胞，所述表达载体包含编码根据权利要求34所述的融合蛋白的结构基因，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的增强蛋白表达的多肽，和在造成由所述结构基因编码的所述融合蛋白和所述目标靶蛋白的共表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。
56.一种增强目标靶蛋白的表达的方法，所述方法包括下述步骤：
1)构建编码融合蛋白的重组基因，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，所述靶蛋白结合结构域结合所述目标靶蛋白；
2)将所述重组基因插入表达载体中以形成重组表达载体，其中所述重组基因序列与转录启动子序列可操作地连接；
3)将所述重组表达载体转染进与所述启动子序列相容的宿主细胞中；和
4)在允许由所述重组基因编码的所述融合蛋白和所述目标靶蛋白的共表达的条件下培养所述转染的宿主细胞。
57.一种修复哺乳动物对象的细胞的分泌蛋白功能的方法，所述细胞缺乏提供所述分泌蛋白功能的天然分泌蛋白的分泌，所述方法包括，在对象的细胞中插入编码融合蛋白的外源核酸分子，所述融合蛋白包含与靶蛋白结合结构域连接的根据权利要求1所述的增强蛋白表达的多肽，所述靶蛋白结合结构域结合所述天然分泌蛋白，其中所述融合蛋白和所述天然分泌蛋白在细胞中的表达会增强所述天然蛋白的分泌以给所述对象的细胞提供所述蛋白功能。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述对象具有与天然蛋白在所述对象中的分泌缺乏有关的疾病。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述疾病选自朊病毒相关的疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、囊性纤维化(CF)和α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述对象是缺乏囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白的分泌的人对象，且所述疾病是囊性纤维化。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述对象是缺乏AAT的分泌的人对象，且所述疾病是AAT缺乏。
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